PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỂ Một nhà bác học Pháp đã từng nói: Trong 100 con vi sinh vật thì cố tới 99 cọn có lợi và chỉ có một con là có hại”. Thế nhưng con người cũng chỉ mới phát hiện ra mặt có lợi của một số ít vi sinh vật trong vô số vi sinh vật có trong tự nhiên. Vì vậy, việc khai thác tiềm năng sẵn có trong giới vi sinh vật nhằm phát huy mặt có lợi của vi sinh vật phục vụ sức khoẻ con người là nhiệm vụ của các nhà khoa học. Ngày nay, mặc dù với sự phát triển của khoa học, nhiều chất kháng sinh được tạo thành từ con đường tổng hợp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn được thế giới quan tâm. ở Việt nam do điều kiện khí hậu nóng ẩm đã tạo nên một quần thể vi sinh vật sống trong đất rất phong phú, nhiều loại xạ khuẩn (Actinomycetes) sinh kháng sỉnh, trong số đó phải kể đến chi Micromonospora. Các nhà nghiên cứu Việt Nam đã phân lập được một số chủng Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có hoạt phổ rộng. Để tiếp tục công trình này chúng tôi đã lựa chọn đề tài: Nghiên cứu cải tạo giống và phát triển công nghệ lên men kháng sinh nhờ chủng Micromonospora N°9với những mục tiêu cụ thể sau: Tiếp tục nghiên cứu cải tạo giống bằng đột biến kết hợp với sàng lọc nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Micromonospora N°9. Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh trên qui mô phòng thí nghiệm với các biến chủng đã được tuyển chọn. Tìm hiểu sơ bộ về thành phần các chất kháng sinh của Micromonospora N°9 và tiếp tục hoàn thiện qui trình chiết xuất tinh chế trên qui mô phòng thí nghiệm.
Trang 1BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
-fix'ty
-s v NGUYỄN THỊ HƯƠNG
NGHIÊN CỨU CẢI TẠO GIỐNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH NHỜ CHỦNG MICROMONOSPORA N°9(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1996 - 2001)
Người hướng đẫn : TS Cao Vần Thu
Th.S.Kiều ThịTIỒng Nơi thực hiện : Bộ môn Công nghiệp dược
Trường đại học Dược Hà nội Thời gian thực hiện : 1/03 - 20/05/2001 ’
Trang 2MỤC LỤC
PHẦN I - ĐẶT VẤN Đ Ể 1
PHẦN II - TỔNG QUAN 2
2.1- Đại cương về Micromonospora 2
2.1.1 Đặc điểm sinh thái của Micromonospora 2
2.1.2 Đặc điểm hình thái của Micromonospora 2
2.1.3 Đặc diểm sinh lý của Micromonospora 2
2.1.4 Sự tạo thành sắc tố của Micromonospora 3
2.1.5 Sự tạo thành kháng sinh của Micromonospora 3
2.2- Cải tạo, chọn giống vi sinh vật .4
2.2.1 Đại cương về cải tạo chọn giống vi sinh vật sinh kháng sinh 4
2.2.2 Đột biến bằng tia u v 5
2.2.3 Chọn giống bậc thang 6
2.3- Lên men sinh tổng hợp kháng s in h 7
2.3.1 Lên men bề m ặt 7
2.3.3 Lên men chìm i.' 7
2.4 Chiết tách và tinh c h ế 8
2.4.1 Chiết suất bằng dung môi hữu c ơ 8
2.4.2 Sử dụng nhựa trao đổi ion và sắc k ý 9
2.5.Các nghiên cứu mới nhất về kháng sinh 10
2.5.1 Sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm-bafilomycin B] và C| từ Streptomyces halstedii K I2 2 1 0 2.5.2 Microcin J25 từ Escherichia coli ức chế sự phát triển của Salmonella enteritidis 11 PHẦN III - THỤC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 12
3.1- Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 12
3.1.1 Nguyên liệu 12
Trang 33.1.2 Phương pháp nghiên c ứ u 14
3.2- Kết quả và nhận x é t 18
.3.2.1 Các kết quả cải tạo giống 18
3.2.2 Kết quả chiết xuất và tinh c h ế 31
PHẦN IV- KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT r 34
4.1- Sau thòi gian thực nghiệm chúng tôi đã có một số kết lu ận 35
4.2- Ý kiến đề xuất 35
Trang 4Ẩ l ơ i a d m ơ n
