Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL

Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG

L- TETRAHYDROPALMATIN TRONG DƯỢC LIỆU BÌNH

VÔI VÀ TRONG CHẾ PHẨM VIÊN HOÀN BALOK, VIÊN

NANG CỨNG HEANTOS 4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất

Mã số : 6007513

Luận văn Thạc sĩ dược học

Người hướng dân khoa học: AB

PGS T3: Grinh Odin Liu

GS TS Dham Ghanh Ky

Hà Nội-2004

Dé tii nay dave thu tién tut Ctén Kiém ughiétm — BE tế dưới

sa hung dan aia DGS TE Trinh Odin Lita - phd Otten trudug Olin Ktéim aughiim va GS SS: Pham Shank Ry - Chi nhiém bb min Duve 2w, 22⁄4 Pat hee Duve Ha Hee

Dé hoan think dé taé nay, toé di nhin dave su chi din tin tink eita PGS TS Trinh Oin Liu va GS TE Pham Thanh Ry

Froug thot gian thuclitn dé tit, tol ciug nuthin Muoe nhiing § kéén ding gop qui bia «ia DGS TS Srin Fi An, QGS Dhum Gia Hut, TS Shiti Dhan Quinh Whi, Th8 Phum Phi Ging eng ete thiy, cé_gtiéo khie Ding thot tol cing (tiêm nhdn duve su quan tim gitip dé uhiél tinh «ia ShS Wguyin Fhi Kim Thanh oa cette ban dong ughtitp tai phong Thude chuin, phong Ping dave eta (1⁄4 Kitm

“2/2

“¿2 dị nay, l2? x2 ad ld loug bidl dn chin think dé odt 4a

giuip dé guy bia eta ete thiy cb va_cte ban ding ughtép

DS Pham Shel Duyén

MUC LUC

DAT VAN DE

Chuong 1: TONG QUAN

1.1 Dược liệu Bình vôi

1.2; L- tetrahydropalmatin (rotundin)

1.3 Các phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất

L- tetrahydropalmatin từ củ Bình vôi và các chế phẩm đông

dược có chứa Bình vôi

1.3.1 Phương pháp chiết nóng

1.3.1.1 Phương pháp chiết nóng theo DĐ VN IH

1.3.1.2 Phương pháp chiết của Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có

tinh dầu Liên Xô cũ (VILAR)

13.2 Phương pháp chiết lạnh `:

14 Các phương pháp đã dùng để định lượng

L- tetrahydropalmatin đơn chất, trong các chế phẩm và

trong được liệu Bình vôi

1.4.1 Phương pháp kết tủa với bạc nitrat

1.4.2: Phuong pháp chuẩn độ môi trường khan

1.4.3 Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến

1.4.4 Phương pháp đo quang kết hợp với phương pháp SKLM

1.5 Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

09" 09°

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất L- tetrahydropalmatin từ

bột mịn Bình vôi và từ bột mịn Balok

2.3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết nóng theo DDYN III và phương

pháp chiết lạnh bằng lắc siêu âm trên 2 mẫu bột mịn Bình vôi

và bột mịn Balok

2.3.1.2 Đề xuất phương pháp chiết L~- tetrahydropalmmatin từ bột mịn

Bình vôi và bột mịn Balok

v2.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC để định tính và định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi và trong viên

hoàn Balok

2.3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

23.22 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi và trong viên

hoàn Balok

2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

2.3.3.1 Đánh giá hiệu quả chiết

2.3.3.2 Định tính

2.3.3.3 Định lượng

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Xây dựng phương pháp chiết L- tetrahydropalmatin trong

dược liệu Bình vôi và trong viên hoàn Balok -

3.1,1, Khảo sát phương pháp chiết lạnh dùng máy lắc siêu âm:

3.1.2 Khảo sát phương pháp chiết nóng theo DĐ Việt Nam III

3.1.3, Khảo sát điều kiện chiết thích hợp:

3.1.3.1 Khảo sát thể tích dung môi chiết xuất

3.1.3.2 Khao sát thời gian chiết xuất

oi

28

28

cờ 34

3.2.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định tính và định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi và trong viên

3.2.2 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng

L- tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vôi và trong viên

hoàn Balok

3.2.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của pic L- tetrahydropalmatin thu

được từ dịch chiết mẫu thir M; va M,

3.2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính L- tetrahydropalmatin

3.2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng L- tetrahydropalmatin

3.2.3 Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng

L- tetrahydropalmatin trong 3 loài Bình vôi ở Việt Nam và

trong viên nang cứng Heamtos 4

3.2.3.1 Định lượng L- tetrahydropalmatin trong 3 loài Bình vôi ở

Việt Nam

3.2.3.2 Định lượng L- tetrahydropalmatin trong viên nang cứng

Heantos 4

Chuong 4: BAN LUAN VE KET QUA

KET LUAN VA DE NGHI

TAI LIEU THAM KHAO

Những chữ viết tắt dùng trong luận van

: Giới hạn phát hiện

: Giới hạn định lượng : Phương pháp

: Phân tử lượng

: Stephania

: Sác ký lớp mỏng : Số kiểm soát

: Trach nhiém hữu hạn

: Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ

: Tử ngoại

: Tử ngoại — khả kiến : Vừa đủ

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

L— tetrahydropalmatin hay con gọi là rotundin (øindarin, hyndarin,

caseanin) là một alcaloid chính được chiết xuất từ củ Bình vôi: Stephania glabra (Roxb.) Miers hoặc một số loài Bình vôi khác họ Tiết đê (Menispermaceae), mọc hoang khá phổ biến ở nước ta và một số nước khác

Trên thị trường nước ta hiện nay đang lưu hành nhiều dạng thuốc có hoạt

chất L- tetrahydropalmatin với các tên gọi khác nhau như: Xiro Rotunda, viên

nén Rotunda, viên nén Roxen, viên Stilux-60, viên bao phim Sen vông — R, thuốc tiêm Rotundin sulphat, chè an thần Các chế phẩm trên đều dùng làm thuốc trấn kinh, an thần L- tetrahydropalmatin có tác dụng an thần, gây ngủ

tương tu nhu dan xuất của benzodiazepin, hơn nữa lại không gây nghiện nên

L~ tetrahydropalmatin ngày càng được ưa dùng và trở nên thông dụng

Hàm lượng alcaloid toàn phần cũng như L— tetrahydropalmatin trong

dược liệu Bình vôi thay đổi tuỳ theo loài và theo thời vụ thu hái, do đó cần phải xác định được hàm lượng L~— tetrahydropalmatin có trong các loài Bình vôi để góp phần tìm nguồn nguyên liệu có hàm lượng L tetrahydropalmatin cao, giúp cho công việc bảo tồn, nhân giống và tiêu chuẩn hoá được liệu này Bình vôi không những được dùng làm nguyên liệu để chiết xuất lấy

L-= tetrahydropalmatin mà hiện nay Bình vôi còn là một thành phần quan trong

trong nhiều bài thuốc, nhất là trong chế phẩm hỗ trợ cắt cơn nghiện ma tuý và

phục hồi thể lực như: chế phẩm Balok được Công ty TNHH đông nam dược

Bảo Long nghiên cứu và bào chế dưới dạng viên hoàn; chế phẩm Heantos 4 đã được Viện Hoá học thuộc TTKHTN và CN Quốc gia bào chế dưới dạng viên nang cứng Vì vậy, việc xác định chính xác hàm lượng L- tetrahydropalmatin

trong các chế phẩm này là vấn đề cần được quan tâm trong công tác tiêu

Dược điển (DĐ) Trung Quốc định lượng L— tetrahydropalmatin nguyên liệu bằng pp kết tủa với AgNO; và định lượng L— tetrahydropalmatin trong các thành phẩm bằng pp đo quang phổ tử ngoại - khả kiến DĐ Việt Nam III định lượng alcaloid toàn phần trong củ Bình vôi bằng pp chuẩn độ acid — base

Cho đến nay, chưa thấy tài liệu nào công bố cu thé việc định lượng

bang pp sac ky long hiéu nang cao (HPLC)

Mặt khác hiện nay ở Viện Kiểm nghiệm Trung ương cũng như nhiều cơ

sở sản xuất thuốc, nhiều Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm — Mỹ phẩm ở

các tỉnh và thành phố, đã được trang bị máy HPLC Do vậy, xuất phát từ nhu

cầu thực tế, chúng tôi tiến hành đề tài;

