Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS

Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS Nghiên cứu định lượng hợp chất holothurin b trong một số mẫu hải sâm và thực phẩm chức năng có chứa hải sâm ở việt nam bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC MS

NGUYEN BUC HOANG LONG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT

HOLOTHURIN B TRONG MOT SO MAU HAI

SAM VA THUC PHAM CHUC NANG CO CHUA

HAI SAM O VIET NAM BANG PHUONG PHAP

SAC KY LONG KHOI PHO LC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYEN NGANH : KIEM NGHIEM THUỐC & ĐỘC CHẤT

MA SO: 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS.Trần Việt Hùng

PGS.TS Phan Văn Kiệm

TRƯỜNG ĐH DƯỢC HÀ ana

LOI CAM ON!

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Việt Hùng-

Trưởng khoa Vát lý do lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung wong và

PGS.TS Phan Van Kiém- Vién Khoa hoc va Cong nghé Viét Nam, cdc thay

đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng nghiên cứu của Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã quan tâm và tận tình hướng dân tôi

trong quá trình thực hiện đỀ tài này:

Đặc biệt, tôi đã luôn nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ khoa Vật

Lý- Viện Kiém nghiệm thuốc Trung ương: DS Vũ Thị Nguyệt Minh, DS Dương Minh Tân đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các đẳng nghiệp, bạn bè, người thân đã hết lòng động viên và giúp đồ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này!

Học viên Nguyễn Đức Hoàng Long

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

Dược điền Việt Nam III

Diode Array Detector / Photodiode array

Detector mang diode

Electron spray isonization (Nguồn ion hóa phun điện tử)

Food & Agriculture Organisation

(Tô chức lương thực Quốc Te)

Gas Chromatography - Mass spectrometry

(Sắc ký khí ghép khối phổ)

Hiph Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

Liquid chromatography — Mass spectrometry

(Sắc ký lông ghép khối phổ)

Limit of detection

(Giới hạn phát hiện) Limit of quantitation

(Giới hạn định lượng)

Mass spectrometry Khối phố

Pulsed amperometric detection (Detector do xung ampe)

Quadrupole ion Trap (Phan tich bay ion) Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

Selected Reaction Monitoring

(Chọn lọc ion con sau phản ứng) Ultraviolet-Visible

Phổ tử ngoại khả kiến

Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Việt Nam

DANH MUC CAC BANG

Cach pha cac dung dich chuan

Cac thong sé cia khdi phé ding dé xae dinh holothurin B

Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của bolofrin B

Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi chuẩn trên cột DLAION HP- 20

Kết quả định lượng holothurin B trong các mẫu nghiên cứu

Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp LC-MS

Giới hạn phát hiện và giới hạn dinh luong cua holothurin B

trong các đối tượng NC

Mét so loai Hai Sam & Việt Nam: Hải Sâm đen và Hải Sâm cát

Một số món ăn làm từ Hải Sâm

Một số sản phâm có chứa /J4¡ Sâm

Câu trúc hoá học của holothurin B và holothurin A

Một số hợp chất phân lập từ loài Holothuria scabra

Bộ phân tích thời gian bay

Bộ phân tích cộng hưởng 1on cyclotron

Thiết bị LC — MS sử dụng trong nghiên cứu, Máy sắc ký lỏng

khối phổ (LC - MS/MS) Thermo Finigan LCQ Advantage

Max

Thiét bi LC-MS Agilent — Technologies

Mẫu Hải sâm: Huyết đen (a), Môi son (b) và Tà la (c)

Phổ MS của dung dich chuan holothurin B 10 ug/ml trong

methanol, ghi trên thiết bị LC — MS Agilent — Technologies,

Viện KH&CN VN

Phổ MS của dung địch chuẩn Z#ø/o/hrin B 10 ug/ml trong

methanol, ghi trên thiết bị LC - MS Thermo Finnigan LCQ

Advantage Max, Viện KNTTW

Phé MS? cia dung dich chuan holothurin B 10 pg/ml trong

methanol, với mức năng lượng E = 5% ghi trên thiết bị LC —

MS Thermo Finnigan LCQ Advantage Max, Vién KNTTW

Phố MS” của dung dich chuan holothurin B 10 ug/ml trong

methanol, với mức năng lượng E — 10% ghi trên thiết bị LC -

MS Thermo Finnigan LCO Advantage Max, Viện KNTTW

SKD mau C4 (1 |pg/ml) phân tích LC— MS chế độ - ESI SIM

859

Đồ thị biểu điễn mối tương quan giữa nông độ và diện tích

peak cua holothurin B

Kiém tra LOD, LOQ bang dung dich chuan

Sắc ký đồ dung dịch phân doan 1

MỤC LỤC

Trang bìa phụ

Loi cam ơn

Mục lục

Danh mục các chữ viet tat

Danh muc cac bang

Danh muc cac hinh

Trang

CHƯƠNG I TÓNG QUAN 22 s2 CS E231 E31 E311 EEZ1xeEEEerrrerrrrrre 3

1 a RARE BID scecenonnsassivononsnnnsissenssiessoss ins Ais CEA RTA CRELAD PREIS 3 1.1.1 Đặc điểm của Hải SÂNM -.e -ceSct 5< St ‡rkE+tevtxtertertrxterksrerrrrkerrree 3

I2 n7 an 6 6-dHqúẴA,HRHẬH H)HẶ)H 4

LJ COngy ding Crt TIO SGM: ccmcvecsexernssanssavrsnenasntnncenorenanntenereenasenswcrgenrssenindd

LLS Méts6 san phdm cb chiber Gi SG sccsscssscsesssvusszssnavsnsasssnasnssnsnnsxvenssesxeenens 7

1.2 TỎNG QUAN VÉ HOLOTHURIN B -.5 25225csscrsesrtserrrrrree 7

1.2.1 Nhém chat triterpen glycosid chiết xuất từ Hải (Siâm -. «5c: or

122: Bee dit BHBIHHBỀI ununadaiinaasbsttstiEiiitifflGGB103001387000288808840800089 10 1.2.2.1 Tính chất lý hóa s2 12211151511 11212 2221121722223 217212 ce 10 1.2.2.2 Một số công trình nghiên cứu về holothurin B - - 10,

1.2.2.3 Phân lập holothurin B từ nhóm chất triterpen gÌycosid I1

1.3 TONG QUAN VE PHUONG PHAP CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP HỢP

®:/v0:909/)/.000108 12

1.3.1 CHi€t XUGE sscsssesssesessescsessessseanesneesncsnesssssnssseesssenecssesscanecsessssesecscsneesscenesnes 12

1,1 ã FIIẨN HT eee=esennnsibosdtigllikdtbdkbisxslis3SNg2gieislasxEgi2SX4GG088019/388081.R8128450d0 13 1.4 TONG QUAN VE PHUONG PHAP SAC KY LONG KHOI PHO 16

