Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn fasciola SPP ở việt nam

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---***--- NGUYỄN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN

FASCIOLA SPP Ở VIỆT NAM

CHUYÊN NGÀNH: ĐỘNG VẬT HỌC

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SỸ

Hà Nội, 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, PHÂN TỬ VÀ SINH HỌC CỦA SÁN LÁ GAN LỚN

FASCIOLA SPP Ở VIỆT NAM

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Lời cảm ơn

Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đối tới ban lãnh đạo Viện sốt rét – ký sinh trùng và côn trùng ương, Khoa sinh học phân tử thuộc viện Sốt rét, phòng Ký sinh trùng, phòng Sau đại học cùng với ban lãnh đạo viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Ngọc Doanh, người thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo và trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện luận văn này!

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em thuộc khoa Sinh học phân tử

- Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng trung ương và phòng Ký sinh trùng viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện

đề tài cũng như đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn của tôi

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy/cô trong Hội đồng chấm luận văn

đã có những ý kiến đóng góp quý báu để luận văn của tôi được hoàn thiện

Tôi xin chân thành cảm ơn, người thân, bạn bè đồng nghiệp đã ủng hộ tôi và giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn đến 2 bên Cha, Mẹ

đã vất vả sinh thành, nuôi dưỡng cũng như tạo điều kiện để tôi có được kết quả như ngày hôm nay Cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chồng và con tôi! Những người luôn sát cánh bên tôi và luôn là chỗ dựa tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt nhất luận văn này

Hà Nội, tháng 12 Năm 2014

Nguyễn Thị Thu Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn trung thực và chưa từng công

bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác.Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về tính trung thực và khoa học của các kết quả trong nghiên cứu này

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Mục Lục

Lời cảm ơn

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của sán lá gan lớn Fasciola spp 4

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn 4

1.2 Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn 5

1.2 Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới 6

1.2.1 Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn 6

1.2.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người 7

1.2.3 Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 9

1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá gan lớn tại Việt Nam 11

1.3.1 Mầm bệnh 11

1.3.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò 12

1.3.3 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam 12

1.3.4 Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn 13

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG,ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNGVÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu: Sán lá gan lớn Fasciola spp ở Việt Nam 15

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 15

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Phương pháp thu sán lá gan lớn trưởng thành từ bò: 15

2.4.2 Phương pháp thu trứng sán từ bò 16

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn 16

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu phân tử 16

2.4.5 Phương pháp nuôi trứng sán lá gan lớn 17

2.4.6 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của miracidium: 17

2.4.7 Phương pháp gây nhiễm miracidium cho ốc 17

2.4.8 Phương pháp nghiên cứu sự hóa nang và sức sống của metacercaria 18 2.4.9 Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và SPPS 18

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp ở Việt Nam 19

3.1 1 Đặc điểm hình thái sán lá gan Fasciola spp ở Việt Nam 19

3.1.2 Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn dựa trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 21

3.1.3 Thảo luận 26

3.2 Đặc điểm sinh học của sán lá gan F gigantica 30

3.2.1 Sự phát triển của trứng sán lá gan F gigantica 30

3.2.2 Đặc điểm sinh học của miracidium 34

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành 4

Hình 1.2 Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn 6

Hình 3.1 Hình thái chung của sán lá gan có ruột và tinh hoàn phân nhánh 19

Hình 3.2 Các dạng hình thái của sán lá gan lớn thu từ bò 20

Hình 3.3 Trình tự của TN3-Tây Ninh thể hiện một số vị trí có 2 đỉnh 24

Hình 3.4 Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài Fasciola spp 25

Hình 3.5 Trứng sán lá gan trong nước cất (a) và dung dịch muối 0,85% (b) 31

Hình 3.6 Sự phát triển của trứng sán lá gan ở nhiệt độ 25-340C 32

Hình 3.7 Miracidium của sán lá gan F gigantica 32

Hình 3.8 Ba loài ốc Lymnaea ở Việt Nam 39

Hình 3.9 Các giai đoạn phát triển của ấu trùng sán lá gan 44

Hình 3.10 Metacercaria sống (a) và chết ở nước muối 1,5% sau 15 phút (b) 48

Hình 3.11 Ảnh hưởng của các nồng độ muối 3 và 5% lên rau dấp cá, rau diếp và rau ngổ sau thời gian ngâm 15 phút 49

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nước muối 2% đến các loại rau sau khi ngâm 15 phút 50

Hình 3.13 Một muỗng canh muối 20 gram pha trong 1 lít nước để rửa rau sống 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Vật chủ trung gian của F hepatica ở các nước và vùng địa lý 10

Bảng 3.1 Kích thước sán lá gan lớn thu từ các địa điểm nghiện cứu 20

Bảng 3.2 So sánh kích thước của các nhóm sán lá gan có hình dạngcơ thể khác nhau 21

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu 22

Bảng 3.4 So sánh trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài sán lá gan 23

Bảng 3.5 Sự phát triển của trứng sán lá gan ở các điều kiện khác nhau 31

Bảng 3.6 Sự phát triển của trứng sán ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 33

Bảng 3.7 Thời điểm trứng sán nở trong ngày 35

Bảng 3.8 Khả năng sống của miracidium ở điều kiện 26-280C 36

Bảng 3.9 Độ sâu ưa thích của miracidium 38

Bảng 3.10 Kết quả gây nhiễm miracidium sán lá gan cho các loài ốc 40

Bảng 3.11 Thời gian cercaria thoát khỏi ốc và hóa nang 45

Bảng 3.12 Sức sống của nang sán trong các nồng độ muối khác nhau 48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/

