Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam

Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam Nghiên cứu tính đa dạng thực vật và thành phần hóa học của các loài trong chi gymnema r BR ở việt nam

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM HÀ THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG THỰC VẬT

VA THANH PHAN HOA HOC CUA CAC LOAI

TRONG CHI GYMNEMA R.BR O VIET NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI, 2012

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM HÀ THANH TÙNG

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG THỰC VẬT

VA THANH PHAN HOA HOC CUA CAC LOAI TRONG CHI GYMNEMA R.BR O VIET NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CÔ TRUYÊN

Nơi thực hiện đề tài : Bộ môn Thực vật

Thời gian thực hiện : Từ 12/2010 đến 10/2012

HÀ NỘI, 2012

LOI CAM ON

Trong quả trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự ủng hộ và tạo điều kiện của Đảng ủy, Ban giảm hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội và Bộ môn Thực vật nơi tôi công tác và học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn và TS

Trần Thế Bách là những người Thây đã hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý bảu trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn các ẩơn vị, cơ quan đã hợp tác và hỗ trợ

nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trinh thực hiện luận văn: Bộ môn Kỹ thuật

di truyền — Viện Di truyền nông nghiệp; Phòng thí nghiệm Dược liệu — Khoa Dược Đại học Quốc gia Seoul, Phòng tiêu bản — Viện sinh thái và tài nguyên

sinh vật, Phòng tiêu bản — Đại học quốc gia Hà Nội,

Đề hoàn thiện luận văn, tôi không thể quên sự giúp đỡ chân thành của

các thay cô và các anh chi đồng nghiệp tại Bộ môn Thực vật và các Bộ môn,

phòng ban trong Nhà trường

Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân luôn giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thiện luận văn Xin chân thành cảm ơn tắt cả sự giúp đỡ quý báu này!

Acid Deoxyribo Nucleic

Amplified Fragment Length Polymorphisms

(Tính đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân bản) Cetyl trimethylammonium bromide

Deacylgymnemic acid

Đái tháo đường

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

Gymnema

Phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

(Low density lipoprotein — Lipoprotein tỷ trọng thấp)

National center for biotechnology Information

(Trung tâm quốc gia về công nghệ sinh học Hoa Kỳ)

Oral Glucose Tolerance Test

(Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống)

Polymerase Chain Reaction (Phan tmg chu6i tring hgp)

Poly (vinyl pyrrolidone)

Random Amplification of Polymorphic DNA (DNA da hinh khuéch dai ngau nhién)

Sodium dodecyl sulfate

Streptozotocin

Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages

Very low density Lipoprotein (Lipoprotein ty trong rat thap)

Phong tiéu ban dai hoc quốc gia Hà Nội

Phòng tiêu bản thực vật, Viên sinh thái tài nguyên sinh vật Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

Vi tri phan loai cla chi Gymnema R.Br

Danh sach tén loai thye vat thudc chi Gymnema R.Br

theo “The Plant list”

Phân bố các loài Gymnema R.Br ở một số nước

Khóa phân loại các loài Gyznnema R Br ở Việt Nam

Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu

Đặc điểm hình thái các loai trong chi Gymnema R.Br

Các thành phần cơ bản của phản ứng PCR

Các môi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

Các đặc điểm vi phẫu phân biệt giữa các loài trong chỉ

Gymnema R.Br

Các đặc điểm vi phẫu lá phân biệt giữa các loài trong

chi Gymnema R.Br

Tỷ lệ băng đa hình của các môi nghiên cứu

Tỷ lệ GX4 định lượng trong các mẫu nghiên cứu

Các loài trong chi Gymnema R.Br cng bé trong cdc

tài liệu ở Việt Nam (đối chiếu tên chính thức theo The

Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập được từ

Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Sơ đồ phản ứng thủy phân acid gymnemic tạo Gymnemagenin

Quy trình tối ưu hóa chiết xuat GS4 tir Gymnema sylvestre

(Retz.) R Br ex Schult

| Quy trình chiết xuất phân đoạn và thủy phân các mẫu

trong nghiên cứu

_ Đặc điểm hình thái Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex

Các băng điện di của của các mẫu với mỗi OPAH17

Sắc ký đồ HPLC dịch chiết methanol 8 mẫu nghiên cứu

khai triển với hệ ACN:H¿0 (grandient 10-90%), thời gian

30 phút

Dinh tinh gymnemagenin trong các phân đoạn cthylacetat

va n-butanol trong mau Gymnema latifolium Wallich ex

MUC LUC

Danh mục chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

CHƯƠNG 1: TÖNG QUAN .-ccccccccc 2c si 3

1.1 Nghiên cứu vé thye vat chi (Gymnema R.Br.) trên thế giới 3

1.1.1 Nghiên cứu về thực vật - ccc ni 3 1.1.2 Nghiên cứu về đa dạng di truyền .- - : 7

1.1.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học .ccccc cà: 9 1.1.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học .:‹ :- 12

1.1.5 Các nghiên cứu chuẩn hóa thành phần tác dụng 14

1.2 Nghiên cứu chỉ Gynnema R.Br ở Việt Nam 16

1.2.1 Nghiên cứu về thực vật cccc nen l6 1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học . ‹ - 17

1.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học .- - c<¿ 19 1.2.4 Các vấn đề tồn tại cu nhớ 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứỨu . 21

2.2 — Địa điểm nghiên cứu con xa 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Nghiên cứu hình thái và giải phẫu . . 23

2.3.2 Nghiên cứu da dang di truyền "¬ 25 2.3.3 Nghiên cứu hóa học .cccẰ cà 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU 32

3.1 _ Đặc điểm thực vật và đa dạng sinh học của Gymnema R.Br 32

3.1.1 Đặc điểm chung của chỉ Gymnema R.Br 32

3.1.2 Đặc điểm hình thái các loài trong chỉ Gymnema R.Br 33

3.1.3 Cấu tạo giải phẫu các loài trong chi Gymnema R.BI 40

3.1.4 Da dang di truyền các loài trong chi Gymnema R.Br 45

3.2 Thành phần hóa học của các loài trong chi Gymnema R.Br 49

3.2.1 So sánh thành phần hoá học các mẫu nghiên cứu 49

3.2.2_ Định lượng GX4 trong các mẫu nghiên cứu 51

3.2.3 So sánh thành phần phân đoạn GX4 trong các mẫu nghiên cứu 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .- c- ccccc Sẽ 54 4.1 Về đặc điểm thực vật và đa đạng sinh học 34

