Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của quả cây bạch chỉ di thực ở việt nam

PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỂ Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học và y học hiện đại, việc sử dụng rộng rãi các vị thuốc cổ truyền không những hoàn toàn chỉ dựa vào kinh nghiệm dân gian, mà còn dựa trên cơ sở khoa học đã được chứng minh bằng những thành phần hoá học và tác dụng sinh học của chúng. Bạch chỉ là rễ đã phơi hoặc sấy khô của câv Hàng châu Bạch chỉ Angelica dahurica (Fisch.), Benth. et Hook,và cây Xuyên Bạch chỉ Angelica anomaỉa Lallem họ ( Apiaceae), là vị thuốc cổ truyền được sử dụri2 làm thuốc siảm đau, hạ sốt, chữa tràng nhạc, viêm tuyến vú, nsạt mũi, viêm mũi chảy nước hôi, mụn nhợt chốc lở... Thành phần hoá học và tác dụns sinh học của rễ Bạch chí đã được nhiều tác 2Íả trong và ngoài nước nghiên cứu. Ngoài bộ phận dùnơ là rễ ra, chúng tôi thấy quả Bạch chí cũng là nsuồn nsuyên liệu rất phong phú. nhưng chưa được sử dụns rộnơ rãi. Tài liệu trons và ngoài nước viết về quả Bạch chỉ cho tới nay hầu như còn rất hiếm. Chúng tòi mới chỉ thấy một tài liệu duy nhất, đó là quyển Những Coumarin và Furocoumarin tự nhiên” của ‘viết về sự có mật của Byak angelicin trong quả của câv Angelica dahurica.Với mong muốn 2Óp phần tìm nguồn nguyên liệu làm thuốc từ nhữnơ dược liệu sẵn có trong nước, chúns tôi bước đầu tiến hành sơ bộ nghiên cứu quả cây Bạch chi di thực ở Việt Namvới những mục tiêu sau: Định tính phát hiện một số hợp chất tự nhiên. Định lượng thành phần hoá học chính. Chiết xuất, phân lập, tinh chế, phân tích và sơ bộ nhận dạn2 chất phân lập được. Thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn của dịch chiết quả và thành phần hoá học chính có trong quả. 1

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

PGS.TS BẾ THỊ THUẤN

Bộ môn Dược liệu 2-5/2001

HÀ NỘI - 5 / 2001

LỜI CAM ƠN

Vói lòng kính trọng và biết ơn sâu sác nhốt, tôi xin b à y tỏ lòng biế t ơn chân thành tới:

PGS TS Bế Thị Thuẩn.

Người tháy dỡ trục tiếp huóng dân, tận tình ch ỉ bả o và dành rát nhiều thòi gian giúp dỡ tôi trong suốt thòi gian thục hiện vò hoàn thành công trình tố t nghiệp.

Tôi xin chôn thành cảm ơn TS Chu Thị Lộc, TS Nguyên Viết Thân, TS.ĐỖ N gọc Thanh và c á c tháy cô giáo, c á c cán bộ bộ môn Dược liệu và b ộ môn Vi sinh — Kháng sinh đỡ giúp đ ỡ , tạo diêu kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành dề tài tố t nghiệp.

Hà Nội ngày 15 tháng 05 nám 2001.

Sinh viên

Vũ Thị Thu Hương.

3.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm ' 83.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 93.2.1 Định lượng tinh dầu trong quả Bạch chỉ 93.2.2 Đặc điểm bên ngoài của quả Bạch chỉ 93.2.3 Thành phần hoá học 103.2.4 Chiết tách, phân lập định tính Coumarin 183.2.5 Thử tác dụng kháng khuẩn in vitro 28

PHẦN I

ĐẶT VẤN ĐỂ

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học và y học hiện đại, việc sử dụng rộng rãi các vị thuốc cổ truyền không những hoàn toàn chỉ dựa vào kinh nghiệm dân gian, mà còn dựa trên cơ sở khoa học đã được chứng minh bằng những thành phần hoá học và tác dụng sinh học của chúng

Bạch chỉ là rễ đã phơi hoặc sấy khô của câv Hàng châu Bạch chỉ -

Angelica dahurica (Fisch.), Benth et Hook, và cây Xuyên Bạch chỉ - Angelica anomaỉa Lallem họ (Apiaceae), là vị thuốc cổ truyền được sử dụri2 làm thuốc

siảm đau, hạ sốt, chữa tràng nhạc, viêm tuyến vú, nsạt mũi, viêm mũi chảy nước hôi, mụn nhợt chốc lở Thành phần hoá học và tác dụns sinh học của rễ Bạch chí đã được nhiều tác 2Íả trong và ngoài nước nghiên cứu.

