Chế kháng nguyên và kháng thể kháng Vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp dùng trong chẩn đoán huyết thanh học

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vi Diễn giải Ký hiệu PRRS Porcine reproductive and Polymerase Chain Reaction MARC-145 Tế bào thận khỉ xa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-* -

ðỖ THỊ HOA

CHẾ KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP DÙNG TRONG CHẨN

ðOÁN HUYẾT THANH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-* -

ðỖ THỊ HOA

CHẾ KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG

VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN

VÀ HÔ HẤP DÙNG TRONG CHẨN ðOÁN HUYẾT

THANH HỌC

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60640101

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học PGS.TS Tô Long Thành

HÀ NỘI – 2012

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦ i

Lêi cờm ển Lêi cờm ển

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm chẩn ựoán thú y trung ương - Cục Thú Y ựã giúp ựỡ và tạo ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Tô Long Thành Giám ựốc trung tâm chẩn ựoán thú y trung ương Ờ Cục Thú Y là giáo viên trực tiếp hướng dẫn và giúp ựỡ tôi hoàn thành luận văn này

Xin bày tỏ lòng biết ơn và kắnh trọng tới Ths Nguyễn Tùng, phó Giám ựốc trung tâm chẩn ựoán thú y trung ương Ờ Cục Thú Y ựã dành nhiều thời gian, công sức giúp ựỡ tôi trong suốt quá hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn những y kiến ựóng góp quý báu của thầy giáo, cô giáo trong ban đào tạo sau đại học Ờ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam trong quá trình học tập, hoàn thiện và bảo vệ luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ nhân viên trong phòng Vi rút, phòng Giải phẫu bệnh thuộc trung tâm chẩn ựoán thú y trung ương Ờ Cục Thú

Y ựã tạo ựiều kiện, giúp ựỡ trong các thắ nghiệm thực hiên ựề tài

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sựu giúp ựỡ nhiệt tình của các bạn ựồng nghiệp, gia ựình và người thân ựã ựộng viên, giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 15 tháng 11 năm 2012

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả thu ñược trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Nếu có gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tác giả luận văn

ðỗ Thị Hoa

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… iii

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1 Giới thiệu chung về PRRS 5 1.1.1 Khái quát về PRRS 5 1.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 8 1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 13 1.1.4 Tình hình dịch Tai xanh ở Việt Nam 16 1.2 Các kiến thức về chẩn đốn 22 1.2.1 Chẩn đốn qua các dấu hiệu lâm sàng 22 1.2.2 Chẩn đốn dựa vào bệnh tích 22 1.2.3 Chẩn đốn vi rút học 23 1.2.4 Phương pháp huyết thanh học 24 CHƯƠNG II VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1 Ổn định giống vi rút PRRS để chế kháng nguyên 26 2.2.2 Chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA, ELISA 26 2.2.3 Sử dụng vi rút để chế kháng huyết thanh trên Lợn 26 2.2.4 Chuẩn độ kháng nguyên và kháng huyết thanh chế được 27

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… iv

và kháng huyết thanh tự chế

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phân lập vi rút trên mơi trường tế bào MARC145 27 2.3.2 Phương pháp phát hiện, giám định vi rút bằng phương pháp

2.3.3 Phương pháp chế kháng nguyên và kháng huyết thanh 32 2.3.4 Phương pháp ELISA 34 2.3.5 Phương pháp IPMA 36 2.3.6 Phương pháp kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu của kháng nguyên

và kháng thể tự chế

38

2.3.7 Phương pháp tính TCID50 theo cơng thức Karber 40 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 40 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Nhân giống và chuẩn độ vi rút 41 3.2 Chế kháng nguyên cho kít ELISA 43 3.3 Chuẩn độ kháng nguyên tự chế bằng phương pháp IPMA, ELISA 45 3.3.1 Kết quả chuẩn độ kháng nguyên bằng phản ứng IPMA 45 3.3.2 Kết quả chuẩn độ kháng nguyên trên kít ELISA 49 3.4 Theo dõi sự hình thành kháng huyết thanh bằng phản ứng ELISA 52 3.5 Kết quả chuẩn độ kháng huyết thanh 54 3.5.1 Chuẩn độ kháng huyết thanh bằng phương pháp ELISA 54 3.5.2 Chuẩn độ kháng thể bằng phương pháp IPMA 56 3.6 Kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu bằng phản ứng ELISA 59 3.7 Kết quả kiểm tra chế phẩm sau khi chế 61 3.7.1 Tính tinh khiết của kháng nguyên và kháng thể sau khi chế 61 3.7.2 Kết quả kiểm tra tính ổn định của kháng nguyên và kháng thể

băng phương pháp ELISA

62

3.8 Kết quả so sánh mẫu huyết thanh chẩn đốn bằng kháng nguyên và

kháng thể tự chế với kít Herdcheck 3X

64

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… v

3.9 Kết quả so sánh 343 mẫu bằng 2 phương pháp ELISA và IPMA 66 3.10 Mỗi tương quan giữa nguyên liệu tự chế và kít Herdcheck 3X 69 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vi

Diễn giải

Ký hiệu

PRRS Porcine reproductive and

Polymerase Chain Reaction MARC-145 Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi

CPE Cytopathic pathogene effect Bệnh tích tế bào

FCS Fetal calf serum Huyết thanh thai bê

BSC II Bio-safety cabinet Buồng an toàn sinh học cấp II MEM Modified Eagles medium Môi trường nuôi cấy tế bào

AEC 3-Amino-9-ethylcarbazole Chất phát màu - IPMA

DMSO Dimethylsulfoxide Thành phần trong bảo quản tế

bào PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối ñệm phốt phát

TCID50 50 % tissue culture infective

dose

Liều gây nhiễm 50 % tế bào

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sự tương ñồng về nucleotide của các chủng PRRS khi so

sánh với chủng Bắc Mỹ VR2332 7 Bảng 1.2 Một số tên gọi của bệnh 8 Bảng 1.3 Các ñoạn gen mã ñọc mở của vi rút PRRS 9 Bảng 2.1 Danh mục các cặp mồi và mẫu dò 30 Bảng 2.2 Công thức áp dụng cho kít realtime RT-PCR (hãng

Bảng 3.2 Kết quả theo dõi sự phát triển bệnh tích tế bào sau 3 ngày 46 Bảng 3.3 Kết quả chuẩn ñộ kháng nguyên 07196 49 Bảng 3.4 Tóm tắt kết quả S/P của kháng nguyên pha loãng 51 Bảng 3.5 Hàm lượng Kháng thể trung bình sau khi công 53 Bảng 3.6 Kết quả chuẩn ñộ kháng huyết thanh bằng 2 kháng nguyên 55 Bảng 3.7 ðộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể tự

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 ðại thực bào khi bị PRRS xâm nhập 6 Hình 1.2 ðại thực bào chưa bị PRRS xâm nhập 6 Hình 1.3 Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS 10 Hình 1.4 Hệ phả của 5 chủng virus PRRS từ các nước khác nhau 10 Hình 2.1 Mô tả phản ứng ELISA gián tiếp phát hiện kháng thể

Hình 3.1 Hình ảnh 10 chai tế bào trước khi nhiễm 43 Hình 3.2 Ảnh tế bào bình thường 44 Hình 3.3 Tế bào phá hủy 100% 44 Hình 3.4 Xử lý RIPA trên chai tế bào bị phá hủy 44 Hình 3.5 Ảnh chiết tách protein vi rút bằng RIPA 45 Hình 3.6 Hình ảnh dương tính trong phản ứng IPMA 48 Hình 3.7 Hình ảnh âm tính trong phản ứng IPMA 48 Hình 3.8 Biểu ñồ hàm lượng kháng nguyên tự chế 52 Hình 3.9 Biểu ñồ hàm lượng kháng thể tăng theo các tuần sau khi

công

54

Hình 3.10 Biểu ñồ kết quả chuẩn ñộ kháng thể sau khi chế 56 Hình 3.11 Kháng huyết thanh pha loãng 1/80 trong phản ứng IPMA 57 Hình 3.12 Kháng huyết thanh pha loãng 1/320 trong phản ứng IPMA 57 Hình 3.13 Kháng huyết thanh pha loãng 1/1280 trong phản ứng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 1

