Định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin trong viên nén bằng phưưong pháp quang phổ UV VIS

ĐẶT VẤN ĐÈ•Lịch sử ngành kháng sinh được hình thành từ khi Alexander Fleming tình cờ phát hiện ra Penicillin vào năm 1929. Qua một quá trình phát triển lâu dài cùng với những thành tựu lớn lao trong công cuộc đấu tranh phòng chống bệnh tật, kháng sinh đã trở thành một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất của Y học hiện đại. Ngày nay, nhằm tăng cường hiệu quả điều trị, giảm tác dụng phụ, tránh kháng thuốc, và mở rộng phổ của kháng sinh, các nhà bào chế học đã bào chế ra nhiều chế phẩm có nhiều thành phần, trong đó các kháng sinh kết hợp với nhau hoặc kết hợp với thuốc phi kháng sinh khác, spiramycin (SP) và Metronidazol (ME) là cặp phối hợp kháng sinh hoá trị liệu nhằm mở rộng phổ tác dụng, có hiệu quả điều trị cao. Rodogyl biệt dược của hãng Dược phẩm Aventis, Pháp là một chế phẩm chứa hai thành phần hoạt chất nói trên từ lâu đã có mặt trên thị trường Việt Nam. Bên cạnh đó, hàng loạt chế phẩm nội khác có chứa hai thành phần này cũng lần lượt ra đời như Naphacogyl (Naphaco), Dophargyl (Dopharma), Dorogyne (Domesco), Rotaforte (Mediplantex), Novogyl (Mekophar), Vidorigyl (Thephaco), Hadozyl (Hataphar)...Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại của Metronidazol, các TCCS của các nhà sản xuất trong nước đều áp dụng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UVVis) để định lưọng hoạt chất này trong chế phẩm. Còn Spiramycin hoạt chất còn lại được định lượng bằng phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này yêu cầu cơ sở vật chất nghiêm ngặt và thường mất nhiều thời gian.Trong quá trình khảo sát điều kiện để định lượng đồng thời hai thành phần này trong viên nén bằng phương pháp phân tích đa cấu tử, chúng tôi

B Ộ Y T ẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI - c « ỉo -

ĐÀO THỊ THANH NHÀN

ĐỊNH LƯỢNG ĐÒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ

SPIRAMYCIN TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

QUANG PHỎ ƯV-VIS

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006)

Người hướng dẫn : TS THÁI DUY THÌN

NCS TRẦN VIỆT HÙNG

Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá Dược Thời gian thực hiện : 02/2006 đến 05/2006

Hà Nội, 05/2006

Lòi cảm ơn

Đ ể hoàn thành được khoá luận tố t nghiệp nàỵ, trước tiên tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn sâu sắc tói:

Tỗ Thái Duỵ Thìn NCỒ Trần Việt Hùng

Những ngưòi đã hướng dẫn tôi tận tình trong suốt thòi gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và kỹ thuật viên bộ môn Hoá Dược đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đõ tôi trong thòi gian tôi lảm thực nghiệm tại bộ môn

Tôi cũng xin gửi tói toàn thể giảng viên, cán b ộ Trưòng Đại ĩìọc Dược ỉlả Nội lòi cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt dạỵ bảo trong suốt năm năm tôi học tập tại đâỵ

Và cuối cùng, cho phép tôi được bày tỏ lòng b iết ơn tối cha mẹ, bạn

b è - những ngưòi luôn giành cho Lôi tình thương ỵêu, sự quan tâm, động viên giúp đõ chân tình đ ể tôi hoàn thành tố t nhất khoá luận tố t nghiệp nàỵ

ỉlà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2 0 0 6

Dào Thi Thanh Nhàn

USP : United States Pharmacopoeia - Dược điển Mỹ

DĐVNIII : Dược điển Việt Nam xuất bản lần thứ 3

HPLC : High Perfomance Liqid Chromatography - sắc ký lỏng hiệu

năng caoMCA : Multi Component Analysis

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN Đ È 1

PHẦN 1: TỒNG Q UAN 3

1.1 Đại cương về Metronidazol và Spiramycin 3

1.1.1 Metronidazol 3

1.1.2 Spiramycin 5

1.1.3 Các phương pháp định lượng Metronidazol và Spiramycin 8

1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis 12

1.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp định lượng bằng quang phổ UV-Vis 12

1.2.2 Các kỹ thuật định lưọng bằng phương pháp quang phổ UV-Vis 14 1.2.3 ư u , nhược điểm của phương pháp định lượng bằng quang phổ UV-Vis 19

PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21

2.1 Nội dung, đối tượng và phương pháp nghiên cứ u 21

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 21

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2 Thuốc thử, hoá chất, dụng c ụ 25

2.3 Xây dựng phưotig pháp định lượng đồng thời Metronidazol và Spiramycin trong viên nén bằng phương pháp quang phổ UV-Vis 26

2.3.1 Khảo sát phổ hấp thụ u v và lựa chọn các bước sóng phân tích 26 2.3.2 Khảo sát tính tuyến tính và tính cộng phổ ở các bước sóng phân tích của dung dịch hỗn hợp 2 chất Metronidazol và Spiramycin 28 2.3.3 Phân tích chế phẩm Rodogyl 30