1.4.1 Tổng quan về sắc kí lỏng khối phô 5WgifV0w'SvS3o$i9080050G402058gi691G601S803661408.01300680248g8 16

1.4.2 Một số kỹ thuật LC/MS .cvscccccssssesscsessesseessssssessesssseesessenssensessceescenssseneess 22

1.4.2.1 Kỹ thuật phân tích toàn thang (FULL SCAN) 22 1.4.2.2, Ky thuat phan tich chon Ipe ton (SIM) sssssessssssanceserseceavscrensesssevesses 22

VN san 0 i8 S L.,.H,H, 23

CHƯƠNG II ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 25Š

2.1 NGUYEN VAT LIEU VA THIET BI NGHIEN CỨU 25

2.1.2 Thiết bị, QIÌNG ÚT suggniinniidddiinngataat1LCDEESG410109000/00001111417180530000n91002219)

2.2 ĐÓI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 277

3.3.1 Boi AOS WIEN CU ra 27?

2.2.2 Nội dung và phương pháp nghiÊn CỨU «« -<-s««-ex-xe 200

#3.2.1 Chuẩn Bỉ dụng dịch KhUẨN san naanuaueotiioiaiidtoasgaadtsgasege 200 2.2.2.2 Xử lý mẫt ¿5256122111 1E11111xE1errrrserrrrrrrrrsssrrers 2Ô

2.2.23, Dinh tinh và định lượng bolotiuHtii Ð saeseaseaeoeesaadaeodneassans 322

CHƯƠNG III KẾT QUÁ THỰC NGHIỆM 388 3.1 KHAO SAT DIEU KIEN VA XAY DUNG CHUONG TRÌNH CHẠY

3.1.2 Thiết lập chương trình LC - ÌMẮS - + +©s+St£2Se+texeckrserserrrrrcee 422

3.2 BINH TINH VA DINH LUQNG HOLOTHURIN B TRONG HAI SAM VA TRONG — PHAM CHUC NĂNG .- ¿55s 488

chức năng SeqVie — ÍÏải SẲNHH óc ằc ĂsS SS trhtgrme ng ri rre 499

3.3 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP ii 544

3:3 1: TÌNH EU DĐ tescsvngiiistiooiraGE000000316081409900GE0000990360v999663564604399355a3394310x6a 0788 544

in: an 555,

CHUONG IV: BAN LUAN i cecscccsscsssssessssesssecsssessssesessecssvecsusssseeessseessees 588

4.1 DOL TUQNG NGHIÊN CỨU -2- 552 SseSEeEezttersersreerrrrrr ĐỂ)

4.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨPU .- ¿2 22 S2 SeEx2verxzseccee 58

4.2.1 Qui trivthe xv ly 1G nh ố.ố.ốố 58

Sáu, Ê HƯƠNG DHÁN Ác s WES: scssscscossvsnncensvesseveannecmesessneeswentwevtaneaanesevausavanenve 509

đ4.XÊT 0U NGHI NCU co naaaaeenaaaandaaosouosastaragaasaassai 60

KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ -222222222222222022255e- ối

41800079 007 ¬55344 ÔÒỎ 6L

KIỂ NHI Gaeeieeaeegaatgogtoiiootiboiodio is GIGGSGDNGSGGagEBSgSE.ng0gssenag 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DAT VAN DE

Nghiên cứu tìm kiếm thuốc từ nguồn hợp chất thiên nhiên biến đã được

nhiều nước trên thế giới thực hiện Thông qua các chương trình nghiên cứu này, rất nhiều thuốc mới của các hãng được phâm có nguồn gốc sinh vật biển đã có mặt trên thị trường Một trong những chương trình nghiên cứu đó là chương

trình nghiên cứu về /1đ¿ Sâm và các chất có hoạt tính sinh học quý của nó là

holothurin A, B để làm thuốc, được thực hiện tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VKHCNVN) và đã thu được những kết quả nhất định

Theo y học cố truyền, Hai Sâm có công dụng bổ thận ich tinh, dưỡng

huyết nhuận táo, thường được dùng đề chữa các chứng bệnh như tỉnh huyết hao

tổn, hư nhược, liệt dương, di tỉnh Các y thư cô như Bản thảo nhiếp yếu, Dược

tính chỉ nam, Dược tính khảo đều đã nói đến các công dụng trên của Hải S2m I816M51

Còn theo kết quả nghiên cứu dược lý học hiện đại cho thấy, Hi Sớm có

tác dụng tăng cường sức đề kháng và nâng cao năng lực miễn dịch của cơ thê,

U#!I?' chống mệt mỏi cơ bắp,

ức chế quá trình sinh trưởng của các tế bào ung thư

chống lão hoá, tăng cường hoạt động của thần kinh và tăng phản xạ; tăng tuần

hoàn máu, cải thiện khả năng hấp thụ oxi và chống mệt mỏi cơ tim Hơn nữa, do

chứa rất ít lipid và hau nhu khéng cé cholesterol nén Hai Sdm 1a loại thực phẩm

bồi bổ lý tưởng cho những người bị rối loạn lipid máu và bị các bệnh lý động mach vanh tim I8H9H15HI3H27H301

Hiện nay trên thị trường có một số sản phẩm lưu hành dưới dạng thực phẩm

chức năng có chita Hai Sam: Amorvita Hai Sam (Céng ty cổ phần Traphaco),

Hasamin (Cong ty duge Dong Duong), Seavie-Hai Sam ( Anvygroup) , trong

tiêu chuẩn chất lượng của các sản phẩm trên có công bố hàm lượng holothurin B

nhưng lại không có phương pháp định tính định lượng Do đó việc cần thiết

phải có một phương pháp định tính định lượng hoạt chất ho/o/hurin B trong các sản phẩm nói trên nhằm phục vụ công tác quản lý chất lượng là hết sức cần thiết

Để kiểm nghiệm Dược liệu, thuốc có nguồn gốc Dược liệu hay các sản phâm có

nguồn gốc thiên nhiên khác thì cần thiết phải có các chất chuẩn là các hợp chất

đặc trưng được chiết ra từ Dược liệu Đề tài nhánh đề tài khoa học công nghệ

cấp nhà nước mã số: KC.10.16.07/06-10 “Nghiên cứu chiết suất, phân lập và

tình chế holothurin B từ Hải Sâm làm chất chuẩn phục vụ kiểm nghiệm dược

liệu" có mục tiêu chiết xuất, phân lập và tỉnh chế holorhurin B có độ tỉnh khiết

tối thiêu 95 % tir Hai Sam làm chất chuẩn Nhằm góp phần thực hiện đề tài trên

và dé đánh giá chất lượng một số sản phâm có chứa Hải Sâm trên thị trường

chúng tôi đặt vấn đề: “Nghiên cứu định lượng hợp chát holothurin B trong mot

số mẫu Hải Sâm và thực phẩm chức năng có chứa Hải Sâm ở Việt Nam bằng

phương pháp LC-MS” với các mục tiêu sau:

@ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng hợp chat holothurin B bang

sắc ký lỏng ghép nồi khối phố (LC-MS)

® Ứng dụng phương pháp định lượng holothurin B trong một số mẫu Hai Sam

và thực phâm chức năng có chứa Hải Sám ở Việt Nam

Chuong I TONG QUAN

1.1 Hai Sam

12; [17], [32], [41]

Hinh 1.1 Mot sé loai Hai Sdm & Viét Nam: Hai Sam den va Hai Sam cat

Hải Sâm có tên gọi dân gian là đỉa biến, là tên gọi chung của một số nhóm động

vật biển thuộc lớp Holothuroidea (ngành Echinodermata) sống trong lòng biển

trên khắp thế giới #4? Sâm có thân hình trụ dài, lớp da dẻo, trơn bóng và có

lông hoặc gai san sùi; có những loài có thân trong suốt Trong số hàng trăm loài

chỉ khoảng hơn 10 loài ăn được hoặc dùng làm thuốc Chiều dài của /đi Sâm

trung bình khoảng từ 2.5 em đến 30 em Loài lớn nhật là Synapta maculata có

có thể co giãn tuỳ con vật, giúp chúng có khả năng luồn lách giữa các khe chật

hẹp Vỏ ngôài eủa Hải Sâm eó câu trúe đặt biệt, được tạo bởi những ehất đẻo, eó

khả năng co giãn, không thắm nước giúp cơ thê Hai Sdm có khả năng kiểm soát

được sự nỗi và chịu được áp lực lớn Nhờ đó, chúng có thể sống ở đáy biển hoặc

trôi nôi trên mặt biển Một số loài còn eó khả năng tự vệ bằng cách tiết ra độc tô holothurin có thể giết các sinh vật gần bén chung Hai Sam là loài chuyên ăn xác

chết của động vật dưới biển, là người vệ sinh của biển Thức ăn của chúng là các

loài phù du và các chất hữu cơ tìm thấy dưới bién Hai Sdm sinh sản bằng cách

phóng tỉnh trùng và trứng vào nước biến Tuỳ vào điều kiện thời tiết, mỗi cá thê

có thể sản xuất hàng ngàn giao tử /74¡ Sâm sông rất dày đặc nơi thêm biển dưới đáy sâu: ở độ sâu dưới 8,8 km, Hải Sâm chiếm đến 90% khối lượng sinh vật

Tại vùng biến phía nam của New Zealand loài Squamocnus brevidentis (Strawberry sea cucumber) sống tập trung đông đến 1,000 cá thẻ/mˆ Khoảng

10% sắc tổ trong máu của Hai Sém là vanadium Máu của Hi Sâm có màu

vàng vì có sắc tố yanabin chứa vanadium (tuy nhiên vanabin không có khả năng chuyển vận oxygen, như hemocyanin va hemoglobin) Tại Châu Á, đặc biệt là Trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam A (ca Viét Nam), Hai Sam được xem như

là một loại thực phẩm quý, rất được ưa chuộng nên bị đánh bắt quá mức, hiện

nay đang được nghiên cứu đê nuôi tại các trại Hải Sám

1.1.2 Phạm vỉ phân bố [12], [L7], [28], [36], [41], [46], [50], [51]

- Các vùng biển của Hoa Kỳ thuộc khu vực Thái Bình Dương và Đại Tây Dương

có một số loài Hđi Sâm như : Stichopus Johnsoni thuộc họ Holothuriidae, lớn

khoảng 16-20 cm, gặp trong vùng bién Santa Barbara; Stichopus californicus phan bố từ vùng biển Puget Sound, Washington dén Monterey, California;

Holothuria ƒloridana là loài lớn nhất tại Hoa Kỳ, phân phối nơi vùng san hê

ngoai khoi Florida

- Trung Quốc là nơi tiêu thụ và buôn bán Hai Sdm quan trong nhat Thị trường chính kiểm soát giá và số lượng /đải Sám trên thế giới là Hong Kong, Singapore

va Dai Loan $6 loai Hai Sam ở vùng ven biển Trung Quốc có khoảng 150 loài,

trong đó có một số loài có giá trị cao như: 4posiiehopus japonicus thuộc họ Sticho podidacea phân bố tại vùng Liaoning, Sơn Đông, Hồ Bắc, Giang Tô;

Stichopus chloronotus, phan bé tai ving quanh Hai Nam; Stichopus hermanni quanh Dai Loan, Quang Tay, Quang Déng, Hoang Sa va Truong Sa

- Ngoài ra, Hải Sâm còn phân bỗ ở một số vùng biển khu vực Châu Âu, Đông Phi, Đông Ân Độ Dương, và khu vực Đông Nam Á

- Tại Việt Nam, #ái Sâm có nhiều nhất ở các vùng biến Nha Trang, Khánh Hoà,

Phan Thiết, Côn Đảo Các loài Hải Sâm ở Việt Nam phổ biến như:

+ Holothuria nobilis: Hải Sâm vú, thân hình ống dài đến 40 em, đường kính 5 -

6 cm, mau xam dén nau - den nhat, doc theo lưng và hai bên có những cục thịt u lỗi lên như 2 hàng vú, bụng có nhiều chân nhỏ

+ Actinopyga echinites: Hai Sam mit, than co vách day, giống như quả dưa leo, hình trụ dài, thon ở hai đầu và phình ra ở giữa, đài 20 - 30cm; đường kính 2 - 4

cm Lưng có màu nầu xậm, có nhiều gai thịt nhô lên Bụng có màu nhạt hơn, nhiều chân nhỏ

+ Holothuria seabra: Hải Sâm trắng, thân đài 30 - 40 em, có con dài đến 70 em

Lưng chúng có màu tro sậm, hai bên nhạt hơn, bụng có màu trăng Tập trung

thành những bãi lớn dọc bờ biển, những nơi có vùng thuỷ triều thấp đáy cát và

nhiều rong biển

+ Holothuria vagabonda: Hải Sâm đen, toàn thân màu đen, bụng màu nhạt hơn,

dài đên 50 cm, hay sông nơi ven biên chân núi đá có sóng mạnh

1.I.3 Giá trị dinh dưỡng của Hải Sâm [6], [27], [28], [32]

Hai Sam được khai thác như một nguồn lợi kinh tế Trong đó, Hải Sâm trắng được xem là có giá cao nhất, một con có thể nặng đến 2 kg, giá khoảng 50-60

