Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng

MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu thưởng thức hoa và cây cảnh của con người ngày càng được chú trọng. Lily (tên khoa học là Lilium, thuộc họ Liliaceae) là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị kinh tế cao. Hoa lily có kiểu dáng sang trọng, màu sắc quyến rũ, hoa thơm, lâu tàn, dễ thu hoạch, dễ bảo quản, dễ vận chuyển và được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, cây lily có phổ trồng hẹp, do có xuất xứ ở những vùng ôn đới có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao. Bên cạnh đó, hiện nay khí hậu toàn cầu đang ngày càng biến đổi, nhiệt độ tăng lên ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng, làm giảm năng suất cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển, thậm chí khiến cây chết là một thách thức lớn cho ngành trồng hoa này. Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới, nên ở khu vực phía bắc chỉ mới bước đầu trồng thử nghiệm một số giống lily vụ đông. Hơn nữa, sự thay đổi khí hậu cùng sự nóng lên toàn cầu làm cho việc trồng cây hoa lily này vốn trước đây đã khó lại càng gặp nhiều trở ngại. Các cây hoa lily sinh trưởng, phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ cao, thể hiện ở chất lượng cây kém, đặc biệt là hoa xấu, dẫn tới năng suất cũng như chất lượng cây hoa thấp. Chính vì vậy, việc cải tiến, tạo cây giống mới có năng suất và chất lượng cao, đặc biệt là có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt độ cao là nhiệm vụ cấp bách với các nhà nghiên cứu (Đặng Văn Đông, 2010). Với nhiều phương pháp hiện đại đang được áp dụng, nhiều giống cây trồng nói chung, cây hoa nói riêng hiện nay đang được phát triển một cách chủ động. Trong chọn tạo giống hoa lily, lai xa là một phương pháp truyền thống đang được kết hợp với một số kỹ thuật hiện đại có thể tạo giống mới đạt được nhiều mục đích khác nhau thông qua việc tái tổ hợp vật chất di truyền của các dòng bố mẹ (VanTuyl et al., 1991,2003; Chi, 2002). Bên cạnh đó, giống hoa lily cũng ngày càng được làm phong phú hơn nhờ tiến hành kỹ thuật chuyển gen. Gen codA mã hóa choline oxidase, tham gia sinh tổng hợp glycin betaine đã được chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng và được chứng minh là cây chuyển gen ít nhiều có khả năng chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi. Ví dụ như cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA đã được tăng cường khả năng chịu nóng, lạnh và băng giá (Alia et al., 1998; Sakamoto et al., 2000), cây cải bẹ, bạch đàn, cà chua chuyển gen codA cũng tăng cường khả năng chịu mặn và oxy hóa (Prasad et al., 2000a; Ahma et al., 2008; Yu et al., 2009). Ở cây lily, việc chuyển một gen nhằm tăng cường khả năng chịu nóng chưa được thực hiện từ trước đến nay. Chính vì vậy, việc chuyển gen codA vào lily nhằm tăng cường khả năng chống chịu với những điều kiện bất lợi, đặc biệt là nhiệt độ cao là điều cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng” làm tiền đề cho việc tạo ra các giống hoa lily mới có khả năng chống lại các điều kiện bất thuận của môi trường. Đề tài được thực hiện với các nội dung gồm: (i) Đánh giá nguồn gen lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử và công nghệ nuôi cấy mô tế bào; (ii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng lai tạo và cứu phôi; (iii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng xây dựng và tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua A. tumefaciens; (iv) Chọn dòng lily in vitro có khả năng chịu nóng. Mục tiêu của đề tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn tạo các dòng hoa Lilium spp. có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao với mục tiêu cụ thể là (1) xây dựng được quy trình chuyển gen codA vào lát cát vảy củ lily, (2) ứng dụng kỹ thuật lai và nuôi cấy mô phôi tạo con lai chi lily và (3) đánh giá khả năng chịu nóng in vitro của các dòng lily thương mại, dòng lily chuyển gen và dòng con lai. Những kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong tạo giống cây trồng mới nói chung và cây lily nói riêng có khả năng chống chịu điều kiện nhiệt độ cao.

BÙI THỊ THU HƯƠNG

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN

VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG

CHỊU NÓNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2015

Bùi Thị Thu Hương

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN

VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG

CHỊU NÓNG

Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Mã số: 62 42 01 12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 GS.TS Lê Trần Bình

Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Trịnh Khắc Quang

Viện Nghiên cứu Rau quả

Hà Nội, 2015

i

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng

sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công

bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015

Tác giả

Bùi Thị Thu Hương

ii

Lời cám ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình và PGS.TS Trịnh Khắc Quang đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học cùng lãnh đạo, cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ Tế bào thực vật

và phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam và bộ môn Công nghệ sinh học, viện Nghiên cứu Rau Quả đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, lãnh đạo

và cán bộ thuộc bộ môn Thực vật, khoa Nông học, bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện

đề tài

Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015

Nghiên cứu sinh

Bùi Thị Thu Hương

iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

4 ADN Acid Deoxirionucleic

17 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

25 HSF Heat shock factor

26 HSPs Heat shock proteins

27 Hygr Hygromycine resistant

31 M Thang Marker chuẩn

32 MAS Marker assisted selection

33 MDA Malondialdehyde

34 Mm Millimolar

35 MS Murashige and Skoog, 1962

36 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein

37 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β-D-glucoronide

38 µl micro litte

39 µM Micromolar

40 NptII Neomycin Phosphotransferase II

41 PCR Polymerase Chain Reaction

42 Pic Picloram

43 QTL Quantitative trait loci

44 RAPD Random Amplified Polymorphic AND

v

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cám ơn ii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU iii

MỤC LỤC v

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cây lily 3

1.1.1 Giới thiệu chung về lily 3

1.1.2 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily 3

1.1.3 Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily 4

1.1.4 Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của cây lily 5

1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật 6

1.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật 6

1.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến cây lily 8

1.2.3 Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật và lily 9

1.3 Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở thực vật 15

1.3.1 Giới thiệu chung về glycine betaine 15

1.3.2 Chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu cho cây trồng 16

1.4 Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công

nghệ gen 17

1.4.1 Công nghệ tế bào trong tạo giống lily 17

1.4.2 Tình hình ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống lily 18

vi

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu 21

2.1.1 Thực vật 21

2.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng 22

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24

2.1.4 Máy móc và thiết bị 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Các phương pháp sử dụng trong đánh giá vật liệu nghiên cứu 25

2.2.2 Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi 27

2.2.3 Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng kỹ

thuật gen 30

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37

3.1 Đánh giá tập đoàn các giống lily nghiên cứu 37

3.1.1 Đánh giá quan hệ di truyền các giống lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử 37

3.1.2 Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của một số giống lily nghiên cứu 39

3.1.3 Ngưỡng chịu nóng in vitro của một số giống lily nghiên cứu 41

3.2 Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi 44

3.2.1 Kiểm tra chất lượng hạt phấn của một số giống hoa lily nghiên cứu 44

3.2.2 Lai tạo và cứu phôi 45

3.2.3 Bước đầu xác định con lai bằng chỉ thị phân tử 48

3.4.4 Khả năng chịu nhiệt cao của mô vảy củ của các dòng lily lai được

tạo ra 53

3.3 Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng công nghệ gen 55

3.3.1 Thiết kế vector chuyển gen chứa gen codA mã hóa choline oxydase 55

3.3.2 Tối ưu hóa qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily bằng

A tumefaciens 62

vii

3.3.3 Chuyển gen codA mã hóa choline oxydase vào lily 71

3.3.4 Khả năng chịu nóng các dòng lily chuyển gen 73

3.3.5 Khả năng tích lũy glycine betaine ở một số dòng lily chuyển gen codA 77

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 79

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91

1 Kết luận 91

2 Đề nghị 92

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 93

TÀI LIỆU THAM KHẢO 95

SUMMARY 112

PHỤ LỤC 115

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách tên và ký hiệu giống lily (Lilium spp.) sử dụng 21

Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen TP-codA-cmyc và codA-cmyc 23

Bảng 2.3 Tên và trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.4 Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.5 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 24

Bảng 2.6 Môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây lily chuyển gen 24

Bảng 3.1 Hệ số tương đồng di truyền giữa 13 giống lily nghiên cứu 37

Bảng 3.2 Sự phát sinh hình thái và cảm ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ các giống lily sau 4 tuần nuôi cấy 40

Bảng 3.3 Tỷ lệ hữu dục và tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn các giống lily nghiên cứu 44

Bảng 3.4 Tỷ lệ tạo quả sau thụ phấn của các tổ hợp lai 46

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA tới tỷ lệ nảy mầm và tạo củ in vitro từ hạt lai được tách ra từ lát cắt quả non 47

Bảng 3.6 Khả năng sống sót và khả năng tái sinh củ của lát cắt vảy củ 3 dòng lily lai và các dòng bố mẹ sau xử lý nhiệt (37oC ± 1oC, 13 ngày) 54

Bảng 3.7 Tên và trình tự đoạn mồi nhân đoạn promoter HSP18.2 của

A thaliana 57

Bảng 3.8 Kết quả chuyển gen codA vào thuốc lá nhờ A tumefaciens 60

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của Cefotaxime đến sự tái sinh củ của lát cắt vảy củ đã biến nạp 64

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hygromycine đến khả năng sống của củ lily

in vitro 65

Bảng 3.11 Khả năng chuyển gen của các chủng A tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily 66

ix

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen

vào lát cắt vảy củ lily 67Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển

gen vào lily 67Bảng 3.14 Khả năng nhận các cấu trúc gen ở 3 giống lily nghiên cứu 71

Bảng 3.15 Khả năng sống sót của các dòng lily chuyển gen in vitro sau xử

lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) 74

Bảng 3.16 Khả năng sống sót của mô vảy củ in vitro của 8 dòng lily

chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) 75

Bảng 3.17 Khả năng sống sót tạo củ in vitro của lát cắt vảy củ của một số

dòng lily chuyển gen sau xử lý nhiệt (37 oC ± 1oC, 13 ngày) 76Bảng 3.18 Mối quan hệ sự tích lũy glycine betain trong lá và một số đặc

điểm khác của một số dòng lily in vitro 77

x

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR 13 giống lily với mồi ISSR 8 (A),

mồi ISSR 52 (B) 37

Hình 3.2 Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền giữa 13 giống lily 38

Hình 3.3 Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC ± 1oC 42

Hình 3.4 Tỷ lệ sống sót của các giống khi nuôi cấy ở nhiệt độ 42oC ± oC 43

Hình 3.5 Sự tạo củ lily in vitro từ lát cắt vảy củ(A) và khả năng sống của củ lily in vitro trong điều kiện nhiệt độ cao(B) 44

Hình 3.6 Hạt phấn bắt màu thuốc nhuộm (A) và hạt phấn nảy mầm (B) 45

Hình 3.7 Sự cứu phôi bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt bầu nhụy (A);

nuôi cấy phôi (B) 47

Hình 3.8 Sản phẩm PCR với mồi RAPD của các cặp bố mẹ và dòng con lai 49

Hình 3.9 Sản phẩm PCR với mồi ISSR 51(A) và ISSR 55(B) của tổ hợp Sor, Bel và 134 50

Hình 3.10 Sản phẩm PCR với mồi ISSR 7 (a) và ISSR 55 (b) của tổ hợp Sor và L; L và F và các con lai 51

Hình 3.11 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa con lai và dòng bố mẹ 53

Hình 3.12 Ảnh điện di sản phẩm TP-codA-cmyc, pBI121/35S-codA-cmyc và pCAMBIA1301 sau khi cắt bởi enzym giới hạn HindIII, EcoRI (A) và sản phẩm tinh sạch các đoạn gen (B) 55

Hình 3.13 Sơ đồ vùng T- DNA của pCAMBIA1301 tái tổ hợp chứa gen codA được điều khiển bởi promoter 35S CAMV 56

Hình 3.14 Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của các khuẩn lạc A tumefaciens 57

Hình 3.15 Kết quả nhân đoạn (A) và tinh sạch (B) promoter HSP18.2 58

xi

Hình 3.16 Sản phẩm cắt vector

pCAMBIA1301/35S-TP-codA-cmyc/35S-GUS-Nos, promoter HSP18.2 bằng enzyme giới hạn HindIII,

XbaI (A) và sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu(B) 59

Hình 3.17 Sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen codA trong cây thuốc lá 61

Hình 3.18 Chồi thuốc lá in vitro chuyển gen codA-cmyc (A ) và

TP-codAcmyc (B) khi được xử lý X-gluc 61

Hình 3.19 Hình ảnh điện di protein ở các dòng thuốc lá chuyển gen codA 61

Hình 3.20 Cây thuốc lá trước (A) và sau (B) xử lý nhiệt (37 oC ± 1 oC, 21 ngày) 62

Hình 3.21 Sự tái sinh củ in vitro từ lát cắt vảy củ lily đã biến nạp sau 4

tuần nuôi cấy 64

Hình 3.22 Củ lily in vitro trong môi trường có hygromycine sau 4 tuần

nuôi cấy 64

Hình 3.23 Sự biểu hiện tạm thời gen GUS của lát cắt vảy củ sau biến nạp 69

Hình 3.24 Sự biểu hiện gen GUS ở cây lily in vitro 8- 12 tuần tuổi 69

Hình 3.25 Các bước chuyển gen thông qua A tumefaciens vào lát cắt vảy

củ lily in vitro 69

Hình 3.26 Quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua vi khuẩn

A tumefaciens hiệu quả cao 70

Hình 3.27 Sự hình thành và phát triển củ lily in vitro của vảy củ được

biến nạp tổ hợp gen đích (gồm gen kháng hygromycin, gen

GUS và gen codA) 72

Hình 3.28 Cây lily in vitro được chuyển tổ hợp gen đích (gồm gen kháng

hygromycine, gen GUS và gen codA) bắt màu với thuốc nhuộm

X-gluc 72Hình 3.29 Ảnh điện di sản phẩm RT – PCR mẫu lily với mồi đặc hiệu gen

codA (A) và gen TP-codA (B) 73

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu thưởng thức hoa và cây cảnh của con người ngày càng được chú trọng

Lily (tên khoa học là Lilium, thuộc họ Liliaceae) là một trong những loài hoa

đẹp và có giá trị kinh tế cao Hoa lily có kiểu dáng sang trọng, màu sắc quyến rũ, hoa thơm, lâu tàn, dễ thu hoạch, dễ bảo quản, dễ vận chuyển và được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, cây lily có phổ trồng hẹp, do có xuất xứ ở những vùng ôn đới có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao Bên cạnh đó, hiện nay khí hậu toàn cầu đang ngày càng biến đổi, nhiệt độ tăng lên ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng, làm giảm năng suất cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển, thậm chí khiến cây chết là một thách thức lớn cho ngành trồng hoa này Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới, nên ở khu vực phía bắc chỉ mới bước đầu trồng thử nghiệm một số giống lily vụ đông Hơn nữa, sự thay đổi khí hậu cùng sự nóng lên toàn cầu làm cho việc trồng cây hoa lily này vốn trước đây đã khó lại càng gặp nhiều trở ngại Các cây hoa lily sinh trưởng, phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ cao, thể hiện ở chất lượng cây kém, đặc biệt là hoa xấu, dẫn tới năng suất cũng như chất lượng cây hoa thấp Chính vì vậy, việc cải tiến, tạo cây giống mới có năng suất và chất lượng cao, đặc biệt là có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt độ cao là nhiệm vụ cấp bách với các nhà nghiên cứu (Đặng Văn Đông, 2010)

Với nhiều phương pháp hiện đại đang được áp dụng, nhiều giống cây trồng nói chung, cây hoa nói riêng hiện nay đang được phát triển một cách chủ động Trong chọn tạo giống hoa lily, lai xa là một phương pháp truyền thống đang được kết hợp với một số kỹ thuật hiện đại có thể tạo giống mới đạt được nhiều mục đích khác nhau thông qua việc tái tổ hợp vật chất di truyền của các dòng bố mẹ (VanTuyl

et al., 1991,2003; Chi, 2002) Bên cạnh đó, giống hoa lily cũng ngày càng được làm

phong phú hơn nhờ tiến hành kỹ thuật chuyển gen Gen codA mã hóa choline

nhiều loài cây trồng và được chứng minh là cây chuyển gen ít nhiều có khả năng

chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi Ví dụ như cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA đã được tăng cường khả năng chịu nóng, lạnh và băng giá (Alia et

al., 1998; Sakamoto et al., 2000), cây cải bẹ, bạch đàn, cà chua chuyển gen codA

cũng tăng cường khả năng chịu mặn và oxy hóa (Prasad et al., 2000a; Ahma et al., 2008; Yu et al., 2009) Ở cây lily, việc chuyển một gen nhằm tăng cường khả năng

chịu nóng chưa được thực hiện từ trước đến nay Chính vì vậy, việc chuyển gen

codA vào lily nhằm tăng cường khả năng chống chịu với những điều kiện bất lợi,

đặc biệt là nhiệt độ cao là điều cần thiết

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng công

nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng” làm tiền đề cho việc tạo ra các giống hoa lily mới có khả năng

chống lại các điều kiện bất thuận của môi trường

Đề tài được thực hiện với các nội dung gồm:

(i) Đánh giá nguồn gen lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử và công nghệ nuôi cấy mô tế bào; (ii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng lai tạo và cứu phôi; (iii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng xây dựng và tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua A tumefaciens; (iv) Chọn dòng lily in vitro có khả năng chịu nóng

Mục tiêu của đề tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn

tạo các dòng hoa Lilium spp có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao với mục tiêu cụ thể là (1) xây dựng được quy trình chuyển gen codA vào lát cát

vảy củ lily, (2) ứng dụng kỹ thuật lai và nuôi cấy mô phôi tạo con lai chi lily và

(3) đánh giá khả năng chịu nóng in vitro của các dòng lily thương mại, dòng lily

chuyển gen và dòng con lai

Những kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong tạo giống cây trồng mới nói chung và cây lily nói riêng có khả năng chống chịu điều kiện nhiệt độ cao

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây lily

1.1.1 Giới thiệu chung về lily

Cây hoa lily (có nơi còn gọi là hoa loa kèn, huệ tây) có tên khoa học là

Lilium spp thuộc Chi Lilium, Họ Loa Kèn (Liliaceae), Bộ Loa Kèn (Liliales), Lớp

Thực vật Một lá mầm (Liliopsida) (Phạm Hoàng Hộ, 2000) Chi Lilium được phân

thành 7 nhóm, đó là các nhóm có tên Liriotypus, Martagon, Pseudolirium, Archelirion, Sinomartagon, Leucolirion và Oxypetalum (Comber, 1994a) Phân loại của lily hiện nay được mở rộng thêm bởi việc lai tạo giữa các giống giữa nhóm lily quan trọng có màu sắc đẹp quyến rũ, hoa thơm, lâu tàn, kiểu dáng sang trọng, dễ thu hoạch, bảo quản và vận chuyển, có giá trị kinh tế cao, đang được ưa chuộng trên thế giới và ở Việt Nam (Đặng Văn Đông, 2010)

1.1.2 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily

Cây hoa lily có nguồn gốc chủ yếu từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, California (Mỹ) và rải rác ở một số nơi khác Loại cây này có mặt ở hầu hết các châu lục, với một khoảng phân bố rộng từ 10o đến 60o độ bắc của những vùng có khí hậu ôn đới và lạnh hoặc ở những vùng núi cao từ 1200m trở lên của các vùng nhiệt đới như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Việt Nam Ước chừng khoảng 80 loài cơ bản, chúng xuất hiện ở châu Á với khoảng 50-60 loài, châu Mỹ có 20 loài, châu Âu là 12 loài Ngoài ra, còn rất nhiều loài lai tạo giữa các loài trong tự nhiên như: Aarrelian, Backhause, Fista, Olipie được phân bố ở nhiều nơi (Trần Duy Quý

và cs., 2004)

Lily là cây một lá mầm, thân thảo lâu năm, phần dưới mặt đất gồm thân vảy,

rễ Phần trên mặt đất gồm lá, thân Thân vảy là phần phình to của thân tạo thành Trên đĩa thân vảy có vài chục vảy hợp lại Lá lily mọc rải rác thành vòng, đầu lá hơi nhọn, không có cuống hoặc cuống ngắn Quả lily là quả nang, có 3 góc và 3 nang,

mỗi nang có nhiều hạt (400-500), độ lớn trọng lượng hạt tùy theo giống Trong điều

kiện khô và lạnh, hạt có thể bảo quản được 3 năm

Hoa lily có hình dạng hoa rất phong phú và hấp dẫn Một số loài hoa có

dạng hình phễu như L longifloum, L candidum; có loài có dạng hình chén như

L wallichianum với những cánh hoa nhỏ hẹp; có loài lại có dạng hình chuông

như L cannadense; hình nõ điếu L auratum Hoa lily có màu sắc cũng rất phong

phú: như là màu trắng của L longiflorum; màu đỏ L candidum; ngoài ra còn có

các màu khác là vàng, hồng, tím Hoa lily có mùi hương thơm ngát (ví dụ

L auratum) nhưng cũng có loài mùi khó chịu (như ở L matargon) Hoa dạng

lưỡng tính, có 6 cánh; 6 nhị (bao gồm bao phấn và chỉ nhị); một nhụy (bao gồm

đầu nhụy, vòi nhụy và bầu nhụy); vòi nhụy dài; đầu nhụy hình cầu chẻ ba (Đặng

Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2004)

1.1.3 Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily

Loài lily hoang dại L candidum là giống được mô tả lần đầu tiên là tổ tiên

của các gốc hoa lily phát triển tới ngày nay Đến giữa thế kỷ 13, ít nhất có 3 loại

hoang dại được ghi chép lại Loại thứ nhất là lily hoa trắng dùng làm thuốc được gọi

là loại hoang dược (L brownii), loại thứ hai là Quyển Đan (L lancifolium), loại thứ

ba là Sơn Đan (L pumilum) Năm 1765, Trung Quốc đã xây dựng một số vùng

trồng lily chủ yếu để ăn và làm thuốc Vài chục năm trở lại đây lại xuất hiện một số

giống cây lily hoang dại được trồng chủ yếu ở trong vườn thực vật các tỉnh Tô

Châu, Cam Túc, Tứ Xuyên, Vân Nam Cuối thế kỷ 16 các nhà thực vật học người

Anh đã phát hiện và đặt tên cho các giống cây lily Đầu thế kỷ 17, cây lily được di

thực từ Châu Âu đến Mỹ Sang thế kỷ 18, các giống lily của Trung Quốc được di

thực sang Châu Âu và lily được coi là cây hoa quan trọng của Châu Âu, Châu

Mỹ.Vào cuối thế kỷ 19, bệnh virus lây lan mạnh ở lily đến nỗi mà người ta tưởng

chừng cây lily sẽ bị hủy diệt Tuy nhiên, đến đầu thế kỷ 20, khi người ta phát hiện ra

giống lily thơm (L.regane) ở Trung Quốc giống này được nhập vào Châu Âu và

chúng đã được dùng vào việc lai tạo giống mới để tạo ra các giống có tính thích ứng

rộng, cây lily lại được phát triển mạnh mẽ Sau đại chiến thế giới thứ 2, các nước

Châu Âu có cao trào tạo giống lily Rất nhiều giống lily hoang dại của Trung Quốc

đã được sử dụng làm giống bố mẹ và người ta đã tạo ra nhiều giống mới có giá trị

đến ngày nay (Võ Văn Chi & Dương Đức Tiến, 1978)

Ở Việt Nam, các nhà khoa học mới phát hiện thấy 2 loài cây là

Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, có vẩy củ thân dùng làm thuốc và loài Lilium

poilanei Gagnep có ở Sapa, Hoàng Liên Sơn (Trần Duy Quý và CS, 2004)

Ngày nay, do nhu cầu tiêu dùng hoa lily trên thế giới ngày càng tăng nên hoa

lily ngày càng được trồng phổ biến hơn Diện tích trồng hoa lily được mở rộng ở

những vùng có điều kiện thuận lợi như khí hậu phù hợp, trình độ sản xuất tiên tiến

và chi phí sản xuất rẻ Tuy nhiên, sản xuất củ giống lily trên thế giới tập trung ở một

số nước, trong đó Hà Lan có diện tích sản xuất lớn nhất với khoảng trên 4000 ha,

theo sau là Pháp (khoảng 400ha); Chile (khoảng 200ha ); Mỹ (khoảng 200ha); Nhật

Bản (khoảng 200ha) và New Zealand (khoảng 100ha)

Ở Việt Nam, lily cũng là một trong những loại hoa cắt cành có giá trị kinh tế

cao nhất Trước năm 2000, lily được trồng chủ yếu ở Đà Lạt Ngày nay, Lilium

longiflorum (loa kèn) được trồng nhiều nơi với diện tích khoảng 3 ha, còn diện tích

sản xuất lily lai nhập nội đang dần tăng lên (khoảng 10 ha) Nhu cầu tiêu dùng nội

địa mỗi năm vào khoảng 20 triệu cành lily, trong khi chúng ta mới chỉ đáp ứng 12

triệu cành, lượng còn lại chúng ta phải nhập khẩu từ các nước khác (chủ yếu từ

Trung Quốc, Hà Lan, Đài Loan) Đây là một thách thức cho các nhà trồng lily ở

Việt Nam nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước và một phần cho xuất khẩu Tuy nhiên,

để mở rộng diện tích trồng trọt trong nước là một khó khăn lớn, do Việt Nam thuộc

vùng khí hậu nhiệt đới Như vậy, muốn thực hiện việc này cần phải tiến hành chọn

tạo giống mới thích hợp (Đặng Văn Đông và CS, 2010)

1.1.4 Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của

cây lily

Lily là cây ưa ánh sáng với cường độ ánh sáng yếu Thời gian chiếu sáng

thích hợp cho thời kỳ sinh trưởng là 10 giờ/ngày; ở thời kỳ ra hoa, chất lượng hoa

tăng khi thời gian chiếu sáng 11 giờ/ngày (với nhiệt độ trung bình 18oC) Lily

thích hợp không khí ẩm ướt với độ ẩm trung bình là 80% - 85% Thời kỳ đầu cây cần nhiều nước để duy trì độ ẩm trong củ; thời kỳ ra hoa nhu cầu nước giảm đi (vì nhiều nước củ dễ bị thối, rụng nụ) Lily sinh trưởng tốt ở nơi đất nhiều mùn, đất thịt nhẹ, thoát nước tốt Lilyrất mẫn cảm với muối, đất nhiều muối cây không hút được nước đặc biệt thời kỳ phân hóa hoa và ra hoa Nói chung, hàm lượng muối trong đất không được cao quá 1,5 mg/cm3 Lily cần dinh dưỡng cao nhất là 3 tuần đầu sau khi nảy mầm Tuy nhiên, thời gian này cây cũng con dễ bị ngộ độc do muối, vì vậy để tránh bị ngộ độc muối trước khi trồng 6 tuần cần phải phân tích đất Nhiệt độ thích hợp cho lily sinh trưởng ban ngày 20oC - 25oC, ban đêm 13oC -

17oC Ở điều kiện môi trường dưới 5oC và trên 28oC sự sinh trưởng của cây bị ảnh hưởng xấu Nhiệt độ thích hợp nhất của cây lily trong thời gian đầu dao động trong khoảng 12oC - 13oC cho 1/3 chu kỳ sinh trưởng của cây hoặc ít nhất là cho đến khi các bộ phận rễ đã trưởng thành Nói chung, hầu hết các giống lily, đặc biệt các giống mọc hoang dại hay đang được trồng chủ yếu ở vùng có vĩ độ cao (ví dụ Hà Lan) ưa khí hậu mát và ẩm nên có tính chịu rét tốt, chịu nóng kém (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2004)

Chính vì vậy, hiện nay khu vực trồng hoa lily ở nước ta chỉ mới tập trung ở miền Bắc vào mùa đông hay một số vùng núi cao như Đà Lạt, Lâm Đồng Để phát triển ngành trồng hoa này ở Việt nam, các nhà khoa học đang phải tiến hành nghiên cứu cải tiến, thay đổi điều kiện trồng trọt hay chọn tạo giống mới có khả năng chống chịu với điều kiện khí hậu, tự nhiên khắc nghiệt

1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật

1.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật

Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của cây Nhiệt độ môi trường xung quanh cao là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với thực vật và cây trồng trên toàn thế giới Nhiệt độ cao gián đoạn hoặc liên tục là nguyên nhân gây ra một loạt thay đổi về hình thái giải phẫu, sinh lý và sinh hóa; ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển của thực vật dẫn đến suy giảm sản lượng và thậm chí có thể gây chết (Hall, 2001)

1.2.1.1 Thay đổi trong hình thái, giải phẫu

Nhiệt độ cao tác động vào giai đoạn đầu của sự hình thành lá ở Zygophyllum

qatarense, làm lá đa hình và có xu hướng giảm sự bốc hơi nước (Sayed, 1996)

Nhiệt độ cao làm ảnh hưởng nghiêm trọng về sự tăng trưởng cành non, chiều dài lóng và dẫn đến sự chết sớm của cây (Hall, 1992) Ở cà chua, hiệu ứng đáng chú ý nhất của nhiệt độ cao trong quá trình sinh sản là vòi nhụy kéo dài vượt ra ngoài bao phấn hình nón làm ngăn chặn tự thụ phấn (Hall, 1992) Ở cấp độ giải phẫu, chúng

có chung một xu hướng là giảm kích thước tế bào, đóng lỗ khí khổng để giảm mất

nước, tăng mật độ lỗ khí và mạch xylem thường lớn hơn của cả rễ và thân (Anon et

al., 2004) Ở cây nho, khi nhiệt độ cao, cấu trúc màng thylakoid thay đổi như là sự

mất mát các cột Grana hoặc các cột này sưng phồng; các không bào to; các cristae bị

gián đoạn và ty thể trở thành rỗng (Zhang et al., 2005) Nhiệt độ cao tăng tốc

chuyển động của các phân tử qua màng do đó nới lỏng các liên kết hóa học trong các phân tử của màng sinh học, biến tính protein hoặc tăng các axit béo không bão

hòa, làm cho màng sinh học bị lỏng hóa (Savchenko et al., 2002)

1.2.1.2 Những thay đổi về sinh lý

a Cân bằng về nước bị phá vỡ

Trạng thái nước của thực vật có những biến đổi quan trọng nhất theo sự thay

đổi nhiệt độ của môi trường xung quanh (Mazorra et al., 2002) Nói chung, các thực

vật có xu hướng duy trì trạng thái nước ổn định, kể cả khi độ ẩm cao Tuy nhiên, nhiệt độ cao làm hỏng thiên hướng này khi nước chỉ có hạn (Machado & Paulsen, 2001) Trên đồng ruộng, stress nhiệt thường kết hợp với sự giảm lượng nước trong

tế bào (Morales et al., 2003; Simoes-Araujo et al., 2003; Tsukaguchi et al., 2003; Anon et al., 2004; Wahid & Close, 2007)

b Sự thay đổi trong quang hợp

Quang phản ứng trong thylakoid và chuyển hóa cacbon trong stroma của lục

lạp đã được nghiên cứu khi thực vật tiếp xúc nhiệt độ cao (Wise et al., 2004) Tỷ lệ

diệp lục a/ b tăng và tỷ lệ chất diệp lục/carotenoid giảm ở những kiểu gen có khả

năng chống chịu nhiệt độ cao (Camejo et al., 2005; Wahid & Ghazanfar, 2006)

Những tác động về chất diệp lục hoặc bộ máy quang hợp có liên quan đến sự hoạt

động tổng hợp các chất oxy hóa cũng đã được nghiên cứu (Camejo et al., 2006; Guo

et al., 2006) Nhiệt cao có thể dẫn đến sự phân ly của phức vận chuyển oxy (OEC),

dẫn đến sự mất cân bằng vận chuyển dòng electron giữa OEC và chất nhận điện tử

của PSI và PSII (hệ thống quang hóa I và II) (De Ronde et al., 2004)

c Sự hình thành chất oxy hoá (AOS)

Ngoài sự mất nước ở mô, stress nhiệt có thể gây ra stress oxy hóa Ví dụ, sự tái tạo và hoạt hóa của phức hoạt hóa ôxy (activated oxygen species - AOS) bao gồm oxy phân tử (O2), superoxyde (O2-), hydrogen peroxyde (H2O2) và hydroxyl (OH-) là những triệu chứng của tổn thương tế bào do nhiệt độ cao (Sairam & Tyagi,

2004; Xu et al., 2006)

1.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến cây lily

Nhiệt độ cao (26oC ban ngày/ 24oC ban đêm) có thể làm một số giống lily lai châu Á như 'Red Carpet', 'Cherub', 'Sunray' và 'Connecticut Lemonglow' không xuất hiện chồi cấp ba Hàm lượng của fructose ethanol hòa tan, glucose, sucrose trong lá

và nụ ở nhiệt độ trên thấp hơn so với ở 16oC/13oC của giống 'Red Carpet' Các tác giả này cũng cho rằng, sự cung cấp carbohydrate để chồi hoa phát triển có thể bị giới hạn ở nhiệt độ cao và kết quả là chồi hoa bị hỏng (Mark S Roh, 1990)

Nhiệt độ cao trong một thời gian ngắn đã tác động đến các enzym chống oxy hóa, hàm lượng protein hòa tan và độ dẫn điện tương đối của hai giống lily ‘White Heaven’ và ‘Tiber’ Ngoài ra, hình thái thực vật và hàm lượng malondialdehyde (MDA) cũng bị ảnh hưởng một phần ở 37oC và 42oC, tăng rõ rệt ở 47oC đặc biệt

giống Tiber (Yin et al., 2007) Tác giả này tiếp tục nghiên cứu xác định những thay đổi các chất oxy hóa (ROS) và sự đáp ứng của lily (L longiflorum) ở nhiệt độ

cao (47oC) Cụ thể là stress nhiệt gây ra sự thiệt hại oxy hóa, liên quan đến những thay đổi trong hoạt động enzyme chống oxy hóa và chất chống oxy hóa (Yin & Chen, 2008)

Khi Lilium davidii Duchartre.var.unicolor bị xử lý nhiệt độ cao, hàm lượng

chất diệp lục giảm, tính thấm màng tế bào, độ dẫn điện tăng, lượng MDA, SOD tăng lên, hoạt động POD đầu tiên tăng và sau đó giảm Giống này có thể chịu đựng

42oC/38oC; 40oC/35oC khoảng 72 giờ, 96 giờ; ngoài thời gian trên, cây lily không thể phục hồi vì bị hư hỏng nặng Ở nhiệt độ cao 37oC/ 32oC, Lilium davidii

Duchartre.var.unicolor không bị ảnh hưởng đáng kể (Xing, 2010)

Ngoài những báo cáo trên sự nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến lily còn rất hiếm, không rõ ràng Chính vì vậy, cần nghiên cứu chuyên sâu nhằm cung cấp cơ sở lý luận chung về ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến lily và phương pháp nhằm khắc phục những tổn hại về năng suất, chất lượng của cây hoa có giá trị cao này

1.2.3 Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật và lily

1.2.3.1 Xử lý cây giống bằng cảm ứng tăng cường khả năng chịu nhiệt

Việc tăng cường khả năng chịu nhiệt của giống cây có sản lượng cao sẵn có

là một hướng đáng chú ý Cơ sở cơ bản của kỹ thuật này là xử lý cây trước khi gieo trồng Để thực hiện điều này, có rất nhiều phương pháp như phun lên lá hay xử lý hạt bằng dung dịch pha loãng các loại muối vô cơ, các chất gây áp suất thẩm thấu (ví dụ glycin betaine), các phân tử dẫn truyền tín hiệu (hormone sinh trưởng), chất oxi hóa (H2O2) cũng như việc tạo điều kiện ban đầu cho cây

Các nhà khoa học đề xuất rằng khả năng chịu nhiệt độ cao liên quan tới việc tăng cường tổng hợp glutathione, thúc đẩy việc liên kết amino (Wahid & Close, 2007) So với cây không được xử lý, lá của cây được xử lý trước bởi nhiệt biểu hiện

sự ổn định nhiệt cao hơn, sự oxi hóa sinh malondialdehyde (MDA) thấp hơn và

những tác hại đối với lục lạp thấp hơn trong điều kiện bất lợi về nhiệt độ (Xu et al.,

2006) Việc tiếp xúc trước tạo thuận lợi cho việc giữ lại lá xanh nhiều hơn trong giai

đoạn nở hoa, dẫn đến năng suất giảm ít hơn (Tewolde et al., 2006)

Cây cà chua đã được xử lý điều chỉnh sự thẩm thấu tốt thông qua việc duy trì khả năng thẩm thấu và độ dẫn khí khổng, do vậy sinh trưởng tốt hơn cây không xử

lý (Morales et al., 2003)

Một số loại cỏ mùa lạnh, khi sốc nhiệt, Ca2+ cần thiết để duy trì hoạt động chống oxi hóa chứ không phải cho việc điều hòa thẩm thấu (Jiang & Haung, 2001) Khi sốc nhiệt (nhiệt độ cao), lượng Ca2+ đòi hỏi cho sinh trưởng cao giúp cho việc làm giảm bớt ảnh hưởng của sốc nhiệt (Kleinhenz & Palta, 2002) Việc cung cấp Ca2+ ngoại bào thúc đẩy sức chống chịu nhiệt cho cây Việc cung cấp

Ca2+ dưới dạng CaCl2 trước khi xử lý nhiệt làm tăng sản phẩm oxi hóa lipid, đồng

thời kích thích hoạt động của guaiacol peroxidase, superoxide dismutase và

catalase, điều này có thể giải thích cho sự tích lũy khả năng chống chịu nhiệt

(Kolupaev et al., 2005)

Trong số các hợp chất hữu cơ trọng lượng phân tử thấp, glycine betaine (GB) và polyamine đã được ứng dụng thành công để tăng khả năng chịu nhiệt độ cao trong rất nhiều loài thực vật Chẳng hạn như ở lúa mạch, khi được xử lý trước với glycine betaine dẫn tới việc tổn thương màng thấp hơn, hiệu suất quang hợp tốt hơn, thế nước của lá được cải thiện và trọng lượng khô của cây cao hơn so với

hạt không được xử lý (Wahid & Shabbir., 2005) Li et al (2011)cũng sử dụng GB

để cảm ứng tăng cường khả năng chịu nhiệt của hạt cà chua giai đoạn nảy mầm Ứng dụng ngoại sinh của một trong hai GB hoặc H2O2 cũng cải thiện cả khả năng

chịu lạnh và stress oxy hóa đồng thời với tăng cường hoạt động catalase (Park et

al., 2004)

Như vậy, cho đến thời điểm hiện tại, đã có một số công trình sử dụng phương pháp tăng cường khả năng chịu nhiệt của cây bằng xử lý giống với một số tác nhân hóa học Tuy nhiên, ở lily, chưa có một công trình nào công bố việc sử dụng kỹ thuật này với một tác nhân nào nhằm tăng cường khả năng chống chịu nhiệt độ cao

ở lily

1.2.3.2 Sàng lọc giống có khả năng chịu nhiệt

Các nhà trồng trọt thường tạo điều kiện để tập đoàn giống sinh trưởng, phát triển dưới nhiệt độ cao để phân biệt giữa khả năng chịu nhiệt và tiềm năng tăng trưởng giữa chúng Kết quả xác định thấy rằng, thực vật với tiềm năng tăng trưởng cao hơn thường thể hiện khả năng chịu nhiệt tốt hơn trong bất cứ điều kiện phát triển như thế nào (Wahid & Close., 2007)

Ở lily, để chọn lọc các giống có khả năng chịu nhiệt, người ta có thể tìm kiếm các giống có khả năng sống ở những vùng lục địa hay quẩn đảo nhiệt đới nóng như

là L regale ở Trung Quốc, L sulphureum ở Myanmar, L formosanum ở Đài Loan,

L longiflorum ở Nhật Bản (Okubo, 2014) Tại Việt Nam, các tác giả Đặng Văn

Đông và cộng sự cũng cho rằng L longiflorum và đặc biệt là L formolongo có khả

năng trồng được ở một số tỉnh thành trong cả nước ngay cả ở thời điểm mùa hè nắng nóng (Đặng Văn Đông và cs., 2010)

1.2.3.3 Lai tạo dòng chịu nóng

Để tạo dòng chịu nóng, người ta cũng có thể tiến hành lai tạo giữa dòng có khả năng chịu nóng nhưng các đặc tính về nông học không ưu việt và dòng có năng suất cao (có đặc tính ưu việt) Ví dụ, ở dòng cà chua có khả năng chịu nóng, hai đặc điểm không mong muốn (không ưu việt) thường được quan sát thấy là quả nhỏ và tán lá bị hạn chế Việc tạo ra các trái nhỏ có thể do tác dụng phụ của nhiệt độ cao đến sự sản sinh của auxin trong trái cây và tán cây nhỏ là do bản chất sinh sản của

các kiểu gen chịu nhiệt (Scott et al., 1997)

Tuy nhiên, các đặc tính khác của giống chịu nhiệt là vẫn còn trong bí ẩn và chúng ta cần chú ý nhiều hơn Tài liệu chứa các thông tin về cây có khả năng chịu nhiệt trong giống cây trồng khác nhau còn tương đối ít Tuy nhiên, bất chấp tất cả sự phức tạp của khả năng chịu nhiệt và những khó khăn gặp phải trong quá trình chuyển khả năng chịu nhiệt của dòng bố mẹ tới các cây lai ghép đã đang được phát triển và công bố, ít nhất là trong một vài loài cây trồng như cà chua có khả năng

chịu nhiệt đã được công bố (Scott et al., 1986, 1995)

Việc tạo ra dòng lily có khả năng chịu nhiệt có thể được tiến hành lai cùng

loài hoặc lai khác loài với L longiflorum Thunb hay L formosanum Wallace của

nhóm Leucorilion tạo ra nhiều giống lai mới Các giống này thường có hoa hình loa

kèn nên được gọi là các giống lai của L longiflorum x ví dụ L formolongo (được

đánh giá là có khả năng chịu nóng tốt) (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2004)

Khi lai giữa các loài có quan hệ di truyền xa nhau của chi Lilum đều có độ

bất dục cao Điều này có thể do một vài nguyên nhân như sự không tương hợp về

bộ nhiễm sắc thể, sự không tương hợp về di truyền (bất dục di truyền) hay do những nhân tố khác mà chúng ta vẫn chưa biết đến Tuy vậy, hiện tượng bất hợp được khắc phục khi sử dụng các biện pháp kỹ thuật rất hiệu quả là phương pháp thụ phấn và cứu phôi Các phương pháp đó là: phương pháp cắt vòi nhụy; phương pháp

ghép vòi nhụy và kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm (VanTuyl et al., 1991) để vượt qua rào cản trước thụ tinh, kỹ thuật thụ phấn in vitro và các phương pháp nuôi

cấy phôi; nuôi cấy lát cắt bầu nhụy, nuôi cấy noãn để vượt qua rào cản sau thụ tinh Nuôi cấy phôi là một dạng của nuôi cấy mô với mục đích cụ thể là ngăn ngừa việc chết sớm của con lai có nguồn gốc từ những cặp lai hiếm, không tương đồng Kết

quả là nhiều con lai khác loài đã được tạo ra thành công Ví dụ như: L longiflorum (Leucolirion) x L martagon (Martagon), L Longiflorum (Leucolirion) x lily Asiatic (Sinomartagon), giống lai giữa L longiflorum x lily Oriental (Archelirion),… (VanTuyl

et al., 2003) Tuy nhiên, những dòng lily lai chưa được đánh giá tính chịu nhiệt hay

tiềm năng chịu nhiệt

1.2.3.4 Áp dụng công nghệ sinh học trong tạo giống chịu nhiệt

Nghiên cứu di truyền gần đây cho rằng khả năng chịu nhiệt được xác định là một tính trạng đa gen Sự khác nhau về khả năng này điều khiển bởi hệ gen khác nhau, trong các mô khác nhau và đặc biệt quan trọng cho các giai đoạn phát triển khác nhau ở cây trồng (Howarth, 2005;Bohnert et al., 2006)

Việc sử dụng các kỹ thuật di truyền làm tăng mức độ chịu nhiệt, phân tích tương quan di truyền và sử dụng chỉ thị phân tử để xác định khả năng này là những

phương pháp đầy hứa hẹn chọn tạo giống cây trồng có khả năng chịu nhiệt (Maestri

kể của nghiên cứu đã được thực hiện ở các loài cây trồng khác nhau để xác định các chỉ thị di truyền liên quan với những stress môi trường khác nhau, đặc biệt là hạn hán, độ mặn, nhiệt độ cao hay thấp (Foolad, 2005)

Tiến bộ gần đây trong việc tái tổ hợp di truyền và kỹ thuật biểu hiện gen đã góp phần rất lớn trong hiểu biết những cơ sở di truyền và sinh hóa của khả năng chịu nhiệt Trong một số trường hợp, một số dòng thực vật đã được nâng cao khả năng chịu đựng các stress phi sinh học (Wahid & Close, 2007) Ví dụ, một tiến bộ đáng kể đã được thực hiện trong xác định gen, enzym hoặc các hợp chất với khả năng chịu stress đáng kể thực vật ở cấp độ tế bào hoặc cơ thể (Apse & Blumwald,

2002; Bohnert et al., 2006) Hơn nữa, thao tác nhằm biểu hiện hoặc nhân bản các

gen xác định các protein, các enzyme hoặc các hợp chất thông qua kỹ thuật chuyển

gen đã tạo ra một số dòng thực vật với tính chống chịu stress khác nhau (Zhang et

al., 2001; Rontein et al., 2002)

Một số nghiên cứu ban đầu về kỹ thuật sinh học phân tử để cải thiện khả năng này tập trung vào việc tăng cường sản xuất các enzym khử độc, bao gồm cả SOD Các chất gây phản ứng oxy hóa được tạo ra bởi hầu hết các loại stress

(Havaux, 1998; Sairam & Tyagi, 2004) Các kết quả nghiên cứu cho thấy, số lượng

các chất SOD đã được nhân lên trong loài mới (Allan et al., 2006) Ngoài phương

pháp này, nhiều phương pháp tiếp cận tiềm năng khác cũng được sử dụng để giải độc ROS và tạo cây có khả năng chịu stress nhiệt (Zidenga, 2005)

Các kỹ thuật di truyền cũng đã được áp dụng nhằm tăng các giống thích nghi theo một số hướng riêng biệt, hiện đại Ví dụ, cây thuốc lá chuyển gen với sự thay đổi màng lục lạp bằng cách làm im lặng gen lục lạp mã hóa axit béo omega-3 ở các loại hoang dại Cây này hiện có khả năng quang hợp tốt và phát triển tốt hơn so với

các cây khác dạng hoang dã dưới nhiệt độ cao (Murakami et al., 2000) DNAK1, một gen chịu trách nhiệm cho khả năng chịu mặn cao trong Cyanobacterium

Aphanothecehalophytica, khi chuyển vào thuốc lá được bày tỏ kháng nhiệt độ cao

(Ono et al., 2001) Phát triển của cây trồng chuyển gen BADH đã gợi ý một phương pháp hiệu quả có khả năng tăng cường chịu nhiệt ở thực vật (Yang et al., 2006)

Bên cạnh đó, đã có những nghiên cứu phát triển dòng thực vật có thể chịu nhiệt bằng sự tăng cường tích lũy các chất hòa tan tương thích (Ashraf & Foolad, 2009) Kỹ thuật di truyền đã cho phép sự ra đời của con đường sinh tổng hợp vào

loài glycine betaine (GB) thâm hụt (Sakamoto et al., 2000; Quan et al., 2004) GB,

chất tạo áp suất thẩm thấu để đáp ứng với áp lực môi trường ở thực vật khi cây trồng gặp điều kiện bất lợi (ví dụ, nhiệt)

Sự ổn định nhiệt của rubiscoactivase, một phân tử chaperone chịu trách

nhiệm về hoạt động của Rubisco, là yếu tố quan trọng trong việc duy trì hoạt động của nó đã được nghiên cứu nhằm tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật (Salvucci &

Crafts-Brandner, 2004) Bằng cách biến đổi cây thuốc lá có gen rubiscoactivase,

khả năng chịu nhiệt độ cao đạt được bằng cách tái tạo quá trình decarboxyl hóa

rubisco, là một cơ chế bảo vệ bộ máy quang hợp (Sharkey et al, 2001)

Kỹ thuật di truyền của các yếu tố sốc nhiệt (HSF) và chiến lược chống sự nhạy cảm nhiệt là công cụ cho sự hiểu biết của vai trò của HSPs và sự điều hòa của HSFs Sự biểu hiện gen quá mức của HSFs và HSF-fusion protein (các protein kết

hợp HSF) ở cây chuyển gen dẫn đến kết quả là sự biểu hiện của HSPs ở nhiệt độ bình thường (Iba, 2002)

Sự đòi hỏi tăng khả năng chịu nhiệt độ cao ở dòng chuyển gen đã phân bố lại ở các cấp cao hơn các chất đi kèm HSP Người ta đã chứng minh rằng ở cà chua, MT-sHSP có một chức năng như phân tử chaperone (một loại HSP hỗ trợ tế bào, mô vượt qua điều kiện cực đoan) trong ống nghiệm (Liu & Shono, 1999) và gần đây nó được chứng minh rằng cây thuốc lá biến đổi gen với MT-sHSP thể hiện

khả năng chịu nhiệt độ cao ở cấp cơ thể (Sanmiya et al., 2004)

Gần đây, người ta cũng thông báo rằng, gen mã hóa cho một hạt nhân HSP32, mã hóa một protein 32 kDa, đã được nhân bản thành công trong cà chua

(Liu et al., 2006)

Các số liệu chuyển gen thu được từ cây biến đổi gen, di truyền ngược và kỹ thuật gây đột biến trong các loài ngũ cốc xác nhận thấy HSPs có quan hệ nhân quả

trong khả năng chịu nhiệt độ cao ở thực vật (Queitsch et al., 2000)

Với lily, chọn tạo giống có khả năng chịu nóng bằng hỗ trợ của chỉ thị phân

tử cũng như kỹ thuật di truyền vẫn chưa có công bố nào trên thế giới cũng như ở Việt Nam

1.3 Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở thực vật

1.3.1 Giới thiệu chung về glycine betaine

Glycine betaine (GB) là một hợp chất amoni bậc bốn, có hoạt động hiệu quả nhất trong tăng cường ấp suất thẩm thấu của tế bào, được gọi như là một chất hòa tan tương thích GB đã được tìm thấy ở cả tế bào động vật, vi khuẩn và một

số loài thực vật hạt kín có khả năng chống chịu (hạn, mặn) (McCue & Hanson, 1990) Việc tăng cường tích lũy GB ở thực vật đóng vai trò sinh lý quan trọng trong việc làm giảm stress liên quan đến áp suất thẩm thấu Những loài có khả năng tích lũy GB một cách tự nhiên như rau bina, lúa mạch, ngô, củ cải đường khi chúng tiếp xúc với các stress hạn, mặn, lạnh, nhiệt độ cao GB bảo vệ thực vật bằng cách duy trì cân bằng nước và ổn định các đại phân tử dưới sự mất nước khi tế bào ở điều kiện môi trường stress

GB có nhiều ở lục lạp, nơi có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh và bảo

vệ màng thylacoide, do đó, tăng cường hiệu quả hoạt động của bộ máy quang hợp

(Yang et al., 2007)

Ở thực vật bậc cao, GB được tổng hợp từ choline qua betaine aldehyde

nhờ enzyme choline monooxygenase (CMO); sau đó betaine aldehyde được chuyển thành glycine betaine nhờ betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) (Rathinasbapathi et al., 1997)

Ở một số vi khuẩn như Arthrobacter globiformis và Arthrobacter panescens,

GB được tổng hợp chỉ cần xúc tác bởi choline oxydase (codA) mà không thông qua hợp chất trung gian nào (Ikuta et al., 1997)

Người ta cho rằng, có nhiều gen liên quan tổng hợp GB như: CMO, BADH,

codA từ những cơ thể sinh vật Gen mã hóa cho CMO và BADH được phân lập từ

một số loài thực vật bậc cao (Rathinasbapathi et al., 2001) còn codA được phân lập

từ vi khuẩn A Globiformis (Hayashi et al., 1997)

Gen codA mã hóa cho choline oxydase, là enzyme chìa khóa có vai trò

quan trọng trong phản ứng sinh tổng hợp GB chỉ được tìm thấy và phân lập ở

vi khuẩn Arthrobacter globiformis, thuộc nhóm vi khuẩn gram dương sống

trong đất

1.3.2 Chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu cho cây trồng

Từ khá lâu, một số nhà khoa học cho rằng, gen codA của vi khuẩn

Arthrobacter globiformis có khả năng giúp cây trồng có thể chống chịu được các điều

kiện bất lợi từ môi trường: mặn, lạnh, hạn và nhiệt độ cao như là khi chuyển gen này

vào cây Arabidopsis thaliana (Alia et al., 1998; Hayashi et al., 1997; Sakamoto et al., 2000) Nó còn có thể chịu được ánh sáng cường độ cao (Alia et al., 1999) và chịu lạnh (Sakamoto et al., 2000) Kể từ đó, nhiều nhà chọn tạo giống đã chú ý chuyển gen này vào nhiều loại cây trồng khác nhau như là năm 2003, Sulpice et al., đã cho rằng, cây A thaliana chuyển gen codA tạo choline oxidase cho phép tổng hợp glycine

betaine (GB) và tăng cường khả năng chịu đựng các loại căng thẳng không những trong quá trình nảy mầm và tăng trưởng thực vật mà còn ở giai đoạn sinh sản, đó là

giai đoạn cây nhạy cảm nhất với môi trường căng thẳng (Sulpice et al., 2003) Cây

thuốc lá chuyển gen này khi có kích thước 1,0 cm - 1,5 cm có thể tồn tại môi trường

MS có 400 mmol/L NaCl trong hơn 30 ngày trong khi cây không chuyển gen không

có khả năng như vậy (He et al., 2001) Dòng lúa indica Pusa Basmati 1 biến đổi gen với choline oxidase (codA) bởi Agrobacterium cũng thể hiện khả năng chịu mặn (Mohanty et al., 2002) Ngoài ra, lúa Oryza sativa L chuyển gen này không chỉ chịu mặn mà còn chịu lạnh (Sakamoto et al., 1998)

Những năm gần đây, các nhà khoa học đã bước đầu chuyển gen codA vào

một số cây trồng khác như là vào cà chua (có tác dụng bảo vệ hạt, cây và hoa khỏi

sự phá huỷ bởi lạnh) (Park et al., 2004) (làm tăng cường khả năng chịu muối và stress nước) (Goel et al., 2011) Cây trồng chuyển gen codA cũng được tăng cường

khả năng chịu nóng ví dụ như ở cây cà chua chuyển gen này có khả năng chịu nóng

giai đoạn hạt nảy mầm và cây con (Li et al., 2011); Cây Brassica chinensis khi được

chuyển gen này cũng thể hiện khả năng chịu nhiệt độ cao và muối cao (Matsunaga

et al., 2012); Wang et al., (2010) đã sử dụng gen codA để tăng cường khả năng chịu

mặn của cây Eucalyptus globulus (một loại cây lấy gỗ nguyên liệu để làm giấy) Ở Việt Nam, cây xoan ta chuyển gen codA đã tăng cường khả năng chịu muối khá tốt

(Bùi Văn Thắng, 2013)

1.4 Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công nghệ gen

1.4.1 Công nghệ tế bào trong tạo giống lily

Ở lily, tạo giống lily mới phổ biến hiện nay vẫn bằng phương pháp lai tạo giữa các giống trong loài hoặc lai xa Tuy nhiên, các hạt của tổ hợp lai xa dễ chết sớm

do phôi không thể tồn tại trong cơ thể hoặc không này mầm khi ở điều kiện in vivo Chính vì vậy, công nghệ nuôi cấy in vitro mô phôi nguyên vẹn hay các phôi được tách

ra đã khắc phục được khó khăn trên (VanTuyl et al., 1991; Maesato et al., 1994; Barba

- Gonzalez et al., 2004) Có hai phương pháp cứu phôi cụ thể như sau:

a Nuôi cấy lát cắt bầu nhụy (Ovary-slice culture)