2.4 So sánh gía trị trung bình và độ lặp lại giữa phương pháp mới xây

dựng và phương pháp định lượng theo các TCCS trong nước 35

2.4.1 Khảo sát sự ảnh hưỏfng của spiramycin đến kết quả định lưọTig Metronidazol của các phương pháp theo TCCS trong nước 36

2.4.2 So sánh độ lặp lại và giá trị trung bình của kết quả định lượng Metronidazol theo hai phương p h áp 38

2.5 ứ ng dụng phương pháp định lượng vừa xây dựng để định lượng một s ố chế phẩm nội chứa Metronidazol và Spiramycin 41

2.6 Bàn luân 41

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X UẤT 45

3.1 Kết luận 45

3.2 Đe xuất 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐÈ •

Lịch sử ngành kháng sinh được hình thành từ khi Alexander Fleming tình cờ phát hiện ra Penicillin vào năm 1929 Qua một quá trình phát triển lâu dài cùng với những thành tựu lớn lao trong công cuộc đấu tranh phòng chống bệnh tật, kháng sinh đã trở thành một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất của Y học hiện đại Ngày nay, nhằm tăng cường hiệu quả điều trị, giảm tác dụng phụ, tránh kháng thuốc, và mở rộng phổ của kháng sinh, các nhà bào chế học đã bào chế ra nhiều chế phẩm có nhiều thành phần, trong đó các kháng sinh kết hợp với nhau hoặc kết hợp với thuốc phi kháng sinh khác, spiramycin (SP) và Metronidazol (ME) là cặp phối hợp kháng sinh - hoá trị liệu nhằm mở rộng phổ tác dụng, có hiệu quả điều trị cao Rodogyl - biệt dược của hãng Dược phẩm Aventis, Pháp - là một chế phẩm chứa hai thành phần hoạt chất nói trên từ lâu đã có mặt trên thị trường Việt Nam Bên cạnh

đó, hàng loạt chế phẩm nội khác có chứa hai thành phần này cũng lần lượt ra đời như Naphacogyl (Naphaco), Dophargyl (Dopharma), Dorogyne (Domesco), Rotaforte (Mediplantex), Novogyl (Mekophar), Vidorigyl (Thephaco), Hadozyl (Hataphar)

Dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại của Metronidazol, các TCCS của các nhà sản xuất trong nước đều áp dụng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) để định lưọng hoạt chất này trong chế phẩm Còn Spiramycin - hoạt chất còn lại - được định lượng bằng phương pháp vi sinh vật Phương pháp này yêu cầu cơ sở vật chất nghiêm ngặt và thường mất nhiều thời gian

Trong quá trình khảo sát điều kiện để định lượng đồng thời hai thành phần này trong viên nén bằng phương pháp phân tích đa cấu tử, chúng tôi

nhận thấy rằng Spiramycin trong môi trường NaOH cũng có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại và đạt hấp thụ cực đại tại bước sóng 232nm.

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Định lượng đồng thời Metronidazol và Spiramycìn trong viên nén bằng phương pháp

i~ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Metronidazol và

Spiramycin trong viên nén Rodogyl bằng phưong pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis

i- So sánh độ lặp lại và độ đúng của kết quả định lượng Metronidazol

giữa phương pháp vừa xây dựng với phương pháp theo các TCCS trong nước

i- ứ n g dụng phương pháp mới xây dựng để định lượng một số chế phẩm nội khác chứa Metronidazol và spiramycin

Với mục tiêu như vậy, chúng tôi mong muốn giới thiệu một phương pháp định lượng mới đơn giản và dễ thực hiện hơn, có thể áp dụng được cho những cơ sở sản xuất, kiểm nghiệm không có đủ điều kiện cơ sở vật chất để định lượng Spiramycin bằng phương pháp vi sinh vật

PHÀN I TỐNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN

Tên khoa học : l-(ß-hydroxyletyl )-2-methlyl-5-nitroimidazolể- Tên khác;

■ Bột kết tinh hoặc tinh thể màu trắng hoặc ánh vàng, không mùi

■ Tan ít trong nước, aceton, alcol và methylen clorid, rất ít tan trongether

■ sẫm màu dần khi tiếp xúc với ánh sáng

4^ Tính chất hoá học:

■ Tính chất của dị vòng imidazol;

► Do có 2N nên mang lại tính base, tuy nhiên IN cạnh nhóm nitro có tính base yếu Vì vậy, khi tác dụng với các acid, chỉ có IN tham gia phản ứng tạo muối

► Dung dịch chế phẩm tác dụng với acid picric tạo tủa vàng của muối picrat, nóng chảy ở 150°c

► Dị vòng imidazol hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại Dung dịch chế phẩm

Tác dụng:

Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn trên Bacteroides, Fusobacterium

và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc khác, nhưng không có tác dụng lên vi khuẩn ái khí Khi bị nhiễm cả vi khuẩn ái khí và kỵ khí, Metronidazol phải được phối họp với các thuốc kháng khuẩn khác

4- Chỉ định:

■ Điều trị các trường hợp nhiễm khuẩn do Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Dientamoeba fragilis ở trẻ em, Giardia lamblia

và Dracunculis

■ Điều trị nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn kỵ khí nhạy cảm như nhiễm khuẩn ổ bụng, nhiễm khuẩn phụ khoa, nhiễm khuẩn da và các cấu trúc da, nhiễm khuẩn hệ thần kinh trung ương, nhiễm khuẩn huyết và viêm màng trong tim.

