Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu định lượng myricetin trong chè dây và một số chế phẩm có chứa chè dây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BO Y TE

TRUONG DAI HOC DUOC HA NOI

MONG MINH HUYEN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG

MYRICETIN TRONG CHE DAY

VA MOT SO CHE PHAM CO CHUA CHE DAY BANG PHUONG PHAP

sD

SAC KY LONG HIEU NANG CAO ^== — — —

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

MUC LUC

Trang

LOI CAM ON

MUC LUC

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

DANH MUC CAC BANG

DANH MUC CAC HINH

OE ecmmeuscacecenenmewannmancmucamnmnmnanammnmnnamauens 1 HHEDHEI.- TÙNG ADT svecscssnsssssscs essai 3

1.1 Tổng quan về cây ché day, myricetin va m6t so san pham chira

ChE GAY sinicssiccsorssiacsemmnneneenn inn anaes Reem 3 LD) “TỗdWHdanVÊElt CH- ỔY:(.eeooaioaaontagdtudddaiataeasbesane 3 1.1.2 Tổng quan về myricetin -2©-s<-s+ese-secse Š

LS (lai HÀ pees 8 1.1.4 Chế phẩm Thiên Bảo giảo cổ lam . -2 25-52: 10 1.1.5 Một số phương pháp định lượng myrieetin 11 1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng eao ———= , — 13 12.1 Một số nét sơ lược về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao i3

1.2.2 May sac ky long hiéu nang CA0 .s.cccesccsesesessesessesessseeeeesseneeenes 14

1.2.3 Một số thông số đặc trưng cho quá trình rửa rải ló 1.2.4 Một số ứng dụng của sắc ký .eeee TẾ” CHUONG 2 - ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 1T, ĐốI RRðHIE HghÌE Hi naoadaicdqidediotiGtdilSkaskoiadvtleceoosydagiln 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu SIENNA RDN 20 TI:L TTHH kg -I ÔN EỦHT co kurradoodiddoriodioedildddiddaeatiioseee 20

Sơ đồ khói của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 14

Phé hap thụ tử ngoại của Myrticetltn eeeneoeooosee 26

Pie Tels NHI sacgea giang a0 0 ung 06002 tagg 27 Sắc ký đồ khảo sát pic myricetin ở 2 bước sóng 254nm va

370ïimi sÙ đựng phá CONS FS ciccccoccdiaacGetioaosasalledbstsdioe 28

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic va

tiện” để MVIIEEDH sscesikceeiatgdiioapssdsebsdsoititoneostgxstos 554 30 Phé hap thụ 2D của myricetin chuẩn .- cccccccccecc 36

Sắc ký đồ mẫu chuẩn myricetin - -. -<-5- «c7 cc<cs<s< 37

Sắc ký đồ định lượng Mỹyricetin trong lá chè dây 37

Sắc ký đồ định lượng myricetin trong mẫu viên ampelop 37 Sắc ký đồ định lượng myricetin trong mẫu viên Thiên Bảo

DAT VAN DE

Năm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam được thiên nhiên ưu ái

ban tặng một thảm thực vật phong phú và đa dạng trong đó có nhiều được liệu đã

được nhân dân ta sử dụng để phòng và chữa bệnh Cho tới nay, đã có nhiều sách tập hợp các công trình nghiên cứu vẻ được liệu cũng như những kinh nghiệm phòng và

chữa bệnh trong nhân dân như: '*Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi [14]: '“Từ điển cây thuốc” của Võ Văn Chỉ [3]: “Cây thuốc và động vật làm

thuốc ở Việt Nam” của tập thê tắc giả ở Viện dược liệu [lô]

Từ lâu chè dây đã được nhiều người biết đến như vị thuốc chữa viêm loét dạ

dày, hành tá tràng hiệu quả mà không mây tốn kém Chè dây được gọi là Thau rả (theo dân tộc Tày) hay Khau rả (theo dân tộc Nùng) Đây là loại dây leo có vị ngọt,

dang, tinh mat, duge déng bào dân tộc miền núi sử dụng như một vị thuốc dân gian chữa các bệnh liên quan tới dạ dày như ợ hơi, ợ chua đau rát thượng vị Ngoài ra

chè đây còn có tác dụng an thân, chữa mắt ngủ

Trong hai mươi năm trở lại đây chè dây đã nhận được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong nước Tiêu biểu là các nghiên cứu của Phạm Thanh Kỳ và các cộng sự Qua các nghiên cứu này, các nhà khoa học đã xác định