CHỮ VIẾT TẮT

ITS : Internal Transcribed Spacer (đoạn giao gen)

PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi Polymerase)

WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

1

MỞ ĐẦU

1 Sự cần thiết của đề tài

Bệnh sán lá gan lớn gây nên bởi các loài sán lá Fasciola spp., phổ biến

là 2 loài Fasciola hepatica Linnaeus, 1758và Fasciola giganticaCobbold,

1855, có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe gia súc và gây thiệt hại cho ngành chăn nuôi.Hơn thế nữa, sán lá gan còn gây bệnh cho người.Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) bệnh sán lá gan lớn là một trong những vấn đề y tế quan trọng và luôn được quan tâm nghiên cứu Người và động vật nhiễm bệnh sán lá gan lớn do ăn phải rau, cỏ hoặc uống nước lã có chứa ấu trùng cảm nhiễm metacercaria Sán trưởng thành ký sinh ở gan vật chủ, gây tổn thương chủ yếu ở gan, nhưng cũng có thể gây tổn thương ngoài gan khi ký sinh lạc chỗ (Dalton 1999)

Trong vòng đời phát triển của sán lá gan lớn, trứng được thải ở gan vật chủ, theo ống dẫn mật xuống ruột và ra môi trường cùng với phân Gặp điều kiện thuận lợi, trứng phát triển và nở ra thành ấu trùng miracidium.Miracidium bơi trong nước, tìm vật chủ trung gian thích hợp để xâm nhập và phát triển thành các giai đoạn ấu trùng sporocyst, redia và cercaria.Cercaria trưởng thành thoát khỏi ốc, rụng đuôi hoá nang bám vào thực vật thuỷ sinh hoặc trôi nổi trong nước Khi vật chủ chính ăn phải thực vật thuỷ sinh hoặc uống nước có chứa metacercaria của sán lá gan lớn thì chúng phát triển thành con trưởng thành ký sinh ở gan Vật chủ trung gian thích hợp của sán lá gan lớn là ốc nước ngọt, thường là ốc thuộc họ

Lymnaeidae.Tuy nhiên, ốc vật chủ trung gian của các loài sán lá gan lớn,

thậm chí của cùng một loài ở các vùng địa lý khác nhau có thể là những loài

ốc khác nhau (Dalton 1999).Vì vậy, việc xác định chính xác vật chủ trung gian của sán lá gan lớn rất quan trọng trong việc phòng chống bệnh sán lá gan lớn cho gia súc và người

2

Ở Việt Nam, số ca bệnh mắc sán lá gan lớn ở người trong những năm gần đây tăng đáng kể, đặc biệt là ở miền Trung và miền Nam (Trần Vinh Hiển và CS 2006; Triệu Nguyên Trung và CS 2012).Vì vậy, sán lá gan lớn

và bệnh sán lá gan lớn ở nước ta được đặc biệt quan tâm nghiên cứu.Tuy nhiên, nhiều vấn đề về định loại hình thái, phân tử và vật chủ trung gian chưa thống nhất Các thông báo trước đây cho rằng ở Việt Nam tồn tại cả 2 loài sán

lá gan lớn, trong khi những nghiên cứu về phân tử gần đây chỉ phát hiện một

loài F gigatica và dạng lai (Lê Thanh Hòa và cs 2002; Nguyễn Văn Đề

2003; Lê Quang Hưng và cs 2003; Đặng Tất Thế và cs 2003; Nguyễn Văn Khá 2005; Trần Vinh Hiển và cs 2006; Nguyễn Văn Đề và cs 2006; Le et al 2007; Periago et al 2006; Nguyen et al 2009; Nguyen et al 2012) Một số

nghiên cứu cho thấy 2 loài ốc Lymnaea viridis và Lymnaea swinhoei là vật

chủ trung gian của sán lá gan lớn (Phan Địch Lân 1985; Nguyễn Trọng Kim 1997; Nguyễn Trọng Kim và cs 1997; Lê Hữu Khương và cs 2001; Vũ Sĩ Nhàn và cs 1989; Hồ Thị Nhuận và Nguyễn Ngọc Phương 1987), trong khi

một số tác giả khác chỉ tìm thấy ấu trùng sán lá gan lớn ở ốc L viridis (Phạm

Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê 2005;Phạm Ngọc Doanh và cs 2012; Dung et

al 2013) Để làm sáng tỏ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân tử và sinh học của sán lá gan lớn

Fasciola spp ở Việt Nam”

2 Mục tiêu của đề tài: Làm sáng tỏ đặc điểm phân loại và sinh học của sán

lá gan lớn Fasciola spp ở Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

- Cung cấp dẫn liệu chính xác về phân loại và đặc điểm sinh học của sán lá gan lớn ở Việt Nam

- Tạo cơ sở khoa học cho công tác phòng chống sán lá gan lớn một cách hiệu quả, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng

4 Những điểm mới của luận văn

- Khẳng định chỉ có loài ốc A viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan lớn F

gigantica(= L viridis) ở Việt Nam, còn loài R auricularia (= L swinhoei)

không bị nhiễm

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối đến sức sống của metacercaria, đưa

ra nồng độ muối thích hợp nhất để rửa sau sống an toàn là 2% ngâm trong 15 phút

4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung về đặc điểm hình thái và vòng đời phát triển của

sán lá gan lớn Fasciola spp

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn

Vị trí phân loại của sán lá gan lớn như sau:

Ngành (Phylum): Platyhelminthes Schneider, 173

Lớp (Class): Trematoda Rudolphi, 1808

Bộ (Order): Fasciolida Skrjabin et Schulz, 1935

Họ (family): Fasciolidae Railliet, 1895

Giống (Genus): Fasciola Linnaeus, 1758

Loài (species): F hepatica, F gigantica

Sán trưởng thành có kích thước lớn, hình lá dẹt (hình 1.1).Khi còn sống cơ thể màu nâu đỏ Phần đầu có dạng hình nón, có giác miệng, tiếp theo là hầu, ruột phân nhánh chạy dọc từ trước ra sau cơ thể Hai tinh hoàn phân nhánh và nằm

ở phần giữa cơ thể.Buồng trứng phân nhánh, nằm ngay phía trước tinh hoàn.Tử cung đổ vào lỗ sinh dục nằm ở vùng giác bụng

Hình 1.1 Hình thể sán lá gan lớn trưởng thành

( A: F gigantica B: F hepatica) Hai loài sán lá gan F hepatica và F gigantica khác nhau về kích thước

và hình dạng cơ thể.Loài F hepatica ngắn hơn và rộng hơn, trong khi loài F

5

gigantica dài hơn và hẹp hơn.Ngoài ra loài F hepatica có phần đầu rộng hơn,

làm thành bờ vai, còn loài F gigantica thuôn hơn (Dalton et al 1999; hình

1.1).Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp rất khó phân biệt 2 loài này về mặt hình thái

1.1.2 Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn

Trong vòng đời phát triển, sán lá gan lớn trải qua 5 giai đoạn (hình 1.2), bao gồm:

Giai đoạn trứng được thải khỏi vật chủ ra môi trường ngoài: Trứng sán lá gan lớn được bài tiết theo phân vật chủ ra ngoài môi trường Trong môi trường nước, trứng phát triển thành ấu trùng miracidium

Giai đoạn miracidium tìm kiếm và xâm nhập vào vật chủ trung gian: Trong môi trường nước, miracidium tìm kiếm vật chủ ốc thích hợp để xâm nhập vào

vật chủ, chủ yếu là ốc Lymnaea

Giai đoạn phát triển và tăng sinh số lượng trong cơ thể ốc: Trong cơ thể ốc,

ấu trùng sán phát triển qua các giai đoạn sporocyt, redia mẹ, redia con, và cuối cùng là cercaria

Giai đoạn cercaria thoát khỏi ốc và hoá nang: Sau khi rời khỏi ốc, cercaria bơi trong nước và hóa nang thành metacercaria bám vào bề mặt thực vật thuỷ sinh Một số metacercaria không bám được vào thực vật thuỷ sinh mà trôi nổi

Ở nhu mô gan thì quá trình hấp thu dinh dưỡng bắt đầu và gây tổn thương cho

6

gan, gây ỉa chảy, thiếu máu Sán di chuyển đến mô gan trong thời gian từ 5-6 tuần và cuối cùng đến các ống mật Sau 3- 4 tháng, sán phát triển thành con trưởng thành và đẻ trứng Ở động vật, một cá thể sán trưởng thành có thể đẻ đến 25.000-50.000 trứng/ngày.Sán trưởng thành có thể sống từ 9-14 năm

trong vật chủ (Boray 1982)

Hình 1.2.Vòng đời phát triển của sán lá gan lớn

Qua chu trình phát triển trên có thể thấy sự phát triển của sán lá gan phụ thuộc vào nhiều yếu tố, vật chủ và môi trường Vì vậy, nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của sán lá gan sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc phòng bệnh thích hợp

1.2 Tình hình nghiên cứu về sán lá gan lớn trên thế giới

1.2.1 Phân loại và phân bố của 2 loài sán lá gan lớn

Các nghiên cứu đã cung cấp những bằng chứng cho thấy tính hiệu lực của

2 loài F hepatica và F gigantica, chúng khác nhau về hình thái, vật chủ

7

chính và vật chủ trung gian là ốc ở các vùng địa lý với đặc điểm môi trường khác nhau

Loài F hepatica phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu

Âu, Bắc, Trung và Nam Mỹ; Bắc và Trung Á; châu Đại Dương; Bắc, Đông và Nam Phi; và cả ở các quần đảo lớn như New Zealand, Tasmania, Iceland, Cyprus, Corsica, Sardinia, Sicily, Nhật Bản, Papua New Guinea, Philippine

và một số đảo của Caribbean Loài F gigantica giới hạn ở vùng nhiệt đới và

có mặt ở châu Phi, châu Á, Viễn Đông, Đông Âu Mặc dù nhiều sách cho

rằng F gigantica có ở cả phía Nam nước Mỹ và Hawaii, nhưng không có

bằng chứng để chứng minh loài này trên nước Mỹ Một số vùng có sự phân

bố của cả 2 loài (Dalton 1999).Ở những vùng có sự chồng chéo của 2 loài xuất hiện dạng trung gian khó có thể kết luận là loài nào.Ở châu Á và châu

Phi, có nhiều dạng trung gian đã được phát hiện, một số giống F hepatica, số khác giống F gigantica, và một số dạng trung gian.Sự lai và chuyển gen giữa