■ Viêm lợi hoại tử loét cấp, viêm lợi quanh thân răng và các nhiễm khuẩn khác do vi khuẩn kỵ khí

i- Liều dùng:

■ Uống : 500mg/lần x31ần/ngày xlOngày

■ Tiêm tĩnh mạch : 500-750mg, 8h truyền một lần, dùng 5-7ngày

■ Trẻ em : 30mg/kg cân nặng/ngày X lOngày

■ Điều trị T.vaginalis : 250mg/lần X 31ần/ngày X 7ngày

4- Chống chỉ định: Có tiền sử quá mẫn với Metronidazol hoặc các dẫn chất nitro-imidazol khác

4- Dạng bào chế:

■ Viên nén 250mg, 500mg; kem bôi âm đạo 10%; thuốc trứng 500mg;dung dịch tiêm truyền 500mg/100ml

1.1.2 Spiramycin [1][2][7][8][9][22][23][24]

4- Nguồn gốc: Spiramycin là kháng sinh nhóm Macrolid được sinh tổng

hợp từ loài vi khuẩn Streptomyces ambofaciens.

4- Chế phẩm dược dụng là một hỗn hợp của spiramycin I, II, III

■ Spiramycin I ; Nóng chảy ở nhiệt độ 134°C-137°C

Năng suất quay cực: [a]D^°= -96°

■ Spiramycin II : Nóng chảy ở nhiệt độ 140°-142°

Năng suất quay cực; [a]o^°= - 92,5°

■ Spiramycin III ; Nóng chảy ở nhiệt độ 128°-131 °

Năng suất quay cực: -83°

■ Tác dụng hỗ trợ: Spiramycin kích thích thực bào của bạch cầu trung tính, làm tăng khả năng diệt khuẩn

4 Tác dụng;

■ Spiramycin có tác dụng lên các vi khuẩn gram (+), các chủng Coccus, chủng Bordetella pertussis, Corynebacteria, Chlamydia, Actinomyces, một số chủng Mycoplasma và Toxoplasma cũng nhạy cảm với Spiramycin

■ Spiramycin không có tác dụng với các vi khuẩn gram (-)

4- Chỉ định:

■ Điều trị nhiễm khuẩn đường hô hấp, nhiễm trùng miệng

■ Nhiễm trùng da lành tính

■ Nhiễm trùng sinh dục

■ Phòng ngừa viêm màng não do màng não cầu

■ Phòng ngừa tái phát thấp khófp cấp ở người dị ứng với Penicillin

>4 Chống chỉ định: người có tiền sử mẫn cảm với Spiramycin

-ể- Liều dùng:

■ Uống dạng base: người lớn 0,5-l,0g/lần

■ Tiêm dạng muối: người lón 500mg/lần

Dạng bào chế: Img SP = 3900UI

■ Viên bao phim 750.000ƯI, 1.500.000UI, 3.000.000UI

■ Bột đông khô để pha tiêm: lọ 1.500.000UI

■ Dạng kết hợp: viên bao phim chứa 750.000UI Spiramycin và 125mg Metronidazol

1.1.3 Các phương pháp định lượng Metronidazol và Spiramycin.

1.1.3 ỉ Các phương pháp định lượng Metronidazol

4- Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-Vis trong môi trường acid [1] [7][10][11][12][13][20]

Dựa vào khả năng hấp thụ u v của Metronidazol: đo độ hấp thụ của dung dịch Metronidazol trong HCl 0,1N ở bước sóng hấp thụ cực đại 277nm Mầu trắng là dung dịch HCl 0,1N A(l%, Icm) ở 277nm là 377 Tiến hành song song với chuẩn cùng điều kiện

i- Phương pháp đo quang phổ hấp thụ ƯV-Vis trong môi trường kiềm [16][18]

Hoà tan một lượng chính xác Metronidazol bằng dung dịch NaOH 0,1N trong bình định mức lOOml Lọc bỏ 20ml dung dịch đàu, hút Iml dịch lọc tiếp theo vào bình định mức 1 OOml, bổ sung NaOH tới vạch, lắc đều Dung dịch thu được đem đo mật độ quang ở bước sóng 319nm với mẫu trắng là NaOH 0,1N A (l% ,lcm ) ở 3 19nm là 377 Song song tiến hành với chuẩn cùng điều kiện

Ậ- Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao [14]

Định lượng Metronidazol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với chương trình như sau:

■ Cột Supelco IC-AB2 (150 X 4,6mm, 5|Lim)

■ Detector u v đặt ở 292nm, độ nhạy 0,05 AUFS, Intergator: Attenuation = 1; Minimum area = 1000; Speed 2; Stoptime = 6

- Pha động: acid phosphoric 0,01M: CHCN: CHOH (1000:225:25) Metronidazol là một base Lewis, nên dùng pha động pH=2,4 (<3) cólợi hơn dùng pH trung hoà Metronidazol rất dễ tan trong acid, bề rộng của pic sẽ hẹp và tính đối xứng được đảm bảo (hệ số cân đối 0,9-1,1)

4- Phương pháp định lượng trong môi trường khan:

C 6 H 9 N 3 O 3

1.1.3.2 Phương pháp định lượng Spiramycin [10][11][12][13][20][23]

Spiramycin được định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

Chủng : Baccilus pumilus

i- Môi trưòng nuôi cấy: dùng môi trường kháng sinh chế sẵn số 11

■ Cân 3,05g môi trường, thêm lOOml nước cất, khuấy cho tan.