được thành phần có hoạt tính sinh học chính trong chè dây có tác dụng phòng và

chữa bệnh là nhóm flavonoid với hai chất chính là myricetin và dihydromyricetin

[6], [23], [10] Đồng thời, chè dây cũng trở thành nguồn nguyên liệu được đưa vào

sản xuất thuốc đông được với sự ra đời của viên nang Ampelop do Phạm Thanh Kỳ

và nhóm cộng sự nghiên cứu [12] sau đó được chuyển giao cho công ty cổ phần

Traphaco

Sự phát triển của nhóm thuốc đông dược nói chung và các chế phẩm có chứa

chè dây nói riêng trên thị trường Việt Nam đã đặt ra yêu cầu cấp thiết về đảm bảo

- chất lượng thuốc Qua các công trình nghiên cứu trước đó chúng tôi nhận thấy mặc

dù hàm lượng dihydro myricetin cao hơn myricetin trong lá chè dây nhưng hàm lượng myricetin trong cao chè đây lại cao hơn hàm lượng dihydro myricetin nhiều

lần [6] Bên cạnh đó các đề tài trước đây chưa sử dụng chất chuẩn chính thức Hiện

nay dé tài khoa học công nghệ cấp nhà nước mã số KC.10.16/06-10 đã thiết lập

được chất chuẩn myricetin Mặt khác các sản phẩm Thiên Bảo Giảo Cổ Lam, va

Ampelop có công bố hàm lượng cao chè dây nhưng không định lượng và công bố hàm lượng myricetin trong sản phẩm Vì vậy để đảm bảo chất lượng thuốc đông dược có chứa chè dây trên thị trường chúng tôi quyết định nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu định lượng myricetin trong lá chè dây và một số sản phẩm có chứa chè dây băng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu:

Khảo sát lựa chọn điều kiện và đánh giá phương pháp định lượng myricetin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng Myricetin trong lá chè

dây, và hai chế phẩm chứa chè dây Ampelop và Thiên Bảo Giảo Cổ Lam

CHUONG 1 TONG QUAN

1.1 Tổng quan về cây chè dây, myrieetin và một số sản phẩm chứa chè dây

1.1.1 Tổng quan về cây chè dây

Tén khoa hoc: Ampelopsis cantoniensis ( Hook.et arn.) planch

Ho nho Vitaceae

Cây chè dây ở dạng dây leo dai, xanh tốt, leo trên các bụi rậm hoặc trên các cây to

khác trong rừng Cây mọc hoang và cũng được người dân đem về trồng trong vườn

hoặc ở bờ rào Cây sống lâu năm, mùa đông lá vàng rụng dân, mùa xuân cây bắt đầu

moe chi, lá xanh tốt nhất là vào mùa hè, cũng là mùa nhân dân địa phương thường

thu hoạch 1a, ra hoa thang 6, ra qua tháng 10

a) Đặc điểm hình thái|8| [21], [18]

Hình 1.1 Cây chè dây tươi và Mẫu lá chè dây khô

Cây thân leo sống lâu năm Lá mọc so le, lá kép lông chim lẻ Tua cuốn có 2-

3 nhánh đối diện với lá Hoa mọc thành cụm xim hai ngả, đối diện với lá Quả

mọng, lúc non có màu xanh, khi chín có màu đó mận Quả thường có 2-3 hạt, hạt có

vỏ cứng mặt ngoài màu nâu đen

Dược liệu là lá và ngọn phơi sây khô Lá có màu xanh thẫm, trên lá có những

chấm trắng dày đặc Thân cây và cành màu nâu đỏ

Trên thê giới, chè dây phân bô ở Lào, Trung Quốc, Indonexia, Án Độ,

Campuchia [8] Ở Việt Nam chè dây mọc ở Cao Bằng, Lào Cai, Lạng Sơn, Hải

Nghiên cứu của Phùng Gia Hợp cho thấy cao đặc chè dây có tác dụng điều

trị vết bỏng nông: bỏng độ II và bỏng độ II khá tốt Vết bông tạo được màng thuốc,

lớp màng thuốc bám chắc vào bề mặt vết thương Khi màng thuốc bong thì vết bỏng lành sẹo, bề mặt mềm và mịn Thời gian khỏi trung bình của bỏng độ H là 9.2 ngày

bỏng độ HII là 1§.5 ngày [7]