“Nghiên cứu định tính và định lượng L- tetrahydropalmafin trong

được liệu Bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn Balok, viên nang cứng Heantos 4 bang phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

* Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng pp HPLC để định tính và định lượng L— tetrahydropalmatin trong Bình vôi và trong các chế phẩm đủ tin cậy nhằm góp phần vào công tác

tiêu chuẩn hoá chất lượng dược liệu Bình vôi cũng như chế phẩm Balok và

Heantos 4

* Nội dung nghiên cứu:

I- Khảo sát chọn pp chiết thích hợp để chiết kiệt L- tetrahydropalmatin

từ được liệu Bình vôi, từ chế phẩm Balok và Heantos 4

2- Xây dựng pp HPLC để định tính và định lượng L tetrahydropalmatin

trong các dịch chiết từ các mẫu nghiên cứu

3- Áp dụng pp HPLC đã xây dựng để định lượng L_ tetrahydropalmatin

trong ba loài Bình vôi ở Việt Nam và trong chế phẩm viên hoàn Balok, viên

nang cứng Heantos 4

3

Chuong 1: TONG QUAN

1.1 Được liệu Bình vôi

Bình vôi (Ngải tượng, Củ một, Dây mối tròn, Củ gà ấp; Cà tòm, .) là phần gốc thân phình ra thành củ, đã cạo bỏ vỏ nâu đen ở ngoài hoặc thái thành miếng phơi hay sấy khô của cây Bình vôi: Stephania glabra (Roxb.) Miers

hoặc một số loài Bình vôi khác có chtta L- tetrahydropalmatin (rotundin), ho Tiét dé (Menispermaceae) [7] Cay Bình vôi là loại dây leo mọc hoang từ lâu

đời, trên các vùng địa chất khác nhau, thường tập trung ở các vùng núi đá vôi,

núi đất ven biển ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam nước ta [11], [23], [25] [27]

- Miền Bác: Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lang

Sơn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hoà Bình, Quảng Ninh, Nam Hà, Ninh Bình

- Miền Trung: Thanh Hoá, Nghệ An, Quảng Nam, Đà Năng, Thừa

Thiên Huế, Bình Định, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Phú Yên

- Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Ria-Vũng Tầu

Củ Bình vôi rất đa dạng về hình dáng, kích thước, trọng lượng và màu

sắc bên trong củ Lớp vỏ ngoài có màu nâu đen, hình đáng củ thay đổi tuỳ

theo nơi củ phát triển, có củ rất to nặng tới 40kg, nếu mọc ở đất thì củ nhỏ hơn [5] [5] [25] Trong củ Bình vôi có các aÌcaloid mà thành phân chính là

L— tetrahydropalmatin chiếm tỷ lệ dao động từ 0,2—3,55% [3], [4], [25] Hàm lượng alealoid toàn phần cũng như của L— tetrahydropalmatin trong củ

Bình vôi không phụ thuộc vào màu sắc, khối lượng và hình dáng của củ mà

phụ thuộc vào loài, nơi mọc và tuổi củ khi khai thác Theo ý kiến của một số

tác giả, để Bình vôi có hàm lượng L- tetrahydropalmatin cao, nên bắt đầu thu

hái vào mùa thu sang mùa đông, không nên thu hái vào mùa hè [3] [4], [25]

Theo Bài Thị Bằng và cộng sự [3], hàm lượng rotundin đạt tới 3,55% ở

loài § brachyana Diels (Hoàng Liên Sơn cñ); 1,31% ở loài S sinica Diels (Ha Nam Ninh cut); 1,30% ở loài S kwangsiensis H S Lo (Quảng Ninh); 0,72% ở

4 loài S, hainanensis H S J et Y TSoong (Thanh Hod), 0,62%- 0 loai

S cambodiana Gagnep (Lam Péng); 0,29%-6 loai S cepharantha (Hd Son:

Bình cñ); 0,21% ở loài S peirrel Diels (Tây Nguyên)

Nguyễn Tiến Vững và cộng sự đã xác định hàm lượng L- tetrahydropalmatin trong loai S, kuinanensis H S Lo et M Yang thu hai ở

Lang Son dat 3,06%; loai S glabra (Roxb.) Miers thu hai 6 Ninh Binh 1a

0,59% [27]

Ngoài ra, trong củ Bình vôi còn có các alcaloid khác như: roemerin,

stepharin, cepharamin, cepharanthin, cycleanin, isocorydin, palmatin [4], [18], [25], [27]

Ngoài các alcaloid, trong củ Bình vôi còn có tinh bột, đường khử va acid

hữu cơ [4], [8], [18] DĐ Việt Nam II quy định củ Bình vôi được dùng làm thuốc phải có hầm lượng alcaloid toàn phần ít nhất là 25 tính theo dược liệu

khô [7]

Củ Bình vôi có thể thu hái quanh năm, đem về cạo bỏ vỏ nâu đen, thái lát mỏng phơi hay sấy khô làm thuốc thang sắc uống hoặc tán bột, ngâm rượu

hoặc làm chè thuốc, mà không phải chế biến gì khác Bình vôi chủ yếu được

dùng làm nguyên liệu chiết xuất lấy rotundin hoặc cepharanthin, tuỳ theo loài

[4], cũng có thể từ củ tươi được xử lý, rửa sạch, xay hoặc giã nhỏ để chiết

rotundin hoặc các alcaloid khác [4] [5] [1S]

Bình vôi có vị đắng hơi ngọt, tính mát vào hai kinh can, tỳ; có tác dụng

an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, tán ứ, hành huyết, hoá đàm, tán kết, khu phong hoạt lạc [Š], [7]: dùng để chữa mất ngủ, sốt nóng,

nhức đầu, đau dạ dày (rhể nhzệr), ho nhiều đờm, hen suyễn khó thở hoặc phối

hợp với các thuốc khác để trị ho, sốt rét, kiết ly, ngoài da ngứa lở, mụn nhọt

[5], [7], [8], [9], [18], [25]

1.2 L- tetrahydropalmatin (rotundin)

5

Trong củ Bình vôi, thành phần hoá học được quan tâm nhất là alcaloid,

mà trong đó L- tetrahydropalmatin là một trong những hoạt chất được nghiên cứu nhiều hơn cả [10], [11], [23], [29], [36], [37], [39], [40]

Cong thtfc hoa hoc cua L- tetrahydropalmatin (C,,H,,;NO, ; Ptl: 355,43)

L_ tetrahydropalmatin có cấu trúc nhân isoquinolin, thuéc phân nhóm

Tetrahydroprotoberberin Nitơ trong phân tử thuộc cấu trúc khung của nhân, công thức phân tử có oxy và theo quy luật chung của hợp chất alcaloid, nó là

chất rắn ở nhiệt độ thường, có thể kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng [4] Tuy nhiên, trong cấu tạo phân tử của L— tctrahydropalmatin có liên kết đôi

liên hợp và các nhóm metoxy gắn vào nhân thơm và hợp chất nitơ bậc ba nên

dễ bị oxy hoá, quang hoá và biến đổi bởi các yếu tố như; nhiệt độ, độ ẩm, ánh

sáng

Từ lâu, DĐ Trung Quốc đã có chuyên luận rotundin base, thuốc tiêm rotundin sulphat, viên nén rotundin Rotundin ở dang tinh thể mầu trắng hay

hơi vàng, không mùi, không vị Nó trở nên vàng khi tiếp xúc với ánh sáng và

nhiệt độ Tan trong cloroform, ít tan trong ethanol hay ether, không tan trong

nước, tan hoàn toàn trong acid sulphuric loãng [36], [37]

Các thông số lý hoá đặc trưng của nó là: [36], [37] [39], [40]

- Diém chay: 141°C - 144°C.