MỞ ðẦU

1 Khái niệm và lý do chọn ñề tài

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở Lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), còn gọi là bệnh Tai xanh là bệnh rất quan trọng ñối với ngành chăn nuôi lợn Bệnh này ñã xuất hiện nhiều nơi trên thế giới, là một bệnh luôn gắn liền với chăn nuôi lợn công nghiệp và cho ñến nay vẫn chưa có vắc xin phòng bệnh thực sự hiệu quả ñối với bệnh này

PRRS ñã và ñang trở thành dịch ñịa phương ở nhiều nước trên thế giới, gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế Hội chứng này lần ñầu ñược ghi nhận ở

Hà Lan vào năm 1986 và ở Mỹ giữa năm 1987 và ñược ñặt tên là “Bệnh bí hiểm” hay bệnh Tai xanh Bệnh gây ra triệu chứng ở hầu hết các loại lợn, nhưng 2 nhóm triệu chứng cơ bản thường thấy là hội chứng rối loạn sinh sản bao gồm sảy thai, thai chết lưu và hội chứng hô hấp biểu hiện các dấu hiệu bỏ

ăn, sốt và ho Căn bệnh xuất hiện gần ñây ở Trung Quốc (2005) và Việt nam (2007) này có ñặc ñiểm là xảy ra ở tất cả các tính biệt và lứa tuổi lợn có thể gây lợn chết với tỷ lệ cao khi có bội nhiễm vi khuẩn Thể bệnh mới này ñược cho là vi rút tai xanh thể ñộc lực cao (HP-PRRS) gây ra và khác biệt với vi rút PRRS thể cổ ñiển chủ yếu tấn công lợn nái, lợn con và tỷ lệ chết do bệnh thấp Sau khi xuất hiện ở Việt Nam vi rút này ñã lây lan rất nhanh chóng ñến nhiều tỉnh ở phía Bắc và gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi Theo ñiều tra thấy sự bùng phát xảy ra ở trại nhỏ dưới 50 nái, những trại này không chích vắc xin PRRS tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên ñến 70%, tỉ lệ chết > 30% Trong khi ñó, với trại qui mô lớn là 48/100 trại có phản ứng sốt không xác ñịnh Tỷ

lệ nhiễm bệnh và tỷ lệ chết với từng loại trang trại là khác nhau

Vi rút PRRS có tính thích ứng rất cao ñối với các ñại thực bào ở phổi

Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi ñơn dương, cấu trúc tương tự các

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 2

khung đọc mở (open reading frame, ORF) của Coronavirus, gồm 7 khung đọc

mở gối lên nhau, mã hĩa cho 7 protein của vi rút gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của các kháng thể trung hồ, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn cản hiện tượng trình diện kháng nguyên vi rút của các đại thực bào với các tế bào cĩ thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity) Vi rút PRRS cĩ thể tiêu diệt tới 40% đại thực bào làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác cĩ

cơ hội phát triển

Ở Việt Nam bệnh PRRS đã được phát hiện thấy kháng thể trong huyết thanh của một đàn lợn giống ngoại nhập ở một số trại lợn phía Nam vào năm

1997 Từ năm 1999 – 2002 một số nhà khoa học Nhật bản kết hợp với Trường ðại học Cần Thơ cũng đã tiến hành điều tra một số trường hợp bệnh ở lợn cĩ hiện tượng lợn con chết, lợn nái sảy thai, và điều trị kháng sinh khơng cĩ hiệu quả Trong nghiên cứu này, người ta điều tra một số nguyên nhân gây bệnh trong đĩ cĩ hội chứng rối loạn hơ hấp và sinh sản ở lợn

Tháng 3 năm 2007, một căn bệnh lạ đã xuất hiện trên nhiều đàn lợn ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam như Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Hà Nội, Quảng Nam Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương đã xác định được nguyên nhân chính gây nên căn bệnh lạ đĩ là Hội chứng rối loạn sinh sản và

hơ hấp ở lợn (PRRS) Căn bệnh này cĩ đặc điểm là xảy ra ở tất cả các lứa tuổi lợn và khác biệt với vi rút PRRS thể cổ điển chủ yếu tấn cơng lợn nái và lợn con Sau đĩ căn bệnh này đã lây lan rất nhanh chĩng đến nhiều tỉnh ở phía Bắc và gây thiệt hại lớn cho người chăn nuơi. Hiện nay dịch PRRS, đặc biệt

là thể độc lực cao đã xảy ra ở các nước lân cận như Trung Quốc, Lào và Campuchia, và Việt Nam

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 3

Việt Nam đã ra nhập tổ chức Thương mại Thế giới (WTO) việc giao lưu buơn bán ngày càng được đẩy mạnh, trong đĩ cĩ trao đổi động vật và các sản phẩm nguồn gốc từ động vật Trong quá trình giao lưu buơn bán, việc nhập khẩu con giống cũng như các sản phẩm làm thức ăn chăn nuơi với mục đích nâng cao năng suất chăn nuơi cũng khĩ tránh khỏi nguy cơ làm cho dịch bệnh gia súc cĩ điều kiện xâm nhập Vi rút lưu hành rộng rãi trên đàn lợn mắc bệnh đã khỏi về triệu chứng lâm sàng và tiếp tục được bài thải, phát tán ở nhiều địa phương Việc phịng bệnh bằng vắc xin là một biện pháp giúp giảm bớt thiệt hại do lợn ốm chết Tuy nhiên để đánh vắc xin cĩ tạo được đáp ứng miễn dịch hay khơng, cần phải đánh giá bằng phản ứng phát hiện kháng thể Phương pháp ELISA, IPMA là phương pháp đơn giản dùng để chẩn đốn huyết thanh học bệnh PRRS, hai phương pháp này cĩ độ nhạy tương đối cao,

cĩ thể sử dụng ở nhiều phịng thí nghiệm Tuy nhiên để xét nghiệm sự tương đồng giữa kháng nguyên và kháng thể kiểm tra thì vai trị của kháng nguyên đĩng vai trị quan trọng trong phản ứng, mặt khác để đánh giá được mẫu huyết thanh là dương tính thì phục thuộc rất nhiều và mẫu huyết thanh đối chứng của phản ứng Do đĩ để phục vụ cơng tác xét nghiệm huyết thanh học của bệnh PRRS chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Chế kháng nguyên và kháng thể kháng vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp dùng trong chẩn đốn huyết thanh học”

2 Mục tiêu của đề tài:

- Chế được kháng nguyên và kháng thể cho phản ứng huyết thanh học

- Xác định một số tính chất cơ bản của kháng nguyên kháng thể, đảm bảo độ tin cậy khi đưa vào chẩn đốn huyết thanh học bệnh PRRS bằng phản ứng ELISA, IPMA

3 ðịa điểm, đối tượng nghiên cứu và ý nghĩa khoa học của đề tài

[ơ

ðịa điểm: Phịng Vi rút - Trung tâm Chẩn đốn Thú Y Trung ương –

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 4

Cục Thú Y

ðối tượng nghiên cứu:

+ Mẫu phủ tạng mắc bệnh PRRS: Tập trung nghiên cứu giống 07196 từ

ổ dịch năm 2007 đã được giải trình tự gen NSP2, ORF5

+ Mẫu huyết thanh Lợn với dung lượng mẫu từ 70 đến 500 mẫu

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

Bệnh tai xanh đã và đang rất phổ biến ở Việt Nam, việc chẩn đốn bằng phương pháp dịch tễ, lâm sàng và bệnh lý học cĩ thể kết luận được Tuy nhiên

để khẳng định chắc chắn bệnh, khơng cĩ cách nào khác là phải tiến thành phân lập, giám định vi rút gây bệnh mà để kết luận bệnh nhanh hơn mà vẫn đảm bảo tính chính xác thì phải dùng các phương pháp huyết thanh học

Do đĩ để tiến hành nghiên cứu chế kháng nguyên và kháng thể vi rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn, dùng trong chẩn đốn huyết thanh học là hướng đi đúng đắn và hết sức cần thiết Việc chế được chế phẩm này cĩ ý nghĩa khoa học cao và nĩ khẳng định trình độ khoa học của nghành thú y Việt Nam đối với thế giới, đồng thời sẽ bớt được ngoại tệ, cĩ sẵn nguồn nguyên liệu để chủ động dùng trong cơng tác chẩn đốn huyết thanh học bệnh PRRS