Công dụng của cây chè dây|[3], [7], [21|

Chè dây có vị ngọt đắng, tính mát và có nhiêu công dụng:

Nhân dân vùng núi phía bắc dùng pha nước uống hàng ngày thay chè và để

tri dau da day

Nhân dân vùng Lạng Sơn dùng lá đắp vào chỗ bị viêm tấy có mủ ( áp xe vú)

Dùng lá tươi giã đắp vào các vết bỏng

Nhân dân ở Sapa dùng nước sắc hoặc nước hãm dạng chè uống hàng ngày với tác dụng thanh nhiệt, chữa mắt ngủ, kích thích tiêu hóa viêm đường ruột rất tốt

1.1.2 Tổng quan về Myricetin

a) Đặc điểm hóa lý

Myricetin 1a 1 flavonoid duge Perkin phan lap tit v6 cay Myrica nagi Thunb,

ho Dau rugu Myricaceae tir nam 1896, có công thức phân tir: C}sHj9Og

Cấu trúc của myricetin được xác định vào năm 1902 1a 3, 5, 7- trihydroxy 2- (3°, 4', 5°-trihydroxyphenol) 4,1- benzopyran- 4- on hay 3, 3°, 4°, 5, 5’, 7- hexahydroxy- flavon và sau d6 dugc J.Kalff va Robinson tong hop năm 1925

tetramethyl ether myricetin va 3°, 5- diacetyl myricctin), ding vinblastin lam 4éi

chứng Kết quả cho thấy 3°, 5- diacetyl myricetin có tác dụng mạnh hơn dẫn chất

còn lai va myricetin không có tác dụng này [29]

Những nghiên cứu gần đây của một nhóm nhà khoa học Hàn Quốc chỉ ra

răng myricetin có hiệu lực bảo vệ mạnh theo cơ chế hoá học chống lại các căn bệnh

có liên quan đến yếu tô hoại tử khối u-œ (TNF- alpha) [28]

Theo Kumamoto T., Fujii M., Ho DX., myricetin co tac dung true tiép dén Janus kinase (JK1), ngan chan su bién ddi té bao & cdc té bao biéu mô của chuột

[30]

Nghiên cứu gần đây nhất của các nhà khoa học ở Mỹ Hàn Quốc và Trung

Quốc cho thấy myricetin co kha nang chong ung thu tiềm tang [27], [36]

Một số tác dụng khác

Myricetin có hoạt tính của vitamin PP[I] Hoạt tính này thể hiện ở tác dụng

làm bền vững mao mạch giảm tính giòn của thành mạch

- Theo kết quả nghiên cửu của nhóm Phạm Thanh Kỷ và cộng sự [H1] [21]

- Nghiên cứu sự vận chuyền tích cực ion Ca”” qua màng nguyên sinh chat

của tế bào gan chuột cho thấy myricetin ức chế sự vận chuyển ion Ca” ở nồng độ

I100LM Mức độ ức chế phụ thuộc vào nông độ [3ó]

- Theo Pablo Strobel và các cộng sự myricetin quercetin và catechin øallate

ức chế sự hấp thu ølucose vào trong tế bào tạo mỡ cô lập của chuột [33]

- Myricetin có tác dụng tăng tông hợp BMP- 2, tác dụng nảy có thể góp phần tạo nên hoạt tính gây chín và biệt hóa tế bào tạo xương, làm tăng khối lượng xương

[25].