6

- GÓC quay Cực riéng: tir -290° dén -300° tinh theo chat khan, xac dinh

trén dd ché pham 8mg/ml trong ethanol 95° va do & nhiét dé 25°C

- Độ hấp thụ ánh sáng: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch (đđ) chứa

30ug rotundin trong Iml dd acid sulphuric 0,5%, ở bước sóng 281nm, giá trị

A (1%, lcm) phai tir 150 dén 160

DĐ Trung Quốc quy định rotundin có độ ẩm không được quá 5,0% và

hàm lượng không được thấp hơn 98,0% C,,H.,.NO, tính theo chế phẩm khan

Rotundin là một base yếu, nên nó dễ đàng liên kết với một acid, để tạo

thành dẫn chất muối acid tương ứng, dễ tan trong nước hơn Rotundin base

thường kém bền vững trong môi trường kiềm, ở dạng muối và môi trường acid chúng bên vững hơn [4]

Rotundin tác dụng với acid hydrocloric tạo thành muối rotundin hydroclorid [4] Rotundin hydroclorid va chế phẩm viền nén của nó đã được

đưa vào DĐ Trung Quốc năm 2000 Rotundin hydroclorid (C;¡H;;NO,.HCI; Ptl = 391,89) ở dạng tỉnh thể mầu trắng hay hơi vàng, không mùi, vị hơi đắng,

dễ chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hay nhiệt độ; tan trong cloroform, methanol hay nước nóng, ít tan trong nước, hơi tan trong cồn tuyệt

đối, thực tế không tan trong ether hay aceton [37]

- Điểm chảy: 196°C

- Góc quay cực riêng: -232° tính theo chất khan, xác định trên dd chế

phẩm 10mg trong 1ml nước và đo ở nhiệt độ 25°C

- Độ hấp thụ ánh sáng: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dd chứa 30ug

rotundin hydroclorid trong Iml dd acid hydrocloric 0,01M, ở bước sóng

28lnm Gid tri A (1%, Iem) phải từ 135 đến 146

DĐ Trung Quốc quy định rotundin hydroclorid có độ ẩm không được quá

6,0% và hàm lượng không được thấp hơn 98,5% C;/H;.NO,.HCI tính theo chế

phẩm khan.

7

Rotundin hoa tan trong nước có chứa một lượng acid sulphuric loãng tạo

thành rotundin sulphat [(C;;H;;NO,);.H;SO,] DĐ Trung Quốc dùng dd này

làm thuốc tiêm [36] [37]

Bộ môn Dược học Quân sự —- Học viện Quân Y điều chế ra nguyên liệu rotundin sulphat (C,,H,,NO,.H,SO,); Ptl = 453,51 ở dạng tỉnh thể màu trắng hay hơi ánh vàng, không mùi, vị hơi đắng chát, rất đễ tan trong nước, tan trong

methanol, ít tan trong cồn cao độ, không tan trong ether, cloroform [13]

- Điểm chảy: 217°C - 220°C

- Góc quay cực riêng: từ - 225° đến - 230° tính theo chất khan, xác định

trên dd chế phẩm 1,0% trong nước và đo ở nhiệt độ 25°C

- Độ hấp thụ ánh sáng: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dd chứa 30kg

rotundin sulphat trong Iml nước, ở bước sóng 28l[nm Giá trị A (1%, lem)

khoảng 121

Tiêu chuẩn cơ sở quy định rotundin sulphat có độ ẩm không được quá

5,0% và hàm lượng không được thấp hơn 98,0% C.,H;;NO,.H,SO, tính theo

chế phẩm khan [13]

*® Công dụng, dạng dùng: lotundin là một alcaloid rất ít độc: Theo Đỗ >: Tất Lợi [I8], rotundin được dùng làm thuốc trấn kinh, an thần trong các trường hợp mất ngủ, trạng thái căng thẳng thần kinh, một số trường hợp rối

loạn tâm thần chức năng, sốt, nóng, nhức đầu, đau tim, đau dạ dày, hen Ngày dùng 0,05g - 0,10g dưới dạng thuốc bột, thuốc viên Có thể chế thành dạng tiêm 0,05g rotundin hydroclorid hay sulphat trong ống 5ml Trẻ em từ 1 đến Š tuổi uống với liều từ 0,02g - 0,025g; trẻ em từ 5 đến 10 tuổi uống với liều từ

0,03g - 0,05g Hiện nay Xí nghiệp được phẩm Trung ương | san xuất thuốc tiêm Rotundin sulphat 60mg/2ml

1.3 Các phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất L- tetrahydropalmatin từ củ Bình vôi và các chế phẩm đông dược có

chứa Bình vôi.

8

Để định lượng được chính xác hàm lượng alcaloid toàn phần cũng như rotundin trong củ Bình vôi và các chế phẩm đông dược có chứa Bình vôi, điều

quan trọng nhất là phải chọn được pp chiết thích hợp để chiết kiệt được

alcaloid và dịch chiết thu được phải tương đối sạch để không làm sai lệch kết

quả phân tích Muốn vậy cần phải có pp xử lý mau và tỉnh chế dịch chiết thích hợp

* Việc xử lý mẫu trước khi chiết thường qua các giai đoạn sau;

- Nghiền nhỏ dược liệu để tăng diện tích tiếp xúc với dung môi

- Loại tạp chất trước khi chiết Ví dụ như loại chất béo bằng ether đầu

hoá, loại màu bằng than hoạt [2]

* Việc chiết xuất alcaloid dựa vào tính chất chung sau: alcaloid nói chung là

những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới đạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin, nên phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alcaloid ra khỏi muối của nó bằng kiểm Hầu hết các alcalotd base không tan trong nước, nhưng lai dé tan trong cdc

dung môi hữu cơ ít phân cực như ether, cloroform, hydrocarbon thơm Trái lại, các muối alcaloid thường tan trong nước, cồn và không tan trong các dung

môi hữu cơ ít phân cực [4]

È Để tinh chế và lầm sạch dịch chiết có một vat pp hay ding [4], {6}

- Dựa vào độ tan trong các dung môi khác nhau của hoạt chất cần chiết

và tạp chất từ đó lựa chọn, thay đổi dung môi, môi trường chiết thích hợp để

hoà tan tốt được chất cần phân tích, đồng thời có thể loại bỏ được các tạp chất

- Dùng sắc ký cột hay SKLM điều chế để tách riêng từng alcaloid ra khỏi hôn hợp

Ngoài ra còn dùng pp trao đổi ion và pp chiết pha rắn [2]

Để xác định hàm lượng alcaloid toàn phần hay L— tetrahydropalmatin

trong củ Bình vôi và các chế phẩm đông dược có chứa Bình vôi, các tác giả

đều chọn dung môi là cloroform để chiết các alcaloid base

9

Việc chiết alcaloid toàn phần, L= tctrahydropalmatin trong những tại liệu mà chúng tòi đã tham khảo được có thể phân thành 2 cách chính: pp chiết lạnh và pp chiết nóng, trong đó hầu hết các tác giả đều dùng pp chiết nóng

trong dung cu Soxhlet

1.3.1 Phuong phap chiét nong

1.3.11 Phuong pháp chiét nong theo DD VN II J7}

Can chính xác khoảng 10g bét duoc liéu Tham 4m bang dd amoniac 6N trong 2 giờ Sau đó cho vào bình Soxhlet, chiết bằng eloroform cho đến hết

alcaloid Cất thu hồi cloroform, hoà tan cắn trong dd acid hydrocloric 5% (5 —

7 lần, mỗi lần 5ml) Rửa dịch chiết acid bằng ether dầu hoả (3 lần, mỗi lần 10ml), kiềm hoá bằng amoniac 6N đến pH I0 - II Chiết bang cloroform 5 lần, mỗi lần 10ml để lấy hết alcaloid Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính Bốc hơi dịch chiết tới khô Định lượng alcaloid toàn phần

bằng pp chuẩn độ acid - base

1.3.1.2 Phương pháp chiết của Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tỉnh dâu

Liên xô cũ (VILAR) [3], [15]

Cân chính xác 5,00g dược liệu Thấm ẩm bằng dd amoniac 6N trong 24 giờ sau đó cho vào túi giấy lọc, đặt vào bình Soxhlet chiết nóng bằng cloroform téi kiét alcaloid (kiểm tra bằng thuốc thử DrugendorfŸ Cất thu hồi cloroform thu được cắn alcaloid, hoà tan cắn trong cồn tuyệt đối Sau đó tách riêng các alcaloid băng pp sắc ký lớp mỏng Rồi định lượng rotundin bằng pp