(Dối lỏn (Ị Uíttlt trong, t)(i biíí ổn ÌÂIL sẨe, tô i x ỉu ĩừiụ tẻ- lổ ỉ eảiit útì tố i ỉíttỈỊỊ qìấ 0 ’S' (Qao (Văn ^7hu, C7/t.(S 3Cit’ii CJhi 'Jôfíỉigf đ ầ e biít thầỊỊ ạiâtì CĩcS (Qílô ^Oêiĩ rĩliu - n ạ i ứ'ỉ ỉtê tậ n tìn h giúp, (tở chỉ tìtío cho tô i trong, liLÔt tfajồ'i lỊỈan tíuủi ítiỉit, Ultoó lu đn n ă y
(Dềttạ th ề i tồ i eũiìíỊ ddtL ch đn th ă n h c ẩ m ổn (£<$• \7<$. Ỡ t t ’
Jiluili 3 CúÓiỉ(ị f eắe th a ụ g ì â ú th u ộc hồ rnềti (dồng, n tịiiìíp tltùíe eătiq tíìăíi th ề eâe bí íttđti eâe p h ò n g ban ehửe n ả í Kị trtìn ạ to ă n ită ề tìạ oă eâe han sình o ìỉn đ ê Iiítỉíỉ tilth (ỊÌúp đ&, tạ o đ iề u Uiíti Ỉỉitiùn ỉ fit (‘h o tồ i h oăn th ă n h Ulĩúâ lu ậ n đuttíL th ă i h ạ n • • • • •
nồi, n g ă ụ 2 0 tíiâtĩ(Ị 05 m ĩm 2 0 0 1
S in h ũiỉbn thtừ‘ ítiítt (ìỉạ iiụ ễit £77* /
Trang 5PHẦN I - ĐẶT VẤN ĐỂ
Một nhà bác học Pháp đã từng nói: " Trong 100 con vi sinh vật thì cố tới 99 cọn
có lợi và chỉ có một con là có hại”. Thế nhưng con người cũng chỉ mới phát hiện ra mặt
có lợi của một số ít vi sinh vật trong vô số vi sinh vật có trong tự nhiên Vì vậy, việc khai thác tiềm năng sẵn có trong giới vi sinh vật nhằm phát huy mặt có lợi của vi sinh vật phục vụ sức khoẻ con người là nhiệm vụ của các nhà khoa học
Ngày nay, mặc dù với sự phát triển của khoa học, nhiều chất kháng sinh được tạo thành từ con đường tổng hợp hoặc bán tổng hợp nhưng việc tìm ra các chất kháng sinh mới có nguồn gốc vi sinh vật vẫn được thế giới quan tâm
ở Việt nam do điều kiện khí hậu nóng ẩm đã tạo nên một quần thể vi sinh vật sống trong đất rất phong phú, nhiều loại xạ khuẩn (Actinomycetes) sinh kháng sỉnh, trong số đó phải kể đến chi Micromonospora Các nhà nghiên cứu Việt Nam đã phân lập được một số chủng Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có hoạt phổ rộng Để tiếp tục công trình này chúng tôi đã lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu cải tạo
giống và phát triển công nghệ lên men kháng sinh nhờ chủng Micromonospora
N°9" với những mục tiêu cụ thể sau:
- Tiếp tục nghiên cứu cải tạo giống bằng đột biến kết hợp với sàng lọc nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Micromonospora N°9
- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh trên qui mô phòng thí nghiệm với các biến chủng đã được tuyển chọn
- Tìm hiểu sơ bộ về thành phần các chất kháng sinh của Micromonospora N°9 và tiếp tục hoàn thiện qui trình chiết xuất - tinh chế trên qui mô phòng thí nghiệm
Trang 6PHẦN II - TỔNG QUAN
2.1- ĐẠI CƯƠNG VỂ MICROMONOSPORA [3,9]
2.1.1 Đặc điểm sinh thái của Micromonospora
Micromonospora là một chi thuộc lớp xạ khuẩn Actinomycetes phân bố khá phổ biến trong tự nhiên như đất, nước, đất bùn, bùn cát, Theo Zsuzsa, trong đất miền núi
tỷ lệ Micromonospora là 2,6%, trong đất trồng lúa là 14%, trong đất than bùn là 27% - 60% so với Actinomycetes Còn theo Tibelar và Vruggih từ mẫu đất ruộng sâu khi phân lập chỉ có khuẩn lạc Micromonospora
2.1.2 Đặc điểm hình thái của Micromonospora
Đa số các Micromonospora chỉ có khuẩn ty cơ chất phân nhánh, không hình thành khuẩn ty khí sinh Đường kính khuẩn ty khoảng từ 0,4 - 0,8 p.m khi chưa hình thành bào tử bề mặt khuẩn lạc có màu vàng sáng đến da cam hay nâu đỏ Khi bào tử xuất hiện bề mặt khuẩn lạc sẽ trở nên sẫm mầu có thể từ nâu tối đến sẫm đen, bào tử Micromonospora xuất hiện cả trong nuôi cấy chìm và nuôi cấy trên bề mặt môi trường thạch đặc Bào tử có thể hình tròn, hình oval hay hình dạng khác, có thể nẩm trên cuống sinh bào tử hoặc không có cuống Cuống bào tử có hai dạng chính: dạng đơn độc (monopođial) và dạng chùm (sympodial) Bề mặt bào tử có thể nhẵn, có gai hay xù xì
2.1.3 Đặc diểm sinh lý của Micromonospora
Tồn tại nhiều trong đất, nước Micromonospora có vai trò vô cơ hoá các nguyên liệu hữu cơ trong quá trình mùn hoá Ngoài ra Micromonospora còn có thể phân huỷ cellulose, peptid, kitin, xylan, lignin, casein, tinh b ộ t