Ngoài bộ phận dùnơ là rễ ra, chúng tôi thấy quả Bạch chí cũng là nsuồn nsuyên liệu rất phong phú nhưng chưa được sử dụns rộnơ rãi Tài liệu trons

và ngoài nước viết về quả Bạch chỉ cho tới nay hầu như còn rất hiếm Chúng tòi mới chỉ thấy một tài liệu duy nhất, đó là quyển "Những Coumarin và Furocoumarin tự nhiên” của ‘viết về sự có mật của Byak-

angelicin trong quả của câv Angelica dahurica Với mong muốn 2Óp phần tìm

nguồn nguyên liệu làm thuốc từ nhữnơ dược liệu sẵn có trong nước, chúns tôi bước đầu tiến hành sơ bộ nghiên cứu quả cây Bạch chi di thực ở Việt Nam-với những mục tiêu sau:

PH Ầ N II

TỔNG QUAN

2.1 Đặc điểm thực vật:

Ớ Việt Nam hiện nay chính thức có hai loài cùng cho vị thuốc Bạch chỉ

là Hàng châu Bạch chỉ - Angelica dahurica(Fisch.), Benth.et Hook, và Xuyên

Bạch chỉ- Angelica anomala Lallem họ Hoa tán Ápiaceae [9] Cả hai loài trên

có nguồn gốc từ Tứ Xuyên - Trung Quốc, đã được di thực vào nước ta từ năm

1960 Cây Bạch chỉ thích nghi và phát triển tốt ở đồng bằng và miền núi phía Bắc nước ta [7] Theo Đỗ Tất Lợi [9] và Trần Thuý Nga [11], cây Hàng châu Bạch chỉ là cây sống lâu năm, cao 1 - l,5m, đường kính thân có thể tới 2- 3cm Thân rỗng, mặt ngoài có gờ dọc, gốc màu tím hồng, trên màu xanh lục hoặc toàn thân xanh lục Phía dưới thân nhẵn, không có lông, nhưng phía trên gần cụm hoa thì có lông ngắn Lá phía dưới to, có cuống dài, phiến lá 2-3 lần

xẻ lông chim, thuỳ hình trứng hoặc hình trứng dài, mép có răng cưa Mặt trên

lá màu xanh lục thẫm, mặt dưới màu xanh lục nhạt Hai mặt lá đều không có lông nhưng trên đường gân của mặt trên có lông che chở đơn hoặc đa bào Lá phía trên nhỏ hơn, toàn bộ cuống lá phát triển thành bẹ bao ôm lấy thân Bề mặt bẹ có gờ nhỏ, không có lông

Cụm hoa hình tán kép, mọc ở kẽ lá hay đầu cành, có 1-2 lá bắc phình to dạng túi, bề mặt lông ngắn Mỗi tán có 22 đến 26 tán đơn, chiều dài không đều Cuống tán nhỏ dài Hoa màu trắng, đều lưỡng tính, mẫu 5 Quả bế đôi, cuống treo không có lông Đỉnh quả có dấu vết đĩa tuyến mật và vòi nhuỵ Quả hình bầu dục, gốc quả lõm hình thận, 2 gờ vai nhô lên ít, rộng hơn gốc,

gờ lưng tù tròn, đầy, rộng hơn rãnh Hai cạnh bên quả dạng cánh, mép cánh nhăn nheo không có lông Hạt hình trứng, đầu trên nhọn, vỏ nâu đen Mặt bụng hạt có đường gờ trắng đứt đoạn nối liền với cuống hạt

Cây Xuyên Bạch chỉ là cây sống lâu nãm, thường cao hơn cây Hàng châu Bạch chỉ (cây cao tới 2-3m), đường kính thân nhỏ hơn, chỉ khoảng lcm, toàn thân màu xanh lục, phủ một lớp lông mịn Lá có thuỳ mang cuống rõ rệt Cụm hoa cũng hình tán kép, nhưng mỗi tán kép mang nhiều hoa hơn, thường từ 24-