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 5

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về PRRS

1.1.1 Khái quát về PRRS

Bệnh tai xanh xảy ra lần ñầu tiên ở Mỹ vào khoảng năm 1987, sau này ñược tìm thấy ở Châu Âu, và xuất hiện ở Châu Á vào ñầu những năm 1990 Bệnh xảy ra trên lợn với ñặc ñiểm gây sảy thai ở lợn nái và rối loạn ñường hô hấp trên ở lợn sơ sinh, lợn choai Cho ñến nay, bệnh Tai xanh ñã lan rộng trên khắp thế giới với những ñặc trưng của từng chủng khác nhau gây ra những thiệt hại nặng nề về kinh tế Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn bệnh và lợn khỏe mạnh Vi rút cũng lây lan qua không khí, ñiều ñó giải thích cho sự lây lan ồ ạt trong các vùng chăn nuôi lợn có mật

ñộ cao

Vi rút PRRS do họ arterivirus gây nên, vi rút này ñược phân lập và ñịnh loại vào năm 1991 Nó là một vi rút có vỏ bọc và thuộc loại ARN vi rút, có kích thước vào khoảng 45 ÷ 80µm, chịu ñược nhiệt ñộ thấp (tồn tại 4 tháng dưới nhiệt ñộ -700C) Những con vật mang bệnh là vật gieo rắc mầm bệnh nguy hiểm cho môi trường, không khí cũng phát tán vi rút một cách nhanh chóng ñặc biệt khi ẩm ñộ cao, nhiệt ñộ thấp và tốc ñộ gió mạnh Các trang thiết bị, dụng cụ chăn nuôi, các phương tiện vận chuyển… cũng là nguồn phát tán vi rút Ngoài ra, các loài côn trùng như muỗi (Aedes vexans) và ruồi (Musca domestica); vịt trời… cũng có thể là trung gian truyền bệnh Một ñặc trưng của Arteriviruses là phương pháp và vị trí sao bản sơ cấp, chúng sinh sản trong bào chất quanh nhân của các tế bào chủ

Những virion mới ñược giải phóng bởi exocytosis từ bề mặt của tế bào

Tế bào ñích sơ cấp của vi rút là ñại thực bào túi phôi của lợn, vi rút rất thích

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 6

Vi rút PRRS có 1 ái lực ñặc biệt với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào

ở phổi, ñại thực bào này còn gọi là ñại thực bào phế nang Chúng có tác dụng tiêu hoá và loại bỏ các vi khuẩn và vi rút thâm nhập vào phổi, ngoại trừ trường hợp vi rút PRRS Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ phần lớn hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác có cơ hội phát triển và gây bệnh Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại thực bào chúng nhân lên và phá huỷ rất nhanh tế bào Lúc ñầu vi rút PRRS kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày vi rút sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai ñoạn ñầu quá trình xâm nhiễm do vi rút PRRS dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại vi rút và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch ðiều

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7

này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với các bệnh truyền nhiễm trên cơ thể lợn

Bệnh lần ñầu tiên ñược báo cáo ở Mỹ năm 1987 và sau ñó ở châu Âu vào năm 1990 Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn bệnh và lợn khỏe mạnh Vi rút cũng lây lan qua không khí, ñiều ñó giải thích cho sự lây lan ồ ạt trong các vùng chăn nuôi lợn có mật ñộ cao Cũng có ý kiến rằng sự lan truyền của vi rút có thể qua tinh dịch

Hiện nay có 2 kiểu gen của vi rút PRRS chính ñược công nhận là Châu

Âu (Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm II) có tên gọi là VR2332 Khi so sánh về di truyền ñã thấy sự khác nhau rõ rệt (khoảng 40%) giữa 2 kiểu gen này Ở Châu Á và Nam Mỹ người ta ñã phân lập ñược cả 2 kiểu gen, trong mỗi kiểu gen các chủng khác nhau có mức ñộ tương ñồng khác nhau

Bảng 1.1 Sự tương ñồng về nucleotide của các chủng PRRS khi so sánh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 8

– Heko, Hội chứng sảy thai và bệnh ñường hô hấp (Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome), Lan er bing… ðiều này ñược tổng hợp tại bảng một số tên gọi của bệnh

Bảng 1.2 Một số tên gọi của bệnh

Lan er bing Trung Quốc

Hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn (Swine

infertility and abortion syndrome)

Lợn nái bị bệnh thường

vô sinh và sảy thai

Hội chứng sảy thai và bệnh ñường hô hấp (Porcine

epidemic abortion and respiratory syndrome)

Lợn bị sảy thai và bệnh ñường hô hấp

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

(Porcine reproductive and respiratory syndrome)

Lợn bị rối loạn sinh sản

và bệnh ñường hô hấp

ðến năm 1991 khi bệnh lây lan ra nhiều nước trên thế giới với triệu chứng hô hấp và sinh sản ñặc trưng, nên tại uỷ ban Châu Âu bệnh có tên chính thức là “Porcine reproductive and respiratory syndrome”- viết tắt là PRRS bên cạnh các tên như nêu trong bảng trên (Zimmermen và cs, 1999) Năm 1992 Tổ chức thú y thế giới công nhận tên PRRS như một tên gọi quốc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 9

tế cho bệnh này Ngày nay tên PRRS ñã ñược sử dụng rộng rãi

1.1.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Bệnh PRRS gây ra triệu chứng ở hầu hết các loại lợn, nhưng 2 nhóm triệu chứng cơ bản thường thấy là hội chứng rối loạn sinh sản bao gồm sảy thai, thai chết và chết lưu và hội chứng hô hấp biểu hiện bởi các dấu hiệu bỏ

ăn, sốt và ho

Vi rút PRRS là một loại vi rút có vỏ bọc và là virus RNA chuỗi ñơn Vi rút này thuộc họ Arteviridae, giống Nidovirales Hệ gen của vi rút gồm có 7 ñoạn ñọc mở mã hóa (Open Reading Frames - ORF) cho các protein khác nhau ORF 1a và 1b chiếm 80% hệ gen và mã hóa cho RNA polymerase và 6 ORF khác nhỏ hơn (2-7) mã hóa cho các protein cấu trúc của vi rút

Bảng 1.3 Các ñoạn gen mã ñọc mở của vi rút PRRS

ORF 1 RNA replicase ORF1a and ORF1b Protein không

cấu trúc

ORF 2 Minor membrane glycoprotein GP2a, GP2b

ORF 2-7 Nucleocapsid protein N, nucleolar localization

ORF 3 Membrane glycoprotein GP3

ORF 4 Membrane glycoprotein GP4

ORF 5 Major membrane glycoprotein GP5

ORF 6 Membrane associated protein - M

Protein cấu trúc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 10

ORF 7 Nucleocapsid protein - N

Protein GP5 là protein cấu trúc biến ñổi nhiều nhất, chỉ có 51-55% axit amin ñồng nhất giữa các chủng Bắc Mỹ và châu Âu, ngược lại protein M là protein ổn ñịnh nhất với sự ñồng nhất axit amin là 78-80%

Hiện nay có 2 kiểu gen PRRS chính ñược công nhận là Châu Âu (Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm II) có tên gọi là VR2332 Khi so sánh về di truyền ñã thấy sự khác nhau rõ rệt (khoảng 40%) giữa 2 kiểu gen này

Hình 1.3 Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 11

Hình 1.4 Hệ phả của 5 chủng vi rút PRRS từ các nước khác nhau

(tương ứng với bảng 1.4 bên trên)

Ở Châu Á và Nam Mỹ người ta ñã phân lập ñược cả 2 kiểu gen Trong mỗi kiểu gen cũng có các chủng khác nhau, thể hiện sự tương ñồng về các nucleotide

Hai ñoạn gen không cấu trúc là NSP2 và gen mã hóa khung ñọc mở ORF5, là 2 vùng gen có ñộ ñồng nhất cao và thường ñược giải mã trình từ amino acide ñể phân loại di truyền ñối với vi rút PRRS

