Đánh giá số lượng sống, đặc điểm của sản phẩm vi khuẩn lactic thương mại

Đánh giá số lượng sống, đặc điểm của sản phẩm vi khuẩn lactic thương mại

Viable counts, characteristic

evaluation for commercial lactic

acid bacteria products

GVHD: Lê Phương Chung

Trường đại học Nha Trang

Viện CNSH &MT

TÓM TẮT (Abstract)

• Kiểm nghiệm 8 sản phẩm probiotic thương

mại của chủng vi khuẩn lactic acid( LAB)

– Phân lập được 25 chủng có khả năng kháng các tác nhân gây bệnh đường ruột

– Trong 25 chủng thì chỉ có 5 chủng có khả năng bám vào biểu mô ruột

Kết luận

• Chỉ có vài sản phẩm LAB thương mại mới đáp ứng yêu cầu cơ bản về chức năng của probiotic

GIỚI THIỆU (Introduction)

Giới thiệu

•Cải thiện sức khỏe

•Hỗ trợ người bị rối loạn tiêu hóa và viêm ruột cấp tính

•Cải thiện chức năng tiêu hóa

Sản phẩm LAB

Dạng lỏng: sữa chua Dạng rắn: Bột, hạt nhỏ, viên nén

Gồm 2 dạng

Điều kiện vi khuẩn lactic được sử

dụng làm chế phẩm sinh học:

• An toàn

• Khả năng tồn tại khi chế biến và bảo quản

• Chịu được acid và dịch mật

• Kháng tác nhân gây bệnh

• Bám vào tế bào biểu mô ruột

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP VÀ

KẾT QUẢ

(Materials, methods and results)

Sản phẩm thương mại LAB

Khảo sát số lượng tế bào sống

Khảo sát số lượng tế bào sống

 Môi trường MRS: (De Man, RoGoSa, Sharpe )

 Môi trường BCP: (Bromo Cresol purple)

Quy trình nuôi cấy

10g dạng viên nén

hoặc dạng hạt

Lấy 1g bột hoặc 1ml sữa chua

Dung dịch: 9ml đệm

phosphate PBS, pH =7.2

Nghiền

• Tiến hành pha loãng dung dịch 10 lần liên tiếp với PBS

1 ml

Ủ ở 37 0 C trong 48h( mt MRS) or 72h( BCP) 1/10 1/10 1/10 1/10 1/10

KẾT QUẢ

Khảo sát tỷ lệ sống trong điều

kiện acid và dịch mật

1ml sữa chua hoặc 1g bột

9ml PBS

pH=2

9ml PBS pH=2.5

9ml PBS pH=3.2

9ml PBS pH=7.2

Ủ ở 37oC, 3h

Khảo sát tỷ lệ sống trong điều kiện

acid

Khảo sát tỷ lệ sống trong điều kiện

acid

Môi trường MRS, kỵ khí ở 37 o C, 48h

Khả năng chịu mật bò của LAB được xác định bằng cách so sánh với các tế bào LAB sống trong

37 o C , 6h

Kỵ khí

Có hoặc không 0.3% mật bò

Kiểm tra ảnh hưởng của dịch mật đến sự phát

triển của tế bào LAB

KẾT QUẢ

Chọn lọc và phân lập (Selection and identification)

• Mỗi sản phẩm, chọn ngẫu nhiên 5 khuẩn lạc rời

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn (Antibacterial activity assay)

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn (Antibacterial activity assay)

• Sử dụng phương pháp khuếch tán môi trường thạch

(Toure và cộng sự (2003) ,Garriga và cộng sự (1998)

• Các chủng chỉ thị bao gồm

- Escherichia coli (ATCC 11.775)

- E coli sinh độc tố( enterotoxigenic) (ETEC) (ATCC

43.886)

- Salmonella typhimurium (ATCC 14.028 và chủng I50)

- Staphylococcus aureus (ATCC 9144)

Pha loãng

Chủng chỉ

Ly tâm 7000rpm/5phútNuôi cấy LAB

Tạo 3 giếng

100µl

Sự kháng lại vi khuẩn gây bệnh của tế bào LAB

 Tế bào LAB có nguồn gốc từ các sản phẩm A, B và D thì ức chế (inhibitory) tất cả các chủng chỉ thị.