36 tán đơn Quả có 2 gờ vai nhô hẳn lên, rộng bằng gốc quả, gờ lưng nhọn, hẹp, nhỏ hơn rãnh Các đặc điểm khác gần giống Hàng châu Bạch chỉ

Ảnh 1: Cây Bạch chỉ di thực - ảnh chụp tại xã Vạn Phúc-Thanh Trì-Hà Nội

2.2 Trồng trọt :

Theo Ngô Vân Thu [1], cây Bạch chỉ di thực được trồng ở một số tỉnh

miền Bắc nước ta hiện nay chính là Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.)

Benth et Hook.f và Angelica dahurica (Fisch.ex Hoffm.)Benth et Hook,

f.var.formosana (Boiss) Shan et Yuan, họ hoa tán (Apiacae) Cây mọc tốt ở cả

đồng bằng lẫn miền núi Hạt giống thu hoạch ở cây mọc hai năm , giữ cây giống ở vùng có khí hậu mát như Tam Đảo Gieo hạt vào tháng 10, 11 Bạch chỉ là cây ăn rễ sâu, cần cày sâu, bừa kỹ Đánh luống, gieo hốc, mỗi hốc 10 -

3

15 hạt, tưới nước, vì hạt thích ẩm Khi cây cao 20 - 30 cm thì tỉa bớt còn vài ba cây ở mỗi hốc Cần làm cỏ bón phân khi lá chưa phủ hết mặt luống Nếu có bệnh đốm đen (trên lá có đốm đen) thì hái lá đốt đi hoặc phun dịch Bordeaux Nếu có sâu bọ nhiều thì dùng thuốc trừ sâu để phun.

Ảnh 2: Bạch chỉ mùa thu hoạch tại xã Vạn Phúc-Thanh Trì-Hà Nội

2.3 Bộ phận dùng, phương pháp thu hái, chê biến:

Bộ phận dùng của Bạch chỉ là rễ củ của cả hai loài Vào mùa thu, khi trời khô ráo, đào lấy rễ, cắt bỏ thân và rễ con, rửa sạch đất, để ráo nước, cho vào lò xông sinh một ngày đêm rồi đem phơi hoặc sấy Khi khô xông sinh lần nữa [ 1] Theo sổ tay trung dược tễ [11], có thể chế biến Bạch chỉ theo phương pháp sau: Bạch chỉ khô đã sơ chế, rửa sạch, để ráo nước, cho vào nồi nhôm hai lớp, thêm rượu 15°, chưng cách thuỷ trong 8 giờ đến khi mềm không còn chảy nước Cho ra khay, sấy ở 60°-70°C cho đến khô

Dược điển Việt Nam I tập 2 [4] và Dược điển Việt Nam II tập 3 [5] đã

mô tả về hình thái vị thuốc: rễ nguyên, ít khi phân nhánh, hình chuỳ thẳng

hoặc cong queo Rễ của loài Angelica, dahurica có thiết diện gần như vuông trong khi rễ của loài Angelica anomala có thiết diện gần tròn Rễ dài 5-25cm,

đường kính từ 0,5 cm trở lên Mùi thơm hắc Đầu rễ phía trên to và còn vết tích của thân cây, phía dướỉ thuôn nhỏ dần Mặt ngoài màu vàng nâu có vết tích của rễ con đã cắt bỏ, có nhiều nếp nhăn xếp thành 4 hàng dọc, nhiều bì khổng lồi nổi lên thành những vết sần ngang Mặt cắt ngang màu trắng đến trắng ngà, nhiều bột, tầng sinh libe-gỗ rõ rệt là một vòng màu nâu, mỏng như sợi chỉ Phần vỏ có nhiều đám màu nâu là các ống tiết tinh dầu bị cắt ngang

Rễ có thể chất cứng chắc, đầu phía trên khó bẻ, vết bẻ lởm chởm, nhiều bột Đặc điểm vi học của cả hai loài tương tự giống nhau Vi phẫu rễ cắt ngang có cậc đặc điểm: mô mềm vỏ có khuyết, nhiều ống tiết nằm chủ yếu trong phần libe [1]