Bệnh lần ñầu tiên ñược báo cáo ở Mỹ năm 1987 và sau ñó ở châu Âu vào năm 1990 Trong hơn 2 năm bệnh ñã lan ra khắp các nước chăn nuôi lợn công nghiệp ở châu Âu Sự lây lan của bệnh chủ yếu thông qua tiếp xúc trực tiếp giữa lợn bệnh và lợn khỏe mạnh Vi rút cũng lây lan qua không khí, ñiều

ñó giải thích cho sự lây lan ồ ạt trong các vùng chăn nuôi lợn có mật ñộ cao Cũng có ý kiến rằng sự lan truyền của vi rút có thể xảy ra qua tinh dịch

Wenvoort (1991), Collins (1990), áp dụng ñịnh ñề Koch ñã khẳng ñịnh nguyên nhân cuả PRRS là do vi rút, khẳng ñịnh có hai dòng vi rút nguyên mẫu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ gây ra PRRS Tác giả ñã ñặt tên cho

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 12

vi rút gây ra PRRS ở Châu Âu là Lelystad

Benfield (1992), Cozelman (1993), Dea (1992), Saito (1996), ñã khẳng ñịnh vi rút gây PRRS có quan hệ họ hàng gần với vi rút viêm ñộng mạch ngựa, vi rút tăng enzyme lactate dehydrogenase ở chuột, vi rút gây sốt xuất huyết ở khỉ Cũng như ñưa ra những ñặc tính quan trọng của họ Arteriviridae,

bộ Nidovirales

Benfield (1992), ñã mô tả, ñặt tên cho virus gây bệnh ở Bắc Mỹ là VR-

2332 và ñưa ra ñặc tính của PRRSV như sức ñề kháng của PRRSV Tác giả khẳng ñịnh PRRSV thích hợp ở pH từ 6,5- 7,5

Mengeling và cs (1996), Mengeling và cs (1998), nghiên cứu về vắc xin chống lại PRRSV Khẳng ñịnh virus vắc xin kích thích ñáp ứng miễn dịch chậm, vi rút vắc xin có thể truyền qua nhau thai, truyền từ con ñược tiêm vắc xin sang con không tiêm vắc xin

Vezina và cs (1996), Yoon và cs (1995), ñã nghiên cứu về quá trình ñáp ứng miễn dịch của lợn khi cơ thể lợn nhiễm PRRSV Các tác giả ñã khẳng ñịnh kháng thể IgM xuất hiện vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 IgG xuất hiện sau khi nhiễm PRRSV Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4-5 tuần sau nhiễm PRRSV và ñạt tối ña vào lúc 10 tuần, miễn dịch kéo dài khoảng 1 năm

Zimmermen và cs (1999) ñã nghiên cứu một cách ñầy ñủ và sâu sắc về Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn Các tác giả ñã giải thích về nguồn gốc tên gọi PRRS, cũng như cung cấp cho ñộc giả một bảng danh sách tên gọi trước khi có tên PRRS

Jun Han, Yue Wang, Kay S.Faaberg (2006) ñã khẳng ñịnh, về mặt di truyền học và tính kháng nguyên hai loại vi rút Lelystad và VR- 2332 hoàn toàn khác nhau, nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng ñược tiến hoá theo hai hướng khác nhau Hai vi rút này ñã trở thành hai dòng vi rút nguyên mẫu, dòng Châu Âu (vi rút Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (VR2332)

Tại Trung Quốc, một căn bệnh bí hiểm ñã xảy ra còn ñược gọi là bệnh

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 13

sốt cao vào năm 2006 và người ta thấy có dấu hiệu của PRRS Căn bệnh này

ñã lan rộng ra hơn 10 tỉnh và tấn công 2.000.000 lợn, gây chết 400.000 lợn Không giống với PRRS ñiển hình, căn bệnh bí hiểm này xảy nhiều trên lợn lớn với dấu hiệu sốt cao, và một số triệu chứng như Dịch tả lợn Khi phân tích

hệ gen, người ta thấy các vi rút PRRS phân lập ñược thuộc nhóm II và tương ñồng rất cao với chủng HB-1, một chủng PRRS của Trung quốc (96,5%)

Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ phần lớn

hệ thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác có cơ hội phát triển và gây bệnh Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại thực bào chúng nhân lên

và phá huỷ rất nhanh tế bào bảo vệ cơ thể Vì thế vi rút hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó Một tỷ lệ lớn tế bào ñại thực bào trong phế nang phổi bị vi rút xâm nhiễm rất sớm

Lúc ñầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày vi rút sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai ñoạn ñầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại vi rút và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch ðiều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc ñánh giá mức ñộ miễn dịch ñối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn

Vi rút tương ñối mẫn cảm và dễ dàng bị tiêu huỷ bởi các yếu tố vật lý

và hoá học Cụ thể, vi rút bị tiêu huỷ nhanh chóng khi môi trường có pH<5.5 hoặc pH>6.5 và tính gây bệnh cũng giảm ñi ñến 90% ở những môi trường như vậy; ñối với tác ñộng của nhiệt ñộ, vi rút có thể tồn tại khoảng 120 giờ khi ở nhiệt ñộ 400C, 20 giờ ở nhiệt ñộ 200C, 3 giờ ở nhiệt ñộ 370C và 6 phút ở nhiệt ñộ 560C Vi rút cũng bị vô hoạt nhanh chóng khi bị tác ñộng bởi các loại hoá chất thông thường như chloroform hoặc ether

1.1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 14

Năm 1997 Việt Nam nhập 104 lợn giống từ Mỹ và đưa ra cơng ty giống gia súc Hà Nội 51 conlợn, khi kiểm tra cĩ 10/51 con cĩ huyết thanh dương tính với PRRS Từ năm 1997 đến 2006 cĩ rất nhiều tác giả trong nước nghiên cứu về hội chứng PRRS nhưng chỉ dừng lại ở điều tra, giám sát tỷ lệ lưu hành huyết thanh Bắt đầu từ tháng 3 năm 2007, khi các ổ dịch lâm sàng PRRS bùng nổ thì việc nghiên cứu về bệnh ở Việt Nam mới được triển khai tồn diện trên cả nước dưới nhiều hình thức cả về dịch tễ học và các biện pháp chẩn đốn xét nghiệm, phịng chống dịch bệnh

Từ năm 1999 – 2002 một số nhà khoa học Nhật Bản kết hợp với Trường ðại học Cần Thơ cũng đã tiến hành điều tra một số trường hợp bệnh

ở lợn cĩ hiện tượng lợn con chết và lợn nái sảy thai và điều trị kháng sinh khơng hiệu quả Trong nghiên cứu này, người ta điều tra một số nguyên nhân gây bệnh trong đĩ cĩ hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn ðiều tra được tiến hành ở các đàn lợn gia đình, một số trại giống của Nhà nước và một

số lị mổ

Các nhà khoa học đã phát hiện thấy kháng thể PRRS trong huyết thanh

ở các đàn lợn nuơi gia đình và cĩ tỷ lệ lưu hành cao ở các trại lợn của Nhà nước cùng với hiện tượng tỷ lệ lợn con chết cao Ngồi ra, cũng phát hiện thấy virus giả dại và virus Dịch tả lợn

Tơ Long Thành (2007), đã trình bày một cách tổng hợp về hội chứng PRRS nĩi chung, khẳng định lợn các lứa tuổi đều mắc, nhưng nặng nhất ở lợn nái và lợn con Tác giả đã đưa ra biện pháp phịng hội chứng PRRS, trong đĩ nhấn mạnh việc phịng bệnh PRRS bằng vắc xin

Khi lợn mắc PRRS khơng chỉ cĩ những bệnh tích đặc trưng nhất của PRRS là ở phổi và hạch lâm ba, mà cịn cĩ những bệnh tích khác do vi khuẩn

kế phát gây ra Những vi khuẩn kế phát ở đường phổi thường gặp là Mycoplasma hyopneumoniae (suyễn lợn), Pasteurella multocida (Tụ huyết trùng), Streptococcus suis type 2 (liên cầu khuẩn type 2), Bordetella