đo quang phổ tử ngoại

1.3.2 Phương pháp chiết lạnh

Một số tác giả [24| đã đưa ra pp chiết lạnh như sau: Lấy một lượng bột

mịn chế phẩm đông dược có chứa củ Bình vôi trộn đều với nhôm oxyd trung

tính với tỷ lệ 1:5, chuyển vào bình nón nút mài, thấm ẩm lượng bột trên bằng

amoniac đậm đặc (TT), đậy kín và để yên trong 2 giờ Chiết với cloroform 4

lần, môi lần lắc siêu âm trong 30 phút Tập trung dịch chiết cloroform, cô trên

10

cách thủy tới gần cạn rồi để bay hơi tự nhiên thu được cắn Hoà tan cắn trong

dd acid hydrocloric 0,1N (TT) Lọc, kiềm hoá dịch lọc bang dd amoniac 10% đến pH khoảng 9, chuyển vào bình gạn Chiết 4 lần bằng cloroform (TT) Gop

các dịch chiết cloroform, cô trên cách thuỷ tới gần cạn rồi để bay hơi tự nhiên

thu được cắn Hoà tan cắn trong Iml ethanol tuyệt đối Dùng SKLM điều chế

với hệ dung môi thích hợp để tách riêng rotundin ra khỏi hỗn hợp các alcaloid

Cạo lấy vết rotundin rồi phản hấp phụ bằng cloroform Bốc hơi dung môi thu được cắn Hoà fan cắn írong mefthanol thu được dd thử Tiến hành chạy HPLC

để xác định sự có mặt của rotundin trong hỗn hợp nhiều dược liệu

1.4 Các phương pháp đã dùng để định lượng L- tetrahydropalmatin đơn chất, trong các chế phẩm và trong dược liệu Bình vôi

1.4.1 Phương pháp kết tua voi bac nitrat /36 }, 37}

Cách tiến hành: Trong một bình định mức dung tích 50ml, hoà tan một

lượng chế phẩm chứa khoảng Ø,3g rotundin (mầu cân chính xác) trong 2ml

acid acetic, thêm 15ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan hết, trộn đều Thêm chính xác 25,0ml dd kali iodid 1,7%, pha loãng với nước cất đến vạch, trộn

đều Lọc qua giấy lọc khô, bỏ dịch lọc đầu Lấy chính xác 25,0ml dịch lọc thêm 3 - 5 giọt chi thi natri eosin, chuan do bang dd AgNO, 0,05M_ cho đến

khi xuất hiện tủa mâu hồng đông von lại Song song tiến hành chuẩn độ một

mẫu trắng

Iml dd AgNO; 0.05M tương ứng với I7,77mg C.,H;;NO,

Phương pháp này được DĐ Trung Quốc năm 2000 áp dụng để định lượng

rotundin nguyên liệu Một số cơ sở sản xuất trước đây cũng dùng để định

lượng rotundin trong các chế phẩm

1.4.2 Phương pháp chuún độ môi trường khan /37J

Chuẩn độ môi trường khan là pp chuẩn độ các acid và base yếu hoặc

những muối của chúng trong môi trường không phải là nước [6] Rotundin là

11

một base yếu, nên DĐ Trung Quốc năm 2000 đã áp dung pp nay dé dinh

lượng rotundin hydroclorid nguyên liệu

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,35g chế phẩm, thêm 25ml acid acetic khan, 2ml anhydrid acetic va 5ml dd thuỷ ngân (II) acetat, lắc cho

tan hết, thêm I giọt dd tim tinh thể làm chỉ thị và chuẩn độ bằng dd acid

percloric 0,1M cho đến khi dd chuyển sang mầu xanh lục Song song tiến

hành chuẩn độ một mẫu trắng

Iml dd acid percloric 0,1M tương đương với 39,19mg C;,H;,NO;.HCI 1.4.3 Phương pháp ảo quang phổ tử ngoại khả kiến /1 }, f6 j, [14], /36 j, /37 } Phương pháp này dựa trên định luat Lambert — Beer: D6 hap thu (D) cua

dd một chất ở một bước sóng xác định tỷ lệ thuận với nồng độ (C) và bề đày (I) của lớp dd đem đo Sự phụ thuộc này được biểu thị bằng phương trình:

Trong dé: k 1a hé so hap thu

C là nồng đệ của dd chất khảo sát

I là bề day cua lớp dd đem do

Nếu C tính theo nồng độ phần trăm kl/tt, l tính bằng cm, thì hệ số hấp thụ

k được gọi là độ hấp thụ riêng của một chất tan, ký hiệu là A (1%, lcm) Nó

có thể được coi là độ hấp thụ của dd chất tan ở nồng độ 1% (Kl/tt) hay 10g/1 trong một cốc có chiều dày lcm và do ở một bước sóng xác định Khi đó:

D=^A (1%, lcm): C (2) Trị số A (1%, Icm) ở một bước sóng riêng, trong một dung môi xác định

là một đặc tính của chất đó Như vậy, từ giá trị A (1%, 1cm) đã biết, với giá trị

(D) đo được ta có thể tính được nồng độ (C) của dd cần định lượng

D

4

12 Cách tiến hành: Hoà tan một lượng chế phẩm chứa rotundin với nồng độ

khoảng 0,003% trong dd acid sulphuric 0,5% Rồi đo độ hấp thụ của dd thu

được ở bước sóng À = 28lnm, mẫu trắng là dd acid sulphuric 0,5% Tính hàm lượng rotundin trong chế phẩm theo trị số A (1%, lcm) ở bước sóng cực đại

X„„=281nm là 155 [10] [H1] [36] [371

DĐ Trung Quốc áp dụng pp này để định lượng rotundin trong các chế

phẩm viên nén và thuốc tiêm

1.4.4 Phương pháp đo quang kết hợp với pp sắc ký lớp mỏng /3jÿ, [15], [16]

* Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc của pp đo quang phổ tử ngoại - khả

kiến và kỹ thuật SKLM

Theo pp của Viện nghiên cứu cây thuốc và cây có tinh dau Liên xô cũ:

Chuyển hoàn toàn alcaloid từ đạng muối trong dược liệu sang dang base bang

cách thấm ẩm dược liệu đã tấn nhỏ băng dd NH,OH 6N trong 24 giờ Sau dé cho vào túi làm bằng giấy lọc, chiết alcaloid trong bình Soxhlet bằng dung

moi hitu co (cloroform) cho téi kiệt alcaloid (kim tra bằng thuốc thử

Dragendorƒf) Cất thu hồi dung môi, thu được căn là alcaloid đạng base, hoà

tan cắn trong cồn tuyệt đối

Tiến hành tach rotundin ra khỏi các alcaloid khác bằng pp SKLM với hệ

dung môi thích hợp Triển khai trên càng một bản mỏng dd chuẩn rotundin và

dd thử Phun thuốc thử hiện màu hay soi đưới ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm để xác định vết rotundin trong dd thử tương ứng với vết rotundin của dd chuẩn Xác định hàm lượng rotundin theo một trong 2 cách:

® Phương pháp đo quang phổ UV-VIS sử dụng chương trình máy tinh Adobe photoshop: Sau khi phụn hiện mau alcaloid bang thuốc thử

Dragendorff, thu được cấc vết gọn, đồng đều về màu sáe và tách rời nhau

Trong đó đồng đều về màu sắc là rất quan trọng, vì nó sẽ ảnh hưởng đến quan

hệ mật độ vết và diện tích vết Đưa bản mỏng lẽn máy quét ảnh với chế độ

quét thích hợp sao cho thu được các vết tương đối sắc nét Đo vết tự động

13

bằng máy để xác định diện tích vết Dựa vào đồ thị tương quan giữa điện tích

vết và nồng độ của dd rotundin chuẩn, suy ra nồng độ rotundin trong dd thử

Từ đó tính được hàm lượng rotundm có trong được liệu [16]

¢ Cao lấy vết chứa rotundin ở cả dd thử và dd chuẩn để riêng ra hai cốc Dùng cồn tuyệt đối để phản hấp phụ alcaloid Lọc, bỏ dịch lọc đầu Do d6 hap

thụ của dịch lọc thu được ở bước sóng À = 282nm

Dựa vào đồ thị tương quan giữa độ hấp thụ (D) và nông độ (C) của

rotundin suy ra nồng độ rotundin trong dd thử Từ đó tính được hàm lượng

rotundin có trong dược liệu [3] [15]

* Nhận vét: Phương pháp đo quang kết hợp với SKULM yêu cầu lượng

mẫu thử khá lớn (5g củ Bình vôi), do đó lượng chế phẩm có chứa củ Bình vôi tương ứng sẽ rất lớn Việc áp dụng pp này để định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi và trong các chế phẩm chứa