4.1.1 Về đa dạng các loài trong chỉ Gymnema R.Br ở Việt Nam 34

4.1.2 Đa dạng mẫu thu trong nghiên cứu .-. - 56

4.1.3 Xác định tên khoa học của các mẫu thu được trong nghiên cứu 57 4.2 Về đặc điểm cấu tạo giải phẫu ‹- cc cà 57 4.3 VỀ đa dạng di truyền .- Lí SH se 38 4.44 Về thành phần hóa học .- cc-cccc cc sen 60 KẾT LUẬN -.- CC ST nh TH nh nh nen nha 64 | Co 8 Cs nh 64 2 DE XUAE na .a.<4 64

Tài liệu tham khảo

Phụ lục 1: Bản đồ phân bố các mẫu thu trong nghiên cứu

Phụ lục 2: Đặc điểm hình thái của chỉ Gymnema R.Br

Phụ lục 3: Chỉ số đồng dạng di truyền Nei&Li của 27 mẫu nghiên cứu

DAT VAN DE

Day thia canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) da duge nền y học cô truyền An D6 Ayurveda str dung tir hon 2.000 nam để điều trị Đái tháo đường (ĐTĐ) [69] [72] Dựa trên kinh nghiệm này, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành xác định nhóm hoạt chất chính đem lại tác dụng của dược liệu này là các acid gymnemic [60][66] Tuy nhiên việc tách chiết acid

gymnemic ở quy mô lớn để ứng đụng chữa bệnh cho đến nay còn nhiều khó

khăn do chi phí cao nên đã giới hạn việc sử dụng nhóm đơn chất này trong thực tế Vì thế, một định hướng nghiên cứu được liệu này là tách chiết GS4,

là phân đoạn các saponin triterpenoid phân lập từ dịch chiết toàn phần của cây [54, 55] Khả năng tách chiết đơn giản có thê ứng dụng trên quy mô lớn cùng với việc hiệu quả hạ đường huyết được chứng minh trong các nghiên

cứu và đã mở ra hướng ứng dụng rộng rãi GS4 trong nghiên cứu phát triển

sản phẩm thuốc thảo được từ Dây thìa canh

Tại Việt Nam, các nghiên cứu liên quan loài Dây thìa canh (Gyzmnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) có nguồn gốc trong nước đã được thực

hiện từ năm 2008 [18] và từ đó một số sản phẩm từ dược liệu này đã được

phát triển nhằm phục vụ nhu cầu sử dụng trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường

bước đầu đã được thương mại hóa như Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma), Tainsulin (Dược Nhân Hoà), Gygurmar (TC-Pharma), Bitabet

(Hataphar), Ayubes (K-Link), Trong bối cảnh đó, các nghiên cứu liên

quan dược liệu này ngày cảng quan tâm hon phân đoạn GS4 nhằm đáp ứng những nhu cầu sản phẩm có chất lượng điều trị cao của thị trường [10] Bên cạnh đó, một xu hướng mới đang được các nhà khoa học quan

tâm áp dụng là tìm kiếm, sàng lọc tác dụng điều trị đái tháo đường tương tự

Dây thìa canh từ các loài trong cùng chi Gy7nnema R Br Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các loài cùng một bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau đo đó có xu hướng có cùng tác dụng sinh học giống nhau [3] Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết tương tự cũng có 6 cdc lodi Gymnema montanum Hook

[21][50], Gymnema_ inodorum (Lour.) Decne [57][58], Gymnema

yunnanense Tsiang [70],

Cho dén nay các nghiên cứu trong nước được thực hiện trên 2 loài là Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [18] va Gymnema latifolium Wallich ex Wight [14] Các nghiên cứu này bước dau đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết của nguồn gen các loài này thu ở trong nước Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào được thực hiện một cách hệ thống về tính đa dạng thực vật các loài trong chỉ Gymnema R.Br và thành phần các phân đoạn GX4 (là phân đoạn giàu saponm triterpenoid của các loài trong chi Gymnema được phân lập theo quy trình tương tự như quy trình phân lập GS4 của Dây thia canh Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu đa dạng thực vật và thành phần hoá học của các loài trong chỉ Gymnema R.Br ở Việt Nam” được thực hiện với các mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm thực vật, cầu tạo giải phẫu và xác định tính đa dạng di truyền của các loài trong chỉ Gymnema R Br ở Việt Nam

2 So sánh thành phần hóa học và định lượng phân đoạn G4 của các nhóm mẫu đa dạng thực vật đã được xác định

CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 NGHIEN CUU CHI (GYMNEMA R.BR.) TREN THE GIOI

1.1.1 Các nghiên cứu về thực vật

1.1.1.1 VỊ trí phân loại

Lich sir phan loai cua chi Gymnema R.Br gan lién voi lich sit quan điểm phân loại của hai họ Thiên lý (Asclepiadaceae) và họ Trúc đảo (Asclepiadaceae) Trong đa số các tài liệu phân loại thực vật kinh điễn, chi Gywmnema R.Br được xếp trong họ Thiên lý (Asclepiadaceae) [23][25] Tuy nhiên, theo hệ thống phân loại công bố năm 2009, Takhtajan đã theo quan điểm của Hallier (1905, 1912), Stebbins (1974), Thorne (2006), Endress &

Bruyns (2000) va Endress & Stevins (2001) để nhóm Apocynaceae và

Asclepiadaceae thành một họ duy nhất, và theo đó Gymnema R.Br trở thành một chi trong phân họ Asclepiadoideae của một họ lớn là Apocynaceae (Hình 1.1) Quan điểm gộp này dựa trên giả thuyết của Cronquist về sự tiến

hóa thẳng trong cấu tạo hoa của Apocynaceae và Asclepiadaceae, cụ thế từ phân họ Plumerioideae đến lần lượt các phân họ Apocynoideae,

Periplocoideae, Secamoneae và cuối cùng là phân họ Asclepiadoideae [67]

Cho đến nay quan điểm thứ 2 được thừa nhận rộng rãi trong các hệ

thống phân loại quốc tế [68]

Bang 1.1: Vi tri phan loai cua chi Gymnema R.Br

Hình 1.1: Giả thuyết về sự tiến hóa thẳng trong cấu tạo hoa của các

phân họ trong Apocynaceae và Asclepiadaceae [63 |

1.1.1.2 Đặc điễm thực vật của chỉ Gymnema R.Br

Cây leo, không có rễ phụ trên thân Lá mọc đối, không nạc Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm Hoa nhỏ Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài

có tuyến, ít khi không có tuyến Tràng hình bánh xe; thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai vặn phải Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng, thường có các hàng lông xếp đọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2