- Cho đến nay, myricetin là flavonoid duy nhất đã được phát hiện có tác đụng

làm tăng thu giữ và giảm thải !od Tác dụng giảm phát tán và tăng thời gian lưu giữ

iod của myricetin có thể có ý nghĩa lâm sàng trong điều trị ung thư tuyến giáp bằng

- Diệt trừ Helicobacter Pylori

- Chống viêm, giảm đau

- Giảm tiết acid

- Liền sẹo vết loét dạ dày - hành tá tràng

Chỉ định: Viêm loét dạ dày, hành tá tràng

Chống chỉ định: Mẫn cảm với bất cứ thành phần nào của thuốc

Hiện nay trong tiêu chuẩn viên Ampelop chỉ định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp đo quang (tính theo quericetin) Phương pháp này có độ chính xác không cao và chỉ cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần, chưa xác định

được hàm lượng myrieetin trong chế phẩm

Một số nghiên cứu về tác dụng điều trị loét đạ dày tá tràng của chế phẩm

Ampelop được sản xuất từ chè đây

Bảng 1.2 Kết quả nghiên cứu vê tác dụng điều trị loét dạ dày tá trằng

của chế pham Ampelop

Vũ Nam [15] Nguyên Thị Tuyết

Lan[ 13]

Tae Dựng Cao che | Alusi Ampelop Metronidazol

day Amoxiciclin ( AMA)

Cat con dau trung binh 8.9 ngay 17,35

ngày

Bệnh nhân hét dau sau 2 tuan | 90.09% 61.11% | 95%

diéu tri

Liên sẹo 6 loét hanh ta trang | 79,55% 50% 92.5%

Sach Helicobacter pylori 42.5% 19.35% | 70%

Tác dụng giảm viêm dạ dày có Không Giảm rõ rệt

Tác dụng không mong muốn | Không có Không có

Kết quả nghiên cứu đưới sự chỉ đạo của Nguyễn Khánh Trạch theo dõi điều trị cho

63 bệnh nhân loét dạ dày — tá tràng băng AMPELOP — AMOXICICLIN - FLAGYL che thay[17]:

- Về mặt lâm sàng: thuốc Ampelop có tác dụng tốt trong việc cải thiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh loét đạ dày tá tràng Sau cả đợt điều trị số bệnh

nhân hết các triệu chứng lâm sàng đạt 98,41% chỉ còn I bệnh nhân không hết đau

(1.58%)

-Tỷ lệ liền sẹo ở mức độ tốt và khá: 85,71%

- Tác dụng diệt HP: 53.97% Bệnh nhân không còn HP 14.28% còn số lượng

ít bệnh nhân 31.75% bệnh nhân có lượng HP không thay đổi

1.1.4 Một số nét sơ lược về viên Thiên Bảo giảo cỗ lam [5]

Thiên Bảo - Giảo Cổ Lam là tập hợp thành quả nhiều năm nghiên cứu

của Phạm Thanh Kỳ và cộng sự đã được chuyển giao cho Công ty Dược phẩm Đông Á

Giảo Cô Lam còn gọi là cây thất diệp đởm cây trường sinh, từ xa xưa đã

được sử dụng cho vua chúa dé tang cuong suc khoe, kéo dai tudi tho Thanh phan hóa học chính của Giao Cé Lam 1a flavonoid va saponin, hrong saponin trong Giao

Cổ Lam nhiều gấp 3 —- 4 lần nhân sâm nên cây còn được gọi là Ngũ Diệp Sâm

Nhiều nghiên cứu của y dược học hiện đại đã chứng minh Giảo Cô Lam là một vị

thảo được quý có tác dụng hạ mỡ máu giảm cholesterol xấu góp phần ngăn ngừa

xơ vữa mạch máu, chống huyết khối và bình ôn huyết áp phòng ngừa các biến

chứng tim mạch

Chè Dây được người dân sử dụng nhiều với tác dụng giúp tiêu hóa tốt, để

ngủ Chè Dây là một loại dược liệu giàu flavonoid và tannin, con gọi là polyphenol

Đây là nhóm chất có tác dung sinh hoc cao, chéng lão hóa mạnh

Việc kết hợp hai loại thảo được này sẽ mang lại nhiều lợi ích chữa bệnh hơn

khi dùng riêng lẻ Hiện nay, trên thị trường xuất hiện nhiều sản phẩm mang tên Giảo Cô Lam, nhưng Thiên Bảo Giảo Cô Lam với sự hòa quyện giữa 2 dược liệu quý này sẽ tạo ra một sản phẩm thực sự chất lượng giúp làm hạ mỡ máu én định