Bình vôi sẽ không tránh khỏi sai số nhất định, vì yẽu cầu cao về độ đồng đều

về màu sắc khi phun thuốc thử hiện màu Hơn nữa, trong Bình vôi có nhiều

alcaloid khác, có cấu trúc hoá học và tính chất quang học tương tự rotundin như: roemerin, stepharin, cepharanthin, palmatin và trong thành phần của

các chế phẩm còn có nhiều được liệu khác và tá dược cũng phần nào gây ảnh

hưởng đến kết quả

1.5 Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [6], [1L4], [19], [20], [21], [28], [31], [32], [38], [41]

Phương pháp HPLC là một kỹ thuật phân tích hoá lý, dùng để tách và định

lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trến ái lực khác nhau giữa các chất

với hai pha luôn tiếp xúc, nhựng không hoà lấn vào nhau: pha tnh (được nhồi

trong cột sắc ký) và pha động (dung môi rửa giải) Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao vä các chất cần phân tích di chuyển theo

pha động qua cột với tốc độ khác nhau, tuỳ theo ái lực của chúng với hai pha dẫn đến sự tách ra của các chất Sự tách này đạt được là do các quá trình phân

14

bố, hấp phụ hoặc trao đổi ion của các chất tan khác nhau vệ cấu trúc hoá

học và tính chất

Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột, được nhận biết bởi bộ phận

phát hiện goi 1a detector Tuy theo ban chất của các chất cần phân tích, mà sử

dung detector thich hợp Detector hay được sử dụng nhất là detector UV (phát hiện được lượng chất cần phân tích có trong dịch rửa giải sau khi qua cột dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại của chất cần phân tích ở một bước sóng xác định) Sau một quá trình sắc ký, ta thu được sắc ký đồ Sắc ký đồ

phản ánh quá trình tách sắc ký ở trong cột tốt hay không Trong quá trình sắc

ký, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất trong pha tinh sé được pha động rửa giải ra khỏi cột sau cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ phụ thuộc vào bản chất sắc ký của pha

tĩnh cũng như cấu trúc hoá học và tính chất của chất tan Sắc ký đồ thường có dạng như hình l:

Hình 1: Sắc ký đồ hai chất | va 2

Trên sắc ký đồ thể hiện một số thông số quan trọng:

cột hay là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột sắc ký.

15

- ta (thoi gian liai): Thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic Thời gian lưu đặc trung cho mot chất Trên

cùng một điêu kiện HPLC đã chọn: t, của mỗi chất là hằng định, các chất

khác nhau thì t„ khác nhau, vì vậy t,„ là đại lượng để phát hiện định tính các chất So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều

kiện ta sẽ định tính được chất đĩ Nếu t¿ nhỏ quá, sự tách kém, pic xuất hiện quá sớm, đề lần pic tạp Nếu t¿ lớn quá pic bị dộng, độ lặp lại kém, thời gian

phân tích kéo dài

-t(thời gian lưu thực) = ty-,

- ư(độ lệch chuẩn): Độ rong nwa pic tại các điểm uốn tương ứng

- 0g s(độ rộng pic ở nửa chiều cao) = 2,354 ð;:

- ,(d6 rong day pic)

-k (hệ số dưng lượng): Hệ số dụng lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đĩ trong 2 pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở tại thời điểm

cân bằng Hệ số k phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, đặc tính của pha

tĩnh và pha động

Nếu k nhỏ thì ty cũng nhỏ và sự tách kém, k lớn thì pic bị dỗng; độ nhạy kém và thời gian phân tích kéo đài Trong thực tế k từ 1 đến 5 là tốt nhất

- œ (độ chọn lọc): Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất, cho biết hiệu quả

tách của hệ thống sắc ký, hai chất chỉ được tách ra khi các giá trị k` khác nhau

Qo <= (Ko> Kj) (5)

&, tụ, —Í

Để tách riêng hai chất cần cĩ a > I, thường dùng œ trong khoảng 1,05 đến

2,0 œ càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, nhưng khi œ quá lớn thời gian ' phân tích sẽ kéo dài

=N (số đĩa lý thuyết): Đại lượng đặc trưng cho hiệu lực của cột sắc ký Số đĩa lý thuyết được tính theo cơng thức:

16 weltel ord te] = |= ( 54 afm 6

Trong thực tế nếu các pie cân đối, thì độ phân giải tối thiểu để hai pic tách

ra khỏi nhau trong phép thử định lượng R = 1,5 là phù hợp

Độ phân giải phụ thuộc vào hệ số dung lượng của cấu tử ra sau (Èk;), độ chọn lọc œ và số đĩa lý thuyết N của cột

Re 3W 4 &- a 14 k,

Do vậy, để tang dé phan giai R cua hai pic ta c6 thé tang s6 dia ly thuyét

N (dàng cột dài hơn, cột có kích thước hạt nhỏ hơn hay giảm tốc độ dòng pha

dong); tang k (bdng cach thay đổi thành phần của pha động: thay đổi độ

phán cực của pha động nếu là RP -HPLC, thay đối cường độ ion nếu là IE- HPLC); tăng độ chọn lọc œ (bảng cách chọn cột khác phù hợp hơn với qúa

trình tách, hoặc thay đổi thành phan pha động)

Nếu R quá lớn thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy

sẽ kém Giảm R bằng cách thay đổi thành phần pha động, tăng tốc độ dòng

hay ứng dụng quá trình rửa giải gradient dé cho chất thứ hai ra nhanh hơn

-T (hệ số bất đối xứng): cho biết mức độ đối xúng của pic trên sắc ký đồ

đoạn nối từ cột đến đetector; thay đổi thành phần pha động sao cho kha năng

rửa giải tăng lên; giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột, bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặc giảm thể tích tiêm

- Diện tích và chiều cao của pic: thể hiện nồng độ và thể tích chất tan được tiêm vào cột Khi so sánh diện tích hay chiều cao của pic trong sắc ký đồ của

dd mẫu thử và mẫu chuẩn làm trọng cùng điều kiện, ta sẽ xác định được hàm lượng hoạt chất trong mâu thử

Phương pháp HPLC đã được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong kiểm nghiệm thuốc tân dược Gần đây, người ta cũng đã

áp dung pp HPLC trong kiếm nghiệm thuốc đông dược Phương pháp này có

độ chính xác và độ nhạy cao, tốn ít mâu, có tính đặc hiệu, thực hiện tương đối

nhanh và thuận tiện, có thể thực hiện được ở những cơ sở kiểm nghiệm đã duoc trang bi may HPLC

Tuy nhién pp HPLC con it duoc nghién cttu ap dung trong viéc phan tich định lượng L- tetrahydropalmatin Trong các tài liệu mà chúng tôi đã tham

khảo ở tạp chí và trên Internet các tác giả đã nêu lên một số chương trình sắc

ký sau đây để phân tích L- tetrahydropalmatin cũng nhự các alcaloid khác

trong củ Bình vội,

* Yuan YE, Liu 2L, Li XL [42] đã sử dụng chương trình sắc ký sau đây

để tách và xác định DL.- tetrahvdropalmatin và các alcaloid khác trong cây

Corydalis Yanhusuo W T Wang:

- Cét silica gel

- Pha dong la: Hon hop methanol - đệm phosphat 2 mmol/l (75:25)

* Huang J, Guo J, Duan G [33] xac dinh 7 alcaloid cé hoat tinh sinh hoc

trong các cây thuộc ch¡ Stephania bảng pp sắc ký long pha dao:

- Detector::::.UV 282 n

hệ dung môi là pha động

* Chương trình sắc ký của các tác gia [24] xác nhận được sự có mặt của

rotundin trong hôn hợp nhiều dược liệu:

-Cot =: Lichrosorb C18 (Sum, 4,6 x 250mm)

- Pha động: Hôn hợp dung môi đệm phosphat 0,05M pH 4,6 — acetonitril (1:1) Dung dịch KH;PO, 005M chỉnh pH ve 4,6 bang dd acid hydrocloric