Nuôi cấy lát cắt bầu nhụy sau thụ tinh được ứng dụng cho việc tạo ra các con lai khác loài Bầu nhụy được thu hoạch 7 ngày - 10 ngày sau thụ phấn, cắt

thành các lát cắt có độ dày 2 mm - 5 mm và được đặt trên môi trường MS bổ sung sucrose Số điểm phồng lên của noãn trong nuôi cấy bầu nhụy được dùng để ước lượng hiệu quả trung bình về sự phát triển noãn Trong vòng 30 ngày, noãn và phôi có thể được chia tách từ các lát cắt và nuôi cấy riêng biệt cho tới khi nảy mầm (Lim & VanTuyl, 2006)

Phương pháp nuôi cấy noãn phải được ứng dụng trong suốt quá trình sinh trưởng của phôi và trước khi phôi bị thoái hóa Thời gian cho nuôi cấy noãn phụ thuộc vào sự kết hợp của phép lai (kiểu gen con lai) và nằm trong phạm vi từ 30 ngày - 45 ngày sau thụ phấn Do phương pháp cứu phôi tốn kém, phức tạp nên phương pháp nuôi cấy noãn có thể được thực hiện trong một thời gian ngắn Tuy nhiên, tỷ lệ nảy mầm của phôi ở phương pháp nuôi cấy noãn là thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy phôi (Lim & VanTuyl, 2006)

b Nuôi cấy phôi (Embryo culture)

Nuôi cấy phôi từ hạt không có nội nhũ và có nguồn gốc từ phép lai xa

liên quan đến L lankongense đã thu được thành công Nuôi cấy phôi có thể được

ứng dụng thành công trong các phép lai mà sự thoái hóa của phôi diễn ra một cách chậm chạp Điều này thường xảy ra với các phép lai giữa các loài có quan

hệ gần gũi một cách tương đối Trong hầu hết các trường hợp, phôi có thể được cứu khi chúng đạt đến giai đoạn hình cầu Kỹ thuật này rất đáng tin cậy và các phôi sinh trưởng nhanh mà không có bất kỳ sự phát triển khác thường nào Thời gian tốt nhất cho phương pháp cứu phôi là khoảng 40 ngày - 60 ngày sau thụ phấn (Lim & VanTuyl, 2006) Với việc sử dụng các kỹ thuật trên, trên thế giới cũng như ở Việt nam đã có rất nhiều giống lily được tạo ra từ lai xa (Đặng Văn Đông và cs., 2010)

1.4.2 Tình hình ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống lily

Chuyển gen vào cây lily đã được thực hiện bởi phương pháp trực tiếp

nhưng kết quả chỉ tạo được cây L longiflorum chuyển gen nhờ phương pháp bắn

gen Kĩ thuật biến nạp di truyền thường được dùng là bắn các phân tử ADN nhỏ này vào các vảy củ Một hướng tiếp cận khác của các nhà khoa học là sự biến nạp

di truyền phấn hoa Các phân tử nhỏ ADN có chứa gen kháng kanamycin và gen

β-glucuronidase sau đó được bắn vào các hạt phấn tách rời dùng để tạo ra các cây

trồng chuyển gen Một số lượng lớn (400000) hạt phấn L longiflorum đã được tạo

ra và được sử dụng để thụ phấn với cây làm mẹ Sàng lọc khả năng kháng kanamycin của 65000 cây con đầu tiên đã thu được 3 cây kháng kanamycin Ở

những cây này cũng có sự hoạt động của gen GUS, sử dụng PCR có thể xác nhận

sự có mặt của gen này ở mức độ phân tử

Gần đây người ta đã thực hiên chuyển gen thành công bằng phương pháp sử

dụng vi khuẩn Agrobacterium (Eady et al., 2000; Suzuki & Nakano, 2002) Vi khuẩn Agrobacterium thường được sử dụng là A.tumefaciens chủng EHA 101/pIG121Hm, trong đó có chứa gen neomycin phosphotransferase II (nptII),

hygromycine phosphotransferase (hpt) và gen β-glucuronidase (Hoshi et al., 2004;

Ogaki & Furuichi, 2008); chủng LBA4404 mang vector pBI121 chứa Zm-40 cũng

có thể sử dụng (Liet al., 2008a) A tumefaciens chủng EHA 105 chứa plasmid mang gen nptII kháng kanamycine, chứa gen GUS mã hóa cho ß-glucuronidase và gen

bar mã hóa cho phosphinothricin acetyltransferaza (Nguyễn Thị Phương Thảo và

cs., 2008) và gần đây nhất là Xi et al., (2012) đã sử dụng chủng EHA105 với

pCAMBIA1304 và anti lLAC01 Những lát cắt từ vảy củ hoặc màng thân lily (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2008) hay những khối callus (Nguyễn Thị Lý

Anh và CS., 2009) được nuôi cấy khởi động 3 ngày (Liet al., 2008a) hoặc không

nuôi cấy khởi động, được đưa vào dịch huyền phù tế bào khả biến có OD600 = 0,8

khoảng 5 phút (Li et al., 2008a) hoặc OD600 = 0,6 trong 10 phút (Ogaki & Furuichi, 2008), sau đó nuôi trong môi trường đồng nuôi cấy khoảng 3 ngày (Nguyễn Thị Lý

Anh và CS., 2009) hoặc 5 ngày (Li et al., 2008a) hay có thể là 7 ngày (Hoshi et al.,

2004) Môi trường đồng nuôi cấy là môi trường MS có chứa 2 g/l gellan, 100 µM

AS, 30 g/l sucrose, 1 mg/l picloram (Ogaki & Furuichi, 2008) Một số nghiên cứu gần đây lại cho thấy ảnh hưởng của nồng độ gellan trong môi trường đồng nuôi cấy

đến kết quả chuyển gen, với nồng độ 10 g/l gellan biểu hiên tạm thời của gen GUS tăng từ 2 đến 3,5 lần so với nồng độ là 3 g/l (Hoshi et al., 2005) Ngoài ra, môi

trường không chứa NH4NO3 được coi là tạo điều kiện thuận lợi cho chuyển gen vào

cây hoa lily (Hoshi et al., 2004) Sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành chọn lọc những

mẫu cấy chứa gen chuyển và loại bỏ vi khuẩn ra khỏi mẫu cấy bằng cách nuôi trong

môi trường chọn lọc chứa kháng sinh Cefotaxime, kanamycine, hygromycine được

bổ sung vào môi trường với nồng độ thích hợp như là 300 mg/l cefotaxime và 50

mg/l hygromycine (Hoshi et al., 2004) hay 500 mg/l cefotaxime (Nguyễn Thị

Phương Thảo và cs., 2008) Sau khi chọn lọc, mẫu cấy, khối callus được đưa vào

môi trường tái sinh để phát sinh hình thái và phát triển thành cây hoàn chỉnh Môi

trường tái sinh sau biến nạp là môi trường MS, có bổ sung 0,1 mg/l PIC; 0,01 mg/l

BA; 20 mg/l meropenem trihydrate; 30 g sucrose và 3 g/l gellan (Hoshi et al., 2004)

hoặc bổ sung 1 mg/l 6-BA và 1 mg/l NAA (Li et al., 2008a) hay 0,4 mg/l PIC và

0,044 mg/l 6-BA (Yue et al., 2012a) Các mẫu mô callus sau khi được chuyển gen

sẽ được đánh giá kết quả và hiệu suất chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen

GUS, phân tích PCR và lai phân tử Trong một số năm gần đây, sự thành công trong

nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã được công bố trên một số

loài thuộc họ Liliacea bao gồm: Asparagus officinalis (Kiasaka & Kameya, 1998),

Allium sativum (Kondo et al., 2000), Allium cepa (Eady et al., 2000), Agapanthus

praecox (Suzuki & Nakano, 2002) và Muscari armeniacum (Suzuki & Nakano,

2002) Gần đây nhất, Hoshi et al (2005), đã nghiên cứu thành công quy trình tạo

cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid Lilium cv Acapulco bằng vi khuẩn

Agrobacterium

Ở nước ta, một số nhà khoa học cũng sử dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo

các giống hoa loa kèn mang đặc tính mong muốn như là đã nghiên cứu sự cảm ứng

tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo ở cây hoa loa kèn L formolongo làm cơ sở

cho công tác chọn tạo giống bằng kỹ thuật chuyển gen (Nguyễn Thị Phương Thảo

và cs., 2006); nghiên cứu nuôi cấy mô vảy củ in vitro và chuyển gen GFP (green

fluorescent protein) vào callus hoa loa kèn trắng (L longiflorum) nhờ vi khuẩn

A tumefaciens, đã xác định được môi trường tái sinh thích hợp cho mô sẹo nuôi cấy

và làm rõ ảnh hưởng của một số khâu kỹ thuật đến quá trình chuyển gen (Nguyễn

Thị Lý Anh và cs., 2009) Những kết quả này là tiền đề cơ bản cho các nghiên cứu

chuyên sâu tạo cây lily mới bằng kỹ thuật chuyển gen

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Don Hà Lan

Che Hà Lan

11

Lily Lake carey

(Oriental hybrids ‘Lake

carey’lily)

Lily Phương đông

Bel (B) Hà Lan

Dòng thuốc lá K326 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp, được sử dụng cho mục đích làm vật liệu thử nghiệm chuyển gen mục tiêu

2.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng

- Các chủng vi khuẩn E.coli (DH5α), A tumefaciens do phòng Công nghệ tế

bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp

- Các vector chuyển gen ở thực vật pCAMBIA1301 mang gen GUS, pBI121/35S-codA-cmyc mang gen codA nhân tạo có bổ sung một đoạn 30 nucleotide

mã hóa đoạn peptide cmyc giúp cho phát hiện mức độ biểu hiện gen chuyển và pBI121/35S-TP-codA-cmyc tương tự như pBI121/35S-codA-cmyc có bổ sung thêm một đoạn TP (Transite Peptide; đoạn ADN dài 216 nucleotide mã hóa tín hiệu dẫn,

giúp vận chuyển enzyme vào trong lục lạp) Các vector này do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