2 loài sán lá gan, F hepatica và F gigantica đã được thông báo ở các nước

châu Á, như Hàn Quốc (Agatsuma et al 2000; Choe et al 2011), Nhật Bản (Itagaki et al 2005), Iran (Ashrafi et al 2006; Amor et al 2011), Trung Quốc (Peng et al 2009; Ai et al 2011) và Việt Nam (Le et al 2008) cũng như các nước châu Phi (Periago et al 2008; Amer et al 2011)

Một nghiên cứu hình thái tỷ mỉ và chính xác đã thực hiện để xem liệu có phân

biệt 2 loài F hepatica và F gigantica không.Tác giả kết luận rằng các chỉ số

chiều dài/rộng cơ thể (BL/BW) và khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút cuối cơ thể có ý nghĩa phân biệt 2 loài (Periago et al 2006)

1.2.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở động vật và người

Trâu, bò, cừu là động vật nuôi bị nhiễm sán lá gan lớn nặng nhất.Mặc

dù, dê, ngựa, lợn, hươu và nhiều loài động vật khác cũng có thể bị nhiễm, nhưng ít quan trọng hơn ở những động vật này.Nhiều cuộc điều tra về tỷ lệ nhiễm hai loàiđược thực hiện ở nhiều nước trên thế giới Tỷ lệ nhiễm dao

lá gan ở người lại ít gặp (Dalton 1999)

Ở châu Âu, bệnh công bố ở 19 nước, chủ yếu từ Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và Liên Xô (cũ) Pháp được coi là khu vực dịch tễ quan trọng với gần 6.000 ca bệnh được phát hiện từ 9 bệnh viện trong thời gian 1970-1982.Bệnh cũng được cho là quan trọng ở Portugal với hơn 1.000 ca mắc trong thời kỳ 1970–1992

Ở Bắc Mỹ, bệnh xuất hiện rải rác ở Mỹ và Canada.Ở Trung Mỹ, bệnh sán lá gan lớn là vấn đề lớn ở đảo Caribbean, đặc biệt là của Puerto Rico và Cuba.Ở Nam Mỹ, bệnh nghiêm trọng ở Bolivia và Peru, và có thể ở cả Ecuador Ở Bolivia, vùng dịch tễ cao thấy ở Altiplano, với tỷ lệ nhiễm tới 100%, số người

có nguy cơ nhiễm lên tới 2,5 triệu (Dalton 1999)

Ở châu Á, các ca bệnh được công bố ở một vài quốc gia, trong đó Iran là đáng quan tâm nhất, ước tính hơn 10.000 ca nhiễm và khoảng 6 triệu có nguy cơ nhiễm

Ở châu Phi, một số ít ca bệnh nhiễm sán lá gan lớn được thông báo.Một số

vùng có sự chồng chéo giữa 2 loài F hepatica và F gigantica.Loài F

hepatica phân bố ở các nước bắc Phi (như Morocco, Algeria and Tunisia,

Zimbabwe) và Nam Phi, Kenya và Ethiopia.Loài F gigantica xuất hiện ở

9

khắp lục địa châu Phi Đa số các trường hợp công bố từ Ai Cập, nơi mà loài

Fasciola vẫn chưa được xác định ở hầu hết các trường hợp, mặc dù đôi khi F hepatica được cho là nguyên nhân gây bệnh

Ở châu Đại Dương, chỉ có ít ca bệnh nhiễm từ Australia

Người không phải là vật chủ thích hợp của sán lá gan, đa số sán bị giữ ở nhu

mô gan và chết, không đến được ống dẫn mật (Dalton 1999); tuy nhiên, ở vùng dịch tễ cao sán lá gan lớn thích nghi tốt hơn với vật chủ người Thời gian nhiễm ở người chưa biết rõ, nhưng ước tính rằng chúng có thể sống tới 13,5 năm (Dalton 1999)

1.2.3 Vật chủ trung gian của sán lá gan lớn

Sán lá gan không có mặt ở những vùng mà điều kiện không thuận lợi cho sự

phát triển của ốc - vật chủ trung gian, thường là ốc thuộc họ Lymnaeidae.Ốc

Lymnaeidae rất đa dạng về hình thái và thành phần loài, vì thế hệ thống phân

loại của chúng rất phức tạp, vị trí phân loại của nhiều loài và giống có sự thay đổi.Ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian thích hợp của sán lá gan khác nhau tùy thuộc vào loài sán và vùng địa lý

Vật chủ trung gian của F hepatica

Ốc điển hình liên quan đến truyền bệnh do F hepatica là Lymnaea

truncatula Ốc L truncatula có khả năng thích nghi với nhiều môi trường

sống như độ cao (>4000m) ở Bolivian Altiplano.Ngoài ra, còn các loài ốc khác.Dưới đây là danh sách các loài ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian của

F hepatica ở các nước và vùng địa lý (Boray 1985)

Vật chủ trung gian của F gigantica

Ốc điển hình liên quan đến truyền sán lá gan F gigantica là loài

Lymnaea auricularia.Kendall (1954, 1965) kết luận rằng không dễ dàng phân

biệt về mặt hình thái hoặc sinh thái của các dòng ốc thuộc loài L

11

auricularia.Tác giả cho rằng các dòng ốc vật chủ trung gian của sán lá gan ở

nam, tây và đông châu Phi là L a natalensis; ở Ấn Độ, Bangladesh và Pakistan là L a rufescens; ốc vật chủ ở Đông Nam Á là L a rubiginosa Một loài ốc tương tự, L ollula, là vật chủ của F gigantica ở Nhật Bản (Uneno and