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 15

bronchiseptica (viêm teo mũi) và Haemophilus parasuis (viêm đường hơ hấp)… Bùi Quang Anh và cs (2007) Theo kết quả nghiên cứu của Viện Thú

y Quốc gia do tác giả Cù Hữu Phú thực hiện cho thấy, các bệnh nhiễm trùng

kế phát thường gặp ở lợn mắc bệnh Tai xanh gồm: Tụ huyết trùng, Liên cầu khuẩn và Viêm phổi do vi khuẩn ở lợn

Phạm Ngọc Thạch và cs (2007), nghiên cứu về một số chỉ tiêu lâm sàng

và chỉ tiêu máu của lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên đã cho thấy, khi lợn mắc PRRS tần số hơ hấp, tim mạch, thân nhiệt đều cao hơn sinh lý bình thường, chỉ tiêu sinh lý, sinh hố máu thay đổi đặc biệt là số lượng bạch cầu, độ dự trữ kiềm tron máu tăng cao Trong khi hàm lượng protêin tổng số, hàm lượng đường huyết lại giảm rõ rệt

Lê Văn Năm (2007), khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể ở lợn mắc PRRS tại một số địa phương thuộc ðồng bằng Bắc Bộ- Việt Nam đã thấy rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS tương tự như các tài liệu trong và ngồi nước cơng bố Nhưng điểm khác đĩ là tỷ lệ tiêu chảy, lạc giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo bĩn ở lợn lớn hơn

Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên và cs (2007), đã sử dụng kỹ thuật RT- PCR để phát hiện vi rút PRRS trong các mẫu huyết thanh, tinh dịch,

mơ của lợn cĩ kết quả dương tính và âm tính với kháng thể PRRS khi dùng phương pháp ELISA Tác giả đã khơng ghi nhận được mối tương quan giữa

sự liên hệ của kháng thể kháng PRRS và kết quả dương tính với virus PRRS chẩn đốn bằng kỹ thuật RT- PCR

Tơ Long Thành, Nguyễn Văn Long và cs (2008) đã cho biết năm 2008

số lượng bệnh phẩm lợn mắc PRRS gửi đến Trung tâm chẩn đốn thú y TW nhiều hơn năm 2007, khẳng định những mẫu bệnh phẩm dương tính với PRRS cĩ sự bội nhiễm vi khuẩn Chủng vi rút độc lực cao của Việt Nam cĩ

sự tương đồng về cấu trúc gen với chủng vi rút độc lực cao của Trung Quốc

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 16

đến 99% Khi sử dụng virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam cơng cho lợn thí nghiệm lợn khơng chết, huyễn dịch bệnh phẩm lấy tại ổ dịch của Việt Nam gây chết 100% lợn trong 72h ðiều này cho thấy vai trị của vi khuẩn bội nhiễm

Trần Thị Bích Liên (2008) đã tổng quát về tình hình dịch PRRS cả Việt Nam và thế giới cũng như những đặc điểm cơ bản về PRRSV ðặc biệt tác giả đưa ra phương pháp chẩn đốn PRRS như phân lập virus bằng phương pháp IPMA, IPMA kết hợp với PCR, phương pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể Tác giả chỉ rõ để phát hiện kháng nguyên sử dụng phương pháp RT- PCR

là hiệu quả nhất, phát hiện kháng thể cĩ hai phương pháp cĩ độ chính xác cao

Nĩi chung, cho đến nay ở Việt Nam chưa cĩ nhiều nghiên cứu về Hội chứng rối loạn và sinh sản ở lợn, đặc biệt là nghiên cứu sâu về mầm bệnh, tính chất kháng nguyên cũng như độc lực của vi rút gây bệnh Việc điều tra sự lưu hành của vi rút PRRS cũng chưa được tiến hành một cách rộng rãi

Từ tháng 3 năm 2007, một căn bệnh lạ đã xuất hiện trên nhiều đàn lợn

ở một số tỉnh như Hưng Yên, Hải Dương, Thái Bình, Hà Nội, Quảng Nam Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương đã xác định được nguyên nhân chính gây bệnh là Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn (PRRS) Căn bệnh này cĩ đặc điểm là xảy ra ở tất cả các lứa tuổi lợn và khác biệt với vi rút PRRS thể cổ điển chủ yếu tấn cơng lợn nái và lợn con

Các mẫu vi rút PRRS phân lập được từ các ổ dịch đã được gửi đi giá định tại Phịng thí nghiệm Chẩn đốn Thú y quốc gia của Hoa Kỳ (USDA-NVSL) và tại Trung tâm Kiểm sốt và phịng chống dịch bệnh Trung Quốc

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17

Kết quả giám ñịnh cho thấy các mẫu vi rút của Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ

và có ñộ tương ñồng cao (98,7-99,8%) với virus PRRS gây bệnh tại Trung Quốc năm 2006 Phân tích cấu trúc gen NSP2 của vi rút PRRS phân lập ở Việt Nam cũng thấy có 2 ñoạn mất không liên tiếp của axit amin tại vị trí 481

và 532-560 Theo các nhà khoa học Trung Quốc vi rút PRRS phát hiện ñược

ở Việt Nam có sự mất ñoạn giống với PRRS chủng ñộc lực cao ở Trung Quốc

1.1.4 Tình hình dịch Tai xanh ở Việt Nam

Tại Việt Nam, bằng chứng của vi rút PRRS lần ñầu tiên ñược phát hiện

ở ñàn lợn giống nhập khẩu từ Hoa Kỳ vào năm 1997 Sau ñó, một số nghiên cứu giám sát khẳng ñịnh có sự lưu hành của vi rút PRRS tại các tỉnh miền Nam ở các mức ñộ khác nhau tùy theo từng ñịa phương và trại chăn nuôi Tuy nhiên, ñến trước tháng 3/2007 không có ổ dịch PRRS nào ñược báo cào từ các ñịa phương trong cả nước

Tháng 3/2007, lần ñầu tiên dịch bệnh trên lợn xuất hiện tại Hải Dương

5 tỉnh khác của miền Bắc Sau ñó, với sự hộ trợ của Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), nguyên nhân gây bệnh ñã ñược khẳng ñịnh là do vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ gây ra Vi rút này ñã ñược xác ñịnh là có tương ñồng ở mức ñộ cao về kháng nguyên so với vi rút PRRS gây bệnh trầm trọng tại Trung Quốc vào năm 2006 Tuy nhiên, những ñặc ñiểm dịch tễ của bệnh PRRS tại Việt Nam chưa ñược hiểu rõ ràng, các giải pháp xử lý lợn mắc bệnh

và lợn trong vùng dịch vào thời ñiểm ñó còn gặp nhiều khó khăn

Kết quả ñiều tra ổ dịch tại các tỉnh miền Bắc (Hưng Yên, Hải Dương và Thái Bình), các tỉnh miền Bắc Trung bộ và miền Trung (Thanh Hóa, Quảng Nam) và các tỉnh miền Nam (Long An, Vĩnh Long và Bạc Liêu) cho thấy:

- Nguyên nhân phát dịch PRRS tại Việt Nam có thể liên quan ñến tình

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 18

hình dịch ở các nước láng giềng, cụ thể: nguồn bệnh có thể từ Trung Quốc vào Việt Nam qua cửa khẩu Quảng Ninh, Lạng Sơn Việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm không ñược kiểm soát triệt ñể nên nguồn bệnh ñã xâm nhập vào nước ta và sau ñó ñã lây lan theo ñường vận chuyển, gây ra dịch tại các tỉnh Hải Dương, Bắc Giang, Hưng Yên, Thái Bình ở ñợt dịch ñầu năm 2007 Nhận ñịnh này tương ñồng với thông báo của Tổ chức Thú y thế giới (OIE) là trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nước trong khu vực, ñặc biệt dịch ñã ñồng loạt xảy ra ở nhiều nơi trên toàn lãnh thổ Trung Quốc Ngoài ra, kết quả phân tích cấu trúc gien của vi rút PRRS do phía Trung Quốc

và Mỹ thực hiện cho thấy, vi rút PRRS gây dịch tại Việt Nam ñều có mức tương ñồng về amino acid từ 99-99,7% so với chủng vi rút PRRS thể ñộc lực cao gây dịch ở Trung Quốc