ô, có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phân không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn

có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi

ô phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dang vòi nhụy Cột nhi - nhụy hình ống nhọn đầu [23][34]

1.1.1.3 Các loài thuộc chỉ Gymnemau R.Br

Dy an “The plant list” thyc hign b61 Royal Botanic Gardens, Kew va Missouri Botanical Garden khởi động từ năm 2010 đã xác định 103 tên loài thudc chi Gymnema R.Br thu thập từ các cơ sở đữ liệu khác nhau trên thế giới trong đó có 49 tên khoa học được chấp nhận (47,6%), 31 tên được xắc

định là tên đồng nghĩa (30,1%) và 23 tên chưa xác định được chính xác thông tin (22,3%) Danh sách các tên được chấp nhận theo The plant list

được trình bày trong Bảng 1.2 Một điểm đáng lưu ý theo danh sách này là loai Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult phé bién trong chỉ được xếp

là tên đồng nghĩa của loài Ä⁄2rsđenia sylvestris (Retz.) P.I.Forst [68] Bảng 1.2: Danh sách tên loài thực vật thuộc chỉ Gyznnema R.Br theo

“The Plant list” [68]

Bảng 1.2: Danh sách tên loài the vat thudc chi Gymnema R.Br theo

“The Plant list” [68]

Tên các loài trong chi Gymnema R.Br được chấp nhận Gymnema lacei Craib

| Gymnema lactiferum (L.) R.Br ex Schult

| Gymnema latifolium Wall ex Wight

Gymnema littorale Blume

Gymnema longiretinaculatum Tsiang

Gymnema lushaiense M.A.Rahman & Wilcock

| Gymnema macrothyrsa Warb

Gymnema maingayi Hook.f

Gymnema mariae Schltr

Gymnema micradenium Benth

| Gymnema molle Wall ex Wight

Gymnema montanum Hook.f

Gymnema muelleri Benth

| Gymnema pachyglossum Schltr

| Gymnema piperii Schltr

| Gymnema pleiadenium F Muell

| Gymnema recurvifolium Blume

| Gymnema rotundatum Thwaites

Gymnema rufescens Decne

| Gymnema schlechterianum Warb

Gymnema spirei Costantin

Gymnema suborbiculare K.Schum

Gymnema syringaefolium (Decne.) Costantin

| Gymnema thorelii Costantin

| Gymnema tricholepis Schltr

Gymnema trinerve R.Br

Bảng 1.2: Danh sách tên loài the vat thudc chi Gymnema R.Br theo

“The Plant list” [68]

Phân bố của chỉ Gymnema R.Br khá rộng, ở vùng Tây châu Phi đến Australia, châu Á [12] Trong thực vật chí Trung Quốc, Tsiang và cộng sự đã

mô tả và xây dựng khóa phân loại chỉ Gymnema R.Br [23] Nam 2011, Jingyun Fang và cộng sự đã công bố bán đồ phân bố của 7 các loài Gymnema R.Br tai Trung Quốc [32] Các tài liệu thực vật, Thái Lan ghi nhận có 3 loài,

Ấn Độ có 2 loài , Indonesia 2 loai va Lao [31], Đài Loan có 1 loài [34] Sự phân bố một số loài trong chỉ Gyzmnema R.Br ở một số nước Châu Á được trình bày tóm tắt trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Phân bố các loài Gynnema R.Br ở một số nước

Tổng số loài | 7 |3l212 1| L1Ị

1.1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của chỉ Gymnema R.Br.

Các nghiên cứu đa dạng di truyền hiện được tập trung nghiên cứu trên

loai Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult sử dụng các chỉ thị phân tử

khác nhau nhv isozyme [62], RAPD[53][62], ISSR[53] va AFLP[43] Trình

tự ADN của mét sé loai trong chi gm Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult., Gymnema inodorum (Loureiro) Decaisne đã cơng bố trên Blast [64] Padmalatha (2006) đã nghiên cứu tối ưu hĩa quy trình chiết xuất ADN từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult st dung phuong phap CTAB cai tién dat ham lugng ADN 1-2 pg/pl ti 1g mé 14 Quy trinh RAPD

sử dụng nồng độ cao MgCl; (3 mM), nồng độ thấp mơi (0.5 uM) và Tag

polymerase (0.2 đơn vị), 50 ng khuơn ADN với nhiệt độ gắn mơi 37°C được chứng minh cho kết quả tách ADN tối ưu nhất [44]

Smita Nạr và cộng sự đã phân tích tính đa đạng di truyền của 18 mẫu Gymnema thu ở các vùng khác nhau của Kerala (An Ðộ) sử dụng chỉ thị

1sozymes và RAPD Trong nghiên cứu, 3 hệ enzyme malate dehydrogenase, esterase, và RUBISCO đã khảo sát, trong đĩ 5/8 locus (62.5%) cho biéu hién

đa hình, trong đĩ hệ enzym RUBISCO khơng cho biểu hiện đa hình giữa các

mẫu nghiên cứu Trong nghiên cứu RAPD thu được 123 băng ADN sử dụng

15 mỗi ngẫu nhiên Trong đĩ cĩ 90 băng đa hình (73.2%) Chỉ số Jaccard trong khoảng 0.72 - 0.85 cho thấy mức độ khác biệt giữa các mẫu khảo sát

[62]

Trong một nghiên cứu khác trên mối quan hệ di truyền của 22 quan thé Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult phan b6é & ving Maharashtra (Ân Độ) sử dụng 2 chỉ thị phân tử RAPD va ISSR cho thấy cĩ sự khác nhau

ở mức độ cao (GST = 0.41 theo chỉ thị ISSR va Nm = 0.92 dựa trên chi thi

RAPD) [53]

Mức độ đa hình cua 20 mau Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex

Schult được đánh giá bằng chỉ thị AFLP sử dụng phan tng Multiplex PCR phối hợp 64 (8x8) mơi 14 kết hợp mỗi được xác định là phù hợp nhất với

485 (28.7%) là đặc trưng riêng cho một mẫu riêng biệt Số băng cho mỗi cặp

mồi từ 55-225, trong đó băng đa hỉnh trong khoảng 34 (E-ACC/M-CAC) đến

157 (E-AGG/M-CAG) và các băng đặc trưng của mỗi mẫu quan sát được trong khoảng 8 (E-ACC/M-CAC) tới 69 (E-AGG/M-CAC) Các cặp mỗi E- AGG/M-CAC, E-AGG/CTG, E-AGG/CAG va E-ACA/CAT cho nhiều

thông tin về đa đạng di truyền nhất Hệ số đồng dạng di truyền giữa các mẫu trong khoảng 0.212 tới 0.731 [43]