 Tế bào LAB có nguồn gốc từ các sản phẩm từ C và E

không ức chế các chủng chỉ thị trừ S aureus (không biểu

hiện kết quả)

Nếu các tế bào

LAB có thể nhanh chóng đi qua dạ dày

và cư trú trong ruột, sản phẩm của chúng trong môi trường

acid có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật có hại.

Khảo sát sự bám gắn của LAB (Adherence assay of LAB)

Nuôi cấy tế bào biểu mô Int-407

• Int-407( ATCC CCL 6) là tế bào ở người có nguồn gốc từ ruột và hồi tràng của phôi người

• Nuôi cấy tế bào đơn lớp để khảo sát

Nuôi cấy tế bào biểu mô Int-407

Khảo nghiệm sự bám gắn của tế bào LAB

Lấy các tế bào Int-407 trong 15 giếng được

chọn ngẫu nhiên rửa 2 lần với PBS, trộn với

formallin 10% trong 30 phút, nhuộm với thuốc tím trong 5 phút, rửa lại 3 lần với PBS, rổi quan sát dưới kính hiên vi (độ phóng đại gấp 200X)

Đếm tế bào LAB trên khoảng 100 tế bào Int-407

để xác định số lượng tế bào LAB bị dính chặt

vào tế bào Int-407

Khảo nghiệm sự bám gắn của tế bào LAB

Các tế bào LAB bám dính trên bề mặt tế bào

Int-407

Vì sao phải làm test này?

• Các chủng probiotic bám dính được vào thành ruột , khu trú tốt trong đường tiêu hoá  sinh sôi nảy nở.

• Ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô, tăng khả năng miễn dịch của vật chủ

• Tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác.

Phương pháp sinh học phân tử

THẢO LUẬN

• Hầu hết sản phẩm LAB thương mại được tuyên bố có số lượng LAB cao, hữu ích cho chức năng probiotic

• Một số sản phẩm probiotic được tuyên bố chứa chủng LAB đặc trưng, có thể tồn tại và thể hiện chức năng của chúng trong đường tiêu hóa.

• Sử dụng tế bào Int-407 để đánh giá tỉ lệ sống sót, khả năng bám dính trên bề mặt tế bào biểu mô

ruột và khả năng ức chế vi khuẩn có hại

Hầu hết các sản phẩm thương mại

(commercial products) của chủng LAB không thể hoặc thích nghi yếu với biểu mô đường ruột của người

• Khi phân tích sản phẩm dạng viên và hạt để

kiểm tra số lượng tế bào LAB trên cả môi

trường BCP và MRS (bổ sung với 0,05%

L-cysteine) thì không thấy sự hiện diện của tế bào

• Nguyên nhân: tế bào LAB có thể bị ảnh hưởng bởi các điều kiện xử lý: các lực nén trong quá trình dập viên, các thành phần của thuốc, và

nhiệt độ bảo quản vv

 Theo 1 báo cáo năm 2001, trong 30 chế phẩm sinh học dạng

khô, có 11 chế phẩm không có vi khuẩn sống(viable bacteria), chỉ có chứa 7 loài đã tuyên bố và có hơn 18 loài khác so với

những loài ghi trên nhãn.

 Kết quả 1 cuộc khảo sát các loại sản phẩm Probiotic được bán

ở Mỹ cho thấy số lượng vi khuẩn thấp, một số trường hợp

không có, bị nhiễm hoặc ghi thông tin sai lệch trên nhãn.

Thiếu các tiêu chuẩn(standard) cho các chế phẩm Pribiotic