USD ( khoảng 1 triệu đồng VN) Giá trị dinh dưỡng của Hi Sâm đã được

nghiên cứu khá kỹ tại Trung Quốc Các thông tìn của cơ quan Lương nông Quốc

tế (FAO) đều dựa trên các kết quả từ Viện Nghiên cứu Nghề Cá Hoàng Hải của

Trung Quốc Về mặt dinh dưỡng, /đ¡ Sâm được xem là một thực phẩm bố

dưỡng lý tưởng, chứa nhiều chất đạm (55%), ít chất béo Thành phần chất đạm

gồm nhiều acid amin cần thiết Ngoài ra, “đi Sđm còn chứa nhiều kim loại hiếm

gặp ở các loài thuỷ hải sản khác Ví dụ, loài H.nobilis có chứa các thành phan,

acid amin, cao nhat 1a Glycine (17.8%), Glutamine (11.2%), Alanine (8.4%), va

cdc acid amin chinh yéu nhu Arginine (4.95%), Leucine (2.64%) và đặc biệt

la Taurine (một acid amin có khả năng giúp cho sự tăng trưởng của các tế bảo

não) Ngoài ra thành phần còn có các khoáng chất hiểm như: Chromium (10.1ppm), Đồng (6.1ppm), Strongtium (6 6ppm)

Hình 1.2 Một số món ăn làm từ Hải Sâm

I.!4 Công dụng của Hải Sâm [6], [9], [1Š], [18] [23] [30], [32], [37], [45] a) Trong Y học cổ truyền: Hải Sâm có vị mặn/ngọt, tính ấm tác động vào các kinh mạch thuộc Can và Thận với các tác dụng chính:

+ Bồ thận, trợ dương: dùng để trị các chứng suy nhược vẻ sinh lý, trị di tỉnh

+ Bỗ huyết, chỉ huyết: trị thiếu máu với các triệu chứng mỏi mệt

b) Trong Y học hiện dai

- Hải Sâm là nguồn cung cấp rất tốt các mweopolysaccharides, đã được chứng

mỉnh là có khả năng giúp làm giảm đau và sưng trong các bệnh về xương khớp

- Trong Hải Sám còn có chứa các saponin (các íriterpen glycoside, philonopsid

A ), 66 cầu trúc hoá họe tương tự như các saponin trong Nhân Sâm, Linh Chỉ Các saponin này đã được các nhà nghiên cứu tại Nga, Nhật, Trung Quốc chứng

minh có hoạt tính chống sưng và chống ung thư do ức chế các thụ thể

tyrosinkinase

- Dau béo tir Hai Sam cũng đang được nghiên cứu để chế tạo các dược phẩm

điều trị ung thư do hoạt tính giúp tăng sự hoạt động của men caspase-3

1.1.5 Một số sản phẩm có chứa Hải Sâm

Một số sản phẩm có chứa #!đi Sâm được liệt kê trong hình 1.3

Hình 1.3 Một số sản phẩm có chứa Hải Sâm

- Amorvita Hải Sâm (Iraphaco) với chỉ định: tăng cường sinh lực, yêu sinh lý nam

- Hasamin (CT dược Đông Dương) có chỉ định: tăng cường sinh lực, chống lão

hoá, tăng cường miễn dịch

- Seavie Hải Sâm của Anvy group: thành phần gồm có bột Hải Sâm, bột Hải Mã,

tỉnh chất Nhân Sâm có tác dụng điều hoà thận khí, dưỡng huyết, bồi bố cơ thể, tăng cường miễn dịch

1.2 Tổng quan về holothurin B

1.2.1 Nhóm chất triterpen glycosid chiết xuất từ Hái Sâm [ 12], [24], [25], [29], [38], [39], [40], [42], [45], [47], [49], [52], [53]

- Những triterpen glycosid tir Hai Sam thudng cé phé hoat tinh rộng như độc tế

bào, kháng nấm, tan máu, điều biến miễn dịch Đã có khoảng hơn 100 chất

thuộc nhóm này được phân lập Phần lớn các chất này có khung câu trúc

holostane cơ bản gắn với gốc đường có nhiều nhất là 6 đơn vị nối với cacbon vị

trí số 3 của aglycon Sự khác biệt thường thấy giữa các hợp chất này chủ yếu được tạo bởi sự sai khác giữa các vị trí nổi đôi trong khung, vị trí và số lượng các đường gắn với C-3 của aglycon, cũng như cấu trúc của nhánh bên Thông

qua các thử nghiệm, người ta đã nhận ra rằng sự sai khác về cấu trúc của phần aplycon với gốc đường đều liên quan đến sự thay đổi về hoạt tính kháng nắm

của holostane Cụ thể là các triterpen gắn bốn phân tử đường thường có hoạt tính

cao hơn các triterpen có gắn hai hoặc sáu phân tử đường Những chất có chứa

đường quinovose thường có hoạt tính cao hơn, những hợp chất có nhánh bên dạng mở thường không có hoạt tính cao băng các hợp chất có nhánh bên dạng

vòng Từ đó dẫn đến kết luận là hoạt tính kháng nam của các hợp chất trên phụ

thuộc vào khả năng tạo phức của các phân tử dường với các màng sterol, Ví dụ mỉnh hoạ cấu trúc hợp chất olothurin B là một triterpen gÌveosid cô 2 phân tử

đường, có độ phân cực cao Trong quá trình chiết tách thường xuất hiện cùng vGi cdc hep chat triterpen glycoside khac 1a holothurin A có 4 phân tử đường

cũng như một loạt các hợp chất triterpen glycoside khac Tuy nhién, holothurin

B thường chiếm hàm lượng cao nhất trong các hợp chất Hải Sâm, sau đó mới

Hình 1.4 Câu trúc hoá học của Aolothurin B ¥a holethurin A

- Tại các vùng biển Việt Nam, loài Holohuria seabra sinh sông khá phổ biến và chiêm một tỷ lệ cao so với các loài #đ¡ Sm khác Tuy nhiên, hiện có rất ít các

nghiên cứu về thành phân hoá học và hoạt tính sinh học của loài này trên thê giới và chưa có nghiên cứu nào được tiên hành ở nước ta Dưới đây là một số hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ loài này

1.2.2 Hợp chất holothurin B [21] [22], [33], [35], (381, [39] [48], [52], [54]

1.2.2.1 Tính chất lý hóa

- Công thức phân tử: CaiH¿4O¡;SNa

- Khối lượng phân tử: M = 882

- Dang tha hinh: Tinh thé hinh kim trong Ethanol

'

1 '

Holothurm B là một triferpen glvcosid , độ phần cực cao

1.2.2.2 Một số công trình nghiên cứu về holothurin B [14], [21], [24], [25],

[38], [39], [45], [47] [48], [52]

- Nam 1965 Sobotka da nghién ctru vé holothurin va saponin steroid tit sinh vat

bién

- Nam 1969, Ara Der Marderosian thudc dai hoc Duge Philadelphia cũng đã

phân loại và đề cập tới holorhurin ở chỉ Holothuria

- Năm 1980, cac tac gia V.A.S tonik, A D Chumak, V V Isakov, N I Belo - sortseva, V.Ya Chirva và G B Elyakov cũng đã công bố cấu trúc hoá học của

holothurin B từ loài Holothuria atra

- Nam 2005, cac tác giả Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lê Mai Hương, Phạm