1.1.3 Các nghiên cứu về tác dụng sinh học

Tổng hợp tài liệu 202 tài liệu công bố tra cứu với từ khóa “Gymnermna”

từ thư viện Y học quốc gia Hoa Kỳ NCBIỊ, tại thời điểm thực hiện nghiên cứu này có 4 nước đang quan tâm tới những tác dụng sinh học của các loài trong chi Gymnema R.Br là Mỹ, Nhật, Trung Quốc, Ân Độ Các nghiên cứu

đã tách biệt theo hai xu hướng:

Xu hướng 1 (chiếm khoảng 50%): Gồm có Trung Quốc và Ấn Độ Hai quốc gia này đang đi sâu nghiên cứu nhằm phân lập và chuẩn hóa các thành phần có tác đụng hạ đường huyết, tiếp tục đi sâu nghiên cứu về tác dụng và

cơ chế phân tử của Gymnema sylvesire (Retz.) R Br ex Schult

Xu hướng 2 (chiếm khoảng 50%): Gồm có Mỹ và Nhật Hiện tại mỗi quan tâm của hai quốc gia này là nghiên cứu các công thức kết hợp Gymnema syivesire (Retz.) R Br ex Schult với các thành phần khác như các chất chống oxy hóa trong các chế phẩm giảm béo Một trong những hướng đi duoc quan tam gan day 1a nghién ctu Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult làm thực phẩm chức năng giúp kiểm soát đường huyết và lipid máu 1.1.3.1 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các loài thuộc chỉ Gymnema R Br

Tác dụng hạ đường huyết được tập trung nghiên cứu trên cây Dây thìa

canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult) dya trén kinh nghiém st dụng lâu đời của nền Y học Ayuveda của Ấn Độ [26] Các nghiên cứu được thực hiện từ thăm dò dược lý, xác định cơ chế tác dụng của dịch chiết toàn

phần, phân đoạn tác dụng GS4 hoặc từ đơn chất có tác dụng chính là acid

gymnemic Một số bằng chứng khoa học cho việc sử dụng trên lâm sảng

bước đầu đã được nghiên cứu chứng minh Một số kết quả nghiên cứu về tác

dung ha dwong huyét cua Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult di được thực hiện:

Chế độ ăn có chứa bột lá Gymnema syivesire (Retz.) R.Br ex Schult với liều 500mg/chuột/ngày trong 10 ngày có tác dụng bảo vệ đáng kế đối với chuột gây ĐTĐ thực nghiệm bằng beryllium nitrat và đưa mức đường

huyết trở về mức bình thường sau 4 ngày so với 10 ngày ở lô chuột không

duge dung Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult Tuy nhién, ở 16 chuột bình thường được cho ăn bột lá trong 25 ngày thì mức hạ đường huyết không có ý nghĩa thống kê [45]

Dịch chiết nước GS3 và GS4 cia 14 Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult với liều 20mg/ngày trong 20-60 ngày làm cân bằng mức đường huyết ở chuột cống được gây ĐTĐ thực nghiệm bằng streptozotocin (STZ) do phục hồi tế bào B đảo tụy Dịch chiết làm tăng gấp đôi số lượng đảo tụy và tế bào B [54]

Thí nghiệm với GS4 điều trị lặp lại trong 32-35 ngày với liều 1g/kg/ngày

ở chuột cống bình thường và chuột được gây ĐTĐ nhẹ bằng STZ liều 30mg/kg cho thấy sự giảm đường huyết có ý nghĩa thống kê trong thử nghiệm dung nạp glucose bằng đường uống (OGTT) và không có bất cứ một biến đôi có ý nghĩa nào tới kháng thể kháng insulin [42]

Thử nghiệm lâm sàng trên 27 bệnh nhân ĐTĐ typ I được cho uống cao GS4 400mg/ngày cùng với điều tri bang insulin cho thay nồng độ đường huyết, HbA1C (Glycosylated hemoglobin AC), protein glycosylate huyết tương hạ thấp nhanh chóng và giảm lượng insulin cần dùng Lipid máu giảm về mức gần bình thường [55]

Trong một thử nghiệm khác, 22 bệnh nhân ĐTĐ typ II được cho uống cao

GS4 400mg/ngày trong 18-20 tháng kết hợp với thuốc điều trị tiêu đường

Nhóm được điều trị có sự giảm đường huyết và HbA1C đáng kể và tăng

lượng insulin tiết ra từ tụy Lượng thuốc uống điều trị tiểu đường cũng

giảm và 5 người có thể bỏ thuốc [22]

10

Cac loai khac ctng chi Gymnema R Br cing da dugc nghiên cứu chứng minh tác dụng ha đường huyết trén thyc nghiém bao g6m: Gymnema

Gymnema latifolium Wall ex Wight [11]

1.1.3.2 Nghiên cứu trên các tác dụng sinh học khác

Day thia canh Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult ti lau da được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian với các tác dụng là thuốc tiêu hóa, làm săn se, lợi tiêu Dịch từ rễ được sứ đụng chống nôn và chữa kiết ly Dịch chiết của cây còn được cho vào sữa mẹ để chữa các triệu chứng lở loét miệng

ở trẻ nhỏ [51 |

Trong một thử nghiệm độc tính cấp, LDso của địch chiết nước và dịch

chiết cồn của Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult thir nghiém trén chuột nhắt được xác dinh 14 375mg/kg, khong cé cdc biéu hién tang can, bat thường thần kinh và phản ứng phản xa Ty 16 an toan (LDso/EDs) la 11 trén chuột bình thường và 16 trên chuột tiêu đường [51]

Các tác dụng khác của Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult đã được nghiên cứu thực nghiệm chứng minh gồm có:

© - Tác động lên chuyển hóa lipid: Làm giảm có ý nghĩa các chất triglyceride trong huyết tương, cholesterol toàn phần, Lipoprotein tỷ trọng rất thấp

(Very low density Lipoprotein - VLDL) và Lipoprotein tỷ trọng thấp

(Low density lipoprotein — LDL) lam tang bai tiét các Sterol trung tinh va Sterol acid qua phân, ngoài ra nó còn làm giảm tổng lượng Cholesterol và mức Triglycerid trong huyết tương [35] Tác đụng này phụ thuộc liều và

tương đương với clifibrate trên mô hình thực nghiệm [69]

©Ò _ Tác dụng giảm cân, chống béo phì: Gurmarin, một polypeptip phân lập được từ địch chiết Gymnema syivestre (Retz.) R.Br ex Schult cd kha nang

làm giảm cảm giác ngọt mà không ảnh hưởng đến các vị giác khác do ức

chế chọn lọc cảm giác ngọt trên dây thần kinh và tế bảo vị giác chuột

cống và chuột nhất [30][40][56] Tác dụng làm mắt vị ngọt Dây thìa canh còn gặp ở người, tinh tinh và động vật linh trưởng [28, 36] Preuss trong

11

các nghiên cứu của mình đã chứng minh rằng dịch chiết chuẩn hóa Dây

thìa canh kết hợp với acid hydrocitric và niacin gắn chromchrom có tác dụng giảm cân kết hợp với việc duy trì mức lipid an toàn cho cơ thê [47]

[46]

©Ò Tac dung khang khuẩn: Dịch chiết cồn của Gymnema syivestre (Retz.)

Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa va Staphylococcus tuy nhién không có tác dụng trén Proteus vulgaris va Escherichia coli [52]

©_ Tác dụng kháng viêm: Dịch chiết nước với liều 300 mg/kg làm giảm có ý

nghĩa thống kê thê tích phù so với đối chứng trong mô hình gây phù chân

chuột bằng dầu hạt bông

° Tac dung quét gốc oxy hóa: Dịch chiết nước Gymnema sylvestre (Retz.)

R.Br ex Schult với mức 32 H1 có tác dụng quét 50% gốc diphenyl-I-

picrylhydrazyl (DPPH) [41]

1.1.4 Thành phần hóa học

Cho đến nay, các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học được tập trung vào loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult với các nhóm chất triterpene saponin thudc 2 nhém oleane va dammarane Saponin khung Oleane

có các acid gymnemic va gymnemasaponins [71, 73], trong khi do saponin khung dammarane là các gymnemasides [29] Trong lá còn xác định có resine, albumin, chlorophyll, carbohydrates, acid tartaric, acid formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid inositole, acid httu co (5,5%), parabin, calci oxalate (7,3%), lignin (4,8%), cellulose (22%) [59][60][61]

Thành phan tác đụng chính được xác định là acid gymnemic, là tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triferpenoid [27][37][38]I60] Các acid gymmenics là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylroyl, ) cia deacylgymnemic acid (DAGA) DAGA tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta- glucoronide của gymemagenin [51] Cấu trúc của Gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được minh họa trong hình 1.2

12

Hình 1.2a: Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập được từ

Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult

13

(a)

11 30 aa 37 ag Ae

VX©XSXPXEXT

Hình 1.3: Cấu trúc của Gurmarin [30, 56]

1.1.5 Các nghiên cứu chuẩn hóa thành phần tác dụng

14

Hai hướng chính nhằm chuẩn hóa thành phần tác dụng của Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult là: (1) Chuẩn hóa theo đơn chất tác dụng được

phân lập và tính khiết hóa như acid gymnemic, deacylgymnemic acid, gymnemagenin (2) Chuan hóa theo phân đoạn hóa học saponin triterpenoid có hàm

lượng acid gymenic cao

a Chuẩn hóa theo don chat:

* Chuẩn hóa theo gymnemagenin: Đây là chất chuẩn đánh dấu (marker)

được sử dụng phố biến nhất Gymnemagenin được tạo ra do quá khi thực hiện thủy phân acid gymnemic toàn phân trong điều kiện kiềm và acid [53] [29]

Cong thức phân tử :CaoHsoO,s

Khôi lượng phân tử: 506.719

Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng thủy phân acid gymnemic tạo Gymnemagenin [33]

* Chuẩn theo acid deacylgymnemic: khi thủy phân acid gymnemic toàn phần trong điều kiện kiềm [66]

Acid deacylgymnemic

15

Acid gymnemic II | 2- Acetyl | Công thức phân tử : C;¿H„;O.;

| methylbutyroyl |

| methylbutyroyl

Hình 1.5: Sơ đồ phản ứng thủy phan acid gymnemic tao acid

deacylgymnemic [66]

Các phương pháp Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) [66] và sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [48][49] duoc sử dụng để định lượng acid gymnemic trong Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Phuong phap can được sử dụng đề định lượng acid gymnemic toàn phần Phương pháp HPLC được

sử dụng để định lượng acid deacylgymnemic từ dịch chiết lá và phương pháp HPTLC định lượng bằng cách so sánh gymnemagenin trong lá với gymnemagenin

chuẩn [74] Ưu điểm của phương pháp này là có tính chính xác và độ tin cậy cao Tuy nhiên phương pháp này hiện nay có nhiều khó khăn khi áp dụng ở Việt Nam

do thiếu chất chuân và khả năng ứng dụng rộng trong sản xuất

b Chuẩn hóa theo phân đoạn hóa học

Hoạt chất chính acid gymnemic trong Gymnema syivesfre (Retz.) R

Br ex Schult là là hỗn hợp các acid gymnemic từ I-XVII với độ phân cực gần nhau và nồng độ của mỗi acid gymnemic rất nhỏ (0,05-0,12%) nên gây

nhiều khó khăn trong phân lập một acid gymnemic đơn độc Do đó xu hướng

chung dé chiét xuat tir Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult là tạo tủa GS4 Phổ biến nhất là phương pháp chuẩn hóa theo GS4 là saponin toan phan,

được tạo thành bằng cách tủa dịch chiết Gymnema syivestre (Retz.) R Br ex

Schult bang HạSO¿ đo saponin trong cây không tan trong môi trường acid Lượng

GS4 xác định bằng phương pháp cân Phương pháp này cho đến nay được áp dụng

rộng rãi do khả năng ứng dụng thực tiễn cao

1.2 NGHIÊN CUU CHI (GYMNEMA R.BR.) O VIỆT NAM

1.2.1 Về đặc điểm thực vật

Mặc dù chưa được xuất bản trong “Thực vật chí Việt Nam” nhưng theo tài liệu công bố mới nhất về họ Asclepiadaceae ở Việt Nam của Trần

16

Thế Bách (2007), chi Gymnema R.Br phan bố ở Việt Nam có 5 loài là Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall Ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst va Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult Dé xdc định các loài này, tác giả

đã xây dựng khóa phan loai cho chi Gymnema R.Br & Viét Nam (Bang 1.4)

sử dụng các đặc điểm phân loại chính của quả và hạt, bao gồm: kích thước

quả, kích thước mào lông va d6 dai hat [2]