Micromonospora phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 6 - 45°c, trên 50°c tất cả các loài Micromonospora đều không phát triển được và khoảng nhiệt độ phát triển tốt nhất
Trang 7là từ 20- 40°c Bào tử Micromonospora khá bền với nhiệt độ và dung môi hữu cơ Bào
tử của trên 50% số chủng loại có thể chịu được nhiệt độ 60°c trong 20 phút Trong dung môi hữu cơ với nồng độ không quá 80% bào tử vẫn có thể sống sót, bào tử tồn tại tốt trong pH từ 6 - 8 nhưng khi quá acid thì thường bị mẫn cảm Là vi khuẩn Gram (+), không ưa acid Micromonospora có thành tế bào kiểu II với thành phần chính là acid meso-diaminopimelic và glycin Thành phần đường xylose, arabinose còn glucose, maltose,galactose thì khác nhau đối với mỗi loài
2.1.4 Sự tạo thành sắc tô của Micromonospora
Ngoài sắc tố cơ chất màu vàng da cam Micromonospora còn tạo sắc tố hoà tan với các màu sắc khác nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau ở những loài khác nhau Sắc tố này gắn với một loài nhất định nên đây là một trong những tiêu chuẩn, quan trọng đùng để xác định loài Micromonospora Ví dụ các sắc tố hoà tan màu vàng
là đặc trưng của loài M.chalcea, M fusca được đặc trưng bằng các sắc tố khuyếch tán màu nâu sẫm, còn các sắc tô' bám trên hệ sợi màu nâu sẫm thường được coi là các đơn
vị nhận biết của M.purpurea và M.echimospora
2.1.5 Sự tạo thành kháng sinh của Micromonospora
Micromonospora là một chi có khả năng tạo kháng sinh khá phong phú với nhiều loại kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau: aminosid, macrolid, polipeptid, ansamycin
Một số kháng sinh quan trọng tạo ra từ Micromonospora đã được phát hiện, nghiên cứu và nhiều chất được ứng dụng trong y học gồm:
♦ Kháng sinh aininosid
+ Gentamicin là một kháng sinh được ứng dụng rộng rãi, sản xuất từ M echimospora và M.purpurea (Weinstein và cộng sự 1963, Lucđemen và Brodsky 1964)
Trang 8+ Sisómicin sản xuất từ M.inyoensis (Weinstein và cộng sự, 1970).
+ Neomicin - B sản xuất từ M.sp 69-683 (Wagman và cộng sự, 1973)
+ Fortimicin A và B sản xuất từ M.olivoasterospora (Naro và cộng sự, 1977, Kwamoto và công sự, 1983)
♦ Kháng sinh nhóm Macrolid
+ Magalomicin do M megalomycea (Weinstein và cộng sự 1969)
+Rososamicin do M.rosaria (Wagman và cộng sự, 1972)-
+ Rifamicin sản xuất từ M.ellipsospora
2.2- CẢI TẠO, CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT [1,2,3,9,11,13]
2.2.1 Đại cương về cải tạo chọn giống vi sinh vật sinh kháng sinh
Trong thực tế hiếm khi có thể phân lập từ tự nhiên một chủng vi sinh vật có khả năng tạo kháng sinh với hàm lượng cao nhằm đưa vào công nghiệp sản xuất Do đó cần phải cải tạo, sàng lọc những chủng mới có sản lượng cao thuận lợi trong quá trình sản xuất từ khâu lên men đến chiết tách, tinh chế sản phẩm
Trang 9Chọn giống dựa vào hai cơ chế làm thay đổi thông tin di truyền:
- Một cơ chế liên quan đến sự phát sinh đột biến, ứng dụng tiến hành chọn giống bằng đột biến gây tạo kết hợp với sàng lọc
- Một cơ chế liên quan đến tái tổ hợp di truyền ứng dụng tiến hành chọn giống bằng phương pháp lai tạo tái tổ hợp
Dạng đột biến quan trọng nhất trong cải tạo giống vi sinh vật là biến đổi trình tự sắp xếp các base trong ADN hay thêm bớt các cặp base trong ADN Có hai loại đột biến:
- Đột biến tự phát: Là những thể đột biến phát sinh không có sự can thiệp của các tác nhân đột biến
- Đột biến gây tạo: Là những đột biến được tạo ra bởi các tác nhân đột biến Tác nhân đột biến có thể là vật lý, hoá học hay sinh học
+ Tác nhân vật lý như: Tia y , tia rơngen , tia ƯV