đường huyết và huyết áp giúp nâng cao sức khỏe và kéo đài tuổi thọ rất hữu ích cho các bệnh nhân bị tăng mỡ máu và có nguy cơ cao với bệnh tin mạch

=———_——"——ễ—— —Ÿ -.—==———

11

Hình 1.3 Vién nang Thién Bảo giảo cổ lam

Thành phần chính:

- Cao khô Giảo cỗ lam (có chứa các Saponin triterpen, Flavonoid, Aminoacid,

Vitamin và các nguyên tô vi lượng v v): 300 mg

- Polyphenol Chè dây (có chứa Myricetin, Dihydro - Myricetin): 150 mg

Tá dược vừa đủ [ viên

Công dụng:

- Giúp hạ cholesterol máu, điều hòa rồi loạn lipid máu

- Bảo vệ thành mạch, giúp ôn định huyết áp

- Chẳng lão hóa, giúp ăn ngủ tốt

Chỉ định: Chống lão hóa, giảm mỡ máu ôn định huyết áp

Trong tiêu chuẩn của viên Thiên Bảo Giảo Cổ Lam mặc dù có công bố hàm

lượng polyphenol Chè Dây nhưng thực tế không định lượng và công bố hàm lượng

myricetin

1.1.5 Một số phương pháp định lượng myricetin đã được sử dụng

Định lượng ƒlavonoid toan phần bằng phương pháp cân [16]: Cân 2g bột lá chè

dây đã xác định độ âm Dược liệu được chuyên vao binh Soxhlet, thém ether dau

hỏa, đun cách thủy trong 2 giờ Dịch chiết đem bay hơi ở nhiệt độ phòng thu được

12

căn Chuyển căn vào bình cầu lắp sinh hàn thêm cthanol 70° chiết đến hết

flavonoid (10 phút) Cất thu hồi ethanol trong địch chiết thu được khoảng 30ml dịch

chiết nước Để nguội thêm gelatin 3% đến không còn tủa trắng Lọc lấy dịch lắc

với ethyl acetate trong binh gan toi hét flavonoid Gộp dịch lọc bốc hơi đến căn

Sấy căn ở 100°C đến khối lượng không đổi thu được flavonoid khan

Luong flavonoid toàn phan được xác định theo công thức:

A_ : khối lượng bột lá chè dây (g)

a _ : khối lượng căn thu được (g)

X% :độ âm của bột lá chè dây

Định lượng mịyricefin bằng sắc ky long hiéu nang cao HPLC

Bang 1.3 Cac chiang trinhh sac kj dinh lwong Myricetin bang HPLC

Đề tải cấp nhà nước KC.10.16/06- 10 [20] xây dựng điều kiện sắc ký định lượng

myricetin như sau:

Cot RP — 18 (150 x 4.6mm ; Sum)

Pha dong KH>PQ, 0,025 M, pH = 3 : Acetonitril ( 70 : 30)

Bước sóng 376 nm,

Tốc độ dòng Iml/phút

Thời gian lưu 4.5 phút

1.2 Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao [2]

1.2.1 Một số nét sơ lược về sắc ký va sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký được phát minh vào năm 1906 khi nhà thực vật học

người Nga Mikhail tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật (Chlorophyl và

Xanthophyl) trong ether dầu hỏa lên một cột nhồi bởi bột mịn calci carbonat, ông

nhận thấy các sắc tô bị hấp phụ trên đầu cột Khi cho dung môi nguyên chất (ether dầu hỏa) lên cột, các sắc tố đi chuyền trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng tách thành những vùng hay những vòng màu chồng xếp lên nhau hình thành sắc ký đồ

Trong may thap ky tiép theo nghién ctru về lý thuyết và ứng dụng của sắc ký

đã phát triển rất mạnh mẽ Hiện nay các kỹ thuật sắc ký luôn có vai trò quan trọng trong nghiên cứu lý thuyết cũng như ứng dụng của khoa học và công nghệ

Cuối những năm 1960 và trong thập kỷ 70 sắc ký lỏng hiệu năng cao được xây dựng và phát triển tạo thêm một bước ngoặt mới trong lịch sử sắc ký

Nguyên lý tách của sắc ký: Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động