Quốc Long, Nguyễn Hoài Nam cùng một số đồng tác giả trên thê giới đã công

10

bố về công trình nghiín cứu tâc dụng độc tính khâng tế băo ung thư của câc hợp

chất triterpen glycoside từ Holothuria martensii vă từ loăi Hai Sđm trắng Holothuria scabra, trong đó điển hình lă nghiín cứu về o/o/uzin B từ loăi Hải

Sđm đen Holothurin vagabunda

- Năm 2006, cac tac gia Hua Han, Yang Hua Yi, Ling Li, Xiao Hua Wang, Bao

Shu Liu, Peng Sun va Min Xiang Pan 6 D.H Y học Hăng Hai Thượng Hải, Trung Quốc cũng đê công bố về câc chat triterpen glycoside tir Holothuria

leucospilota trong d6 có holothurin B

- Năm 2007, câc tac gid Wei-Hua Yuan, Yang-Hua YI, Mei Xue, Hong-Wei

Zhang, Ming-Ping La đê công bố tâc dụng khâng nắm ctia holothurin B chiĩt

suất từ Holothuria axiloga

- Gần đđy nhất văo thâng 2/2009 lă công trình nghiín cứu của hai nhă khoa học

trẻ Nguyễn Xuđn Cường, Nguyễn Hải Đăng thuộc Viện hoâ học vă hợp chất

thiín nhiín với công trình nghiín cứu về thănh phần hoâ học, hoạt tính của câc hoạt chất ở loăi Hai Sam trang Holothuria scabra 6 Viĩt Nam da phan lap duge

3 hoạt chất Holothurin mới có hoạt tính gđy độc với một số câc tĩ bao ung thu

1.2.2.3 Phđn lập holothurin B từ nhóm chất triterpen glycosid

- Hop chat holothurin B \a mĩt triterpen glycosid (cĩ hai phan ti duĩng) cĩ dĩ

phđn cực cao Trong quâ trình chiết tâch thường xuất hiện cùng với câc hợp chất

triterpen ølycoside khâc lă holothurin A (4 phđn tử đường) vă một số câc hợp chat glycosid khac loai holostan argoside F,, impatienside B va pervicoside D

- Qua trinh chiĩt tach hop chat holothurin B tit hop chat triterpen glycosid dau

tiín phải loại bỏ câc chất bĩo vă câc hợp chất phđn cực trung bình bằng câch

^ See ae 4

chiết băng dung môi elorôform/nướe Phđn tan vắ đung môi hữu eỡ đượe lại

9 Ă s , ~ s Ae ˆ * , + N + ˆ AS

bỏ Phđn dịch nước sẽ được loại muỗi vô cơ bằng câch sử dụng sắc ký cột nhồi

Diaion HP - 20 Sau đó bằng câc phương phâp sắc ký cột sử dụng kết hợp silica

II

gel pha thường và pha ngược thu được các hỗn hợp các hợp chất triterpen glycoside c6 chita holothurin B va holothurin A Hai hop chất này khác nhau 2

phân tử đường, đo đó độ phân cực của chúng cũng khác nhau nên có thê chiết

holothurin B ra khoi holothurin A bang các sắc ký cột với áp suất thường

1.3 TONG QUAN VE PHUONG PHAP CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP HỢP

CHAT HOLOTHURIN B

1.3.1, Chiết xuất [1]

Chiết xuất dược liệu là phương pháp nham lay được các chất có trong dược liệu

dưới dạng tỉnh khiết hay hỗn hợp toàn phần phục vụ cho mục đích nghiên cứu

hoặc điều trị Chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và cách thức chiết Dược liệu dùng để chiết xuất có thê là những bộ phận của động vật,

thực vật, khoáng vật hoặc vi sinh vật Quá trình chiết xuất được liệu chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tô thuộc về thành phan, cau tạo của dược liệu (màng tế bào

dược liệu, chất nguyên sinh, các tạp chất ) dung môi (độ phân cực, độ nhớt,

sức căng bề mặt của dung môi ), kỹ thuật và điều kiện chiết xuất (nhiệt độ

chiết, thời gian chiết, độ mịn của dược liệu ) Có nhiều phương pháp chiết xuất

dược liệu Các phương pháp được phân loại dựa vào các yếu tố khác nhau:

+ Dựa vào nhiệt độ: Chiết nóng và chiết nguội (ở nhiệt độ thường);

+ Dựa vào chế độ làm việc: Chiết gián đoạn, chiết bán liên tục và chiết liên tục;

+ Dựa vào chiều chuyển động tương hỗ giữa hai pha: Chiết ngược dòng, chiết

xuôi dòng

+ Dựa vào trạng thái làm việc của hai pha: Phương pháp ngầm, ngắm kiệt

+ Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt có thé lam rút ngắn thời gian chiết:

siêu âm, phương pháp tạo dòng xóay và phương pháp mạch nhịp v.v

* Chiết xuất nhóm Holothurin: Đặc tính của các sinh vật biển là sông ở những

khu vực có áp suât cao, điêu kiện sông khác hăn so với thực vật Do đó đề chiết

—_— tO

xuất được các hoạt chất từ sinh vật biên, điều kiện đầu tiên là phải phá vỡ được

cấu trúc tế bào của các sinh vật biến Trong các dung môi được lựa chọn thì

dung môi MeOH có khả năng phá vỡ màng tế bào của các sinh vật biển hơn cả

Nên chúng tôi lựa chọn dung môi MeOH và các điều kiện siêu âm và thời gian

chiết dé thực hiện việc chiết hợp chất từ sinh vật biền

1.3.2 Phan lap [1]

Sau khi chiết xuất hợp chất từ được liệu, ít khi ta thu được một chất tỉnh khiết

mà thường là hỗn hợp các chất Phân lập chính là quá trình tách riêng một chất

ra khỏi hỗn hợp Có nhiều phương pháp đề phân lập như: Phương pháp kết tinh

phân đoạn băng các dung môi, phương pháp trao đổi ion, phương pháp sắc ký cột, săe ký lớp mông điều ehế, sẵe ký lỏng điều ehá/ bán điều ehễ Hiện nay,

phương pháp phân lập phô biến hay sử dụng nhất vẫn là sắc ký cột Có thể dựng một số kiểu sắc ký cột với một số cơ chế như: sắc ký pha thuận trên silica gel, pha đảo trên chất nhồi Cạ, C¡s hoặc sắc ký rây phân tử (Size exclusion chromatography, SEC) trên Sephadex®

* Phuong phap phan lap bang sắc ký cột

- Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc các thành phần trong hỗn hợp có độ hấp phụ khác nhau trên chất hấp phụ đó nạp trong cột Chất hấp phụ thường dùng là oxyđ nhôm, s¿//ca-gel dùng cho sắc ký cột, bột cellulose Khi cho dịch chiết vào cột,