0,1N hoặc dd NaOH 0.IN

- Chương trinh gradient dung moi: Tu 0 dén 25 phút 12 - 100% B trọng A,

giữ trong 3 phút, sau đó quay lạt 12% B trong A trong 3 phút,

- Tốc độ dòng Iml/phút

- Phát hiện: Detector diode array

Ngoài các pp đã nêu ở trên, một số tác giả còn dùng pp điện đi mao quản để

xác định tetrahydropalmatin trong thuốc đông dược [30]

nm và thực hiện quá-trình rửa giải gradlent với: -:

19

Chuong 2: ĐỐI TƯƠNG, THIẾT BI, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu _

* Mẫu M, là mãu bột mịn củ Bình vôi (Stephania viridiflavens H.S.Lo et

M.Yane) thu hái ở Sơn La tháng I1/2001 Dược liệu khô được tán nhỏ va ray qua rây cỡ 0,4inm,

* Mẫu M;¿ là mẫu bột mịn Balok: Lấy 2 vỉ viên hoàn Balok có SKS: 03/03

(do Công ty TNHH đông nam dược Bảo Long cung cấp) gồm 24 nang có chứa

72 viên hoàn nhỏ, đem sấy các viên hoàn ở nhiệt độ 50°C trong 4 giờ, để

nguội trong bình hút ẩm Nghiên mịn viên đã sấy và rây qua rây cỡ 0,4mm Mẫu M; có các dược liệu sau [I2]:

Duong quy l2g Trầm hương 6g

Bạch thược 12g Đông trùng hạ thảo 6g, Lưỡng diện châm 10g Mộc nhĩ 10g, Nhan sam 6g Hác táo nhân 8g,

Bạch truật l2§

Mẫu M; được dùng để khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khác trong

viên hoàn Balok đến quá trình chiết tách và quá trình sắc ký định tính và định

lượng L_ tetrahydropalmatin bằng pp HPLC

Trong quá trình nghiên cứu, hai mẫu M, và M;¿ được tiến hành song song

* Hai mẫu được liệu Bình vôi ở Việt Nam có tên khoa học là:

- Stephania dielsiana Y.C.Wu thu hái ở Hà Tây tháng 10/2002

- Stephania sp mua ở trên thị trường là nguyên liệu sản xuất viên hoàn Balok

* Một mẫu bột mịn Heantos 4: Lấy 20 viên nang cứng Heantos 4 có số lô:

01 (do Viện Hoá học thuộc TTKHTN và CN Quốc gia cung cấp), cân để xác

định khối lượng trung bình, rồi đem sấy bột thuốc ở nhiệt độ 50°C trong 4 giờ,

để nguội trong bình hút ẩm, nghiền mịn và rây qua rây cỡ 0.4mm Mẫu bột

Công thức này pha chế cho 100g thành phẩm

Tiến hành định tính và xác định hàm lượng L- tetrahydropalmatin trong

các mẫu nghiên cứu bằng pp HPLC đã xây dựng

2.2 Thiết bị và hoá chất

2.2.1 Thiết bị

- May lac siéu 4m Ultrasonic LC 60H

- May HPLC Hewlett — Parkard 1100 với detector UV

- May HPLC Hitachi vdi detector diode array

- Can phan tích Mettler AE 200 với độ chính xác 0,1mg

- Máy quang phổ UV - VIS Hewlett Parkard

- Máy đo pH: 691 pH Meter Metrohm

- Máy khuấy từ điều nhiệt Ikamag RH

- Nồi cách thuỷ

- Dung cu chiét Soxhlet cd 100ml

- Các dụng cụ thuỷ tính chính xác các loại

Tất cả các thiết bị và dụng cụ trên đều đã được hiệu chuẩn và kiểm định

theo đúng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025

2.2.2 Hoá chát

- Acetomril dùng cho HPLC

- Acid phosphoric P A

150g 150g 150g 150g

100g

100g

21

= Acid sulphuric P A

- Amoniac dac

- Ban mong silica gel GF,., cua Merck

- Chuẩn làm viéc rotundin của Viện Kiểm nghiệm

- Thuốc thử Dragendorff pha theo DĐ Việt Nam III

2.3 Nói dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất L— tetrahydropalmatin từ bột mịn

Binh voi va tit bot min Balok

2.3.1.1 Khdo sdt pp chiét néng theo DPVN III va-pp chiết lạnh bằng lắc siêu

âm trên mâu bội mịn Bình vôi (mâu M,) và bột mịn Balok (mâu M,)

2.3.1.2 Đề xuất pp chiết L— tetrahydropalmatin từ bột mịn Bình vôi (mẫu M,) và

bột mịn Balok (mâu M,)

a) Đối với bột được liệu Bình vôi (w„ẩu M,) : :'

Cân chính xác khoảng 0,4g bột mịn dược liệu Bình vôi chuyển vào một túi giấy lọc Làm ẩm khối bột mịn bằng 0,5ml dd amoniac 6N, để yên trong 30 phút Chuyển túi giấy lọc này vào trong dụng cụ Soxhlet cỡ 100ml Dùng 30ml cloroform để chiết alcaloid trong thời gian khoảng 4giờ đến kiệt alcaloid Dịch

chiết cloroform được cô trên cách thuỷ đến cạn Hoà tan cắn thu được trong dd acid sulphuric 0,1N (5 lan, mỗi lần khoảng 10ml) Lọc dd qua giấy lọc vào một

bình gan Kiềm hoá dịch lọc bằng dd amoniac đặc đến pH I0 Chiết 4 lần, mỗi

lần với IÖml cloroform Tập trung dịch chiết cloroform, bốc hơi trên cách thuỷ

tối khô Cắn được hoà tan trong pha động và chuyển vào bình định mức dung tích 50,0ml; thêm pha động đến vạch, lắc đều Lọc sơ bộ qua giấy lọc thường, bỏ

[0ml dịch lọc đầu Dịch lọc sau đó được lọc qua giấy lọc mm cỡ 0,45m: thu

duoc dd thu

22

b), Đối với mâu bột min Balok (mau M;) _

Cân chính xác khoảng 1,00g bột mịn Balok chuyển vào một túi giấy lọc rồi tiến hành chiết giống như đối với mẫu bột mịn dược liệu Bình vôi ở trên

Sơ đồ chiết xuất L— tetrahydropalmatin từ bột mịn được liệu Bình vôi và

bột min vién hoan Balok:

Mau M;: 0,4g bot min

dược liệu Bình vôi

Cho vào túi giấy lọc, làm ẩm bằng 0,5ml dd

amoniac 6N/30 phút Chiết trong dụng cụ

Soxhlet bằng 30ml cloroform/4 giờ

Kiêm hoá bằng dd amoniac đặc

i = 10 Chiết nang cloroform

Dich chiét alcaloid base

| Bay hơi trên cách thuỷ tới khô

Can alcaloid base

Hoà tan cắn trong pha động vở

50,0ml Lọc qua giấy lọc Lọc qua

giấy lọc mịn 0,45um

Dung dịch thử

23

2.3.2 Xdy dung pp HPLC dé dinh tinh và định lượng

L- tetrahydropánatin trong dược liệu Bình vơi và trong vién hoan Balok

2.3.2.1 Khảo sát điểu kiện sắc ký

Trên cơ sở cĩ săn cột RP 18 (250 x:4mm; 5um), chúng tơi tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký thích hợp

a) Khảo sát chọn thành phần pha động, pH pha động và tốc độ dịng

thích hợp cho phép tách L_ tetrahydropalmatin ra khỏi hỗn hợp phân tích

b) Khảo sát chọn bước sống xác định L- tetrahydropaÌmatin

c) Xây dựng chương trình sắc ký

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách

L- tetrahydropalmatin trong dịch chiết từ mẫu được liệu Bình vơi và mâu bột

mịn Balok như: thành phần pha động, pH pha động, tốc độ dịng và bước sĩng phát hiện, chúng tơi đã chọn một chương trình sắc ký với các điều kiện sau

đây cho phép tách được L- tetrahydropalmatin ra khỏi hơn hợp các chất khác

* Cột RP 1§: Chiều dài 25cm, đường kính trong 4mm, chất nhồi cột là octadecylsilyl silicagel dùng cho sắc ký cĩ cỡ hạt 5um (250 x 4mm; Sưm)

* Pha động: Hỗn hợp dd KH,PO, 0,05M 62,5ml poe |

* Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phịng (27 + 3°C)