- Việc giám sát và sớm phát hiện dịch bệnh chưa ñược ñịa phương thực hiện ñầy ñủ do nhiều nguyên nhân khác nhau, dẫn ñến nhiều nơi dịch ñã xảy

ra và nhhiều ngày sau thú y cơ sở mới báo dịch (ví dụ như ở Quảng Nam, Hà Tĩnh, ở Thanh Hóa dịch xuất hiện tại hơn 40 xã, phường trong vòng một ngày,…); và chưa thực hiện triệt ñể các biện pháp chống dịch, tiêu huỷ lợn bệnh ngay từ khi dịch còn ở phạm vi nhỏ Nghiên cứu tại 11 tỉnh cho thấy: Tỷ

lệ hộ chăn nuôi không thông báo cho thú y cơ sở hoặc chính quyền mà tự xử

lý chiếm tương ñối cao (31.94%)

- Dịch lây lan rất nhanh (giữa các tỉnh phía Bắc hoặc từ Bắc vào miền Trung năm 2007) do không quản lý ñược việc vận chuyển lợn ốm Cụ thể, tại 11 tỉnh nghiên cứu tỷ lệ các hộ chăn nuôi lợn bị bệnh có thương lái ñến thăm ñàn lợn trong vòng 1 tháng chiếm 34,29%; hoặc có thú y cơ sở ñến thăm khám, tiêm phòng tại 42% số hộ chăn nuôi lợn trong vòng 1 tháng trước khi xảy ra Ngoài

ra, 70/70 (100%) số hộ chăn nuôi có dịch PRRS ñều mua thịt lợn từ nơi khác

ñể ăn thịt và cho lợn ăn nước rửa hoặc các chất phụ phẩm khác mà chưa qua

xử lý; sử dụng lợn ñực giống từ các cơ sở khác (chiếm 51,43%), mua lợn

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 19

giống từ các xã, huyện khác (chiếm 57,14%)

- Dịch ñã xuất hiện tại trại chăn nuôi lợn giống của một số tỉnh (Hải Dương, Vĩnh Long, Gia Lai và Bạc Liêu), sau ñó lây lan sang các ñịa phương xung quanh do việc bán lợn giống, tinh dịch

* Tổng hợp các ñợt dịch bệnh PRRS ở Việt Nam từ 2007 ñến 2011

Năm 2007: Vào ngày 12/3/2007 lần ñầu tiên dịch PRRS xuất hiện ở

nước ta trên ñàn lợn của tỉnh Hải Dương làm cho 8.179 con lợn mắc bệnh,

844 lợn chết ðến hết ñợt dịch thứ nhất (ñến ngày 15/5/2007), dịch PRRS xảy

ra tại 172 xã, phường, thuộc 30 huyện, thị xã của 09 tỉnh Sau ñó vào tháng 6/2007, dịch xuất hiện tại Quảng Nam và lây lan sang các tỉnh miền Trung và miền Nam tại 233 xã, phường thuộc 45 huyện, thị của 14 tỉnh, thành phố Trong năm 2007, toàn quốc có 324 xã, phường của 65 huyện, quận thuộc 18 tỉnh, thành phố có dịch Số lợn mắc bệnh là 70.577 con (chiếm 0,26% tổng ñàn, toàn quốc có 26.560.651 con), số lợn chết và phải tiêu huỷ là 20.366 (chiếm gần 0,08%)

Năm 2008: Dịch Tai xanh ñã xảy ra thành hai ñợt chính tại 956 xã,

phường thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con trong ñó số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con Từ ngày 20/3 - 25/5/2008 (67 ngày) xuất hiện tại 821 xã, phường và thị trấn, 59 huyện, thị và thành phố của 10 tỉnh Nặng nhất là Thanh Hóa với 187.436 lợn mắc bệnh, 37.159 lợn chết và có ngày trên 40 xã, phường báo cáo có dịch PRRS, tiếp ñến là Hà Tĩnh với 29.875 lợn mắc bệnh, 296 lợn chết

Năm 2009: Dịch tai xanh xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh,

thành là BR Vũng Tàu, Bạc Liêu, Bến Tre, Bắc Giang, Bình Dương, ðắc Lắc, ðồng Nai, Gia Lai, Hưng Yên, Quảng Ninh, Quảng Nam, Tiền Giang và Vĩnh Long với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu hủy

Năm 2010:

ðợt 1/2010 tại miền Bắc: Dịch lợn tai xanh ñã xảy ra từ ngày

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 20

23/3/2010 tại Hải Dương Tính ñến hết tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các

ổ dịch tai xanh tại 461 xã, phường, thị trấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố gồm Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Hà Nội, Nam ðịnh, Hà Nam, Nghệ An, Quảng Ninh, Hòa Bình, Cao Bằng, Sơn La Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con trong ñó số tiêu hủy là 65.911 con

ðợt 2/2010 tại miền Nam: Theo kết quả ñiều tra, ñợt dịch này bắt ñầu

từ ngày 11/6/2010 tại Sóc Trăng Sau ñó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Lào Cai (11/7), Quảng Trị (01/7) Tổng số lợn trong ñàn mắc bệnh là 926.333 con, số mắc bệnh là

621.086 con, trong ñó số chết, tiêu hủy là 336.975 con

Năm 2011:

ðợt 1: Dịch lợn tai xanh ñã xảy ra từ ngày 25/2/2011 tại 01 hộ chăn nuôi lợn nái hậu bị tại xã ðức Long, huyện ðức Thọ, tỉnh Hà Tĩnh, ñến nay toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 128 xã, phường, thị trấn của 21 quận, huyện thuộc 7 tỉnh là Bắc Ninh, Hải Dương, Thái Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị và Bình Dương Tổng số lợn mắc bệnh là 14.759 con trong

ñó có 1.468 con lợn nái, 5.346 con lợn thịt và 7.665 con lợn con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 14.158 con trong ñó 1.373 con lợn nái, 4.850 con lợn thịt và 7.581 con lợn con

ðợt 2: Dịch lợn tai xanh ñã xảy ra từ ngày 30/8/2011 tại tỉnh Tây Ninh, ñến nay toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 137 xã, phường, thị trấn của 29 quận, huyện thuộc 8 tỉnh là Tây Ninh, Long An, Tiền Giang, Sóc Trăng, Quảng Nam, Cần Thơ, Khánh Hòa và Hà Nội Tổng số lợn mắc bệnh

là 27.558 con lợn trên tổng ñàn 46.328 con; tổng số lợn phải tiêu hủy là 12.361con

Tình hình dịch PRRS năm 2011 ñã giảm so với cùng kỳ năm 2010 cả

về phạm vi, quy mô dịch và số lượng gia súc phải tiêu hủy

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 21

90 ngày Năm 2008 dịch xảy ra trầm trọng nhất nhưng ñộ dài của các ñợt dịch

là ngắn nhất (16-73 ngày) Năm 2007, dịch có ñộ dài lớn nhất (trung bình 27 – 90 ngày) Năm 2009, dịch có ñộ dài trung bình 27 - 63 ngày (ngắn nhất) ðiều này cho thấy việc chỉ ñạo chống dịch của các ñịa phương có dịch kéo dài còn có phần lơ là, chủ quan, không triển khai quyết liệt và ñồng bộ các biện pháp phòng chống hoặc do mầm bệnh ñã phát tán và tồn tại ở nhiều nơi nên thỉnh thoảng xảy ra ở các ñịa phương

* Tỷ lệ lợn mắc bệnh: Kết quả phân tích tổng hợp trong 3 năm (2007-2009)

cho thấy lợn choai – lơn thịt mắc bệnh nhiều nhất chiếm tỉ lệ 59,14% (95% CI 58,81 – 59,46%) tổng số lợn ốm, tiếp ñến là lợn nái 20,99% (95% CI 20,72 – 21,25%) và lợn con chiếm 19,79% (95% CI 19,03 – 20,05%), lợn ñực giống ít mắc bệnh 0.01%;

* Tỷ lệ lợn chết vì bệnh: lợn choai – lơn thịt có tỷ lệ chết cao nhất, chiếm

52,89% (95% CI 52,57 – 53,22%), lợn con là 30,90% (95% CI 30,59 – 31,20%), lợn nái là 16,14% (95% CI 15,90 – 16,39%), lợn ñực có tỷ lệ chết thấp nhất là 0,01%