Ở phan trên của cột sé tap trung chất bị hap phu manh nhất, còn ở phan dưới của cột tập trung chất kém hấp phụ nhất Tuy nhiên, giữa các phần chưa có sự phân chia thành ranh giới rõ rệt Do đó, người ta phải dùng một dung môi hay một hệ

dung môi thích hợp chạy qua cột để rửa giải các thành phần đó hấp phụ trong

cột,

- Xác định các thông số của cột: Phụ thuộc vào mục đích phải tách sạch hay chỉ

phân loại thành nhóm mà chọn các thông số cột khác nhau Với mục đích phân

tách thành các nhóm, tỷ lệ giữa khối lượng si//ca-gei và chất cần tách (mix

13

se/mehá) khoảng 8-10; dùng cột có kích thước tỉ lệ chiều đài/ đường kính (h/d) từ

10-15; kích cỡ hạt thường dùng là 100-160um với các dịch chiết từ động thực

vật thường có thành phần phức tạp, khác nhau nhiều về tính chất lý, hóa, độ

phân cực, độ hấp phụ, Dùng hạt quá nhỏ sẽ cản trở tốc độ dòng pha động, do

đó tách chậm, có thể còn tắc cột Còn nếu chọn cột dài thì khả năng tách tốt

nhưng thời gian tách lại lâu Thông thường, một cột có kích thước h/d (chiều

dài/đường kính) khoảng từ 10-15 là phù hợp

- Nhôi cột: Có hai cách: Nhồi ướt và nhi khô

+ Nhéi ướt: Cân siliea-gel cho vào một cốc miệng rộng có dung tích thích hợp,

đồ dung môi vào, khuấy đều tay để duôi hết bọt khí và lam silica-gel phan tan

đều trong đúng môi Cột được kẹp đứng, đáy cột đượe lót một lớp bông xốp Đồ

từ từ s//ca-gel đó được trộn đều với dung môi vào cột Sau khi s///ca-gel đó được đưa vào cột, phải đảm bảo cột luôn được ngâm trong dung mỗi vì nếu để khô hay nứt cột thì khả năng tách sẽ kém nhiêu

+ Nhôi khô: Cân siliea-gel vào một cỗc có dung tích thich hop, dé tir tir silica-

gei, sau đó, tiến hành chuyển dung môi vài lần qua cột dé nén chat silica-gel,

đảm bảo độ đồng đều, tránh hiện tượng vón cục hay tạo thành bọt khí

- Đưa chất lên cột: Tùy thuộc vào dạng chất ban đầu mà ta có thể có các cách

phân tán trong si/ca-gel khác nhau Nếu chất ban đầu ở dạng rắn hay keo thì

phải hòa tan trong một lượng dung môi vừa đủ; sau đó trộn đều với một lượng

sica-gel (lượng silica-gel ding hap phu chat không quá 3 lần so với lượng

chất) và trộn đều, để bay hơi hết dung môi Nếu dạng chất ban đầu là chất lỏng

ta chỉ việc trộn s//ica-gel vào và để cho khô Khi đưa chất lên cột, nên để lượng

dung môi trên cột sao cho chỉ vừa đủ ngập lượng chất dính silica-gel cho vao

- Chạy cột: Mẫu chốt trong quá trình chạy cột là lựa chọn và thay đổi dung môi

chạy cột hợp lý để đảm bảo các chất vừa phân tách tốt mà thời gian chạy qua cột

không quá dài Để tách các chất hữu cơ trên si//ea-gei, thường cho chạy dung

14

môi kém phân cực trước, sau đó mới nâng dần độ phân cực của dung môi cho phù hợp với từng phân đoạn hỗn hợp Nếu chỉ dùng một dung môi trong suốt

quá trình chạy sắc ký, tuy có thể tách sạch nhưng mất nhiều thời gian do phải

chờ giữa hai giai đoạn, hơn nữa những phân đoạn cùng bị hấp phụ mạnh sẽ không di chuyên được hoặc di chuyển chậm Vì vậy, với mỗi đoạn ta tăng dần

độ phân cực của dung môi nghĩa là giảm dần độ hấp thụ của silica-gel, các phân

đoạn sẽ di chuyên liên tục vẫn đâm báo phân tách tốt

* Phân lập bằng sắc ký loại theo kích cỡ và việc sử dung Sephadex”

Sắc ký cột loại theo kích cỡ hiện nay được sử dụng phỏ biến nhất trong phan lập

chất ở quy mô phòng thí nghiệm Sắc ký cột phân loại theo kích cỡ (size

exclusion chromatography- SEC) cũng được biết đến với tên là sắc ký rây phan tir (molecular sieve chromatography), sac ky tham qua gel (gel permeation

chromatography) hay sac ky loc qua gel (gel filtration chromatography) SEC

dựa trên sự khác nhau về kích cỡ của các tiêu phân để tách riêng chúng ra bằng

cách sử dụng các chất có kích thước lỗ xốp xác định làm pha cố định Các phân

tử có kích thước nhỏ hơn sẽ đi sâu vào trong khối xốp và bị giữ lại lâu hơn trước khi ra khỏi cột Trong khi đó, các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ ra khỏi cột

nhanh hơn

Sắc ký gel bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1950 nhưng gần 10 năm sau, chất lọc gel dùng làm pha cô định mới ra đời với tên là Sephadex” Đây là pha rắn

dùng đề lọc các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn tan trong nước, Về sau một

số chất gel polystyren có tính ky nước ra đời dùng dé lọc các hợp chất phân tử

lớn tan trong dung môi hữu cơ Sephadex' là tên thương mại của một loại gel có

các dây nối dextran, được sử dụng nhiều trọng sắc ký lọc gel Sephadex” LH-20

được tạo ra bằng cách hydroxypropyl hoa cac hat dextran dé tạo các cầu liên kết hình thành nên một mạng lưới polysaccharid Mang ludi nay trương nở trong

nước hoặc trong các dung môi hữu cơ Tuỳ thuộc vào dung môi được sử dụng,

15

Sephadex” LH-20 thể hiện cả tính ưa nước và ky nước và có thê đạt được độ chọn lọc sắc ký cần thiết cho những ứng dụng nhất định, Khi sử dụng Sephadex” LH-20 trong quá trình phân lập và tinh chế, dé thu được phân đoạn

của một nhóm hoạt chất, thẻ tích mẫu đưa lên cột có thể lên đến 30% tổng thể

tích cột

1.4 TONG QUAN VE PHUONG PHAP SAC KY LONG KHOI PHO

Ham luong holothurin B trong Hai Sdm va cac san phẩm chức năng rất nhỏ

Ngoài ra, trong phân tử của hợp chất này không có những liên kết đôi, nên

không thê định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng với detertor tử ngoại khả

thây có những công bố nào về định tính , định lượng holothurin B trong Hai

%âm Do đó, chúng tôi lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phố (LC-MS) là phương pháp có tính đặc hiệu và độ nhạy cao