■ Tiệt trùng trong Autoclav ở 121 °c, áp suất 151bs/inch^ trong 15 phút,

pH cuối cùng của môi trường ở 25°c phải là 8,3±0,2

4- Điều chế dung dịch đệm Phosphat số 3 ( theo USP 23)

Cân chính xác một lượng 2 hoạt chất sau đây, thêm 400ml nước cất và hoà tan hoàn toàn, chỉnh pH và thể tích tới lOOOml

■ Rửa vi khuẩn từ thang nghiêng với 3-4ml nước muối vô trùng

■ Cho nhũ dịch vào một bình nhỏ vô trùng có nắp vặn lắc đều

■ Dùng quang phổ kế u v (k = 625nm) với dung dịch muối làm đối

chiếu chuẩn cho nhũ dịch có độ truyền là 2,8%

i- Thực hiện các hộp Petri:

■ Thêm khoảng l,Oml huyền trọc vi khuẩn vào môi trường dùng để định lượng đã để nguội tới khoảng 45°c, lắc đều để trộn, tránh tạo bọt

■ Đổ 20ml môi trưòng vào từng hộp trong số 5 hộp Petri đã tiệt trùng

và đặt trên 1 khay đã nằm ngang để đảm bảo phân phối đều cho môi trường

■ Đe môi trường đặc lại, sấy các hộp trong 30 phút ở 37°c

■ Đặt 4 ống trục inox đã tiệt trùng trên mặt hộp Petri theo sơ đồ phânphối đã vẽ trước trên khuôn đặt dưới hộp

■ề- Điều chế các dung dịch chuẩn và thử:

■ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng chuẩn theo công thức sau

1.000.000 UIKhối lượng (mg) = -

Hoạt lực chuẩn (lU/mg)Hoà tan trong một lượng methanol vừa đủ Bổ sung methanol tới thểtích lOOml để có dung dịch mẹ l.OOOUI/ml

■ Dung dịch thử: nghiền 10 viên chế phẩm, cân chính xác một lượng bột viên thêm metlianol, lắc kỹ, hoà loãng dịch lọc để có nồng độ l.OOOUI/ml

4- Tiến hành thử hoạt lực bằng phương pháp đưòng chuẩn

1.1.3.3 Phương pháp định lượng Spiramycin và Metronidazol trong một chế phẩm [10][11][12][13][20]

4- Với các chế phẩm chứa đồng thời Metronidazol và Spiramycin, các TCCS trong nước đều tiến hành định lượng Metronidazol bằng phương pháp

đo quang phổ ƯV-Vis ở bước sóng hấp thụ cực đại của Metronidazol trong môi trường acid là 277nm spiramycin được định lượng bằng phương pháp vi sinh vật Cả hai phương pháp này đều đã được trình bày ở mục 1.1.3.1 và1.13.2

i- Phương pháp định lượng bằng đo quang phổ hấp thụ UV-Vis [13

Phưong pháp này dựa trên nguyên tắc “độ hấp thụ quang của một dung dịch hỗn họp bằng tổng độ hấp thụ quang của các thành phần trong hỗn hợp đó” ME và SP trong môi trưòng HCl 0,1N đều có khả năng hấp thụ quang, và

có bước sóng cực đại lần lượt là 277nm và 232nm Lần lượt đo mật độ quang của các dung dịch thử hỗn hợp tại hai bước sóng này sẽ tìm ra được nồng độ của mỗi thành phần Tiến hành song song cùng các mẫu chuẩn

1.2 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHÔ HẤP THỤ UV-VIS

1.2.1 Cơ s ở lý thuyết của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ UV-Vis [4] [5] [6] [7] [15] [16] [18]

1.2.1.1 Định luật Lambert-Beer

Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng X và cường độ lo qua

dung dịch đồng nhất có nồng độ c, bề dày lớp dung dịch là 1 Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì

đi qua dung dịch,

Mối quan hệ giữa I và lo được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer:

Với s là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch Hệ số này không phụ thuộc vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch

1.2.1.2 Điều kiện ứng dụng định luật Lambert-Beer

4- Chùm tia sáng phải đon sắc

4- Dung dịch phải loãng ( nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)

ị- Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).

4 Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của ánh sáng (UV-Vis)

1.2.1.3 Sự sai lệch đổi với định luật Lambert-Beer

•ể- Sai lệch do máy: (do bộ phận đơn sắc, bộ phận khuếch đại kém) như do

tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém

■ Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng đơn phân tử.