Tuy nhiên, tỷ lệ lợn bệnh và lợn chết vì bệnh không thực sự chuẩn xác

do khi phát hiện lợn bệnh hoặc lợn chết vì PRRS, toàn bộ ñàn lợn buộc phải tiêu hủy theo Quyết ñịnh số 80/2008/Qð-BNN ngày 15/7/2008 Vì vây, tỷ lệ tiêu hủy chiếm gần 100% tổng ñàn lợn có bệnh, chỉ có một số ít lợn ñã bị người dân và thương lái bán chạy và tiêu thụ ở giai ñoạn ñầu của ñợt dịch

* Mầm bệnh kế phát: Tỷ lệ phát hiện ñược vi rút PRRS tại các mẫu bệnh

phẩm xét nghiệm là 50,27% Ngoài ra, còn phát hiện ñược các loại mầm bệnh khác như vi rút Dịch tả lợn (chiếm 8,23% tổng số mẫu xét nghiệm và 16,36% tổng số mẫu dương tính với PRRS), vi khuẩn Tụ huyết trùng, E.coli và

Streptococcus spp Trung bình, tỷ lệ các mẫu các mẫu xét nghiệm chứa

mầm bệnh khác là 10,60% hoặc chiếm 21,09% tổng số mẫu dương tính với

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 22

PRRS ðiều này cho thấy tình trạng nhiễm trùng các mầm bệnh kế phát là tương ñối phổ biến và ñây cũng là những nguyên nhân dẫn ñến các ca bệnh PRRS càng trầm trọng hơn Bên cạnh ñó, kết quả này một lần nữa khẳng ñịnh

tỷ lệ tiêm phòng các bệnh (ñỏ) ở lợn ñạt kết quả rất thấp

* ðặc ñiểm dịch tễ PRRS liên quan ñến các yếu tố nguy cơ:

- Yếu tố về tổng ñàn lợn: Các ñịa phương có tổng ñàn lớn thường có tỷ

lệ mắc bệnh cao hơn hẳn so với các ñịa phương có tổng ñàn nhỏ Ví dụ, trong các ñợt dịch năm 2007, Bắc Giang có tổng ñán trên 1 triệu lợn thì có tỷ lệ lợn mắc bệnh là 1000,76 con/tổng số 100.000 lợn so với Quảng Trị có tổng ñàn trên 220 nghìn con lợn có tỷ lệ bệnh là 46,46 con tổng số 100.000 Tương tự các ñợt dịch năm 2008 cũng cho thấy, Thanh Hóa có tổng ñàn lợn trên 2 triệu con, có tỷ lệ mắc bệnh là 16304,11 con/tổng số 100.000 lợn so với Nình Bình với tổng ñàn trên 370 nghìn lợn, có tỷ lệ mắc bệnh là 122,2 con/tổng số 100.000 lợn Quảng Nam là tỉnh có tổng ñàn lợn tương ñối lớn trên 500 nghìn con, tỷ lệ lưu hành bệnh luôn ở mức cao trong 3 năm (2007 - 2009), trung bình là 2076,06 lợn bệnh/tổng số 100.000 lợn (khoảng 2,1%)

- Yếu tố về khai báo dịch bệnh: Tỷ lệ hộ chăn nuôi thông báo cho người

thú y cơ sở là 50,12% Tuy nhiên một số thú y cơ sở lại giữ lại lợn bệnh ñể ñiều trị một thời gian và báo cáo với chính quyền và thú y cấp trên khi thấy việc ñiều trị không có kết quả Tỷ lệ hộ chăn nuôi không thông báo cho thú y

cơ sở hoặc chính quyền mà tự xử lý là tương ñối cao (31.94%) Việc giữ lại lợn bệnh ñể tự xử lý cũng có thể là yếu tố làm phát tán, lây lan dịch bệnh

- Yếu tố về vận chuyển và giết mổ lợn bệnh: Một số ñịa phương do

không quản lý ñược việc vận chuyển và giết mổ lợn bệnh, nhiều thương lái hám lời bất chấp luật pháp ñã tham gia vận chuyển bất hợp pháp lợn bệnh ñi tiêu thụ làm dịch bệnh lây lan nhanh Tỷ lệ các hộ có thương lái ñến thăm ñàn lợn trong vòng 1 tháng chiếm 34,29%

- Yếu tố khác: Tất cả (100%) số hộ chăn nuôi mua thịt lợn từ nơi khác

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 23

để ăn và cho lợn ăn nước rửa hoặc các chất phụ phẩm khác mà chưa qua xử lý; sử dụng lợn đực giống từ các cơ sở khác (chiếm 51,43%), mua lợn giống

từ các xã, huyện khác mà (chiếm 57,14%); thú y cơ sở khi đi tiêm phịng hoặc điều trị lợn bệnh các biện pháp vệ sinh, tiêu độc, khử trùng đã khơng thực hiện triệt để, theo điều tra cho thấy: cĩ 42% hộ gia đình trong vịng 1 tháng trước khi xảy ra dịch cĩ thú y cơ sở đến thăm khám hoặc tiêm phịng

1.2 Các kiến thức về chẩn đốn

1.2.1 Chẩn đốn qua các dấu hiệu lâm sàng

Theo ghi nhận của nhiều nghiên cứu về các dấu hiệu triệu chứng lâm sàng ở lợn mắc Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp cho thấy, lợn bệnh thường cĩ các triệu chứng đầu tiên là sốt cao, bỏ ăn, mẩn đỏ ở da, thở khĩ, phân thường táo bĩn hoặc ỉa chảy và một số triệu chứng khác tuỳ thuộc vào bệnh kế phát và từng loại lứa tuổi của lợn

1.2.2 Chẩn đốn dựa vào bệnh tích

Nghiên cứu bệnh tích là một trong những khâu quan trọng để xác định các tổn thương do bệnh nguyên gây ra Kết quả nghiên cứu về bệnh tích đại thể và bệnh tích vi thể ở các nhĩm lợn bệnh của nhiều tác giả cho thấy:

Khi quan sát bệnh tích vi thể ở phổi, nhiều tác giả kết luận Thường thấy dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm tế bào viêm, trong phế nang chứa đầy dịch viêm và đại thực bào, một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân Một bệnh tích đặc trưng nữa là sự thâm nhiễm của tế bào phế nang loại II (pneumocyte) làm cho phế nang bị nhăn lại, thường bắt gặp đại thực bào bị phân huỷ trong phế nang Nguyễn Văn Thanh(2007)

Nghiên cứu phương pháp chẩn đốn Hội chứng rối loạn sinh sản và hơ hấp ở lợn nhiều tác giả cho rằng PRRS cĩ thể chẩn đốn được bằng hai phương pháp cơ bản đĩ là chẩn đốn lâm sàng và chẩn đốn trong phịng thí nghiệm (đặc biệt là chẩn đốn huyết thanh học) Tuy nhiên, trên thực tế để

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 24

đảm bảo độ chính xác cao, việc phối hợp cả hai phương pháp là cần thiết

Về chẩn đốn lâm sàng thường dựa vào hai nhĩm triệu chứng đĩ là các triệu chứng về rối loạn hơ hấp và rối loạn sinh sản

- Ở lợn nái tăng đột biến tỷ lệ sảy thai, đẻ non, thai chết lưu, tỷ lệ lợn con sơ sinh chết cao, các hiện tượng này xảy ra trong khoảng từ 8 - 20% tổng số lợn nái của cơ sở chăn nuơi;

- Ở các nhĩm lợn khác cĩ hiện tượng đồng loạt bỏ ăn hoặc ăn ít, sốt cao 40 -

410C, khĩ thở, ban đỏ ở da, táo bĩn hoặc ỉa chảy, tốc độ lây lan nhanh, đặc biệt ở một số con lợn bệnh chĩp tai bị ứ huyết cĩ màu xanh tím

- Phương pháp phân lập trên tế bào MARC 145 là phương pháp gây nhiễm mẫu nghi lên trên tế bào một lớp và kiểm tra kết quả bằng hình thái CPE đặc trưng của vi rút