2.3.2.2 Xây dựng pp- định tính và định lượng L— tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vơi và trong vién hoan Balok

a) Kiểm tra độ tinh khiết của pic L- tetrahydropalmatin thu được trên sắc ký đồ của dịch chiết mẫu thử bằng máy HPLC với detector diode array b) Xây dựng phương pháp định tính L- tetrahydropalmatin

24 Sti dung may HPLC Hitachi v6i detector diode array dé dinh tinh

L~ tetrahydropalmatin dựa vào việc so sánh các thông số: thời gian lưu (tạ) va

phổ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn thông qua hệ số match

c) Xây dựng phương pháp định lượng L- tetrahydropalmatin

Để định lượng L— tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi và trong viên hoàn Balok bằng phương pháp HPLC, chúng tôi tiến hành:

- Khảo sát đệ lặp lại của phương pháp

- Khảo sát độ đúng của phương pháp

Trên cơ sở đó, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và mẫu thử

năm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Tiến hành sắc ký theo chương trình

đã chọn trên các mẫu thử, song song với mẫu chuẩn L— tetrahydropalmatin

Tính hàm lượng L- tetrahydropalmatin dựa trên diện tích pic

L= tetrahydropalmatin thu được từ sắc ký đồ của dd thử, dd chuẩn và hàm

lượng của chất chuẩn L- tetrahydropalmatin Công thức tính:

mc: Lượng cân mẫu chuẩn (mg)

tip: Lượng cãn mẫu thử (mg)

Œc: Hàm lượng L~— tetrahydropalmatin chuẩn (%)

m, : Khối lượng trung bình viên (mg).

25 b: Độ ẩm dược liệu Bình vôi (g/1g bột mịn dược liệu) 2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

2.3.3.1 Đánh giá hiệu quả chiết

Để đánh giá hiệu quả chiết, chúng tôi dùng phản ứng tạo tủa với thuốc thử Dragendorff, dùng phương pháp SKLM và HPLC

dua trên hệ số match Hệ số match là hệ số toán học nói lên mức độ tương tự

của hai phổ được đem so sánh Hệ số match được biểu thị bằng công thức toán

x, y tuong ứng là các độ hấp thụ đo được trong các phổ của mẫu

thử và mẫu chuẩn ở cùng bước sóng

n là số điểm so sánh

+ Khi hé sé match = 1,000 có nghĩa là hai phổ giống nhau hoàn toàn + Khi hề số match > 0,990 thì hai phổ tương tự nhau

+ Khi hệ số match từ 0,900 đến 0,990 thì hai phổ có những điểm tương tự

nhau, nhưng khi kết luận cần cân nhắc cẩn thận

+ Khi hệ số match < 0,900 nghĩa là hai phổ khác nhau [31], [35]

3.3.3.3 Định lượng

Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng toán thống kê với các đặc trưng sau [ H7]:

27

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUA

3.1 Xây dựng phương pháp chiết L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi và trong viên hoàn Balok

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết lạnh dùng máy lắc siêu âm

Cân chính xác khoảng 0,4g bột mịn củ Bình vôi (mâu Mí,) vào một bình

nón nút mài dung tích IOOml Cân chính xác một lượng mẫu M; có chứa khoảng lg bột mịn Balok vào một bình nón nút mài dung tích 100ml khác,

thấm ẩm lượng bột trên bằng dd amoniac 6N, đậy kín và để yên trong 2 giờ

Song song tiến hành chiết trên 2 mẫu này bằng cách lắc siêu âm 4 lần, mỗi lần dùng I5ml eloroform và lắc trong 30 phút Tập trung dịch chiết cloroform, lọc rồi cô trên cách thuỷ đến khô, thụ được cắn

Để kiểm tra xem pp chiết lạnh dùng siêu âm như trên đã chiết kiệt

alcaloid trong 2 mẫu M; và M; chưa, chúng tôi tiến hành như sau: Ba còn lại

chiết thêm lần thứ 5, cũng bằng cách lắc siêu âm với 15ml cloroform trong 30

phút Dịch chiết cloroform cho bốc hơi trên cách thuỷ đến cạn Hoà tan cắn

trong 2ml dd acid sulphuric 10%, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Quan

sát thấy cả hai mẫu M; và M; đều xuất hiện tủa mau do cam,

Như vậy pp chiết lạnh dùng máy lắc siêu âm nêu trên, chưa chiết kiệt

alcaloid trong mẫu dược liệu Bình vôi và mẫu viên hoàn Balok

3.1.2 Khảo sát phương pháp chiết nóng theo DĐ Việt Nam III

Cân chính xác khoảng 10g bột mịn mẫu M, cho vào một túi giấy lọc

Cân chính xác một lượng bột mịn mẫu M; có chứa khoảng 10g Bình vôi, cho

vào một túi giấy lọc khác, thấm ầm khối bột mịn bằng dd amoniac 6N trong 2

gid Sau đó cho vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform cho đến hết alcaloid Dịch chiết cloroform được cô trên cách thuỷ tới khô Hoà tan cắn trong dd

acid hydrocloric 5% ($ — 7 lần, môi lân Sml) Rửa dịch chiết acid bằng ether

dau hoả (3 lần, môi lần 10ml), kiêm hoá bằng dd amoniae 6N đến pH 10 - 11

28

Chiết bằng cloroform (Š lần, mỗi lần 10ml) để lấy hết alcaloid Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính Bốc hơi dịch chiết đến khô

Để kiểm tra xem đã chiết kiệt alcaloid chưa, chúng tôi dùng bã dược

liệu được chiết tiếp trong dung cu Soxhlet véi cloroform trong | giờ Dich chiết cloroform này được bốc hơi trên cách thuỷ tới khô Hoà tan cắn trong 2ml dd acid sulphuric 10%, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Quan sát

thay ca hai mau M; va M, déu không thấy xuất hiện tủa mau đỏ cam

Nhu vay, thuc nghiém da chitng to pp chiét nong theo DD Viét Nam III

đã chiết kiệt alcaloid trong mẫu dược liệu Bình vôi và trong chế phẩm Balok

Tuy nhiên chúng tôi nhận thấy rằng: với cả 2 mẫu M; và M;, ở giai đoạn tỉnh chế để chuyển alcaloid từ dạng base sang dạng muối acid, DĐ Việt

Nam III dùng acid hydrocloric 5%, nhưng theo các tài liệu mà chúng tôi đã than khảo, cộng với thục tế thực nghiệm, chúng tôi thấy

L— tetrahydropalmatin dé tan trong acid sulphuric loãng và tạo thành dạng muối sulphat dễ tan trong nước hơn Do vậy có thể thay acid hydrocloric 5%

bằng acid sulphuric 0,1N

3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết thích họp

Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi chọn cloroform, một dung môi

quen thuộc mà hầu hết các tác giả Sử dụng để chiết xuất L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi Cloroform là một dung môi không phân cuc c6 kha nang hoa tan chon loc alcaloid dang base

3.1.3.1 Khảo sát thể tích dùng môi chiết xuất

Chúng tôi đã khảo sát dùng dung môi chiết xuất là cloroform với thể

tích là: 30ml, 40ml và 50ml Tiến hành chiết nóng bằng Soxhlet trong thời gian 4 giờ Quá trình khảo sát được tiến hành trên 2 mâu M; và M; theo quy

trình sau: Cân chính xác 3 mẫu thử M;, mỗi mẫu khoảng 0,4g cho vào 3 túi

giấy lọc, thấm ẩm bằng 0,5ml dd amoniac 6N để yên trong 30 phút rồi cho vào 3 bình Soxhlet đã được đánh số thứ tự từ 1 đến 3 Tiến hành chiết theo pp

đã nêu ở mue 2.3.1.2.a, nhưng thay lượng dung môi chiết bang các thể tích

dung môi sau:

29

Bình Soxhlet số I: 30ml cloroform

Binh Soxhlet s6 2: 40m! cloroform

Binh Soxhlet s6 3: 50m! cloroform

Tương tự như vậy, dùng 3 lượng thể tích cloroform trên để chiết 3 mẫu

có thời gian lưu và hình dạng giống với pic L- tetrahydropalmatin chuẩn (Hình

2a) Tuy nhiên, thông qua kết quả các diện tích pic thu được có thể thấy rằng trong cùng điều kiện chiết, với 3 thể tích dung môi khác nhau thì lượng hoạt

chất chiết được là như nhau

Từ đó chúng tôi chọn lượng 30ml eloroform là thể tích dung môi chiết

L— tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vôi và trong chế phẩm Balok BảngI: Khảo sát chọn thể tích dung môi chiết