+ Tác nhân hoá học: N - mustar, etylenimin, H N 02, Nitroguanidin
+ Tác nhân sinh học: đột biến do hiện tượng thiếu các base ĩíitơ hay do tác động của các gen gây đột biến
Tia u v là những bức xạ nhìn thấy được có bựớc sóng >.=3900A° - 13ỐA0, khả năng đâm xuyên kém, tuy nhiên với những tế bào vi sinh vật có kích thước nhỏ (0,3 - 3|im) thì nó có thể đâm xuyên tới nhân nên được dùng rộng rãi trong đột biến Tác dụng của tia u v chủ yếu trên acid nucleic và mạnh nhất ở bước sóng 260nm
Trang 10Cơ chế gây đột biến của tia tử ngoại ở mức độ phân tử: Khi chiếu tia u v với liều lượng cao làm đứt các liên kết hydro trong mạch kép DNA của tế bào vi sinh vật dẫn đến hiện tượng dime hoá thymin Ở đây hai thymin gần nhau được liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử c5 và c 6 Hậu quả là sao chép bị sai lầm vì DNA - polymerase
dễ lắp một nucleotid vào vị trí trên Do tác dụng của tia u v trên sợi DNA cũng xuấthiện một dimepyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4 ở đây c6 của pyrimidin 5' ( timin hoặc cytozin) được liên kết với c4 của pyrimidin 3' ( thường là cytozin) Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi tia u v
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả gây chết và đột biến của tia ƯV
s&ng
- Ánh sáng thường: Khi dịch bào tử đã chiếu tia ƯV để nơi ấntí'thường thì độ sống sót của bào tử sẽ tăng lên so với khi để trong bóng tối Hiện tượng này gọi là sửa chữa hoạt quang
- Liều lượng chiếu được đặc trưng bởi: Thời gian chiếu-, khoảng cách chiếu và độ pha loãng bào tử/có ảnh hưỏng tới chiều hướng của đột biến âm hay dương, ở liều lượng chiếu cho độ sống sót từ 0 , 1 - 1% thường xuất hiện đột biến dương, đột biến âm thường xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hơn
- Ngoài ra pH, nhiệt độ, thành phần môi trường, trạng thái sinh lý của bào tử cũng ảnh hưởng tới hiệu quả của việc chiếu tia u v
2.2.3 Chọn giống bậc thang
Đây là phương pháp chọn giống bằng sử dụng các tác nhân đột biến kết hợp với sàng lọc Trong thực tế dể thu được một đột biến gen thực thụ trong chốc lát là khó khăn, đo vậy việc nâng cao các hoạt tính của các chủng thường được thực hiện bằng cách tích luỹ các đột biến nhỏ qua từng bậc chọn lọc
Trang 112.3- LÊN MEN SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH [9,11,14]
Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh quá trình lên men có ảnh hưỏng quyết định đến hiệu quả của quá trình sản xuất Nếu đạt được các điều kiện tối ưu hiệu suất của chủng có thể tăng từ 2-3ỉần
C(3 hai kiểu lên men chính:
2.3.1 Lên men bề mặt
Vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt của môi trường rắn hay lỏng và chúng hấp
th ụ các chất dinh dưỡng của môi trường, sử dụng õxy không khí để hô hấp, do đó yêu cầu là bề mặt môi trường phải đủ rộng và lớp môi trường không quá sâu (5-10cm)
*
Lên men bề mặt có ưu điểm là dễ thực hiện, đơn giản, đầu tư thấp, tuy nhiên có nhược điểm là: hiệu suất thấp, đòi hỏi diện tích rộng, khó tự động và cơ giới hoá nên ngày nay chỉ áp dụng cho nghiên cứu cải tạo giống trong phòng thí nghiệm
2.3.3 Lên men chìm
Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng và phát triển trong không gian
ba chiều Giống cho lên men được tạo ra qua các cấp nhân giống khác nhau: giống cấp
I, giống cấp II, giống cấp I I I
Thời gian kết thúc lên men tuỳ thuộc vào khoảng thời gian sản phẩm được tạo ra
và có sự khác nhau giữa các chủng
Lên men chìm có ưu điểm là sử dụng triệt để môi trường dinh dưỡng, hiệu suất lên men cao, tiết kiệm mặt bằng sản xuất, dễ cơ giới và tự động hoá các thiết bị vì thế nên ngày nay được ứng dụng rộng rãi
Có nhiều phương pháp lên men chìm: lên men gián đoạn, lên men liên tục, lên
Trang 12men bán liên tục Tuy nhiên, trong khoá luận tốt nghiệp - ' - T này chúng tôi chỉ
sử dụng phương pháp lên men gián đoạn
Lên men gián đoạn còn gọi là lên men mẻ hoạt động như một hệ thống kín Trong suốt quá trình lên men không có bất cứ một tác động bổ sung nào vào hệ thống ngoại trừ việc thông khí, đùng dung dịch điều chỉnh pH, chất phá bọt Vi sinh vật sẽ phát triển qua 4 giai đoạn gọi là 4 pha: pha lag (pha tiềm tàng), pha log (pha luỹ thừa), pha dừng (pha ổn định), pha suy tàn Các kháng sinh (sản phẩm trao đổi chất thứ cấp) thường được tạo ra trong pha dừng và pha suy tàn nên lên men kháng sinh thường kéo dài Trong sản xuất cũng có khi kết thúc lên men khi quá trình sinh tổng hợp kháng sinh chưa dừng nhưng đã chậm lại, không còn kinh tế nữa
2.4 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ [6,9,11]
Lượng kháng sinh trong dịch lên men ban đầu thường thấp (100 -200|ig/ml) mặt khác sản phẩm cuối cùng không phải là một chất mà là hỗn hợp Bởi vậy sau khi kết thúc lên men, môi trường lên men được xử lý và chuyển sang giai đoạn chiết tách - tinh chế
Thao tác cơ bản đầu tiên là tách sinh khối ra khỏi môi trường lên men, công việc tiếp theo tuỳ thuộc vào lý- hoá tính của sản phẩm cần chiết tách* Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp tách như: lọc, chiết, hấp phụ, sắc ký, kết tủ a
2.4.1 Chiết xuất bằng dung môi hữu cơ
Sau khi đã lọc loại sinh khối khỏi dịch lên men nếu sản phẩm là kháng sinh ngoại bào hoặc loại bỏ dịch nếu là kháng sinh nội bào Khi chiết xuất kháng sinh từ dịch lên men người ta dựa vào sự phân bố chất kháng sinh giữa hai pha lỏng/lỏng không đồng tan với nhau là dung môi chiết và dịch lên men ở pH thích hợp bằng một số
Trang 13phương cách như: chiết đơn (chiết một lần), chiết lặp (chiết nhiều lần), chiết ngược dòng
2.4.2 Sử dụng nhựa trao đổi ion và sắc ký
Trong trường hợp kháng sinh không chiết được bằng dung môi hoặc dung môi được dùng có tính chọn lọc thấp thì việc áp dụng các phương pháp trao đổi ion và sắc
ký là khá cần thiết để thu được chất kháng sinh có độ tinh khiết cao
♦ Trao đổi ion
Đối với các kháng sinh aminoglycosid hoặc mộí số kháng sinh peptid có thể sử dụng các loại nhựa trao đổi Cation axit yếu (chứa nhóm Carboxy hoạt động) để hấp phụ kháng sinh từ dịch lên men Còn đối với các chất kháng sinh là các chất lưỡng tính có' thể sử dụng nhựa trao đổi Cation nhóm axit mạnh (nhóm R- S 0 3H ) để hấpphụ kháng sinh Sau khi phản hấp phụ kháng sinh sẽ được tinh chế tiếp
♦ Sắc ký cột
Là phương pháp sắc ký được tiến hành trên những cột thuỷ tinh có đường kính từ l-5cm, dài 10-100cm có chứa các hoạt chất nhồi (pha tĩnh) đường kính 50 -200|im Các chất nhồi hay dùng cũng tương tự sắc ký lớp mỏng (silicagel, nhôm oxid, kigengua, thạch cao, cellulose, bột poliamid, các ionid, sephađex .) chỉ khác là lớn hơn về kích thước Trong qúa trình sắc ký, hỗn hợp cần tách đưa lên cột và cho dung môi chạy qua cột để tách riêng từng thành phần Thường dùng sắc ký lớp mỏng để phát hiện phân đoạn chính chứa chất cần tinh chế
♦ Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Đây là phương pháp hiện đại được sử dụng khá nhiều trong nghiên cứu kháng sinh trong những năm gần đây Chất nhồi trong HPLC là các hạt cỡ 5-10|im (cột dài)
Trang 14và 3-5^im (cột ngắn) Thường dùng silicagel, nhôm oxyd, polime xốp, chất trao đổi ion
Ưu điểm chính của HPLC là ngoài khả năng tách tốt hơn còn có detector: một bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho tín hiệu ghi trên sắc đổ.
Ngoài các phương pháp trên còn có thể sử đụng chất tạo tủa để tách kháng sinh
ra khỏi dịch lên men và đem tiến hành tinh chế tiếp.
2.5.1 Sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm-baniomycin Bị và Cj từ Streptomyces halstediỉ K122 [ 15 ]
Trước đây người ta đã biết s halstedii K I22 sinh ra các hợp chất kháng nấm trên môi trường rắn mà các hợp chất này có tác đụng ức chế sự phát triển của các nấm: Ascomycetes, Basidiomycetes và ảnh hưởng đến sự phân nhánh, hình thái học của chúng Hoạt tính kháng nấm của s halstedii K122 không được phát hiện khi nuôi cấy chìm Tuy nhiên trong các bình Falcon(kiểu bình Rhou)chứa môi trường nuôi cấy có bề mặt rộng, lờp môi trường đày lmm thì s halstedii K I2 2 phát triển mạnh, sinh bào tử và các hợp chất có hoạt tính sinh học chiết được ra từ sợi nấm bằng metanol và tinh chế bằng phương pháp chiết pha rắn trên cột C18 EC với hệ dung môi metanol: H20 (7:3), dung môi rửa giải là metanol: HjO (8:2) Nhằm thu được sản phẩm tinh khiết hơn sử dụng cột silicagel 40x1 cm ( silicagel 60, 40-63 um, Merk) để tinh chế tiếp phần dịch đã được cô từ cột C18 bằng cách hoà tan trong pha động cloroform: metanol: H20 (30:10:1), sau đó tiến hành chạy sắc ký rửa giải Các hợp chất được xác định là bafilomycin B| và C|, sử đụng 2D NMR ( phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân)
và FAB MS (phương pháp phổ khối FAB), s halstedii sinh ra bafilomycine,
những chất ức chế ATPase ở trong bào tương, trước đây chưa được biết đến
Bafilomycin B| và C ị có hoạt tính chống nấm trong các test là tương đương nhau
Trang 15với giá trị MIC trong khoảng < 0,5 — 64 p-g.ml'' Tất cả các nấm đều nhạy cảm hơn
với cả hai bafilomacin B| và Cj ở pH 7,0 và pH 5,5.
2.5.2 Microcin J25 từ Escherichia coli ức chế sự phát triển của Salmonella enteritidis[16]
Trong số các chủng được phân tách từ ruột gia cầm, gia sức sản sinh ra microcin
có hoạt tính ức chế Sal.enteritidis gây bệnh đường ruột thì hai chủng J02, J03 có hoạt tính lớn nhất Các phép thử sinh học và tinh khiết đã xác định được hợp chất đối kháng sinh tổng hợp ra là microcin J25 Để đánh giá khả năng bảo vệ của E.coli đối với việc nhiễm Sal.enteritỉdis người ta đã nghiên cứu khả năng của các chỏng này ức chế sự phát triển của Sal.enteritidis trong nuồi cấy hỗn hợp Hoạt tính đối kháng mạnh xuất hiện ở pha tiền nuôi cấy của chủng E.coii trong môi trường nuôi cấy tối thiểu trước khi cấy Saỉ.enteritidis Trong một bình lên men có chứa môi trường giống môi trường dạ dày, ruột gà thì hỗn hợp hai chủng E.coli J02- J03 đã cho tác đụng ức chế rất mạnh Hoạt tính của microcin J25 không bị ảnh hường bởi mật, enzym tuỵ hoặc môi trường axid Những kết quả này cho thấy rằng các chủng sinh tổng hợp ra microcin có vai trò thích hợp trong mỏi trường đạ dày, ruột và có tác đụng bảo vệ chống lại sự phát triển của Sal.enteritidis trong đạ dày, ruột.
Trang 16PHẦN III - THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
3.1.1 Nguyên liệu
♦ Giống xạ khuẩn: Micromonospora
Chủng Micromonospora N°9 được phân lập từ cơ chất ở Việt Nam có độ ổn định sinh học cao, có khả năng sinh tổng hợp khánh sinh, có hoạt phổ rộng, phát triển tốt trên môi trường Gauze 1, đã qua một số lần đột biến do phòng thí nghiệm Vi sinhv- Kháng sinh, bộ môn Công nghiệp dược và Tổ môn Vi nấm kháng sinh Trường đại học Dược Hà Nội cung cấp
♦ Chủng vi sinh vật kỉểin định
Hai chủng vi sinh vật có độ mẫn cảm cao với kháng sinh từ Micromonospora N°9 được dùng làm vi sinh vật kiểm định là: Bacillus pumillus ATCC 10241 (G+ ) và Escherichia coli ATCC 25922 ( G ')
♦ Các môi trường đã sử dụng
+ Môi trường Gauze 1 (MT1): Tinh bột 20g; K2H P04 0,5g; M gS04.7H20 0,5g; NaCl: 0,5g; K N 03 lg; FeS04.7H20 lOmg; thạch 18g; nước máy vđ: lOOOmỊípH 7,0 -i- 7,2; tiệt trùng ở 1 att/ 30 phút
+ Môi trường Gauze 1 lỏng (MT2): Tinh bột 20g; K2H P04 0,5g; M gS04.7H20 0,5g; NaCl: 0,5g; K N 03 lg; FeS04.7H20 lOmg; nước máy vđ: lOOOmỊ; pH 7,0 -ỉ- 7,2; tiệt trùng ở 1 att/ 30 phút
Trang 17+ Môi trưòmg lên men tối ưu I ( MT3): Tinh bột 30,4g, K2HP04 l,5g, MgS04.7H20 0,5g; NaCl: 0,5g; KNO3 3,3g; FeS04.7H20 lOmg; nước máy vđ: 1000ml pH 7,0 -4- 7,2; tiệt trùng ở 1 att/ 30 phút.