1.4.1 Tổng quan về sắc kí lỏng khối phổ [2] [3] [4] [5], [7] [8] [11] [13] [14], [16] [19], [20], [26] [31] [43] [44]

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và kỹ thuật phân tích khối phổ (MS) là hai

kỹ thuật đã ra đời khá lâu Tuy nhiên mãi đến những năm 1970 người ta mới nhận ra lợi ích to lớn của việc kết hợp chúng với nhau, nguyên nhân của sự

chậm trễ này là vấn đề kỹ thuật khi đưa dòng chất lỏng vào hệ thống khói phô có

độ chân không cao Kẻ từ đó đến nay sắc ký lỏng khối phổ không ngừng phát triền và chứng minh được tầm quan trọng của mình trong phân tích

16

w Pha dong

Pha động trong sắc ký lỏng khối phổ thường là các dung môi hòa tan vào nhau

dé có khả năng tách với độ phân giải phù hợp Có hai cách dùng pha động đề rửa

giai:

- Đăng đồng: Các thành phần pha động không thay đổi trong suối quá trình sắc ký

-_ Gradieni: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi, tỷ lệ các thành phân

thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình dung môi Chế độ rửa giải gradient nồng độ thích hợp với những mẫu phân tích gồm nhiều thành

phần có độ phân cực khác nhau nhiều, khi đó chế độ này giúp rút ngắn

thời gian phân tích và tăng độ phân giải,

3 Hệ thẳng bơm

Bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đây pha động từ bình dung môi qua

hệ thống sắc ký Hệ thống bơm trong sac ky long can đáp ứng các yêu cầu:

-_ Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên

- Đảm bảo lưu lượng lap lai trong khoang 0,01 ul - 5,0 mL/phut

- C6 thé chiu duge tác động của nhiều loại dung môi

x* Cội tách và pha fĩnh

Cột HPLC thường được chế tạo băng thép không gi, thủy tỉnh hoặc chất dẻo có

chiều dài 10-30cem, đường kính trong 4-10mm Kích thước của hạt nhồi trong

cot thuong 1a 5-10um Cac chất nhôi thường được sử dụng là Silica gel, nhôm

,

öxyd, pôlyøïe xốp hôặe cdc loai pha đảo C;, Cạ, C¡s

Cột tách sắc ký lỏng yêu cầu phải trơ, có thành phẳng, đồng nhất trên bề mặt và

có thê chịu được áp suất cao

*®' Hệ tiêm mẫu

Mẫu ở dạng lỏng được tiêm thắng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Đây là một ưu

điểm lớn của HPLC vì có thê tách chính xác, độ lặp lại rất cao

*® Hệ thống điều khiển và thu nhận, xử lý dữ liệu

Toàn bộ hệ thống LC/MS được kết nối với máy vi tính đã cài đặt phần mềm

thích hợp, người phân tích giao tiếp với hệ thống qua máy tính trên phần mềm

này để điều khiến, theo dõi quá trình phân tích, nhận thông tin và xử lý thông

tin

* Defecfor khối phổ

Một trong những bộ phận quan trọng nhất trong HPLC là detector Việc sử dụng

khối phổ kế làm detector cho sắc ký đem lại các ưu điểm sau:

-_ Có thể đưa ra những thông tin đặc hiệu về cấu tạo hóa học của chất cần phân tích

18

- (C6 tinh chon lọc, phân tích đúng và chính xác đối tượng phân tích

- Có độ nhạy cao (Phân tích được hàm lượng siêu vết trong mẫu thành phan

phức tạp)

+ Nguyên tắc hoạt động

Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z)

được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Các ion được

tạo thành trong buông ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khôi

trước khi đến detector Tất cả các quá trình này diễn ra trong thiết bị chân

không, áp suất trong hệ dao động từ 10” Pa đến 10” Pa Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thê hiện bằng một số vạch (píc) có cường độ khác nhau tập hợp

lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khôi

lượng phân tử, nhận dạng các chất), xác định cấu trúc và định lượng các chất

# Các bộ phận của detector khối phổ

Hê chân không (áp suất 1ữ-10”Pa)

Nạp mẫu Nguồn ion Phân tích Detector

Hình 1.7 Các bộ phận của detector khối phổ

- Nạp mẫu: Trong LC-MS, bộ nạp mẫu là đầu ra của HPLC kết nỗi với detector

khối phố

- Nguồn ion: Là bộ phận ion hóa mẫu có nhiệm vụ: lon hóa chất cần phân tích, khử dung môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phan tạo ion ở áp suất khí quyển với bộ phận nằm trong chân không sâu, và rút ra ngoài các phân

tử trung hòa, ion khác dấu có thể ảnh hưởng đến phép đo

19

Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, lon hóa hóa học ở

áp suất khí quyền, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp

Kỹ thuật sử dụng trong luận văn này là kỹ thuật ion hóa bằng nguồn ion phun

sương khử solvat hay kỹ thuật ion hóa bằng tia dién - Electronspray ionization,

ESI

Kỹ thuật này như sau:

Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký được đưa vào một ống mao quản bằng kim loại cao thế 3-4kV (điện thế dương ở đầu kim loại tạo ion dương,

và ngược lại), sau đó được phun mịn bằng khí N¿ thoát ra xung quanh ống mao

quản Dưới tác động của điện thế và của dòng khí N; có sự tạo thành những hat

nhuyễn mang điện tích thoát ra từ đầu ống mao quản Trong khí nóng, các phân

tử dung môi bị bốc hơi, các hạt mang điện tích có thể tích nhỏ dần và do sự đây

nhau giữa các điện tích cùng dấu sẽ vỡ dần thành những hạt nhỏ mang điện tích Sau đó các ion đương hoặc âm tạo thành được đưa vào bộ phận tách ion qua một

cửa rất nhỏ, dung môi và khí Nạ bị bơm hút ra ngoài

- Bộ phân tích khối: Bộ phân tích khối được coi là quả tìm của máy khối phổ

có nhiệm vụ tách các ion có tỉ số m/z khác nhau thành những phân riêng biệt

Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để

đi đến detector Bộ phân tích khối trong luận văn này là bộ phân tích bẫy ion tứ

cực (Quadrupole ion trap) Thế xoay chiều tần số radio áp vào cực trung tâm sẽ

đưa các ion vào chuyển động tròn trong hốc với quỹ đạo ôn định Bằng cách

thay đôi thế xoay chiều làm cho cdc ion eó m/z xác định chuyền động theo quỹ

đạo không ổn định rơi vào cực phía dưới bẫy Bộ phận nhận electron của detector sé thu nhận và phát hiện ion

want 10 oP ate Frica WfSeoeoytrdote đọ †——> :

Hình 1.13 Bộ phân tích cộng hưởng ion

cyclotron

- Bộ phận phát hiện ion: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu

Hình 1.12 Bộ phân tích thời gian bay

điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ Hiện có hai dạng truyền thống: Nhân

electron và nhân quang, trong luận văn này, bộ phận phát hiện ion là dạng nhân electron

1.4.2 Một số kỹ thuật LC/MS [7], [8] [10] [26] [34]

1.4.2.1 Kỹ thuật phân tích toàn thang (EULL, SCAN)

Với một hỗn hợp nhiều chất, sau khi được tách ra qua cột sắc ký lỏng và đưa

vào detector khối phổ, khối phổ kế ghi nhận tổng cường độ các ion sinh ra từ mỗi chất Ta có một sắc đồ toàn ion TIC (Total lon Chromatogram) và phổ khói

được lấy toàn bộ các ion (FULL SCAN)

FULL SCAN cho đầy đủ thông tin về chất phân tích hơn, tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy không cao, nhiễu đường nền có thể lớn

1.4.2.2 Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion (SIM, Selected Ion Monitoring)

Kỹ thuật này chỉ cho khối phổ kế nhận diện một ion và ghi sắc đồ theo thời

gian Kỹ thuật SIM có có tác dụng làm giảm bớt nhiễu đường nền và do đó tăng

độ nhạy, tức tăng tỷ lệ tín hiệu S⁄N

Kỹ thuật SIM nhay hon FULL SCAN

22

1.4.2.3 Kỹ thuật MS/MS

Trong kỹ thuật MS/MS một ion chọn lọc ở chế độ MS lần 1 được phân tích tiếp bang cách sử dụng năng lượng bẻ gãy, tạo ra một hoặc vài ion con đặc trưng ở

chế độ phân tích MS lần 2

Kỹ thuật MS/MS được sử dụng để tăng độ chọn lọc và tăng độ nhạy do làm

giảm nhiễu đường nên rất đáng kê

* Nguyên tắc:

Phân tích khối phổ là phương pháp nghiên cứu các chất băng cách đo chính xác

khối lượng phân tử chất đó Chất phân tích được chuyền thành trạng thái hơi, rồi được chuyền thành ion bằng phương pháp phân tích tích hợp Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích của khói phô ké Tuy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối phố ion đương hoặc âm Các khối phố kế đều nằm trong môi trường chân không cao

* Thiết bị:

Hệ thống thiết bị gồm máy sắc ký lỏng (bao gôm hệ thông bơm pha động, bộ

phận tiêm mẫu, cột sắc ký ) kết nối với detector khối phổ ( bao gồm bộ phận nạp

mẫu là đầu ra của máy sắc ký lỏng, bộ phân ion hoa, bd phận phân tích khôi, bộ

phận phát hiện ion ) và thiết bị ghi phân tích dữ liệu

- Định lượng: Việc so sánh độ lớn tín hiệu thu được từ peak chuẩn và peak thử (

diện tích peak hoặc chiều cao peak) trong mối tương quan với nông độ hoạt chất trong cùng một điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép thử định lượng Từ

dãy chất chuẩn ở trên tiến hành xây dựng đường chuẩn thu được đường chuẩn

23

có dạng y = ax+b với y là nồng độ và x là diện tích peak Hàm lượng của

holothurin B trong nhóm thử sẽ được nội suy theo đường chuẩn trên với sự hỗ trợ của phần mềm Chemsation đi kèm theo máy

24

Chương II ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYEN VAT LIEU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

211 Hod chat va dung méi

- Chat chuan holothurin B déi chiéu héa hoc, (Vién Kiém nghiệm thuốc Trung

uong), ham lugng 96,17 % tinh theo nguyén trang

- Dung môi tỉnh khiết phân tích: ethanol, methanol, cloroform, ether dầu hỏa,

n - hexan, acefon

- Cột trao đổi anion manh Diaion HP - 20 (Mitsubishi Chemical Co ltd., Tokyo,

Japan, kích thước 10 x 300 mm, lugng nhya uot 10 g)

- Dung méi tinh khiét dùng cho sac ki: Methanol (Merck), nước, acid

trifloroacetic (TFA), aceton, acetonitril vv

2.1.2 Thiét bj, dung cu:

- May sắc ký lỏng khối phổ Thermo - Finnigan LCQ Advantage Max, detector PDA và MS/MS (Khoa Vật lý đo lường, Viện KMNTTW), hình 2.1

Hình 2.1: Thiết bị LC - MS sử dụng trong nghiên cứu, Máy sắc ký lỏng khối

phổ (LC - MS/MS) Thermo Finigan LCQ Advantage Max

25

- Máy sắc ký lỏng khối phé Agilent-Technologies, detector MS/MS (Vién

- Máy lắc siêu âm

- Cân phân tích Mettler AB204 (Thụy Sĩ)

- Sinh hàn

- Thiết bị cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (máy cất quay)

- Bình nón, bình định mức, pipet, cốc có mỏ và các dụng cụ thủy tính khác

26

2.2 ĐÓI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối trợng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là holouzin B8 có trong một số loài Hải Sâm đen và một

số thực phẩm chức năng có chứa holothurin B

- Đề tiến hành nghiên cứu, chúng tôi sử dụng:

+ Hải Sâm đen: gồm 3 mẫu Huyết đen (ký hiệu MI), Môi son (M2) và Tà la

(M3) Hàm lượng holothurin B trong Hải sâm được tính theo tỷ lệ 2% trên mẫu

đã loại bỏ ruột và sấy khô ở 100°C đến khói lượng không doi Cac mau Hai Sâm

nghiên cứu được cung cấp bởi Viện Hóa Sinh Biên- Viện KHCNVN

27

Hình 2.3 Mẫu Hải sâm: Huyết đen (a), Môi son (b) và Tà la (e)

28

+ Sản phẩm viên nang mem Seavie - Hải Sâm (Công ty CP Anvy), số lô

011205, ngày sản xuất 10/12/2008, HSD 11/2010, có công thức:

2.2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

* Chuẩn bị mẫu chuẩn

- _ Dưng dịch chuẩn gốc:

+ Dung dịch chuân géc holothurin B trong methanol I mg/ml! (Dung

dịch chuẩn gốc A, I mg/ml): Can chinh xác 20,8 mg chất đối chiếu

holothurin B vào bình định mức 20 ml, thém khoang 15 ml methanol, lắc đều cho tan, thêm methanol vừa đủ, lắc đều Bảo quản dung dịch

này trong tủ bảo quản ở nhiệt độ từ 2 — 8C

+ Dung dịch chuân B (100 ng/ml): Hút chính xác ! ml dung địch A,

thêm methanol vừa đủ 10 ml, lắc đều, được dung dịch chuẩn gốc

100ug/ml

+ Dung địch chuẩn C (10 ug/ml) Hut chinh xac I ml dung dich B, thém

methanol vira di 10 ml, lắc đều Dung dịch nay duge str dung dé tune

máy (hiệu chỉnh tín hiệu) tối ưu hóa điều kiện bắt ion và để khảo sát

mảnh phổ của holothurin B

-_ Đẩy chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc pha day dung dịch chuẩn trong pha động

có nồng độ 0.1 jig/ml; 0,25 jig/ml; 0,5 g/ml; 2,5 ug/ml; 1! jig/ml va 5 pg/ml

29