4 Do phản ứng các chất lạ:

■ Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần định lượng

■ Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng Vì vậy trong quá trình làm phản ứng “tạo màu” (tạo khả năng hấp thụ ánh sáng), phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng

1.2.1.4 Một sổ đại lượng thông dụng

l- Độ truyền qua (T-Transmittance):

Độ truyền qua (hay là còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa;

lo

ThưÒTig T tính ra phần trăm (%) Một chất có T = 1 (hay 100%), nghĩa

là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt

4- Độ hấp thụ (A-Absorbance):

Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa:

A = lgi =s.c.l

Đối với một chất xác định (có s xác định), thường đo trên một loại cốc

đo (có bề dày thông thưÒTig là 1 = Icm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch:

A=K.C ( K = 8.1)

i- Hệ số hấp thụ phần trăm ( ):

Theo công thức A = 8.C.1, nếu 1 = Icm, c = 1% thì;

A= 8 = Eiự:

Vậy ElựJ chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc

đo có bề dày Icm Với một chất tan xác định, tại một X xác định, là mộthằng số

4- Hệ số hấp thụ phân tử (8|^):

Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol, là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ lM /1, dùng cốc đo có bề dày Icm

Cũng như , với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác

định (k, dung môi, nhiệt độ, .), 8^1 là một hằng số

Giữa £¡ 0 !" và s„ có mối liên hê: Sn =

ở đây M là phân tử gam của chất tan

1.2.2 Các kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-Vis

[4] [5]

1.2.2.1 Phương pháp đo phổ trực tiếp

Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ c của dung dịch dựa vào giá trị biết trước (tra cứu)

A = £,'.7 c.l 1% - ^ C = - 4 -77 lew ( với 1 = Icm) ^

^1%Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (Ằ.)

■ Dùng kính lọc Holmium (có các giá trị ^max xác định cho trong tài liệu) để kiểm tra lại máy.

■ Dùng dung dịch K2CrƠ4, K2Cr2Ơ7 tinh khiết quang phổ pha thành dung dịch có nồng độ chính xác Đo phổ tìm các giá trị À-max và tìm

1.2.2.3 Phương pháp thêm chuẩn so sánh

Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch cần tìm nồng độ Cx Thêm một lượng chất tan a (đã b iế t) vào dung dịch, đo độ hấp thụ A ’x của dung dịch tạo thành

^ X ~ ^ X ~ ^ X

- ^ x 1.2.2.4 Phương pháp đường chuẩn

Pha một dãy dung dịch chuẩn, đo A của chúng ở bước sóng đã chọn, lập đồ thị của A theo c Đo Ax của dung dịch trên và xác định Cx dựa vào đưÒTìg chuẩn (Hình 1.1)

Trong trường hợp dung dịch không tuân theo định luật Lambert-Beer (đường chuẩn không thẳng) cần pha nhiều dung dịch chuẩn hơn với nồng độ gần nhau hon (khác nhau không quá 1 0%)

Khi xây dựng đưòng chuẩn, người ta thường sử dụng đường chuẩn tuyến tính (thẳng) hoặc tìm một đoạn tuyến tính trên đường chuẩn để sử dụng trong định lượng nếu đường chuẩn cong (phi tuyến, không thẳng).

Đường chuẩn được lập dựa vào các điểm thực nghiệm, bằng phương pháp bình phưong tối thiểu; tìm phưong trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan r Trong định lượng, nếu khảo sát được một đoạn đường chuẩn có

hệ số tưong quan r > 0,9995 là tốt

1.2.2.5 Phương pháp thêm đường chuẩn

Đo mật độ quang của dung dịch cần định lượng, rồi thêm vào những lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn vào dung dịch cần định lượng,

đo mật độ quang của các dung dịch đó Vẽ đường chuẩn (đồ thị của độ hấp thụ A theo lượng chất thêm vào) Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng độ của chất cần định lượng.(Hình 1.2)

A

Hình 1.1 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ và độ hấp thụ quang

theo phương pháp đường chuẩn

Hình 1.2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ chuẩn thêm vào với độ

hấp thụ quang theo phương pháp thêm đường chuẩn

1.2.2.6 Phương pháp chuẩn độ đo quang

i- Nguyên tắc: Phát hiện điểm tương đương bằng phương pháp đo quang

(chât cân định lượng) (thuôc thử)

p(sản phẩm)

Trong 3 chất trên, ít nhất phải có một chất hấp thụ ánh sáng ở bước sóng khảo sát

Tại điểm tưoTig đương, xuất hiện điểm gãy của đồ thị biểu diễn sự biến thiên của độ hấp thụ A của dung dịch Trên dồ thị trục tung chỉ độ hấp thụ A của dung dịch, trục hoành chỉ lượng thuốc thử cho vào dung dịch cần định lượng (Hình 1.3)

Điều quan trọng của phương pháp này là tìm được bước sóng thích họp

để xác định điểm tưoTig đương

Điểm kết thúc Thể tích thuốc thử

Hình 1.3 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa thể tích thuốc thử và độ hấp thụ

quang theo phương pháp chuẩn độ đo quang,

i ư u điểm; phưong pháp này có ưu điểm nổi bật là vẫn định lượng được trong một số trường hợp mà các phương pháp khác không áp dụng được:

■ Dung dịch có màu không quá đậm

■ Dung dịch không quá đục

■ Dung dịch không tìm được chỉ thị màu

■ Dung dịch không định lượng được bằng phương pháp chuẩn độ đo thế

1.2.2.7 Phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ

Dựa trên tính chất cộng tính của độ hấp thụ ánh sáng ta có:

A t = A ] + A 2 + _

Với hỗn họp có hai chất 1 và 2: At = Ai + A2

Lựa chọn các bước sóng Xx và ^2, đo độ hấp thụ Ati, At2 của hỗn hợp ở hai bước sóng Ằ,1 và Ằ,2 đó

Tâi I Atj ~ Eị \. C] "t" E 2 Ị C 2

Tại A-2 : At2 = E1.2 Ci + £2.2- C2

Các hệ số là các hằng số đã biết, hoặc đã xác định được bằng thực

nghiệm Giải hệ hai phương trình hai ẩn số trên, ta tính được Ci, C2

Với hỗn hợp gồm có 3 chất: đo độ hấp thụ của hỗn hợp tại 3 bước sóng

khác nhau, rồi giải hệ 3 phương trình 3 ẩn

Có thể đo mật độ quang (độ hấp thụ) tại nhiều bước sóng hơn số chất

cần định lưọng (ví dụ đo tại 4-5 bước sóng khi định lượng hỗn họp gồm 2-3

chất) rồi tính kết quả

Chú ý: trong hỗn hợp 2 chất, tại bước sóng nào đó mà có một chất

không hấp thụ ánh sáng hoặc hấp thụ không đáng kể thì ta có thể pha loãng

dung dịch rồi đo A như khi đo một chất

Ví dụ; hỗn hợp Pethidin và Chlorocresol có:

Pethiden : E 257 = 7,3 E279 = 0

Chlorocresol ; E257 = 20 E279 =105

Như vậy nếu ta đo A ở 279 nm, xác định được hàm lượng chlorocresol,

đo ở 257 nm, tính hiệu, được hàm lượng Pethidin

* Phương pháp định lượng đồng thời Metronidazol và Spiramycin trong viên nén mà chúng tôi xây dựng cũng sử dụng kỹ thuật định lượng này

1.2.3 ư u nhược điểm của phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp

thụ UV-Vis

1.2.3.1 ưu điểm

ị- Độ chính xác của phương pháp khá cao.

4- Sai số tưong đối của phương pháp nhỏ, thưcmg vào khoảng 0,5-1%

4- Độ nhạy của phương pháp giúp ta có thể phân tích được các dung dịch

loãng cỡ 1 0'"^ p,g/l, rất thích họp cho các phép phân tích vết (phân tích độc

chất)

4 Thời gian phân tích nhanh chóng, chỉ cần 5-10 phút có thể cho biết

i- Kỹ thuật thao tác đoTi giản, máy móc ngày càng hoàn thiện, gọn nhẹ,

trình độ tự động hoá, tin học hoá cao

■4- Với một số trường hợp hỗn hợp 2 thành phần có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, có cực đại hấp thụ khác nhau và thành phần này không hấp thụ quang ở bước sóng hấp thụ cực đại của thành phần kia, ta có thể dùng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-Vis để định lượng đồng thời hai thành phần mà không cần chiết tách

PHÀN 2 THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ

2.1 NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Nội dung nghiên cứu.

Tiến hành nghiên cứu, khảo sát các điều kiện để xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Metronidazol và Spiramycin trong hỗn họp thuốc bằng phương pháp đo độ hấp thụ tử ngoại trên máy quang phổ thông thường

So sánh kết quả của phưong pháp vừa xây dựng với phương pháp định lượng của các TCCS trong nước

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

ề- Viên nén Rodogyl của Aventis - Pháp, SDK; VN-6470-024- Viên nén Dophargryl của Dopharma- Việt Nam, SDK: VNB-3615-00

4 Viên nén Novogyl của Mekophar - Việt Nam, SDK; VNB-3535-05

i- Viên nén Dorogyne của Domesco - Việt Nam, SDK: VNA-3 580-00

i- Viên nén Rotaforte của Mediplantex - Việt Nam,SDK: VNA-3935-01

125mg 750.000UI vừa đủ 1 viên

■ Công thức chung: Metronidazol

Spiramycin

Tá dược

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

2.1.5.1 Chỉ tiêu nghiên cứu

Các chỉ tiêu nghiên cứu được mô tả ở hình 2.4 ở trang bên

Hình 2.4 Sơ đồ chỉ tiêu nghiên cứu của khoá luận.

2.1.3.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu

i- Khảo sát phổ hấp thụ ư v và lựa chọn các bước sóng phân tích:

Mỗi hoạt chất có bước sóng hấp thụ cực đại khác nhau, vậy nên cần phải khảo sát phổ hấp thụ u v để xác định các bước sóng hấp thụ cực đại Các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử dùng để thiết lập điều kiện xây dựng quy trình định lượng sẽ được đo độ hấp thụ quang tại các bước sóng cực đại này

để giảm thiểu sai số

Pha các dung dịch chuẩn Metronidazol và Spiramycin rồi quét phổ hấp thụ quang trên giải sóng 200-400nm

4- Khảo sát độ tuyến tính của các thành phần phân tích

Nồng độ mỗi chất phân tích đều có mối quan hệ tuyến tính với độ hấp thụ quang tại bước sóng xác định (trong một khoảng nồng độ nhất định nào

đó), nghĩa là trong khoảng nồng độ đó thì độ hấp thụ quang A phụ thuộc vào nồng độ c theo một hàm bậc nhất:

A - a.c + bCần phải xác định khoảng tuyến tính này bằng thực nghiệm, từ đó làm

cơ sở để pha các dung dịch phân tích có nồng độ nằm trong khoảng tìm được

Tiến hành pha một dung dịch gốc, sau đó pha loãng dung dịch gốc này

để thu được một dãy dung dịch chuẩn đã biết trước nồng độ Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch này tại các bước sóng hấp thụ cực đại của mỗi chất Lập phương trình hồi quy, đánh giá độ tuyến tính thông qua hệ số tưong quan

r của mỗi chất tại mỗi bước sóng phân tích

-ế- Khảo sát tính cộng phổ của dung dịch hỗn họp chứa Metronidazol và Spiramycin

Phương pháp định lượng chúng tôi xây dựng dựa trên nguyên tắc “ífợ

hấp thụ quang của một hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụ quang của các thành phần trong hỗn hợp đ ấ ỷ \ do đó cần phải kháo sát tính cộng phổ của dung

dịch hỗn họp để chứng minh rằng, trong khoảng nồng độ đã chọn thỏa mãn nguyên tắc trên

Tiến hành pha các dung dịch chuẩn của từng thành phần riêng rẽ có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính và dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từng thành phần bằng nồng độ của các thành phần trong dung dịch chuẩn riêng rẽ Đo độ hấp thụ của từng dung dịch, tính tỷ lệ giữa tổng độ hấp thụ của từng thành phần với độ hấp thụ của dung dịch chuẩn hỗn hợp

4- Phân tích mẫu:

Pha các dung dịch thử và dung dịch chuẩn, với nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính, tiến hành đo quang các dung dịch đó tại các bước sóng đã chọn Xử lý kết quả bằng phương pháp toán học

ị- Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

Khảo sát độ lặp lại bằng cách tiến hành định lượng lặp lại nhiều lần hoạt chất cần phân tích của mẫu rồi xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê

Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua khả năng thu hồi của kết quả phân tích khi dùng phương pháp thêm chuẩn Thêm vào mẫu thử một lưọng chính xác chất chuẩn đã biết trước hàm lượng sao cho dung dịch cuối cùng có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát và xác định phần trăm thu hồi

ề- So sánh giá trị trung bình và độ lặp lại của phương pháp vừa xây dựng

với phưong pháp theo các TCCS trong nước đối với kết quả định lượng ME

So sánh độ lặp lại (Test F) và so sánh giá trị trung bình (Test T) đối với kết quả định lượng ME theo hai phương pháp nêu trên

2.1.3.2 Phương pháp xử lý số liệu

i- Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê - sử dụng

công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel

Một số đặc trưng thống kê được sử dụng:

■ Sai số chuẩn : s , = - ^

s ,x í xioo

So sánh hai phương sai (test F) : F tn^ ^

s "

■ So sánh hai giá trị trung bình (test T)

2.2 THUỐC THỬ, HOÁ CHÂT, DỤNG c ụ

4- Thuốc thử: dung dịch HCl 0,1N, dung dịch NaOH 0,1N, methanol tuyệt đối ( theo DĐVNIII - “Thuốc thử”)

■«I- Chất đối chiếu: Metronidazol và Spiramycin chuẩn (do Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế cung cấp)

4- Thiết bị: Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Lambda EZ210, cân phân tích, máy siêu âm (Bộ môn Hoá Dược, Trưòng Đại học Dược Hà Nội).4* Dụng cụ: bình định mức các loại 50ml, lOOml; pipet Iml, 2ml, 5ml, lOml

2.3 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG PHỒ UV-VIS

2.3.1 Khảo sát phổ hấp thụ uv và lựa chọn các bước sóng phân tích

Cân chính xác khoảng 50mg ME chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml NaOH 0,1N, lắc đều cho tan hết trong khoảng 5 phút, bổ sung NaOH 0,1N vừa đủ cho đến vạch Lọc, bỏ 20ml dung dịch đầu Hút chính xác 2ml dịch lọc tiếp theo cho vào bình định mức lOOml, thêm NaOH 0,1N đến

vạch, thu được dung dịch Metronidazol lOjug/ml trong môi trường NaOH

0,1N.

Cân chính xác khoảng 30mg SP chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml dung dịch methanol tinh khiết, lắc đều cho tan hết, bổ sung methanol tinh khiết vừa đủ tới vạch Lọc, bỏ 20ml dung dịch ban đầu Hút chính xác 5ml dịch lọc tiếp theo cho vào bình định mức lOOml, bổ sung dung

dịch NaOH 0,1N vừa đủ tới vạch, thu được dung dịch Spiramycin 15/ug/ml

trong môi trường NaOH 0, IN.

Tiến hành ghi phổ hấp thụ riêng biệt mỗi dung dịch trên trong giải sóng 200-400nm, mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,1N, thu được phổ đồ ở hình 2.5 và hình 2.6

Hình2.6 Phổ hấp thụ của Metronidazol trong môi trường NaOH 0,1N.

Nhận xét: trong môi trưÒTig NaOH 0,1N, SP có cực đại hấp thụ tại

bước sóng 232nm, còn ME có 2 cực đại hấp thụ tại các bước sóng 319nm và 228nm Cũng dựa vào dữ liệu phổ, chúng tôi nhận thấy ở bước sóng lớn hơn 300nm, trong môi trường NaOH 0,1N, SP không còn hấp thụ quang Vậy nên,

độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp MS ở bước sóng lớn hơn 300nm

cũng là độ hấp thụ quang của ME Bởi vậy, từ độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn họfp ở bước sóng 319nm, chúng tôi có thể suy ra được nồng độ ME trong dung dịch hỗn hợp Từ nồng độ ME đã tính được, từ độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp tại bước sóng 232nm và theo định luật Lamber-Beer, chúng tôi suy ra được nồng độ SP Do đó, chúng tôi chọn 2 bước sóng phân tích là 3 19nm và 232nm.