Yoshihara 1974) và Hawaii (Alicata 1938)

Vai trò chính của L auricularia là vật chủ trung gian của F gigantica (Kendall 1954).Tuy nhiên, một số loài ốc khác cũng bị nhiễm F

gigantica.Dưới đây là danh sách các loài ốc đóng vai trò là vật chủ trung gian

của F gigantica ở các nước và vùng địa lý (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Vật chủ trung gian của F gigantica ở các nước và vùng địa lý

hepatica và F gigantica(Lê Thanh Hòa và cs 2002; Nguyễn Văn Đề 2003;

Lê Quang Hưng và cs 2003; Đặng Tất Thế và cs 2003; Nguyễn Văn Khá 2005; Trần Vinh Hiển và cs 2006; Nguyễn Văn Đề và cs 2006; Le et al 2007; Periago et al 2006; Nguyen et al 2009; Nguyen et al 2012)

12

1.3.2 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò

Trước đây, ở nước ta có nhiều cuộc điều tra về tỷ lệ nhiễm sán lá gan Phan Địch Lân (1985) tổng kết tình hình nhiễm sán lá gan ở trâu bò cho thấy

tỷ lệ nhiễm tăng theo lứa tuổi và tăng dần từ miền biển đến miền núi, trung du

và đồng bằng; tỷ lệ nhiễm giao động từ 13,7 - 61,3% Hồ Thị Nhuận và Nguyễn Ngọc Phương (1987) điều tra ở các tỉnh miền Nam cho thấy tỷ lệ trâu

bò nhiễm sán lá gan từ 1,4-36,2% Vũ Sĩ Nhàn và cs (1989) công bố tỷ lệ trâu bò nhiễm sán lá gan ở ở đồng bằng (44,5%) cao hơn so với ở miền biển (4,1%).Nguyễn Trọng Kim và Phạm Ngọc Vĩnh (1997) công bố tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn ở trâu bò tại Hà Bắc (cũ) là 49,95%; ở Nghệ An từ 25,27 – 32,65%; tỷ lệ nhiễm chung ở miền Bắc là 43,56% Kết quả nghiên cứu của Lê Hữu Khương và cs (2001) cho thấy tỷ lệ nhiễm trung bình trên cả nước ở trâu

là 46,23%, dao động từ 8,74 – 61,09%, ở bò là 30,64%, tỷ lệ nhiễm tăng dần

từ miền Nam ra miền Bắc

Những năm gần đây, Đỗ Đức Ngái và cs (2006) thông báo tỷ lệ nhiễm sán lá gan ở Đăk Lăk từ 34,2-62,6% Nguyễn Khắc Lực và cs (2010) nghiên cứu tại Quảng Nam, đã xác định tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn trên 245 trâu bò cho thấy

tỷ lệ nhiễm chung là 40,8% Có thể nói, tình hình nhiễm sán lá gan lớn ở trâu

bò tại một số địa điểm ở nước ta vẫn còn cao

1.3.3 Tình hình nhiễm sán lá gan lớn trên người tại Việt Nam

Những ca bệnh sán lá gan lớn ở người ở Việt Nam đã được chẩn đoán từ lâu Gần đây, số bệnh nhân sán lá gan ngày càng tăng, đặc biệt là ở miền Trung và Nam (Lê Quang Hưng và cs 2003; Trần Vinh Hiển và cs 2006) Riêng tại phòng khám Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn đã khám và điều trị cho khoảng 2.600 bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn Số ca bệnh cao nhất tại các tỉnh miền Trung và Tây Nguyên, đặc biệt các tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Gia Lai (Nguyễn Văn Chương và cs 2009) Điều tra cắt ngang tại cộng đồng ở Quảng Nam, Quảng Bình, Bình

13

Định, Phú Yên và Gia Lai cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan lớn từ 0,2-2,1% bằng xét nghiệm phân và 2,4-9,5% bằng ELISA (Lê Quang Hưng và cs 2003; Đỗ Ngọc Ánh và cs 2011) Tại các tỉnh miền Bắc, theo số liệu của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương trong gần 3 năm (2009-2011) số ca bệnh sán lá gan lớn đến khám và điều trị tại Viện chiếm 4,6-8,0% tổng số bệnh nhân nhiễm giun sán đều trị tại Viện, tuy nhiên bệnh nhân chủ yếu đến từ Nghệ An, Thanh Hóa và Hà Tĩnh

Một số trường hợp bệnh nhân được phát hiện với dấu hiệu sán ký sinh lạc chỗ trên người, dưới da vùng bụng ở một phụ nữ 40 tuổi tỉnh Gia Lai (Xuan et al 2005), đầu gối của một bé gái 11 tuổi ở Hà Tây và từ tuyến vú ở phụ nữ 48 tuổi từ tỉnh Quảng Bình (Nguyễn Văn Đề và cs 2006)

1.3.4 Tình hình nghiên cứu về vật chủ trung gian của sán lá gan lớn

Trước đây, vật chủ trung gian của sán lá gan lớntại Việt Nam được thông báo

là 2 loài ốc L viridis và L swinhoei(Phan Địch Lân 1985).Ở Việt Nam có ít tài liệu về ốc Lymnaea Duy nhất trong cuốn sách “Định loại động vật không

xương sống nước ngọt Bắc Việt Nam” của Đặng Ngọc Thanh và cs (1980)

mô tả 2 loài L viridis và L swinhoei ở miền Bắc Việt Nam Mặt khác, có rất

ít nghiên cứu về sinh thái của 2 loài ốc này Duy nhất có công trình của Phan

Địch Lân (1985) cho thấy ốc L viridis phân bố rộng ở tất cả các vùng, ở vùng núi chiếm 75% trong số 2 loài ốc Lymnaea, còn ở vùng trung du chiếm 66,5%, ven biển chiếm 51,5% và vùng đồng bằng là 42,0% Loài L swinhoei

phân bố hẹp hơn, tập trung chủ yếu ở đồng bằng và ven biển, ở vùng núi và trung du ít hơn, đặc biệt ở miền núi rất ít, có nhiều nơi không có Cũng theo Phan Địch Lân (1985), trứng ốc có thể nở được quanh năm với tỷ lệ rất cao,

từ 89,1-100% và thời gian nở rất nhanh, mùa hè cần 5,5 ngày, mùa đông xuân

là 8,5 ngày Về hình thái, có thể phân biệt cá thể trưởng thành của 2 loài ốc này, tuy nhiên với những cá thể còn non thì việc phân biệt 2 loài này không phải dễ dàng (Đặng Ngọc Thanh và cs 1980; Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn

14

Thị Lê 2005;Phạm Ngọc Doanh và cs 2012; Dung et al 2013).Vì vậy, còn có những thông báo khác nhau về vai trò vật chủ trung gian truyền bệnh sán lá gan của 2 loài ốc này

Phan Địch Lân (1985) thông báo cả 2 loài ốc L viridis và L swinhoei

đóng vai trò là vật chủ trung gian của sán lá gan.Nguyễn Trọng Kim và Phạm

Ngọc Vĩnh (1997) cũng thông báo cả 2 loài ốc Lymnaea đều bị nhiễm ấu trùng

sán lá gan với tỷ lệ nhiễm rất cao 43,1-62,1% ở tỉnh Hà Bắc (cũ).Cũng theo Nguyễn Trọng Kim (1997) công bố tỷ lệ nhiễm trung bình ở các tỉnh miền Bắc

ở ốc L swinhoei là 20,8% và ở ốc L viridis là 19,6%.Vũ Sĩ Nhàn và cs (1989) cũng cho thấy ốc L swinhoei ở Đak lak nhiễm ấu trùng sán lá gan với tỷ lệ là

40,0-50,0 %.Hồ Thị Thuận và Nguyễn Ngọc Phương (1987) cũng công bố cả 2 loài ốc ở các tỉnh miền Nam đều là vật chủ trung gian của sán lá gan, nhưng tỷ

lệ nhiễm nhiễm rất thấp (1,1%) Trong khi đó, Nguyễn Thị Lê và cs (1995)

không tìm thấy ấu trùng sán lá gan từ hơn 1.000 ốc Lymnaea ở tỉnh Hà Tây (cũ) Gần đây, Dang and Nawa (2005) công bố 1,2-2,1% ốc Lymnaea ở tỉnh

Bình Định bị nhiễm ấu trùng sán lá gan; Đỗ Đức Ngái và cs (2006) thông báo

tỷ lệ nhiễm ở ốc L swinhoei ở Đak Lak là 0,45% Kết quả điều tra của Phạm Ngọc Doanh và Nguyễn Thị Lê (2005) cho thấy chỉ 0,06% và 1% ốc L viridis

ở Đông Anh và Phú Xuyên, Hà Nội bị nhiễm ấu trùng sán lá gan Phạm Ngọc Doanh và cs (2012) điều tra trên toàn quốc chỉ phát hiện ấu trùng sán lá gan ở

ốc L viridis với tỷ lệ thấp từ 0,6-4,0% Dung et al (2013) cũng chỉ phát hiện

ốc L viridis bị nhiễm ấu trùng sán lá gan

Như vậy, có thể nói vấn đề định loại sán lá gan lớn Fasciolaspp và ốc

vật chủ trung gian của chúng ở Việt Nam chưa được thống nhất giữa các nghiên cứu.Xác định chính xác những vấn đề này rất quan trọng đối với khoa học và thực tiễn, giúp cho công tác phân loại, tiến hóa và phòng chống bệnh sán lá gan ở người và động vật, và cần được làm sang tỏ

15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁPNGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:Sán lá gan lớnFasciola spp ở Việt Nam

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu tại thực địa: Thu mẫu sán lá gan lớn ở bò tại lò mổ của 3 tỉnh

thành đại diện cho 3 miền: Bắc, Trung, Nam là Hà Nội, Nghệ An và Tây Ninh

- Phân tích phòng thí nghiệm:

+ Khoa Sinh học Phân tử - Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn Trùng Trung ương

+ Phòng Ký sinh trùng – Viện Sinh thái và tài nguyên Sinh vật

2.2.2.Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/ 2013 – 12/2014

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Đặc điểm hình thái sán lá gan lớn thu từ bò tại lò mổ ở Hà Nội, Nghệ

An và Tây Ninh

2.3.2 Đặc điểm phân tử trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2 của sán lá gan lớn

2.3.3 Sự phát triển của trứng sán lá gan lớn và đặc điểm sinh học của miracidium

2.3.4 Tính mẫn cảm của ốc Lymnaeidae với ấu trùng sán lá gan lớn qua gây

nhiễm thực nghiệm

2.3.5 Sức sống của metacercaria sán lá gan lớnở các nồng độ muối

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thusán lá gan lớn trưởng thành từ bò:

- Mua gan, túi mật của bò từ các lò mổ tại địa điểm nghiên cứu Dùng dao rạch ống dẫn mật ở gan và túi mật để thu sán trưởng thành, rửa sạch sán bằng nước muối 0,85% Các mẫu sán dùng cho nghiên cứu hình thái đượcđặt

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu hính thái sán lá gan lớn

- Chọn 55 mẫu sán trưởng thành (có trứng ở tử cung) ở mỗi địa điểm nghiên cứu, gồm các mẫu sán có hình thái và kích thước khác nhau, làm tiêu bản cố định bằng cách nhuộm carmine alumine.(Periago et al 2006)

- Sán được đo kích thước chiều dài và chiều rộng cơ thể, từ đó tính tỷ lệ chiều dài/rộng (BL/BW) và đo khoảng cách từ mép sau giác bụng đến mút cuối cơ thể

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu phân tử

- Chọn đoạn ITS1-5.8S-ITS2 của gen nhân để phân tích

- Mẫu nghiên cứu gồm: các mẫu sán lá trưởng thành có hình thái khác nhau tại 3 địa điểm nghiên cứu

- Tách chiết DNA tổng số từ các mẫu nghiên cứu bằng DNeasy kit (QIAgen)

- Nhân bản trình tự đích bằng kỹ thuật PCR: sử dụng cặp mồi BD1:

CAGCGGGT-3’ (Oskouei et al 2001).Kiểm tra sản phẩm PCR bằng gel Agarose 2% Tinh chế sản phẩm PCR bằng bộ hóa chất QIAquick PCR purification kit

- Phản ứng giải trình tự được tiến hành với bộ kit Big-Dye terminator cycle sequencing kit v3.1 (ABI) Trình tự được đọc trực tiếp bằng máy tự động ABI

3100 Đối chiếu các trình tự thu được với các trình tự trong ngân hàng gen bằng chương trình BLAST Sử dụng chương trình phần mềm MEGA6 (Tamura et al 2013) để xử lý, phân tích số liệu, xây dựng cây phát sinh chủng loại và đánh giá mối quan hệ tiến hóa

17

2.4.5 Phương pháp nuôi trứng sán lá gan lớnthu tại lò mổ ở Hà Nội

- Trứng sán lá gan thu từ mật bò được nuôi trong các điều kiện khác nhau: nước cất, nước muối 0,85% NaCl, 0,8% và PBS (Phosphate-buffered Saline chứa 0,8% NaCl), theo dõi ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: nhiệt độ mùa

hè, mùa đông và nhiệt độ tủ ấm 370

- Quan sát thời gian sống của miracidium: hút 100 miracidium mới nở vào đĩa petri nhỏ Quan sát sau mỗi 1giờ để tính số lượng miracidium chết và thời gian sống tối đa của miracidium

2.4.7 Phương pháp gây nhiễm miracidium sán lá gan lớn cho ốc

- Hai loài ốc phổ biến thuộc họ Lymnaeidae là Austropeplea viridis(= L

viridis) vàRadix auricularia (= L swinhoei) ở Việt Nam bắt ngoài tự nhiên,

nuôi trong phòng thí nghiệm cho đẻ ra thế hệ ốc sạch

- Gây nhiễm cho ốc bằng cách đếm số lượng ốc cho vào các đĩa petri, nhỏ miracidium mới nở vào với số lượng 5 miracidium/ốc

- Nuôi ốc bằng rau diếp, thay nước hàng ngày Định kỳ xét nghiệm ốc để xác định sự phát triển của ấu trùng trong ốc và thời gian cercaria thoát khỏi ốc.Những ốc chết cũng được xét nghiệm ngay để tính tỷ lệ nhiễm

độ 0,9%, 1,0% và 1,5%.Sau 15 phút lấy ra 50 metacercaria để kiểm tra sự sống dưới kính hiển vi, 50 metacercaria còn lại theo dõi tiếp ở 30 phút Metacercaria được xác định là chết khi không còn vận động và các tế bào bị

co lại, thay đổi cấu trúc

2.4.9 Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và chỉ số đo

hình thái được tính theo ( min – max) mean STDEV

19

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Đặc điểm phân loại của sán lá gan Fasciola spp ở Việt Nam

3.1.1 Đặc điểm hình thái sán lá ganFasciola spp ở Việt Nam

Sán lá gan có dạng hình lá, giác miệng và giác bụng nằm gần nhau ở phần trước cơ thể.Hầu lớn, ruột phân nhánh (hình 3.1).Tuyến noãn hoàng phát triển, gồm nhiều bao noãn phủ đầy cơ thể.Tinh hoàn và buồng trứng phân thùy nằm ở vùng giữa cơ thể, sau giác bụng.Đa số sán lá gan tại các địa điểm nghiên cứu có cơ thể thon dài, một số cá thể có dạng ngắn hơn.Kích thước các quần thể sán ở 3 địa điểm nghiên cứu tương đương nhau (Bảng 3.1) Tỷ lệ chiều dài/rộng của sán dao động lớn (từ 2,2 - 6,0) So với số liệu của Periago

et al (2006) thì đa số sán giống F gigantica (BL/BW >3,4), một số sán có đặc điểm của loài F hepatica (BL/BW<2,8), và một số có dạng trung gian

giữa 2 loài (BL/BW = 2,9 - 3,3) (Hình 3.2)

Hình 3.1 Hình thái của sán lá gan lớn có ruột và tinh hoàn phân nhánh

Mút sau giác bụng đến cuối

cơ thể (cm)

Hà Nội 1,9 - 5,0

(3,27 ± 0,69)

0,5 - 1,8 (0,95 ± 0,19)

2,7 - 4,8 (3,48 ± 0,47)

1,7 - 4,4 (2,89 ± 0,61)

Nghệ An 2,0 - 4,9

(3,02 ± 0,62)

0,5 - 1,4 (0,93 ± 0,17)

2,2 - 4,6 (3,30 ± 0,57)

1,7 - 4,4 (2,68 ± 0,57)

Tây Ninh 1,9 - 4,6

(2,93 ± 0,71)

0,5 - 1,3 (0,89 ± 0,22)

2,3 - 6,0 (3,34 ± 0,59)

1,6 - 4,0 (2,57 ± 0,62)

*

Theo Periago et al (2006)

Trong tổng số 165 cá thể sán từ 3 địa điểm nghiên cứu, nhóm có hình dạng cơ

thể dài giống F gigantica chiếm ưu thế (49,1%), sau đó đến nhóm trung gian

21

(35,2%) và nhóm giống F hepatica (15,8%) Kích thước chiều dài cơ thể sán của 3 nhóm có sự chồng lấn nhau: nhóm giống F hepatica có chiều dài cơ thể

là 1,6-3,3 cm, nhóm trung gian là 2,0-4,3 cm và nhóm giống F gigantica là

2,1-5,0 cm Kích thước trứng của 3 nhóm đều tương tự như nhau (p>0,05) và

phù hợp với số đo của loài F gigantica (trứng > 150 90 µm) Khoảng cách

từ mút sau giác bụng đến cuối cơ thể của các nhóm cũng tương tự nhau, chiếm 87,3- 88,8% chiều dài cơ thể (Bảng 3.2)

(cm)

1,6 - 3,3 (2,43 ± 0,39)

2,0 - 4,3 (3,02 ± 0,66)

2,05 - 5,0 (3,32 ± 0,64) Chiều rộng cơ thể

(cm)

0,6 - 1,0 (0,95 ± 0,16)

0,6 - 1,3 (0,97 ± 0,20)

0,5 - 1,3 (0,88 ± 0,19)

Tỷ lệ dài/rộng 2,2 - 2,8

(2,13 ± 0,36)

2,9 – 3,3 (3,12 ± 0,13)

3,4 – 6,0 (3,81 ± 0,40) Mút sau giác bụng

đến cuối cơ thể

(cm)

1,4 – 2,9 (2,13 ± 0,36)

2,9 – 3,3 (3,12 ± 0,13)

1,8 – 4,4 (2,95 ± 0,56)

83,3 – 90,9 (87,9 ± 0,17)

82,7 – 96,1 (88,8 ± 0,19)

Trứng

(µm)

150 – 176 x 90 – 100 (156 ± 16 x 920 ± 9)

150 – 180 x 90 – 100 (153 ± 15 x 930 ± 9)

150 – 176 x 90 – 110 (154 ± 15 x 930 ± 9)

3.1.2 Đặc điểm phân tử và quan hệ tiến hóa phân tử của sán lá gan lớn

dựa trên trình tự ITS1-5.8S rDNA-ITS2

Kết quả giải trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của 9 mẫu sán lá gan đại diện cho các nhóm hình thái từ các địa điểm nghiên cứu đã thu được 9 trình tự (Bảng 3.3)

22

Kết quả so sánh cho thấy tất cả các trình tự của sán có cơ thể dài và dạng trung gian hoàn toàn tương đồng với nhau, 2 trình tự của sán có cơ thể ngắn tương đồng với nhau và trình tự của 1 mẫu (TN3- Ngắn) có một số vị trí mang 2 đỉnh (hình 3.3) Đối chiếu với các trình tự trên Genbank bằng chương trình BLAST đã xác định các trình tự ITS1-5.8S-ITS2 của sán có cơ thể dài

và dạng trung gian 100% tương đồng với loài F gigantica, còn sán có cơ thể ngắn hơn có trình tự tương đồng với loài F hepatica (Bảng 3.3) Trình tự

ITS1-5.8S-ITS2 của 2 loài khác nhau ở 12 vị trí nucleotide (Bảng 3.4).Cây phát sinh chủng loại được xây dựng từ bộ dữ liệu trình tự ITS1-5.8S-ITS2 bằng phương pháp Neighbor-Joining cho thấy các trình tự ITS1-5.8S-ITS2

của 2 loài F gigantica và F hepatica tách thành 2 nhánh rõ ràng Trình tự của sán dạng dài và trung gian của Việt Nam thuộc loài F gigantica và trình

tự của sán dạng ngắn thuộc loài F hepatica (hình 3.4)

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái và phân tử của các mẫu nghiên cứu

STT Mã số mẫu nghiên

cứu

Đặc điểm cơ thể

Kích thước trứng

ITS2

2 HN 2 – Trung gian Trung gian F gigantica F gigantica

5 NA 2 – Trung gian Trung gian F gigantica F gigantica

8 TN 2 – Trung gian Trung gian F gigantica F gigantica

gigantica

25

Hình 3.4 Mối quan hệ tiến hóa phân tử của các loài Fasciola spp.được xây

dựng từ trình tự gen ITS1-5.8S-ITS2 bằng phương pháp Neighbor-Joining