2.4.2 Coumarin:

Đây là thành phần được nghiên cứu nhiều hơn trong các hợp chất tự nhiên của Bạch chỉ Theo Ngô Văn Thu [1], trong rễ Angelica dahurica có các chất: Scopolethin, Byak-angenlicol, oxypeucedanin, Imperatorin,isoimperatorin, phelloptenrin, Xanthotoxih, anhydrobyak-angelicin,

5

Neobyak-angelicol, Macmezin Các tác giả Trung Quốc [17] còn công bố về

sự có măt của các chất Heptatriacontane, Bergapten, Bergaptol, Nodakenin Robin Witt và cộng sự [16] đã nêu phương pháp phân lập các chất Coumarin, 5,8-di ( 2 , 3 - d i h y d r o x y - 3 - m e t h l b u t o x y l ) Psoralen từ rễ Angelica dahurica Còn trong Angelica anomala có Byak-angelicol, byak-angelicin, Bergapten Umbeliferon, Anomalin, Ageomalin, Angelicontonxin và acid Angelic [6,9],

Trong quả của Angelica dahurica có byak-angelicin [19] Theo Đàm Hương

Huyền [7], trong rễ Bạch chỉ di thực có: Tinh dầu, Coumarin, Flavonoid, phytosterol, chất béo, trong đó Coumarin và tinh dầu là chủ yếu

Về tác dụng sinh học, chúng tôi ít thấy tài liệu nghiên cứu về tác dụng của Bạch chỉ với tự cách là 1 vị thuốc cổ truyền mà đa số nghiên cứu về tính chất và tác dụng của cao Bạch chỉ, các hợp chất Coumarin phân lập được từ dược liệu Phạm Duy Mai và cộng sự [10] đã công bố về tác dụng giảm đau nội tạng, tác dụng kháng khuẩn rõ rệt của cao lỏng Bạch chỉ đối với các chủng Diplococcus pneumonia, Streptococcus hemolyticus, Staphilococcus aureus, Bacilus subtilis Các tác giả Nhật Bản [18] đã xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của 5,8-di - (2,3-dihydroxy-3-methyl butoxyl) Psoralen,Isoimperatarin, Imperatorin, Phellopterin, Byak-angelicin, Scopolethin phân

lập từ rễ Angelica dahurica đối với các chủng Bacilus subtilis, E.coli,

Cladosporium herbarum, Aspergilus Candidas. Năm 1999, Đàm Hương

Huyền và cộng sự [13] đã thử một số tác dụng dược lý của nước sắc (1:1) Bạch chỉ di thực Kết quả cho thấy:

- Với liều 2,5g/kg, chế phẩm có tác dụng chống viêm trên chuột cống trắng sau 24 giờ

- Vói liều 0,3g/kg, chế phẩm có tác dụng chống đông máu trên thỏ

- Dung dịch chế phẩm ở nồng độ 2 % trong dung dịch Ringer tim làm

giảm biên độ co bóp cơ tim ếch cô lập

- Với liều 0,3g/kg, chế phấm gây hạ huyết áp thỏ 30 phút sau khi uống Ngoài ra, chế phẩm không làm thay đổi nhịp tim ếch tại chỗ, không gâygiãn cơ trơn mạch máu tai thỏ cô lập và dung dịch chế phẩm ở nồng độ 0,1% trong dung dịch Tyrode không ảnh hưởng đến nhu động ruột thỏ

Đối với quả Bạch chỉ, ngoài tài liệu [19] ra cho đến nay chúng tôi chưa thấy tài liệu nào công bố về thành phần hoá học cũng như về tác dụng và công dụng của nó Một số địa phương ở miền Bắc Việt Nam, người ta vẫn dùng quả Bạch chỉ để làm thuốc chống viêm, nhất là bệnh viêm mũi, viêm xoang theo kinh nghiệm dân gian

7

* Lấy mẫu mô tả quả của cây Bạch chỉ.

* Nghiên cứu về hoá học

• Định lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước

• Định tính các nhóm chất tự nhiên bằng các phản ứng hoá học

• Định tính Coumarin bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), với bản mỏng silicagel GF254 của hãng Merck

• Chiết xuất phân lập và tinh chế Coumarin bằng những phương pháp kinh điển ghi trong các tài liệu

• Độ chảy các chất được đo trên máy GallenKamP ( UK ) tại phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại Học Dược Hà Nội

• Đo phổ tử ngoại (UV) trên máy UV-VIS Spectrophotometer cary IE- varian (Australia) tại phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà nội

• Đo phổ hổng ngoại (IR) trên máy 1650-Perkin Elmer (USA) tại phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà nội

• Độ ẩm của dược liệu đo trên máy Satorius tại phòng thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội

• Nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm in vitro tại Bộ môn

vi sinh-kháng sinh trường Đại học Dược Hà nội

3.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét.

3.2.1 Đinh lương tinh dầu trong quả Bạch chỉ [2]:

Cân 20 g dược liệu, cho vào bình cầu cổ mài dung tích 500 ml Thêm

200 ml nước cất Lắp dụng cụ Đun trực tiếp trên bếp điện (qua lưới amiang) trong 2 giờ Ngừng cất Tháo dụng cụ Lấy riêng phần ống hứng tinh dầu, điều chỉnh cho tinh dầu vào phần chia vạch Đọc thể tích tinh dầu và tính kết quả Hàm lượng tinh dầu trong được liệu được tính theo công thức:

Bảng 1: Hàm lượng tinh dầu trong quả Bạch chỉ.

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3Lượng dược liệu (g) 20,00 20,00 20,00

Thể tích tinh dầu (ml) 0,28 0,25 0,29

Hàm lượng tinh dầu (%) 1,60 1,43 1,66

Trung bình (%) 1,56

3.2.2 Đặc điểm bên ngoài của quả Bạch chỉ:

Quả bế đôi, cuống treo không có lông Đỉnh quả có dấu vết đĩa tuyến mật và vòi nhuỵ Quả hình bầu dục, gốc quả lõm hình thận, hai gờ vai nhô lên

9

/

ít, rộng hơn gốc, gờ lưng tù, tròn, đầy, rộng hơn rãnh Hai cạnh bên quả dạng cánh, mép cánlì nhăn nheo không có lông Hạt hình trứng, đầu trên nhọn, vỏ mầu nâu đen, mật bụng hạt có đường gò' trắng, đút đoạn nối liền với cuống hạt.

Ánh 3: Quả của cây Bạch chỉ di thực

Đối chiếu với những đặc điểm của quả Bạch chỉ được mô lá trong các tài liệu [3,7,9], chúng tôi thấy mẫu quả nghiên cứu của chúng tồi có những

đặc điểm giống quả của cây Hàng châu Bạch chỉ Angelica dahurica

cắn bằng 0,5ml anhydrid acetic, lắc đều Đặt nghiêng ống 45°, cho thêm 0,5

ml acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng nâu đỏ (phản ứng dương tính)

Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Phytosterol.

♦> Định tính Glycosid tim :

Cho 10 g bột dược liệu vào 1 bình nón có dung tích 100ml Thêm 80ml cồn 25°, ngâm ở nhiệt độ phòng 24h, gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, loại tạp bằng 1 lượng chì acetat 30% có dư Lọc bỏ tủa Dịch lọc sau khi bay hơi hết cồn được cho vào bình gạn, lặc kĩ 2 lần với cloroform, mỗi lần 15ml Gạn dịch Cloroform vào 1 cốc có mỏ Bay hơi dung môi Hoà tan cắn bằng 10ml cồn 90° Dịch cồn làm các phản ứng định tính:

• Phản ứng Liberman-Bouchardat:

Lấy lm l dịch chiết cồn, thêm vài giọt acid acetic và 2ml hỗn hợp anhydrid acetic: acid sulfuric (50:1),trộn đều Không thấy sự thay đổi màu từ hồng đến xanh lá (phản ứng âm tính)

• Phản ứng Baliet:

Lấy lm l dịch chiết cồn, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch

acid picric ỉ % trong cồn và 9 phần dung dịch NaOH 10%) không thấy xuất

hiện màu đỏ cam (phản ứng âm tính)

• Phản ứng legal:

Lấy 1 ml dịch chiết cồn, thêm 5 giọt dung dịch Natri nitroprusiat 1%, thêm từ từ vài giọt dung dịch Natri hydroxid 10% (bảo đảm kiềm dư) Có xuất hiện mầu đỏ (phản ứng dương tính)

Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Glycosid tim thuộc nhóm

Cardenolid

♦> Định tính Tanin :

11

Cho vào ốns nghiệm to lg dược liệu, thêm 5ml nước cất, đun sôi trực tiếp trên bếp điện trong vài phút, lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc để làm các phản ứng định tính:

• Phản ứng với thuốc thử sát (III) clorid 5%:

Cho vào ống nghiệm lml dịch lọc, thêm vài giọt thuốc thử thấy xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính)

• Phản ứng với dung dich Gelatin 1%:

Cho vào ống nghiệm lml dịch lọc, thêm vài giọt thuốc thử không thấy xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng âm tính)

Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Tanin

♦> Định tính Saponin :

Cho vào ống nghiệm to lg dược liệu, thêm 10ml cồn 70°, đun cách thuỷ

3 phút, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc để làm phản ứng định tính

• Quan sát hiên tương tao bot:

Cho lm l dịch chiết cồn vào 1 ống nghiệm, thêm 5ml nước cất, lắc mạnh trong 30 giây, xuất hiện cột bọt cao khoảng lcm, nhưng không bền

(phản ứng âm tính)

• Quan sát hiên tương phá huyết:

Cho lm l dịch chiết cồn vào 1 ống nghiệm, bay hơi cách thuỷ cho hết cồn thêm 1 ml dung dịch Natriclorid 0,9%, lắc đều Nhỏ 1 giọt dung dịch máu bò 2% đã loại fibrin pha trong dung dịch Natriclorid 0,9% Để yên trong 2 giờ Dung dịch trong ống có màu hồng nhạt, đáy có hồng cầu lắng, khi lắc vẩn đục, chứng tỏ không có hiện tượng phá huyết

Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Saponin

❖ Định tính acid hữu cơ :

Cho vào 1 ống nghiệm to 0,5g dược liệu, thêm 5ml nước cất, đun sôi trực tiếp trên bếp điện 3 phút, lọc nóng qua bông Dịch lọc thêm 1 ít bột Natricarbonat Thấy xuất hiện bọt khí (phản ứng dương tính)

Sơ bộ kết luận trong dược liệu có acid hữu cơ

♦♦♦ Định tính chất béo và Caroten:

Cho vào bình cầu Ig dược liệu, thêm 10ml ether dầu hoả, đun hồi lưu cách thuỷ trong 30 phút, lọc Dịch lọc cho vào hai ống nghiệm nhỏ, khô mỗi ống lm l dịch lọc Bốc hơi dung môi và làm các phản ứng định tính:

Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Caroten.

♦♦♦ Định tính đường khử và acid amin :

Cho vào ống nghiệm to 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 50°, đun trên nồi cách thuỷ sôi trong 5 phút, lọc Dịch lọc để làm các phản ứng định tính:

• Đinh tính đường khử:

Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt thuốc thử fehling A, 2 giọt thuốc thử fehling B, lắc, không thấy xuất hiện màu đỏ nâu (phản ứng âm tính)

Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có đường khử

• Đinh tính acid amin:

Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Ninhydrin 2%, lắc kỹ, rồi đun trên nổi cách thuỷ sôi trong vài phút, không thấy xuất hiện màu xanh tím (phản ứng âm tính)

Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Acid amin

❖ Định tính Flavonoid :

Cho vào 1 bình cầu 3g dược liệu, đun hồi lưu cách thủy với 20ml cồn 70° trong 30 phút Lọc qua giấy lọc Bay hơi dung môi, hoà tan cắn bằng 10ml

13

nước nóng, để nguội, dịch chiết được lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 15ml Phần nước còn lại sau khi lắc được cô tới cạn, hoà tan cắn bằng 5ml cồn 70°

để làm các phản ứng định tính:

• Phản ứng với kiềm:

Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ nóng nhẹ đến khô, hơ lên miệng

lọ đựng amoniac đặc, thấy màu vàng tăng lên rõ rệt

• Phàn ứng với dung dich sắt (IIĨ) clorid:

Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, thấy xuất hiện mầu xanh đen

• Phản ứng Cyanỉdin:

Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại, vài giọt dung dịch acid clohydric đặc, đun cách thuỷ vài phút, thấy mầu dịch chiết không thay đổi

Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Flavonoid

♦> Định tính Coumarin :

Cho vào bình cầu lg dược liệu, thêm 5ml cồn 90°, đun cách thủy trong 3

- 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch chiết thu được để làm các phản ứng sau:

• Phản ứng mở và đổng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ông lm l dịch chiết

- ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

Thêm vào cả hai ốhg nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều

Quan sát: ống 1: trong suốt.

ống 2: có tủa đục.

Acid hoá ống 1 bằng vài giọt acid clohydric, ống 1 trở lại đục như ống 2 (Phản ứne dương tính).

• Phản ứng diazo hoá:

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vào đó 2 giọt dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi rồi để nguội Giỏ vài giọt thuốc thử Diazo, thấy xuất hiện màu đỏ gạch (Phản ứng dương tính)

• Huỳnh quang dưới ánh sáng từ ngoai tăng lên ở môi trường kiềm:Giỏ vài giọt dịch chiết lên 1 miếng giấy lọc, giỏ tiếp lên đó vài giọt Natrihydroxid 5%, sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một đồng xu, rồi chiếu tia tủ ngoại trong một vài phút Bỏ đổng xu ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy: Phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sáng dần lên bằng phần không bị che ( Phản ứng dương tính )

Sơ bộ kết luận trong dược liệu có Coum arin

♦♦♦ Định tính Ảlcaloid :

Cho 2g dược liệu vào 1 bình nón dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dungdịch amoniac, để yên trong 30’ Thêm 30ml cloroform để qua đêm Dịch chiếtlọc qua giấy lọc vào 1 bình gạn, lắc với 10ml acid sulfuric 10% Gạn lớp acid làm các phản ứng định tính:

• Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:

Cho vào ống nghiệm lm l dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff, lắc kỹ, không thấy xuất hiện tủa màu vàng cam (phản ứng âm tính)

• Phản ứng với thuốc thử Mayer:

Cho vào ống nghiệm lm l dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Mayer, lắc, không thấy xuất hiện tủa trắng hơi vàng (phản ứng âm tính)

15

• Phản ứng với thuốc thử Bouchardat:

Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat Không thấy xuất hiện tủa màu nâu (phản ứng âm tính)

Sơ bộ kết luận trong dược liệu không có Alcaloid.

Nhân xét và sơ bỏ kết luân:

- Các phản ứng: với thuốc thử Legal trong định tính Glycosid tim, với kiềm trong định tính Flavonoid, với dung dịch sắt (III) clorid trong định tính Flavonoid và Tanin đều dương tính, song chúng tồi vẫn sơ bộ kết luận không

, có những hợp chất này trong dược liệu,vì những phản ứng đặc trưng của chúng

âm tính

- Qua kết quả của các phản ứng hoá học đặc trưng cho từng nhóm chất trên đây, chúng tôi sơ bộ kết luận trong quả bạch chỉ có Coumarin, Phytosterol, chất béo, Caroten, acid hữu cơ, trong đó có thể coi Coumarin là thành phần hoá học chính.Không có: Flavonoid, Glycosid tim, Saponin, Tanin, alcaloid, acid amin, đường khử

Kết quả được ghi ở bảng 2:

Bảng 2 : Kết quả định tính các hợp chất tự nhiên trong Quả bach chỉ

Hợp chất Các phản ứng định tính Kết qủa Kết luậnPhytosterol Phản ứng với HoS04 đặc ++ CóGlycosid Phản ứng Baljet -

tim Phản ứng Legal ++

Phản ứng Liberman-Bouchardat - Không cóAlcaloid Phản ứng với thuốc thử Dragendorff -

Phản ứng với thuốc thử Mayer

-Phản ứng với thuốc thử Bouchardat - Không cóTanin Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% +

Phản ứng với dung dịch gelatin 1 % - Không cóAcid hữu cơ Phản ứng với Na2C 03 + CóSaponin Quan sát hiện tượng tạo bọt - Không có

Quan sát hiện tượng phá huyết - Không cóChất béo Vết dầu để lại trên giấy lọc + CóCaroten Phản ứng với H2S04 đặc + CóĐường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling - Không cóAcid amin Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin - Không có

Flavonoid Phản ứng với kiềm ++

Phản ứng với dung dịch FeCl-Ị 5% ++

Phản ứng Cyanidin - Không cóCoumarin Phán ứng mở và đóng vòng ỉacton +++

Phản ứng ghép đôi với muối Diazoni +++

Hiện tượng huỳnh quang tăng lên khi cho +++