1.2.4 Phương pháp huyết thanh học

Cĩ thể phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn, dịch của cơ thể,

từ thai chết lưu bằng nhiều phương pháp, nhưng hiện nay thường sử dụng bốn phương pháp sau (William T., Christianson và Han Soo Joo, 2001)

+ Phương pháp lấy mẫu: ðối với các mẫu máu chắt lấy huyết thanh cho làm xét nghiệm phát hiện kháng nguyên, kháng thể, mẫu huyết thanh bảo quản ở 40C và khơng bị dung huyết Tất cả các mẫu vật cần được gửi nhanh đến phịng thí nghiệm và được bảo quản theo yêu cầu kỹ thuật, cĩ báo cáo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 25

diễn biến tình hình và biên bản mổ khám, lấy mẫu kèm theo

+ Phản ứng ELISA (Enzyme linked immunosortbent assay) trực tiếp và gián tiếp, nhưng người ta thường sử dụng phản ứng ELISA gián tiếp Phản ứng ELISA ñược sử dụng nhiều ở Mỹ, ñây là phản ứng sử dụng kháng nguyên gắn vào ñĩa mà vi rút chuẩn ñược gây nhiễm trên ñĩa ELISA

+ IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay) - Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp ðây là phương pháp sử dụng một thảm tế bào ñã gây nhiễm vi rút chuẩn ñể phát hiện kháng thể nghi

+ Phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp Cơ chế giống phản ứng ELISA hay IPMA, nhưng khác là kháng kháng thể có gắn chất phát quang, khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang có hiện tượng phát màu

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 26

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

* Nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu:

- Kít ELISA IDEXX (HerdChek 3X)

- Mẫu bệnh phẩm lợn bị mắc bệnh PRRS chẩn đốn dương tính với rRT- PCR

- Mẫu huyết thanh của một số tỉnh cĩ dịch PRRS

- Tế bào MARC 145

- Lợn khỏe mạnh, âm tính kháng thể PRRS

- Kít chiết tách, kít nhân gen, conjugate kháng lợn ngoại nhập

- Máy rRT-PCR, Máy ELISA

- Micropipet nhiều đầu: 5µl đến 50µl, 50µl đến 300µl

- Dụng cụ nuơi cấy tế bào: chai nhựa 75cm, đĩa nhựa 96 giếng, 6 giếng, 24 giếng

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27

- Dung dịch HCl 1N

- Cồn Ethanol 960

- Cồn Ethanol 700

* Môi trường:

- Nước cất và nước khử ion

- Môi trường nuôi cấy:

Môi trường nuôi cấy: Eagle’s minimum essential medium (EMEM)

- Nhân giống vi rút ñã lựa chọn và chuẩn ñộ vi rút

2.2.2 Chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA, ELISA

- Dùng vi rút ñã chuẩn ñộ gây nhiễm trên tế bào MARC chế kháng nguyên cho phản ứng IPMA

- Sử dụng tế bào MARC 145 và dung dịch RIPA chiết tách kháng nguyên là protein của vi rút làm kháng nguyên cho phản ứng ELISA

2.2.3 Sử dụng vi rút ñể chế kháng huyết thanh trên lợn

- Sử dụng vắc xin PRRS nhược ñộc chế từ chủng vi rút PRRS có ñộc

Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ……… 28

lực cao tiêm cho lợn khơng cĩ kháng thể PRRS để gây miễn dịch (theo liều chỉ định)

- Sử dụng vi rút PRRS đã được lựa chọn tiêm truyền tiếp cho lợn

(Liều ≥ 105 TCID50) để chế kháng huyết thanh PRRS)

2.2.4 Chuẩn độ kháng nguyên và kháng huyết thanh chế được

- Kháng nguyên và kháng huyết thanh đã chế được chuẩn độ bằng phương pháp ELISA sử dụng conjugate kháng lợn ngoại nhập

- Kháng nguyên và kháng huyết thanh đã chế được chuẩn độ bằng phương pháp IPMA sử dụng conjugate kháng lợn ngoại nhập

2.2.5 Kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu chẩn đốn đối với kháng nguyên và kháng huyết thanh tự chế

- Dùng kháng nguyên và kháng thể chế được bước đầu kiểm tra độ nhạy và độ đặc hiệu chuẩn đốn bằng phương pháp ELISA

- Thử nghiệm kháng nguyên và kháng huyết thanh chế được trong chẩn đốn huyết thanh bệnh PRRS bằng phương pháp ELISA

2.3 Phương pháp nghiên cứu

- Các phương pháp chẩn đốn lâm sàng thường quy và mổ khám bệnh tích (Hồ Văn Nam, 1982), (Hồ Văn Nam và cs, 1996), (Hồ Văn Nam và cs, 1996) và (Chu ðức Thắng và cs, 2008)

- Các phương pháp chẩn đốn trong phịng thí nghiệm

2.3.1 Phân lập vi rút trên mơi trường tế bào MARC145

Quy trình phân lập:

Chuẩn bị:

- Tế bào MARC 145 trong chai T75 đã cĩ 80% te bào phát triển trên bề mặt thảm

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 29

- EMEM 5%FCS

- PBS-

- Trypsin 0.05 EDTA

Gây nhiễm tế bào MARC145

- Tế bào vừa phủ khoảng 80% chai nuôi tế bào T75

- Bỏ môi trường ñang có trong bình, rửa 2 lần bằng PBS lượng 10ml

- Thêm vào 0.5-> 1 ml vi rút ñã chọn

- ðặt bình nằm trong tủ 370C trong 1 giờ

- Thêm 15ml EMEM duy trì

- Nuôi trong tủ ấm 370C có 5% CO2

Theo dõi hủy hoại tế bào do vi rút PRRS

Quan sát sự phát triển của tế bào trên kính hiển vi trong vòng 7 ngày, Bệnh tích tế bào khi bị vi rút xâm nhập và gây bệnh, tế bào thay ñổi hình thái: co tròn thành từng ñám (giống hình núi) sau ñó là tế bào không bám dính

Thu huyễn dịch tế bào có chứa vi rút: Cất chai tế bào có vi rút vào tủ

-800C, sau 1 giờ lấy ra giải ñông Cho toàn bộ môi trường nuôi và tế bào vào ống Falcon 15ml, ly tâm, thu dung dịch ở trên và bỏ cặn tế bào

Kiểm tra sự có mặt của vi rút bằng phương pháp realtime RT-PCR

2.3.2 Phương pháp phát hiện, giám ñịnh vi rút bằng phương pháp realtime RT-PCR

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 30

2000UI/ml, Streptomycin 2mg/ml) Ly tâm lấy dịch nổi ñể chiết tách RNA + Mẫu là huyễn dịch sau khi phân lập có bệnh tích tế bào trên tế bào MARC

145

Tiến hành:

Chiết tách RNA: Các mẫu bệnh phẩm nên chiết tách bằng kít, khi sử dụng nên theo hướng dẫn của nhà sản xuất (có thể sử dụng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep)

• Nhỏ 500µl huyễn dịch phủ tạng vào ống ly tâm loại 1,5 ml cộng với 500µl Qiagen buffer RLT có 1% β-ME, lắc ñều trên máy Votex

• Ly tâm nhẹ rồi thêm 500µl cồn ETOH 70% (ethanol) vào ống, lắc mạnh bằng máy Votex

• Ly tâm mẫu ñã bị dung giải trong 5 phút ở tốc ñộ 5000xg ở nhiệt ñộ phòng;

• Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây tốc ñộ ≥ 8000xg ở nhiệt ñộ phòng;

• Bổ sung 700µl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8000xg, thay ống thu mới vào cột lọc;

• Nhỏ 500µl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ñộ ≥ 8000xg, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer, thay ống thu mới;

• Ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 phút ở tốc ñộ tối ña, bỏ ống thu;

• ðặt cột lọc vào ống thu RNA, nhỏ 50µl RNase free H2O vào cột lọc, ủ ở nhiệt ñộ phòng trong ít nhất 1 phút Tách RNA bằng cách ly tâm trong 1 phút

ở 10000vòng/phút, bỏ cột lọc, giữ lại dịch trong ống thu RNA;

• Bảo quản mẫu RNA thu ñược ở 40C trong thời gian ngắn trước khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở - 200C hoặc nhiệt ñộ thấp