Bảng 1.4 : Khóa phân loại các loai Gymnema R Br 6 Viét Nam [2]

1A Quả đài hơn 12 cm co co vn cớ 1 G inodorum 1B Quả ngắn hơn 10 cm

2A Mào lông ngắn hơn 2,6 cm cc sec sec: 2 G yunnanense 2B Mao léng dai hon hay bang 3 cm

3A Chiéu dai hat ngan Hon 0,9 CM cccccececccesesceeeesveeeesseeeeses 3 G sylvestre 3B Chiều đài hạt lớn hơn 1 cm

4A Chiều dài quả ngắn hơn 6 cm; mào lông ngắn hơn 3,5 mm 4 G latifolium 4B Chiều đài qua dai hon 7 cm; mao léng dai hon 3,5 mm 5 G reticulatum

Một số đặc điểm giải phẫu thân lá của 2 loài Gymnema syivestre (Retz)

R Br Ex Schult va Gymnema latifolium Wall Ex Wight ciing da dugce m6 ta chi tiét trong các nghiên cứu của Đỗ Anh Vũ [18] và Pham Van Hai [11] 1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Bằng các phản ứng định tính thường quy, Phạm Văn Hải đã xác định các thành phần chính có trong một đại diện của chi là Œyznmnema latjfolium Wall Ex Wight gồm các nhóm chất saponin, tanin, flavonoid, acid amin, đường khử và coumarm [11]

Trần Văn Ơn và cộng sự (2009) đã khảo sát và xây dựng quy trình tối

ưu chiết phân đoạn saponin triterpenoid GS4 từ Dây thìa canh (Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult) Cac diéu kién chiét xuat tối ưu được xác định là: Kích thước bột được liệu (Bột nửa mịn), Phương pháp chiết xuất

(Ngắm kiệt), Dung môi chiết xuất (Ethanol 40), pH trong phản ứng acid hóa

17

(pH 1-3), pH trong phản ứng kiềm hóa (pH 11) Sơ đồ chiết xuất tối ưu GS4

được trình bày trong hình 1.6 [10]

(Myrtillogenic acid) (Glochioeriosides A)

Hình 1.7 : Cấu trúc hóa học của 2 hợp chat GS4A1 va GS5F2 [10] 1.2.3 Nghiên cứu về tác dụng sinh học

Thử nghiệm trên mô hình gây tăng đường huyết bởi STZ do Đỗ Anh

Vũ thực hiện cho thấy cao lỏng lá Dây thìa canh (Gymnema syivestre (Retz)

R Br ex Schult) có tác đụng hạ đường huyết trên cả lô chuột bình thường (mức độ hạ cao nhất là 37,58%) và trên lô chuột ĐT bởi STZ (mức độ hạ cao nhất là 27,81%) Tác dụng đỉnh ở 2h và kéo đài đến 4h Khẳng định thêm một trong những cơ chế hạ đường huyết của Dây thìa canh là kích thích đảo tụy tiết insulin [18] Qua đó, liều sử dụng đề xuất đối với cao lỏng 1:2 là

0,5ml/25z (10g lá khô/ kg)

Thử nghiệm củng với mô hình trên với đối tượng là Dây thìa canh lá

to (Gymnema latifolium Wall ex Wight.) cũng cho tác dụng tương tự khi dịch chiết cồn có tác dụng hạ đường huyết trên thực nghiệm cả ở chuột thường và chuột đã gây tăng đường huyết bằng STZ [1 I]

1.2.4 Các vấn đề tồn tại

Sau 5 năm kể từ công bố khoa học đầu tiên trong nước theo hướng nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của cây Dây thìa canh có nguồn gen trong nước, các nội dung nghiên cứu đã thực hiện: 1 Mô tả đặc điểm thực vật, giải phẫu; 2 Khảo sát định tính các thành phần hóa học, chiết xuất và định lượng phan doan saponin triterpenoids GS4; va 3 Danh gia tac dung hạ đường huyét cia 2 loai Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult va Gymnema latifolium Wall ex Wight.) Cac nghién cứu tuy mới ở bước đầu sơ khai nhưng với các kết quả thu được, cùng với các dữ liệu khoa học đã được

19

chứng minh trên thế giới đã cho thấy tiềm năng phát triển của các dược liệu

trong chỉ Gymnema R.Br tại Việt Nam theo hướng điều trị Đái tháo đường

hoặc mở rộng thêm các hướng điều trị bệnh mới

Thực tế thị trường Việt Nam đã chứng minh điều này khi hiện nay đã

xuất hiện các sản phẩm có nguồn gốc trong và ngoài nước hỗ trợ điều trị đái tháo đường mà trong thành phần có dược liệu Dây thìa canh nhự Diabetna

(Công ty cỗ phần Dược phẩm Nam Dược), DK-betic (Công ty Dược Khoa), TD-Care (Công ty Việt Đức), Trà kháng đường Glucocare (Công ty Từ Tâm

- nhập khẩu từ Singapore), Vinabetes (Oceanpharm),.v.v Do vậy, việc tiếp tục mở rộng nghiên cứu các dược liệu trong chi Gymnema R.Br ở Việt Nam

là cần thiết Các định hướng có thê mở rộng nghiên cứu bao gồm:

1 Nghiên cứu chuẩn hóa các dược liệu Dây thìa canh đang được sử

dụng phô biến hiện nay trong nước bao gồm: GŒymnema syivesire (Retz) R

Br va Gymnema latifolium Wall ex Wight.) Các nội dung cần nghiên cứu bao gồm: Khảo sát tính đa dạng về nguồn gen, vùng trồng, điều kiện chăm

sóc, thời điểm thu hái, tương quan với sự tích lũy hoạt chất trong cây;

2 Khảo sát đánh giá tác dụng hạ đường huyết của các loài khác, trên

cơ sở đó đánh giá các điều kiện chi phí-an toàn-lợi ích để lựa chọn loài cho

hiệu quả cao nhất khi áp dụng thực tiến

3 Nghiên cứu chứng minh sự an toàn của các loài trong sử dụng và hoàn tất các nghiên cứu để hoàn hồ sơ thứ nghiệm lâm sàng nhằm cung cấp những bằng chứng khoa học vững chắc để có thể ứng dụng phát triển thành các thuốc thảo dược điều trị bệnh

20

Bolikhamxay —- Cộng hòa dân chủ nhân dân Lào cũng được đưa vào trong

nghiên cứu do chúng phân bố gần biên giới Việt Lào có điều kiện khí hậu tương tự như vùng Trung Bộ và Tây nguyên của Việt Nam Một mẫu khác chi Gymnema R.Br la Thién ly (Telosma cordata Burm.f Merr.) duge swt dụng với mục đích đối chứng trong việc nghiên cứu tách loài Trong đó có 11

mẫu thu đầy đủ cơ quan dinh dưỡng và cơ quan sinh sản, 18 mẫu chỉ thu

được cơ quan dinh dưỡng Các mẫu được xử lý theo quy trình xử lý mẫu tiêu bản và lưu trữ tại phòng tiêu bản Trường Đại học Dược Hà Nội (HNIP) Mẫu nghiên cứu đa dạng di truyền: 27 mẫu lá được thu tươi, bảo quản trong silicagel hoặc làm lạnh bảo quản trong tủ lạnh sâu -26°C

Mẫu nghiên cứu hóa học: Mẫu đại diện của các loài được thu để

nghiên cứu so sánh thành phần hóa học giữa các loài hoặc mẫu trong cùng một loài trong điều kiện chăm sóc khác nhau Danh sách và bản đồ phân bố các mẫu nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.1 và Phụ lục 1

2.2 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thực địa: Tại các địa điểm thu mẫu theo danh sách trong

Nghiên cứu hóa học: Bộ môn Thực vật —- Đại học Dược Hà Nội; Phòng thí nghiệm Dược liệu - Khoa Dược - Đại học Quốc gia Seoul (Hàn

Bảng 2.1 Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu

Thời

~ cứu sinh | hóa

mau

Mũi Né — Phan Thiết — Bình

MI2 Hải Hòa - Hải Hậu -NamĐịnh 7/2011 X

' Vườn thực vật Đại học Dược Hà _

Bảng 2.1 Vị trí nơi thu các mẫu trong nghiên cứu

Mau | Co | Nghién Thời

mau

ADN san hoc

Thi tran Ctra Viét — Gio Linh —

Minh Khai — Hai Ba Trung - Ha

M23 | Long Son- Kim B6i— Hoa Binh 9/2011 X

M24 | Tam Dao — Vinh Phúc 7/2012 X

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu hình thái và giải phẫu

2.3.1.1 Phân tích hình thái

23

Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo

phương pháp mô tả phân tích [1]|4] Trong nghiên cứu các đặc điểm được

mô tả, thuộc các nhóm Dạng sống, Thân, Lá, Hoa, Quả, Hạt (Bảng 2.2) Dụng cụ sử dụng trong phân tích bao gồm: Kính lúp soi nỗi Leica EZ4 , máy ảnh kỹ thuật số chụp trực tiếp (Canon EOS 60D + Tamron 60mm f2.0 Macro) hoặc máy ảnh chụp qua kính lúp soi nổi (Canon SD450018)

Bảng 2.2 : Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chỉ Gymnema R.Br

2.3.1.2 Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu

Tiêu bản của thân, lá được làm theo phương pháp cắt, tây và nhuộm kép Tiêu bản được soi và chụp ảnh qua kính hiển vi Kruss ở các vật kính x4, x10, x40 sử dụng máy ảnh Canon SD45001S Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được mô tả và phân tích theo nguyên tắc nghiên cứu tiêu bản

vi phẫu [4]

2.3.1.3 Xác định tên khoa học

Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu thực vật trong nước (Khóa phân loại của Trần Thế Bách [2] , các bản mô tá trong sách Cây có Việt Nam (Tập 2, 2000) của Phạm Hoang

24

Hộ [12], Từ điển thực vật thông dụng của Võ Văn Chi [7]) và các tài liệu ngoài nước (Thực vật chí Trung Quốc [23], Thực vật chí Đài Loan [34], Thực vật chí Đông Dương[25]) Các mẫu sau khi tra khóa được so sánh đối

chiếu với các tiêu bản type hoặc isotype của từng loài tham khảo từ mẫu lưu tại phòng tiêu bản Paris, New York và Kew (nếu có)

2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền

2.3.2.1 Tách chiết ADN tổng số

ADN của 27 mẫu nghiên cứu được tách chiết sử dụng phương pháp

CTAB theo quy trình của Doyle và Doyle có cải tiến [24] ADN tổng sau khi tách chiết được kiểm tra về nồng độ và chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% đối chiếu với thang ADN chuẩn [17]

Dụng cụ tách chiết ADN bao gồm: Chày cối sứ, máy ly tâm tốc độ cao cho ống nhỏ để bàn Eppendorf 5415R, Tủ lạnh sâu -30°C, bể ổn nhiệt Memmert WNBI0 Các hóa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck, bao gồm: Tris base, Boric acid, NaCl, EDTA, Ethanol, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, 2-propanol, PVP-40.000, Acetic acid glacial, SDS, Ribonuclease

2.3.2.2 Nhân bản 1DN bằng máy PCR theo phương pháp RAPD

Phản ứng PCR được thực hiện trên máy nhân gen Mastercycler pro S

ở thể tích 15 ml với thành phần được trình bày ở Bảng 2.3

Quá trình nhân bản ADN được thực hiện theo chu trình nhiệt: Khởi

động nóng 94°C trong 5 phút Tiếp theo là 38 chu kỳ: 94°C trong 1 phút; 34°C trong 1 phút 20 giây; 72°C trong 1 phút 35 giây Pha tông hợp cuối cùng 72°C trong 4 phút

Sản phẩm khuếch đại được phân tích trên gel điện di Agarose 1,2% theo từng mùi riêng biệt chạy ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút bằng phương

pháp nhuộm hiện hình với Ethidium Bromide Kích thước tương đối của các

băng khuếch đại được so sánh với Ladder chuẩn 1kb (Fermentas, lkb ADN Ladder) Tổng cộng 40 môi đã được khảo sát, trong đó có 16 mỗi có xuất hiện các băng đa hình (Bảng 2.4)

Bảng 2.4: Các mỗi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

¬-Ễễ`ễễ`®® ễỆỄ—Ễ—Ể——_—_—_—_———ễềễ>ềễễễễ

26

Da đạng đi truyền của các mẫu được thống kê trên kết quả điện đi sản phẩm PCR của 16 mùi trên Sự có mặt của các băng di truyền được ghi nhận theo từng cặp mẫu-mỗi và mã hóa nhị biến là 1 (có băng di truyền) và 0 (không có băng di truyền) Hệ số đồng đạng di truyền Sị cua cac mau thudc chi Gymnema R.Br dugc tinh theo công thức cla Nei&Li [39]

Trên cơ sở bảng hệ số đồng dang di truyền của 27 mẫu nghiên cứu, cây phả hệ của các mẫu nghiên cứu được thiết lập sử dụng phép phân tích

chùm theo phương pháp khoảng cách liên kết trung bình UPGMA

(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages) sử dụng phần mém NT-SYS PC 2.02h (Numerical Taxonomy System Applied Biostatistics, New York)

2.3.3 Nghiên cứu hóa học

2.3.3.1 Định tính thành phần hóa học

08 mau thuộc ó6 loài trong chi Gymnema R.Br xac dinh diya trén đặc điểm thực vật được lựa chọn tiếp tục nghiên cứu hóa học nhằm phân tích sự tương đồng và khác biệt về thành phần hóa học tương ứng với sự khác biệt

về đặc điểm thực vật Riêng loài Gymnema syivestre (Retz.) R Br ex Schult

có 3 mẫu có sự khác nhau về màu sắc hoa là đỏ, vàng và trắng nhưng được trồng và chăm sóc và thu hái trong cùng một điều kiện tập trung giống nhau

27

Chudn bi dich chiét: Can 10g dược liệu, chiết siêu âm với n-hexan trong 60 phút Loại bỏ dịch chiết n-hexan Cắn tiếp tục được chiết siêu âm 3 lần với MeOH trong 60 phút Dịch chiết được cô về thể tích 10ml

Định tính sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Dich chiét methanol 1g/ml của các mẫu nghiên cứu được lọc qua màng milipore 0,45 nm để triển khai trong hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Water 2690 với detector PDA 996 Triển khai sắc ký với cột sắc ký Thermo Hypersil Gold (C18 — 5um, 250L x 4,6 mm) với dung môi pha động

là Acetonitryl:H;0, nhiệt độ cột là 27C Quy trình gradient triển khai sắc ký

được trình bày trong Hinh 2.1

ACM

ũ 10 M 22 ?ö 3p — Thởi gian i3)

Hình 2.1: Chu trình gradient HPLC áp dụng trong nghiên cứu Dịch chiết methanol toàn phần được phân đoạn lần lượt sử dụng các

dung môi n-hexan, ethyl acetate và n-butanol Hai phân đoạn ethyl acetate và n-butanol được thủy phân sử dụng acid chlohydric 2,5N 50% trong 2h và

KOH 11% trong 2h (hình 2.2) Dịch chiết thuỷ phân cuối cùng được chạy sắc

ký theo quy trình triển khai trong hình 2.1 và so sánh với sắc ký đồ của

gymnemagenin chuẩn (Chromadex)

28

løf?F4 siêu iăn 8Ö piuii x 5 lần: HE! 2,5NM/MaOHl 2%

CăI thái fide that) ôi Hới lưu Ereren 2h

tỏa rạn lại rome rate va an

LOC

Dịch chiết nước Bã dược liệu

Loại chất lieu Làng m-Ìee2z1 Ko H/MeằH 2%

„ Hếi luu 2h

ị „ Bay lai thu cần

Dich chidt nude | „ Hoà tan cần lại trong 1 en! MeOH

Palin cheers wil 4

Quy trình chiết xuất các mẫu nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ

mô tả trong Hình 2.3 đã được áp dụng quy trình chiết xuất phân đoạn GS4 trong Day thia canh Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult được thực hiện bởi Trần Văn Ơn năm 201 1[14] Các công đoạn chính bao gồm:

- Chuẩn bị nguyên liệu: lá được xay tới bột thô, say khô ở 45), Dược liệu được thấm 4m bang ethanol 40° và đậy kín trong 2 giờ rồi nạp vào thiết

bị chiết

- Chiết xuất được liệu: lót một lớp bông thấm nước lên trên ống thoát

dịch chiết để bột được liệu không gây tắc bình và lẫn vào dịch chiết Sau đó

đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn vào đáy bình Cho từ từ bột được liệu đã được làm 4m vào bình, vừa cho vừa san đều và nén nhẹ Đỗ dung môi vào bình chiết cho tới khi có vài giọt chảy ra thì đóng khóa lại Tiếp tục đỗ dung môi tới ngập mặt được liệu 3-4cm Ngâm lạnh trong 48 giờ Hết thời gian ngâm

29

lạnh, mở khóa cho dịch chiết chảy ra với tốc độ là 20 giot/phút Chú ý cho thêm dung môi đảm bảo ngập mặt dược liệu từ 2-3cm

Dich lono ob tua

Hình 2.3: Quy trình chiết xuất GX4 trong nghiên cứu

- Dịch chiết thu được đem cô cách thủy tới cao lỏng 1:2 (thể tích cao/khối lượng dược liệu)

30

- Tạo GX:: Nhỏ từ từ dung dịch H;SOa 5% vào cao 1:2 cho tới pH 3, vừa nhỏ vừa khuấy đều, dung dịch sẽ tạo tủa (GX3) Làm lạnh ở 4°C, thấy xuất hiện tủa, để dung dịch tạo tủa hoàn toàn, ly tam dé lay tha GX3

- Tạo GX4: Hòa tan tủa thu được ở trên (GX3) trong dung dịch KOH

0,1M tới pH 11 Nhỏ từ từ dung dịch H;S5O¿ 5% vào cho tới pH 3, vừa nhỏ

vừa khuấy đều, dung dịch sẽ tạo tủa (GX4) Làm lạnh dịch có tủa ở 4°C dé dung dịch tạo tủa hoàn toàn, ly tâm để lấy tủa Tủa tạo thành được sấy tới khối lượng không đôi ở 60° và cân để xác định khối lượng GX4

Ty lệ GX4 được xác định theo công thức

Trong đó: % GX4: Tỷ lệ % GX4 thu được từ mẫu nghiên cứu

mx : là khối lượng cắn GX4 cuối cùng cân được (g)

Mạ, là khối lượng dược liệu ban đầu (g)

h : Hàm ẩm dược liệu (%) 2.3.3.3 Định tính phân đoạn GX4

Chấm mẫu dịch chiết của 8 mẫu nghiên cứu trên bản mỏng silicagel

sử dụng hệ thống chấm mẫu bán tự động Linomat 5 (tốc độ chấm mẫu 150n1/s, thể tích chấm mẫu 2l) Triển khai mẫu trong bình triển khai tự động ADC?2 (hệ dung môi khai triển Chloroform:methanol (25:15), bão hòa dung môi trong 2 phút, khoảng cách khai triển 70mm)

31