- Các cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen TP-codA-cmyc và codA-cmyc được tổng hợp

từ hãng Macrogen (Hàn Quốc) và các mồi RAPD, ISSR có tên, trình tự như sau:

Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen TP-codA-cmyc và codA-cmyc

Tên cặp mồi Trình tự nucleotide Nhân

gen

Kích thước ADN (bp)

Bảng 2.3 Tên và trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

STT Mồi RAPD Trình tự STT Mồi RAPD Trình tự

Bảng 2.4 Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu

STT Mồi ISSR Trình tự mồi STT Mồi ISSR Trình tự mồi

9 ISSR51 (GA) 8 A

* Hóa chất

Dung dịch tách chiết plasmid: Dung dịch 1 (25 mM Tris HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0; Glucose 50 mM; H20); Dung dịch 2 (0,2 M NaOH; SDS 1%); Dung dịch 3 (3 M đệm Potassium acetat; Acetic acid 11,5%; H20); Isopropanol; Ethanol 70%; dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1)

Dung dịch điện di ADN: dung dịch đệm TAE 50X (121 g Tris base, 28,6 ml Axit acetic glacia; 50 ml 0,5 M EDTA pH 8,0; 500 ml nước khử ion vừa đủ), dung dịch đệm TAE 1X, Agarose 0,8%; 1%; 1,2%; 0,5 µg/ml Ethidium bromide (EtBr); đệm kiểm tra mẫu ADN (Loading buffer), thang ADN 1 kb (Fermentas)

Kit tinh sạch ADN (Gene JETTM Gel Extraction KIT) của hãng Fermentas (Mỹ) cung cấp

Các hóa chất: H2O khử ion, dung dịch đệm buffer Tango 10X, emzym cắt

XbaI và SacI, enzyme T4 ADN ligase, Buffer T4 ADN ligase 10X, enzyme Taq ADN polymerase, kháng sinh kanamycin, cefotaxime và rifamycin nhập khẩu từ

Fermentas (Mỹ)

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Bảng 2.5 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

LB đặc 5 g/l Yeast extract; 10 g/l Trypton; 10 g/l NaCl; 16 g/l agar, pH = 7,0

LB lỏng 5 g/l Yeast extract; 10 g/l Trypton; 10 g/l NaCl; pH = 7,0

Bảng 2.6 Môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây lily chuyển gen

Đồng nuôi cấy CT2 MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar, pH=5,8 Chọn lọc cây

chuyển gen lần 1 CT3

MS + 1 mg/l BAP + 30 g/l sucrose + 8 g/l agar + 500 mg/l Cefotaxime, 50 mg/l kanamycin, pH=5,8 Chọn lọc cây

2.1.4 Máy móc và thiết bị

Máy PCR system 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Voltex (Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy ổn nhiệt và các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp sử dụng trong đánh giá vật liệu nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp phân tử trong đánh giá mối quan hệ di truyền

a Tách chiết ADN tổng số

Tách chiết và tinh sạch ADN các mẫu lily theo phương pháp CTAB của Doyle, (1987)có cải tiến Sau đó, các mẫu ADN được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop Lite (Thermo Scientific)

b Phản ứng PCR

Phương pháp PCR với các mồi RAPD, ISSR (bảng 2.3 và 2.4)được thực hiện trên máy VeritiTM 96 well thermal Cycler (Applied Biosystems, USA) Hỗn hợp với tổng thể tích là 15 l/mẫu gồm những thành phần là 1,8 µl ADN (100 ng/ul); 1,2 µl mồi RAPD hoặc ISSR (10 pmol), 7,5 µl Master Mix2X; 4,5 µl H2O được trộn đều rồi chuyển vào máy PCR và chạy theo chương trình đã cài đặt gồm các bước: bước1: 94ºC trong 4 phút; bước 2: 92ºC trong 1 phút; bước 3: TaºC với mỗi mồi trong 1 phút (trong đó Ta là nhiệt độ bắt cặp từng mồi); bước 4: 72ºC trong 1 phút; bước 5: Lặp lại 40 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; bước 6: 72ºC trong 10 phút; bước 7: Giữ nhiệt độ 10ºC

c Phương pháp phân tích số liệu PCR- RAPD, ISSR

+ Nhị phân hóa sự xuất hiện băng ADN trên bản điện di sản phẩm PCR: Các

đoạn ADN xuất hiện hay không trên bảng điện di được mã hóa bằng số tự nhiên 1

và 0, cụ thể, mẫu nào xuất hiện đoạn ADN thì ký hiệu là 1, còn không xuất hiện thì ký hiệu là 0 (Rohlf, 1989).

+ Phân nhóm các mẫu nghiên cứu dựa trên hệ số tương đồng Jaccard: số

liệu nhị phân các mẫu được xử lý với phần mềm NTSYS 2.0 để tính hệ số tương đồng di truyền và lập biểu đồ quan hệ di truyền hình cây giữa các đối tượng nghiên cứu (Rohlf, 1989)

+Phân nhóm các mẫu nghiên cứu dựa trên phân tích PCA: sử dụng phần

mềm NTYSYS 2.2 để lập biểu đồ phân nhóm 2 chiều dựa trên phân tích PCA (Principal Coordinate Analysis) và qua đó sẽ lập biểu đồ phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền 2 chiều giữa các dòng, giống nghiên cứu (Rohlf, 2000)

2.2.1.2 Phương pháp nuôi cấy mô đánh giá khả năng tái sinh in vitro

Củ lily sau thu hoạch được tách ra thành từng vảy củ riêng rẽ, rửa qua bằng nước xà phòng rồi được rửa sạch dưới vòi nước chảy Sau đó, chúng được xử lý 20 giây trong cồn 70% và được tráng lại bằng nước cất khử trùng Tiếp đó, vảy củ được

xử lý theo các bước tiếp như sau: (i) lắc trong peroxide hydrogen10% (H2O2) (10

phút), (ii) rửa mẫu lại bằng nước cất khử trùng (10 phút), (iii) lắc trong H2O2 30%

(10 phút), (iv) mẫu được rửa lại 3 đến 5 lần bằng nước cất đã khử trùng Mẫu vảy củ (lát cắt vảy củ) sau khi khử trùng hay lát cắt vảy củ in vitro được cấy vào đĩa petri

có môi trường MS đặc (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung đường sacaroza để

cảm ứng tạo củ in vitro của các mẫu giống Mẫu in vitro được đặt ở phòng tối có

nhiệt độ từ 25oC - 27oC, độ ẩm là 70%

2.2.1.3 Phương pháp xác định khả năng chịu nóng in vitro

Để xác định ngưỡng gây chết của lily in vitro ở nhiệt độ cao, củ in vitro được

hình thành từ lát cắt vảy củ lily trong đĩa peptri có môi trường MS + 60 g/l sucrose + 7,5 g agar được đặt ở các nhiệt độ khác nhau 37oC ± 1oC và 42oC ± 1oC (theo Yin

et al., 2007) Quan sát sự thay đổi màu sắc của củ lily (theo ngày đối với thí nghiệm

ở 37oC ± 1oC và 0,5 ngày đối với thí nghiệm ở 42oC ± 1oC) để xác định tỷ lệ mẫu chết Ngưỡng gây chết được xác định dựa vào thời gian gây chết hoàn toàn của các mẫu giống Từ đó xác định chỉ tiêu theo ngày (hoặc 0,5 ngày) tùy thí nghiệm:

2.2.2.1 Kiểm tra chất lượng hạt phấn các dòng làm bố

Hạt phấn của các dòng được lựa chọn (có màu sắc đẹp, khả năng sinh trưởng tốt ở điều kiện Việt Nam hay/và được đánh giá có khả năng chịu nóng) được kiểm tra chất lượng thông qua xác định chỉ tiêu tỷ lệ hạt phấn hữu dục – là tỷ

lệ giữa số lượng hạt phấn có hình dạng đặc trưng, có màu đậm trên tổng số hạt phấn được nhuộm với Iotdua kali (1%) quan sát được trên kính hiển vi (Stanley & Linskens, 1974; Heslop-Harrison, 1992) Bên cạnh đó, để quyết đinh một dòng có nhiều đặc điểm ưu việt làm dòng đực được hay không, chúng ta cũng cần khảo sát khả năng nảy mầm của hạt phấn trên môi trường nuôi cấy nhân tạo có một số

thành phần giống thành phần các chất trên bề mặt vòi nhụy (Soares et al., 2008)

Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trường tối ưu cho nảy mầm hạt phấn

lily là 30 g/l saccarozo + 8 g/l agar + 20 mg/l acid boric (là kết quả thí nghiệm

khảo sát, không trình bày ở đây)

2.2.2.2 Kỹ thuật thụ phấn cắt ngắn vời nhụy và xác định tỷ lệ đậu quả

Các giống có hạt phấn đạt chất lượng cao được sử dụng làm dòng bố và tiến hành lai với một trong các giống còn lại bằng việc sử dụng phương pháp thụ phấn với kỹ thuật cắt ngắn vòi nhụy (còn 1 mm - 3 mm) ở cây làm mẹ (Lim & VanTuyl, 2006) Các dòng bố mẹ được bố trí (trồng) theo khối ngẫu nhiên, số lượng mẫu mỗi dòng làm bố mẹ từ 60 cây - 80 cây Mỗi cây ra hoa trung bình có 3 đến 5 bông/cây/giống Tiến hành thụ phấn, đánh dấu tổ hợp lai và xác định tỷ lệ