3.1.3.2 Khảo sát thời gian chiết xuất

Để xác định thời gian chiết xuất thích hợp, vừa có thể chiết kiệt alcaloid

trong củ Bình vôi cũng như trong viên hoàn Balok, lại vừa có thể tiết kiệm được thời gian và nhiệt lượng Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 2 mẫu MỊ và

30

M, theo quy trinh sau: Can chinh xác 5 mẫu thử M; mỗi mau khoang 0,4g cho vào túi giấy lọc, thấm ẩm bang 0,5mi dd amoniac 6N, dé yén trong 30 phit,

rồi cho vào trong bình Soxhlet đã được đánh số từ 1 đến 5 Tiến hành chiết

nóng với 30ml] cloroform, nhưng thời gian chiết theo thứ tự sẽ là: I giờ, 2 giờ,

3 gid, 4 gid va 5 gid

Tương tự như vay, can chính xác 5 mẩu M; mỗi mẫu khoảng 1g, dùng 5 bình Soxhlet để chiết alcaloid theo pp đã nêu ở mục 2.3.2.1.c

Sắc ký các dd thử MỊ và M; song song với dd chuẩn chứa khoảng

0.05mg L- tetrahydropalmatin khan trong Iml pha động Kết quả thu được

cho thấy rằng, sử dụng thời gian trên để chiết đều thu được sắc ký đồ trong đó

có l pic có thời gian lưu và hình dạng giống với pic L- tetrahydropalmatin chuẩn (Hình 2a, 2b và 2c)

Acq Operator : Duyen

Acq Method : C:\HPCHEM\1\METHODS\CLOBEPRO.M

Last changed : 9/1/03 11:43:02 AM by Duyen

(modified after loading)

Analysis Method : C:\HPCHEM\1L\METHODS\CLOBEPRO.M

Last changed : 9/1/03 12:19:02 PM by Duyen

(modified after loading) Dinh luwowng Rotundin trong vien hoan Balok

Injection Date : 8/28/03 3:16:10 PM

Acq Operator : Duyen

Acq Method : C:\HPCHEM\1\METHODS\ROTUND.M

Last changed : 8/28/03 3:02:48 PM by Duyen

(modified after loading)

Analysis Method : C:\HPCHEM\1\METHODS\SALICY M

Dinh luong Rotundin trong Binh voi S viridiflavens

(modified after loading) Dinh luong Rotundin trong vien Balox

VWDI A, Wavelength=283 nm (DUYEN\ROTUNO26 D)

SSS S SSS SSS SSS SHS SS HSS SSS SS SS SSS SS SS SSS SS SS SSSSSESS STH SSSSeSSE SSE 5SSSS==z= ====

Hình 2c: Sắc ký đồ dịch chiết viên hoàn Balok (mầu M?)

32

Từ kết quả diện tích pic thu được trên sắc ký đồ có thể thấy rằng, trong

cùng điều kiện chiết: bình Soxhlet số 4 và 5 với thời gian chiết là 4 giờ và 5 giờ đã thu được lượng hoạt chất nhiều nhất Kết quả được trình bày ở bảng 2: Bảng 2: Khảo sát thời gian chiết

chiết | Lượng cân | Diện tích pic| Lượng cân | Diện tích pic

Tuy nhiên, với thời gian chiết 5 giờ thì lượng hoạt chất chiết được cũng

không tăng so với thời gian chiết 4 giờ Từ đó chúng tôi chọn thời gian chiết là

4 giờ để chiết L_ tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vôi và trong viên “—=— “mm 7 ewes

hoan Balok

Để kiểm tra xem đã chiết kiệt alcaloid trong các mẫu nghiên cứu chưa, chúng tôi tiến hành như sau: bã dược liệu sau khi chiết trong l giờ, 2 giờ,

3 giờ, 4 giờ và 5 giờ, chúng tôi lại chiết tiếp trong bình Soxhlet: với 30ml

cloroform trong I giờ Bốc hơi dịch chiết trên cách thuỷ tới khô Hoà tan cắn

trong 2ml dd acid sulphuric 10%, chuyển sang ống nghiệm Cho vào mỗi ống

nghiệm đựng dịch chiết đã được xử lý như trến 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Kết quả cho thấy: Các dịch chiết sau 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ đều

xuất hiện tủa mầu đỏ cam, nhưng với dịch chiết sau 4 giờ và 5 giờ không còn thấy xuất hiện tủa nữa

Lấy những dịch chiết bã dược liệu ở trên, cô cạn trên cách thuỷ, rồi hoà

tan cắn trong Iml ethanol 90% Tiến hành kiểm tra bằng SKLM với hệ dung

môi là: Toluen : acetone : ethanol : amoniac (45:45:7:3) Chấm riêng biệt lên

ban mong silica gel G, 20Hl môi dd thir va dd đối chiếu chứa Img và 0,lmg

L— tetrahydropalmatin chuẩn trong Iml ethanol 90% Sau khi triển khai sắc

45

ký, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng rồi phun hiện mầu bằng thuốc thử

Dragendorff Kết quả trên sác ký đỏ cho thấy, các địch chiết mẫu thử sau l giờ,

2 giờ, 3 giờ đều thấy xuất hiện vết có màu sắc và giá trị R; giống vết của

L— tctrahydropalmatin trên sắc ký đồ của dd đối chiếu, nhưng với dịch chiết sau

4 giờ và 5 giờ không còn thấy xuất hiện vết L tetrahydropalmatin (Hình 3a, 3b):

Ghi chú:

C: DD chuẩn rotundin (1mg/ml) 1: Dịch chiết bã dược liệu sau I giờ 2: Dịch chiết bã dược liệu sau 2 giờ 3: Dịch chiết bã dược liệu sau 3 giờ 4: Dịch chiết bã dược liệu sau 4 giờ 5: Dịch chiết bã dược liệu sau 5 giờ

-> *~

/10: DD chuẩn pha loãng 10 lẳn

Hình 3a: Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết trên mẫu Mj

Ghỉ chú:

C: DD chuẩn rotundin (1mg/ml) 1: Dịch chiết bã dược liệu sau l gid 2: Dịch chiết bã dược liệu sau 2 giờ 3: Dịch chiết bã dược liệu sau 3 giờ 4: Dịch chiết bã dược liệu sau 4 giờ 5: Dịch chiết bã dược liệu sau 5 giờ C/10: DD chuẩn pha loãng 10 lần

Hình 3b: Sac ky đồ khảo sát thời gian chiết trên mẫu M

34

Bã dược liệu, sau khi chiết 4 giờ trọng dụng cụ Soxhlet, được chiết tiếp

với 30ml cloroform trong 1 giờ Bốc hơi dịch chiết trên cách thuỷ tới khô, hoà tan cắn thu được trong 2ml pha động, loc qua giấy lọc mịn 0,45m Tiến hành chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao dd thử này với chương trình sắc như đã nêu trong mục 2.3.2.1.c Kết quả cho thấy sắc ký đồ thu được (Hình 3c, 3đ) từ các

dd thử này không thấy xuất hiện píc có thời gian lưu gần hoặc trùng với thời gian lựu của L tetrahydropalmatin chuẩn,

VWDI A, Wavelength=283 nm (DUYENROTUN VW01 A, Wavelength=283 nm (BINHVONROTU

vội sau khi chiết 4 giờ hoàn Balok sau khi chiết 4 giờ

Như vậy, từ các kết quả khảo sát trên, chúng tôi chọn thời gian chiết

nóng trong dụng cụ Soxhtet với 30ml clsroform trong 4 giờ là phù hợp nhất Nếu thời gian chiết xuất kéo đài, sẽ mất nhiều thời gian phân tích một mẫu, tốn nhiệt lượng và có thể sẽ xuất hiện nhiều tạp chất gây ảnh hưởng đến kết quả định tính và định lượng L- tetrahydropalmatin, đặc biệt trong viên hoàn Balok, một chế phẩm đông dược chứa nhiều loại được liệu khác nhau

3.1.4 Nhán xét

Qua kết quả khảo sát các pp chiết L— tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vôi và trong viên hoàn Balok, chúng tôi có thể rút ra một số nhận xét

Sau: