Định lượng sabutamol, guaifenesin, bromhexin hydroclorid trong viên nén ascorin (ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẶT VẤN ĐỂ Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ngày càng tăng. Do vậy, thuốc đa thành phần ngày càng trở nên phổ biến, nhằm kết hợp tác dụng điều trị và thuận tiện hơn cho người sử dụng. Tuy nhiên, trong các dược điển hiện hành của nhiều nước chủ yếu chỉ có các chuyên luận cho các thuốc chứa một thành phần. Chính vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng thuốc có nhiều thành phần là rất cần thiết. Ascorin, một chế phẩm của hãng GLENMARK PHARMA (Ấn độ), là thuốc đa thành phần có công thức : Salbiitamol sulphattương đương với salbutamol 2 mg Bromhexin hydroclorid 8 mg Guaifenesin 100 mg Thuốc này đang được chuẩn bị nhập vào Việt Nam, công tác quản lý chất lượng đòi hỏi một phương pháp định lượng đơn giản, nhanh, phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm ở các trung tâm kiểm nghiệm. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định lượng salbutamol, guaifenesin, bromhexin hydroclorìd trong viên nén Ascorin (Ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu cụ thể sau: Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định tính và định lượng ba thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc Ascorin thử nghiệm bằng phương pháp HPLC.

p m

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN HỮU VÃN

ĐỊNH LƯỢNG SABUTAMOL, GUAIFENESIN,

BROMHEXIN HYDROCLORID TRONG VIÊN NÉN

ASCORIN (ẤN Đ ộ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NẢNG CAO

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2001- 2006)

Người hướng dẫn: Th.s Đặng Trần Phương Hồng

PGS.TS Trần Tử An

Nơi thực hiện: Phòng vật lý- Viện kiểm nghiệm

Trường Đại học Dược Hà Nội

í ầ

Hà nội, 5-2006

m

%

LỜI CẢM ƠN

Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm Trong quá trình thực hiện khoá luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình của các thầy, cô hướng dãn, các giảng viên của bộ môn Hoá phân tích và độc chất, và các cán bộ của phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm- Bộ Y tế

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

- PGS-TS Trần Tử An - Chủ nhiệm bộ môn Hoá phân tích và độc chất - Trường đại học Dược Hà Nội

- Th.s Đặng Trần Phương Hồng - Trưởng phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm-

Bộ Y tế

Đã trực tiếp giúp đỡ tôi những tài liệu và hướng dẫn những kỹ năng cần thiết

để tôi thực hiện khoá luận này

Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong bộ môn Hoá phân tích

và độc chất- Trường đại học Dược Hà Nội, các cán bộ của phòng Vật lý- Viện kiểm nghiệm đã giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận

Tôi xin cám ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu, Phòng đào tạo nhà trường tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện khoá luận này.Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi trong học tập, cũng như trong quá trình thực hiện khoá luận

Hà nội, tháng 5-2006 Sinh viên

Nguyễn Hữu Văn

MỤC LỤC

Trang

Đặt vấn đề 1

Phần 1- Tổng quan 2

1.1 Salbutamol 2

1.2 Bromhexin hydroclorid .3

1.3 G uaifenesin 4

1.4 Phương pháp H P L C 5

1.4.1 Khái quát c h u n g 5

1.4.2 Nguyên tắc cấu tạ o 5

1.4.3 Các đại lượng đặc trưng 7

1.4.4 Pha tĩnh trong H P L C 9

1.4.5 Pha động trong H P L C 10

1.4.6 Nguyên tắc lựa chọn pha động và pha tĩnh 11

1.4.7 Cách tính kết quả 12

1.5 Một số quy trình định lượng ba hoạt chất trên trong các chế phẩm đa thành phần 13

Phần 2- thực nghiệm và kết quả 15

2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 15

2.1.1 Hoá chất- Dụng cụ 15

2.1.2 Đối tượng- Nội dung- Phương pháp nghiên cứu 15

2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 18

2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 18

2.2.2 Thẩm định chương trình sắc ký 24

2.2.2.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 24

2 2 2 2 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 25

2.2.2.3 Khảo sát độ chính xác của phương pháp 282.2.2.4 Khảo sát độ đúng của phương pháp 312.3 So sánh hiệu quả của phưcỉng pháp tìm được với một số phươngpháp định lượng đã được chấp nhận 372.4 Bàn luận về kết quả 42

Phần 3: Kết luân 43

CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

ĐẶT V Ấ N ĐỂ

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ngày càng tăng Do vậy, thuốc đa thành phần ngày càng trở nên phổ biến, nhằm kết hợp tác dụng điều trị và thuận tiện hơn cho người sử dụng

Tuy nhiên, trong các dược điển hiện hành của nhiều nước chủ yếu chỉ có các chuyên luận cho các thuốc chứa một thành phần Chính vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng thuốc có nhiều thành phần là rất cần thiết

Ascorin, một chế phẩm của hãng GLENMARK PHARMA (Ấn độ), là thuốc

tiến hành nghiên cứu đề tài : “ Định lượng salbutamol, guaifenesin, bromhexin

hydroclorìd trong viên nén Ascorin (Ấn độ) bằng phương pháp sắc ký lỏng

hiệu năng cao ” với mục tiêu cụ thể sau:

- Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định tính và định lượng ba thành phần hoạt chất trong mẫu thuốc Ascorin thử nghiệm bằng phương pháp HPLC

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 SALBUTAM OL

1.1.1 Công thức cấu tạo : [ 1]

- Tên khác : Albuterol, Ventolin, Sultamol, Proventil.

- Tên khoa học ; 1- (4’ - hydroxyl- 3’ - hydroxyl methyl- p h en y l) - 2-

tertbuthyl amino ethanol

Hoạt chất được sử dụng trong phương pháp định lượng là

salbutamol sulfat

1.1.2 Tính chất ( dạng muôi su lfa t) [15]:

- Bột kết tinh trắng, không mùi, vị hơi đắng

- Tan trong nước, ít tan hơn trong cồn, cloroform, ether

c 18

(150x 4,6 mm)

(natri-l-hexan sulfonat 1,13 g và acid acetic 12

1.2.2 Tính chất [17]:

- Trắng hay hầu như trắng

- Tan trong ethanol 95% và trong methanol, tan nhẹ trong cloroíorm, rất ít tan trong nước

1.2.3 Một sô phương pháp định lượng :

Bảng 3: Điều kiện định lượng BH bằng phương pháp đo quang

- Bột trắng hoặc gần như trắng, không mùi

- Tan trong ethanol 95%, cloroíorm, ít tan trong nước, ether

1.3.3 Một sô phương pháp định lượng:

Bảng 4: Điều kiện định lượng GU bằng HPLC

ƯVịnm)

Tốc độ dòng (mUphút)

1.4.1 Khái quát chung :

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phương pháp tách dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là một chất lỏng được bao trên một chất mang rắn, hoặc một chất mang rắn đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất cần phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độ khác nhau Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện gọi là detector

1.4.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC [3]:

Hệ thống kỹ thuật HPLC bao gồm các bộ phận chính:

- Bình chứa dung môi: Bình thường làm bằng thuỷ tinh,

- Bơm cao áp: Bơm này có chức năng bơm dung môi vào cột để thực hiện quá trình tách Bơm này được điều chỉnh áp suất để tạo ra được những tốc độ ổn định nhất của các chất cho phù hợp với quá trình sắc ký

- Van bơm mẫu : Van này để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký Các van này có thể tích thay đổi, thường là 20, 50, 100 pl

Hình 1: Sơ đồ nguyên tắc chung cho các máy sắc HPLC (ỉ - Bình chứa pha động; 2- Bơm; 3- Tiêm mẫu; 4- Cột;

5- Detector; 6- Ghi tín hiệu.)

- Cột tách : Là cột chứa pha tĩnh quyết định hiệu quả của sự tách một hỗn

hợp mẫu Cột tách có nhiều kích cỡ khác nhau, và thường có chiều dài từ 10- 25

cm, đường kính trong từ 2- 5 mm

- Hệ thống phát hiện chất phân tích (detector): Dựa theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng các detetor khác nhau, ví dụ như :

^ Detector hấp thụ UV- VIS.

Detetor huỳnh quang

Detector điện hoá (đo dòng, độ dẫn, điện lượng)

^ Detetor chiết xuất.

^ Detetor độ dẫn nhiệt.

Trong các loại trên thì detector hấp thụ UV- VIS được dùng phổ biến hcfncả

- Hệ thống thu nhận và xử lý kết quả : ở đây có nhiều loại, nhưng phổ biến hơn cả là máy tự ghi tín hiệu đo dưới dạng pic.

1.4.3 Các đại lượng đặc trưng [3]:

Các chất khi qua, muốn tách được hoàn toàn khỏi nhau cần phải dám bảo được hai yếu tố:

- Các pic phải cách xa nhau, tức là có tốc độ di chuyển khác nhau rõ rệt

- Pic sắc ký phải gọn (hẹp và cân đối), tức là không có sự doãng pic

* M ột sô đại lượng đặc trưng:

a Thời gian lưu (t¡ị):

Thời gian lull là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu vào cột sắc ký, tới detetor và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic)

Thời gian lưu đặc trưng cho tốc độ di chuyển của một chất Thời gian lưu càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ

b Hệ sô chọn lọc (thừa s ố chọn lọc) ( a):

Hệ số chọn lọc đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất

Công thức:

a =

Trong đó; B được coi là chất bị lưu giữ mạnh hơn A

Kb,K^ là hệ số phân bố, k ’ß, k’^ là thừa số dung lượng tương ứng với chất B và A

B , t \ A là thời gian lưu hiệu chỉnh của B và A.

Để tách hai chất, cần có (X>1, thường dùng trong khoảng 1,05- 2,0 Nếu (X

quá lớn thì thời gian phân tích càng kéo dài

0,75 : Hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều

1,0 : Hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%

1,5 : Hai pic tách nhau gần hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau

0,3%-d S ố đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H):

Cột sắc ký được coi như có N lớp mỏng, ở mỗi lớp sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là đạt đến một trạng thái cân bằng Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết H là chiều cao đĩa lý thuyết nên:

H = — (L: chiều dài cột).

N

Công thức tính N:

w là chiều rộng đo ở đáy pic

Cột có N lớn hay H nhỏ là cột có hiệu lực cao, khi đó độ doãng pic nhỏ

e Hệ s ố bất đối xứng T :

Hệ số bất đối cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, được tính theo công thức :

T = 2a

Trong đó : Wx là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến

mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.

SOOmVg-• Phân loại pha tĩnh

- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử Tương ứng với mỗi loại chất nhồi như thế người ta có một kỹ thuật sắc ký riêng HPLC

• Điều kiện đối với một pha tĩnh :

- Phải trơ và bền với các điều kiện của môi trường sắc ký

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong những điều kiện nhất định

- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Hạt phải đồng nhất

1.4.5 Pha động trong HPLC.

Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan (chất phân tích) ra khỏi cột tách, thực hiện quá trình tách sắc ký Nó có thể chỉ là một dung môi hùha cơ hay cũng có thể là hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo một tỷ lệ phù hợp Nó cũng có thể là dung dịch của các muối chứa các chất đệm , chất tạo phức Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải riêng tạo được hiệu quả tách tốt nhất

• Pha động có thể ảnh hưỏìig đến :

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu của chất tan

- Hiệu lực của cột tách

- Độ phân giải của các chất trong một pha tĩnh

- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký

10

• Điều kiện đối với một pha động :

- Phải trơ với pha tĩnh

- Hoà tan được chất cần phân tích

- Bền với thời gian

- Có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt các cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với detector dùng để phát hiện các chất phân tích

- Có tính kinh tế, dễ kiếm, không quá đắt

• Một sô điểm cần được xem xét đê chọn pha động cho phù hợp :

- Bản chất của dung môi để pha chế pha động

- Thành phần các chất tạo ra pha động

- Tốc độ dòng pha động

- pH của pha động

1.4.6 Nguyên tác lựa chọn pha động và pha tĩnh.

Nguyên tắc lựa chọn: Pha tĩnh thường được chọn có tính phân cực giống các

chất cần tách, và khác với pha động

Trong HPLC, pha tĩnh được gắn hoá học (liên kết) với chất mang (hạt silicagel) tạo nên hợp chất cơ- siloxan

CH, /

Nếu gốc R- trong dẫn chất siloxan tạo thành là một nhóm ít phân cực như octyl (Cg), octadecyl (Cịg) hay phenyl và dung môi phân cực như methanol

11

acetonitril, nước .(ngoài các dung môi chính còn có các dung dịch đệm pH như

dung dịch đệm phosphat để ổn định cho quá trình sắc ký) thì ta có sắc kỷ pha

đảo Hiện nay, người ta thường sử dụng loại cột alkyl hoá Cg, C|8 với các tên

thương phẩm khác nhau để định lượng trong trường hợp này

Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin - (CH2)n-NH2 hay alkylnitril - (CH2)n- CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có sắc kỷ pha thuận Cột

hay sử dụng trong trường hợp này là cột Si

Trong hai loại sắc ký nêu trên thì sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến hơn

vì cho kết quả tách tốt với nhiều đối tượng phân tích

Việc lựa chọn pha tĩnh và pha động phù hợp với chất phân tích có tính chất quyết định đối với quá trình sắc ký Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến chi phí khi thực hiện sắc ký phân tích

1.4.7 Cách tính kết quả.

- Phương pháp ngoại chuẩn: Dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện Kết quả mẫu thử được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy ra từ đường chuẩn

- Phương pháp nội chuẩn: Là phương pháp cho thêm vào mẫu chuẩn và mẫu thử một lượng chất không đổi mà trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

- Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất tương ứng các thành phần cần phân tích trong mẫu thử Tiến hành sắc ký cả hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩn trong cùng một điều kiện sắc ký Kết quả được tính toán dựa vào sự tăng diện tích hoặc chiều cao pic

- Phương pháp tính theo phần trăm diện tích pic: Hàm lượng phần trăm của các chất cần phân tích trong mẫu thử được tính bằng phần trăm diện tích pic của

12

nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ Phương pháp này chỉ đúng khi đáp ứng hai yêu cầu:

Tất cả các chất trong mẫu đều được rửa giải và cho pic trên sắc đồ (trừ thuốc thử và các chất dưới giới hạn phát hiện)

Đáp ứng của detetor như nhau đối với các chất

1.5 MỘT SỐ QUY TRÌNH KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BA Dược CHẤT TRÊN TRONG CÁC CHÊ PHẨM đ a t h à n h PHẦN:

Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành trên cả sắc ký pha thuận

và sắc ký pha đảo, dựa vào kết quả thu được chúng tôi chọn sắc ký pha đảo vì:

- Đáp ứng của hệ đối với sắc ký pha đảo tốt hơn sắc ký pha thuận

- Loại cột c 18 thông dụng hơn cột Si và sẵn có ở phòng thí nghiệm

14

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu.

2.1.1 Hoá chất và dụng cụ.

2.1.1.1 H oáchất.

- Chất chuẩn của viện kiểm nghiệm : salbutamol sulphat (hàm lượng 100%),

guaifenesin, bromhexin hydroclorid 99,9%

- Methanol loại dùng cho HPLC

- Máy lắc siêu âm

- Bộ lọc dung môi sử dụng hệ thống lọc chân không, với màng lọc 0,45 |Jm

- Cân phân tích với độ chính xác 0,1 mg

- Các dụng cụ chính xác như bình định mức có nút mài, p ip e t,

2.1.2 Đối tượng - Nội dung - Phương pháp nghiên cứu.

2.1.2.1 Đ ối tượng nghiên cứu :

Mẫu Ascorin do GLENDMARK PHARMA (Ấn độ) sản xuất, cung cấp cho Viện Kiểm nghiệm để tiến thành thẩm định

Công thức :

15

Bromhexin hydroclorid 8 mg

Mẫu sản xuất tháng 11/ 2004 Hạn dùng tháng 10/2006

2.1.22 Nội dung và phương pháp nghiên cứu:

• Xây dựng chương trình sắc kỷ : Ơiương trình này được xây dụng nhằm mục

đích định tính và định lượng đồng thời SA, BH, và GU trong viên nén Ascorin

Để xây dựng chương trình, chúng tôi khảo sát và lựa chọn các điều kiện :

- Độ đúng của phương pháp bằng phương pháp thêm chuẩn

Các kết quả thực nghiệm được xử lý thống kê để đánh giá

2.12.3 Một s ố công thức tính thống kê xử lý kết quả [2], [9], [13];

- Loại bỏ những dữ liệu ngoại lai {Chuẩn Q):

Chuẩn này áp dụng cho N< 10

Các dữ liệu thống kê được sắp xếp tăng dần: X), Xj, X3, , x„

16

Tính chuẩn Qtn để loại bỏ giá trị nghi ngờ hoặc

So sánh giá trị Q(n với Q tới hạn (Q“');

Qtn < Q* thì không loại giá trị nghi ngờ

- Khoảng tin cậy : / / X _

2.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký:

- Lựa chọn thành phần pha động:

Dựa trên hàm lượng của các chất trong chế phẩm thì thấy SA có hàm lượng nhỏ nhất (2 mg), sau đó đến BH (8 mg) và lớn nhất là GU (100 mg) Vì vậy, chúng tôi định hướng sẽ tìm hệ pha động ưu tiên SA

Theo Dược điển Anh [15], SA.S được định lượng bằng HPLC trong điều kiện pha động là nước cất- amoni acetat 0,05M- isopropanol với tỷ lệ 65: 30: 5, pha động được điều chỉnh pH về 4,5 bằng acid acetic băng, sử dụng cột CN 250x 5mm, 5|Jm

Nhận thấy cột CN là loại cột không thông dụng trong điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm Mặt khác, khi tiến hành định lượng bằng hệ này thì pic của SA tốt, tuy nhiên không thấy xuất hiện pic của BH Do vậy, chúng tôi chuyển hướng sang những hệ ưu tiên pha động BH Sau một số khảo sát, chúng tôi chọn được hệ pha động Methanol - Natri dihydrophosphat 10%, pH=3, tỷ lệ 60: 40 Hệ này cho pic của cả ba chất cần khảo sát, và các pic có độ phân giải khá tốt Tuy nhiên, pic

18

của BH có hệ số bất đối lớn, pic bị kéo đuôi Do vậy chúng tôi thêm triethylamin (TEA), một chất có khả năng làm giảm bất đối xứng của pic Hoà tan TEA trong methanol với tỷ lệ tăng dần và ở tỷ lệ 1/300 cho pic của BH đạt độ cân xứng tốt, T= 1,52.

Vậy, hệ pha động chọn được:

(Methanol- Triethylamin tỷ lệ 300:1)- Natri dihydrophosphat 10%, pH3,0;

tỷ lệ (60: 40)

- Lựa chọn loại cột: Theo tài liệu nghiên cứu tìm hệ dung môi pha động, tác

giả sử dụng cột Lichrosorb RP 18 (250x4 mm, 10|Jm) Cột này có khả năng tách tốt hệ ba chất cần khảo sát, cột có hiệu lực cao với số đĩa lý thuyết trung bình

4023 và là loại cột thông dụng trong công tác kiểm nghiệm

- Lựa chọn tốc độ dòng : Chúng tôi tiến hành chạy sắc ký của dung dịch mẫu

chuẩn ở các tốc độ khác nhau là 1,0; 1,5; 2,0 ml/ phút thì thấy rằng tốc độ dòng ở 1,5 ml/ phút các pic được tách tốt, áp suất (231 bar) vừa phải và thời gian lưu không quá dài (của SA là 1,47 phút, GU là 2,16 phút và của BH là 12,23 phút), ở đây, nếu chỉ nhìn trên sắc đồ chuẩn thì ta sẽ thấy độ phân giải giữa BH và GU là rất lớn Tuy nhiên, trên sắc đồ chất thử xuất hiện một pic của tá dược gần sát phía sau GU Để pic này tách hoàn toàn khỏi GU thì độ phân giải giữa BH và GU phải lớn, và tốc độ dòng 1,5 ml/ phút là hợp lý

- Lựa chọn bước sóng thích hợp đ ể phát hiện ba c h ấ t: Để xác định bước sóng

thích hợp để phát hiện ba chất, chúng tôi tiến hành quét phổ UV-VIS của các dung dịch chuẩn riêng rẽ của ba chất trên dải sóng 200- 400 nm (hình 3, 4 và 5)

SA là chất có nồng độ định lượng thấp nhất trong cả ba chất nên lựa chọn ưu tiên cho SA Nhận thấy ở bước sóng 225 và 276 nm, độ hấp thụ của SA đạt cực đại Độ hấp thụ của SA ở 225 nm lớn hơn ở 276 nên chúng tôi chọn bước sóng

225 nm là bước sóng định lượng SA

19

Khảo sát các bước sóng tiếp theo chúng tôi nhận thấy, ở bước sóng 250 nm là cực đại hấp thụ của BH Chúng tôi chọn bước sóng này để định lượng BH.

Vì GU có nồng độ lớn nhất nên chúng tôi lựa chọn bước sóng định lượng G ư

là một trong hai bước sóng trên, ở bước sóng 225 nm, diện tích pic của GU quá

lớn ở bước sóng 250 nm, GU cho pic không quá lớn và tương xứng với pic của

BH nên chúng tôi chọn 250 nm là bước sóng định lượng GU

Vậy các bước sóng được chọn là :