Pha này có thể là một chất khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua

pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó Pha tĩnh được có định trong một

cột hay trên bẻ mặt chất rắn Các chất tan là thành phân của mẫu sẽ đi chuyển qua

cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh pha

động và chất tan Nhờ tôe độ đi chuyển khác nhau, các thành phần eủa mẫu sẽ tách

riêng biệt thành dai, lam co so cho phân tích định tính và định lượng

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích

thước 4 — 10 um Pha động được đây qua cột bằng một bơm có áp suất cao với tốc

độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân tích một lượng mẫu nhỏ cỡ 20ug

Hiện nay HPLC được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm, áp dụng trong nhiêu lĩnh vực khác nhau do có độ nhạy cao và đễ dàng áp dụng với độ đúng

Gradient: Pha động là hỗn hợp của nhiều dung môi được chứa trong các bình

khác nhau Tỷ lệ các thành phân thay đôi trong quá trình sắc ký theo chương trình

đã định

b) Hệ thống bơm

Hệ bơm HPLC có chức năng tạo áp suất cao để đây pha động từ bình dung môi qua

hệ thống sắc ký

Bom HPLC can dap ứng các yêu cầu:

Có khả năng hoạt động ở áp suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên

Dam bảo bơm lưu lượng lặp lại trong khoảng 0.01-Š.0 mL/phút

Không bị ăn mòn bởi dung môi

c) Hệ tiêm mẫu

Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thăng vào pha động cao áp ngay ở đầu

cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa

mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0.05 - 20uL

đ) Cột và pha tink

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo băng thép không gi, thông thường có chiều dài 10 — 30 cm đường kính trong từ 4-10 mm hạt chất nạp

co 5—10 um

Pha tĩnh thường là silica gel hoặc silica gel có bao một lớp mỏng hữu cơ

hoặc liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động

và trong mẫu phân tích làm giảm tuẻi thọ của cột sắc ký

Cột có thể được làm nóng đê đạt hiệu quả phân tách tốt hơn (nhưng hiếm khi

tiến hành ở nhiệt độ trên 60°C vì có thể làm suy giảm hiệu lực cột hoặc làm pha

động bay hơi)

e) Detector

Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:

- Đáp ứng nhanh và lặp lại

16

- Độ nhạy cao có thê phát hiện chất cần phân tích ở khối lượng hoặc nông

độ thấp

- Vận hành ôn định sử dụng dễ dàng

- Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Trong khóa luận này chúng tôi sử dụng đetector hấp thụ UV: điode array detector — DAD Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh đetector đo ở bước sóng có

định hoặc thay đổi Quang phổ và sắc ký đồ có thể được hiền thị trên màn hình nhờ phan mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Mặt khác hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ bước sóng và thời gian

1.2.3 Một số thông số đặc trưng cho quá trình rửa rải

Ø „ là nòng độ mol của chat tan trong pha tĩnh

c, là nồng độ mol của chất tan trong pha động

Trị số K càng lớn sự đi chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất

trong hôn hợp có hằng số K khác nhau nhiều thì khả năng tách dién ra dé dang hon

- Thời gian lưu tạ là thời gian cần thiết để một chất di chuyên từ nơi tiêm mẫu qua

cột sắc ký tới đầu dò và cho pic trên sắc ký đồ

tụ: thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ

tạ: càng lớn, chất tan bị lưu giữ càng mạnh và tốc độ di chuyển của nó càng

nhỏ

Thời gian lưu tương đối t`ạ được tính theo công thức

Up= tr - tu

- Hệ số dung lượng k° là một đại lượng quan trọng được dùng rộng rãi để mô tả tốc

độ di chuyên của một chât

17

Qs Qy 1a lugng chat tan phan bé trong pha tinh va pha dong

Vs Vy 1a thé tich pha tĩnh và pha động

k* không những phụ thuộc vào bản chất các pha bản chất chất tan, nhiệt độ mà còn

phụ thuộc vào đặc điểm cột

- Hệ số chọn lọc ơ: đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất

HN: A R.A Theo quy ước B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A vì vậy œ luôn lớn hơn 1