+ Môi trường lên men tối ưu II ( MT4): Tinh bột 54,Og, K2HPO4 2,8g, MgS04.7H20 0,5g; NaCl: 0,5g; KNO3 2,0g; FeS04.7H20 lOmg; nước máy vđ: 1000ml pH 7,0 4- 7,2; tiệt trùng ở 1 att/ 30 phút.
+ Môi trường thạch thường ( MT5): pepton 5g, NaCl 5g, cao thịt 6g; thạch 18g, pH 7,0
+ Môi trường canh thang: (MT6): pepton 5g, NaCl 5g, cao thịt 6g; pH 7,0 4-7,2, tiệt
♦ Các dung môi đã sử dụng
+ Dung môi chiết: cloroform ( đ= 1,475 - 1,471, t°s = 60-62°C)
+ Dung mội chạy sắc ký: Aceton, n - butanol, metanol, etanol, cloroform, butylacetat,
NH4OH 25%.
♦ Tác nhân đột biến: tia u v với nguồn phát là đèn tử ngoại toshiba.
♦ Nguyên liệu dùng cho sắc ký
+ Bản mỏng sắc ký tráng sẵn silicagel 60 F254 ( Merck).
+ Silicagel, Kieselgel ( 0,05 - 0,2 mm ) Merck AG Germany nhồi cột sắc ký.
♦ Một số dụng cụ thiết bị đã sử dụng
Trang 18Máy lắc tròn 250 -300 vòng/phút ( Việt Nam), tủ cấy vô trùng Sanyo clean bench, kính hiển vi quang học A kruss optronic Hamburg Germany, cân phân tích Sartorius, nồi hấp Hirayama HL 3030e Japan, tủ ấm Đức, tủ sấy Hung, máy đo pH Mettler Toledo MP 220 pH Meter.
3.1.2 Phương pháp nghiên cứu [6,8,10]
♦ Phương pháp cải tạo giống: Cải tạo giống bằng phương pháp đột biến kết hợp với
sàng lọc ngẫu nhiên sau đột biến
+ Phương pháp gây đột biến bằng tia u v
- Pha hỗn hợp dịch bào tử: Dùng que cấy vô trùng lấy 1 vòng que cấy bào tử Micromonospora N°9 cho vào 10ml nước muối đẳng trương vô trùng lắc cho bào tử phân tán đều Dùng 9ml hỗn hợp dịch bào tử này cho vào một đĩa petri vô trùng
- Chiếu tia UV: Đĩa petri chứa hỗn hợp dịch bào tử đem chiếu tia uv với liều lượng xác định Để đĩa petri chứa hỗn hợp dịch bào tử sau chiếu tia ƯV vào chỗ tối 2-4giờ, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 1 0 '5 '
- Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào
tử ở các độ pha loãng 10 '4, 10 ' 5 nhỏ vào bề mặt môi trường Gauze 1 trong đĩa petri, dàn đều bằng que trang Mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa Tiến hành tương tự với mẫu chứng
ở nồng độ 10 '6 Các đĩa petri sau cấy được ủ ở nhiệt độ 30 -32° trong 6 -ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc Đếm số khuẩn lạc để xác định % độ sống sót theo công thức:
ũ i
N0
Với N j là số khuẩn lạc trung bình sau đột biến ,
N 0\h số khuẩn lạc trung bình trong mẫu chứng
Trang 19Với D j là đường kính trung bình vòng vô khu In của biến chủng.