2.3.2 Khảo sát tính tuyến tính và tính cộng phổ ờ các bước sóng phân tích của dung dịch hỗn hợp Metronidazol và Spiramycin

Cân chính xác khoảng 20mg ME chuẩn cho vào bình định mức 200ml, thêm khoảng 150ml dung dịch NaOH 0,1N, lắc đều cho tan hết, bổ sung NaOH 0,1N vừa đủ tới vạch Lọc, bỏ 50ml dung dịch đầu Dịch lọc thu được

là dung dịch chuẩn ME 100jug/ml trong môi trường NaOH 0,1N (dung dịch

A).

Cân chính xác khoảng 30mg SP chuẩn vào bình định mức 200ml, thêm khoảng 150ml methanol tinh khiết, lắc đều cho tan hết, bổ sung dung dịch methanol vừa đủ tới vạch Lọc, bỏ 50ml dung dịch đầu Dịch lọc thu được là

dung dịch chuẩn SP 150ng/ml trong môi trường methanol (dung dịch B).

Tiến hành pha các dung dịch chuẩn và dung dịch chuẩn hỗn hợp theo bảng 2.1

Bảng 2.1 Pha dãy dung dịch chuẩn và dung dịch chuẩn hỗn họp

Dung dịch

chuân M E’lF M E’2 ME’3 SP’l\ r SP’2 SP’3 M S’l MS’2 MS’3

Sô ml dung dịch cân lây vào bình định mức 5Om

lOME15SP

4ME

Thêm dung dịch aOH 0,1N vừa đủ đên vạch

Tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch trên theo ở các bước sóng 232nm và 319nm, mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,1N Kết quả về tính tuyến tính được trình bày ở bảng 2.2.

Bảng 2.2 Kết quả khảo sát tương quan hồi quy tuyến tính đối với ME và SP

trong môi trường NaOH 0,1N tại 2 bước sóng đã chọn

Phương trình hôi quy

y = ax + b

232 0,9999 y = 0,018x + 0,0004 0,9999 y = 0 ,0 3 5 7 x -0,0002

Nhận xét: Bảng 2.2 cho thấy có sự tương quan tuyến tính rõ rệt giữa độ

hấp thụ quang và khoảng nồng độ khảo sát của ME và SP tại 2 bước sóng đã nêu

Kết quả về tính cộng phổ của ME và SP trong dung dịch hỗn hợp được trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3 Kết quả khảo sát tính cộng phổ của ME và SP.

Độ hâp thụSP

Tông độ hấp thụ ME+SP

Độ hâp thụ hỗn hợp

Nhận xét: Bảng 2.3 cho thấy độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp

Metronidazol và Spiramycin có tính cộng phổ rõ ràng ở 2 bước sóng phân tích

2.3.3 Phân tích chế phẩm Rodogyl

i- Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Cân chính xác khoảng 50mg ME chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml NaOH 0,1N, lắc đều cho tan hết, bổ sung dung dịch NaOH 0,1N vừa đủ Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu Lấy chính xác Iml dịch lọc tiếp theo, cho

vào bình định mức 50ml, thêm NaOH 0,1N vừa đủ, lắc đều, thu được dung

dịch chuân Metronidazol lOßg/ml trong môi trường NaOH 0,lN.

Cân chính xác khoảng 75mg SP chuẩn, cho vào bình định mức lOOml, thêm 70ml methanol tinh khiết, lắc đều cho tan hết, bổ sung methanol vừa đủ Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu Lấy chính xác Iml dịch lọc tiếp theo cho vào bình

định mức 50ml, thêm NaOH 0,1N vừa đủ, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn

Spiramycin 15ịug/ml trong môi trường NaOH 0, ỈN.

4- Chuẩn bị mẫu thử:

Cạo bỏ lóp bao film bên ngoài, cân 10 viên, tính khối lượng trung bình viên, nghiền kỹ thành bột mịn trong cối sứ Cân một lượng bột tương ứng với khoảng lOmg ME cho vào bình định mức lOOml Thêm 40ml methanol và 40ml NaOH 0,1N, lắc kỹ, đem siêu âm 10 phút, bổ sung NaOH vừa đủ tới vạch Lọc, bỏ 20ml dịch lọc đầu, lấy chính xác lOml dịch lọc tiếp theo cho vào bình định mức lOOml, thêm NaOH 0,1N vừa đủ, lắc đều, thu được dung dịch thử

4- Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử:

Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn và thử tại 2 bước sóng

đã chọn với mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,1N

4- Cách tính nồng độ của Spiramycin và Metronidazol sau khi đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn và thử:

■ Các quy ước về thông số:

là độ hấp thụ quang của MS tại bước sóng 3 19nm (đo được)

Ả™/ là độ hấp thụ quang của MS tại bước sóng 232nm (đo được).

là độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn ME tại bước sóng

là nồng độ của ME trong dung dịch thử

■ Xây dựng công thức tính nồng độ ME và SP trong dung dịch thử:

* ở bước sóng 319nm:

Độ hấp thụ quang của MS chính là độ hấp thụ quang của ME trong hỗnhọp