D0 là đường kính trung bình vòng vô khuẩn của chủng chứng,
Dựa vào kết quả thu được lựa chọn ra các biến chủng có % biến đồi hoạt tính dương cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp tfoeo
♦ Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh
Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp khu^ếch tán với 3 cách khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu cần thử: khoanh giấy lọc, đụ-.; lỗ thạch hay khối thạch: trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định ta cho mẫu thử vào theo các cách phù hợp rồi đặt vào tủ ấm cho vi sinh vật kiểm định phát triển ( 24h), rong thời gian nuôi cấy kháng sinh sẽ khuyếch tán trên lớp thạch ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành các vòng vô khuẩn
Đánh giá kết quả: đo vòng vô khuẩn bằíig thước panmer có độ chính xác
0 ,0 2 mm, kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê.
Trang 20♦ Phương pháp lên men: ứng dụng phương pháp lên men gián đoạn
Các bước tiến hành:
- Tạo giôhg cấp ĩ. Chủng Micromonospora N°9 sau khi đã cấy vào ống thạch nghiêng
và phát triển đủ 6 ngày tuổi được cấy vào bình nón 500ml chứa 100ml môi trường Gauze llỏng qua 10ml nước cất vô trùng và đem lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 30 - 32°c tốc độ 250 - 300 vòng /phút trong 48giờ
- Lên men: Giống cấp I được cấy vào bình nón 500ml chứa 100ml môi trường lên men tối ưu với tỷ lệ V giống/v môi trường = 1/10 Mỗi bình giống cấy ra 3 - 7 bình lên men Các bình lên men lắc ờ 30 -32°c với tốc độ 250 -300 vòng/phút trên máy tròn trong
1 2 0giờ
♦ Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữii cơ:
Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được lọc loại bỏ sinh khối, phần dịch lọc được chỉnh về pH thích hợp và tiến hành chiết trong bình gạn theo phương pháp chiết nhiều lần: Dịch lọc đã chỉnh pH =11 cho vào bình gạn'cùng với dung môi theo tỷ lệ Vdung môi/v dịch lọc = 1/15 Lắc 1 phút, để phân lớp lh rồi gạn lấy dung môi Làm tiếp hai lần nữa với cùng thể tích dung môi như trên Kiểm tra hiệu quả của quá trình chiết bằng cách thử hoạt tính kháng sinh của 2 pha
♦ Phương pháp sắc ký
ứng dụng hai phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột+ Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng sắc ký được cắt cho kích thước phù hợp đem hoạt hoá
ở 1 1 0 °c trong lh
Trang 21Dung môi chạy sắc ký là những dung môi tinh khiết pha theo đúng tỷ lệ và cho vào bình sắc ký với lượng vừa đủ sao cho chiều dày lớp dung môi không quá lcm Dùng giấy lọc lót phía trong thành bình để bão hoà dung môi được nhanh hơn.
Chấm dung dịch chứa hoạt chất cần sắc ký lên bản mỏng cách mép dưới l,5cm.Tuỳ theo mức độ đậm đặc của mẫu thử mà có số lần chấm nhiều hay ít Sấy nhẹ bản mỏng cho khô Đặt bản mỏng đã chấm mẫu thử vào bình sắc ký cho dung môi chạy hết khoảng 3/4 bản mỏng thì lấy ra đánh đấu vết dung môi chạy (Ddm) Sấy nhẹ bản mỏng cho khô rồi đem xác định vết bằng đèn tử ngoại: vết chất thử có màu tím trên nền huỳnh quang sáng hoặc bằng phương pháp hiện hình vi sinh vật : đặt bản mỏng đã chạy và sấy khô vào một đĩa petri vô trùng, đổ môi trường thạch thường đã cấy vi sinh vật kiểm định phủ lên bề mặt bản mỏng, ủ ở 37°c trong 24h quanh vết thử sẽ xuất hiện vòng vô khuẩn nếu chất thử là kháng sinh Đo khoảng cách từ điểm xuất phát đến điễm chạy của các vết (Dv) Rf được tính theo công thức:
Ddm+ Sắc ký cột: Chạy sắc ký cột nhằm tách riêng các thành phần sau khi đã xác định sơ
bộ bằng sắc ký lớp mỏng Quá trình tiến hành như sau:
- Chuẩn bị cột: Cột sắc ký đường kính l,2 cm, chiều dài 50cm, chiều cao lớp chất nhồi
là 25cm Chất nhồi được dùng là silicagel Sau khi đã hoạt hoá ở 110°c/lh được hoà thành hỗn dịch với dung môi chạy rồi đưa lên cột, cho đung môi chảy qua cột trong 2
giờ để ổn định cột
- Cho mẫu thử lên cột dung dịch mẫu thử được cô đặc rồi trộn với một lượng nhỏ silicagel đã hoạt hoá, bốc hơi nhẹ ở nhiệt độ thấp hết dung môi, đưa phần silicagel này'4lên cột trong hệ dung môi thích hợp đã pha đúng tỷ lệ chảy qua cột với tốc độ 0,5ml/phút Dịch chảy qua được hứng vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống 2ml, phát
Dv