Đê tách riêng hai chất cần có ơ > 1 thường dùng ơ trong khoảng 1.05 dén 2.0 a càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau Nếu ơ quá lớn thời gian phân tích sẽ kéo

đài

- Hiệu lực cột

Pic trên sắc ký đồ có dạng tương tự như đường cong phân bố chuẩn Gaussian

thu được khi ta vẽ đường cong phụ thuộc giữa kết quả các thí nghiệm lặp lại và tần

số xuất hiện của các kết quả đó

Dạng pic sắc ký lý tưởng là dạng đối xứng như phân bố Gaussian Nhưng

trong thực tẾ pIc thường bị giãn ra và gần như đối xứng.Sự giãn pic là kết quả di chuyên nhanh chậm khác nhau của các phân tử của cùng một chất trong khi đi qua cột sắc ký Các pIc ra muộn bao giờ cũng tù hơn Cột sắc ký tốt (hiệu lực cao) sẽ

cho các pic nhọn (ít bị giãn)

Hiệu lực cột thường được đo băng hai thông số: số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa

18

W 1/2 1a chiéu rong ctia pic đo ở nửa chiêu cao cua pic

Nhu vậy, khi cột co higu lye cao (H nho N Ion) thi W nho (d6 gian pic nho) a eee

N gan bang Nmax:

N_ = 4000 5

d

Iaax

"

D, la đường kính hạt pha tinh (um)

- Độ phân giải: là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký

2|(t;), -(t,),]

Rs =0.75 : Hai pic không tách tốt còn xen phủ nhau nhiều

Rs = 1,0 : Hai pic tach khá tốt còn xen phủ nhau 4%

Re= 1,5 : Hai pic tach hoan toàn, chỉ xen phủ nhau 0.3%

Như vậy đề tăng độ phân giải R, ta có thể:

Tăng N băng cách dùng cột dài hơn (áp suất, thời gian và độ rộng của pic eññg tăng theö) hóặe eùñg loại pha tink cé kich thước hạt nhỏ hơn, cũng có thể giảm tốc độ dòng pha động

Tang k’, bang cach thay đổi thành phần pha động Giá trị k`p nên giao động

Sắc ký đồ cho ta thời gian lưu của chất phân tích cùng với điều kiện sắc ký

(pha động pha tĩnh ) là những thông tin định tính giúp ta khăng định sự có mặt của chất cần phân tích trong mẫu Với mẫu nhiều thành phân việc định tính bằng quang

phô thường gặp khó khăn Cho nên sắc ký thường được dùng để tách các thành phân trước khi phân tích bằng quang phổ Tuy nhiên định tính bằng sắc ký không

cho ta kết quả dương tính chắc chăn Vì vậy đề định tính các chất trong hỗn hợp người ta kết hợp sắc ký phổ IR hoặc sắc ký khối phổ Nhưng sắc ký giúp ta khẳng

19

định đúng két quả âm tính- tức là xác định một chất không có mặt trong hễn hợp Vì

vậy sắc ký thường được dùng đề kiểm tra tạp chất trong mẫu phân tích Trên sắc ký

đồ không có pic tại thời gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu khi chạy sắc ký

trong cùng điều kiện)

- Định lượng

Sắc ký là phương pháp rất thuận lợi đề định lượng một chất trong hỗn hợp vì

chất đó được tách khỏi các chất khác và đồng thời được định lượng dựa vào việc đo

chiều cao hay diện tích pic Với pic hẹp phương pháp đo chiều cao cho kết quả tốt

hơn phương pháp đo diện tích Khi pic tù hay lệch phương phương pháp đo diện

tích cho kết quả tốt hơn

Có nhiều phương pháp đề định lượng một chất trong mẫu phân tích:

- Phương pháp chuẩn ngoại một điểm

- Phương pháp dùng đường chuân

- Phương pháp nội chuẩn

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích

CHƯƠNG 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.Đối tượng nghiên cứu

- Lá chè dây thu hái ở Sapa khoảng tháng § — 9 năm 2009 Lá được phơi khô và xay thành bột Hàm lượng nước trong bột lá chè dây được xác định băng phương

pháp Xác định mát khối lượng đo làm khô (DĐVN TỊI, Phụ lục 5.16)

- Mẫu viên Ampelop của công ty cô phần dược phâm Traphaco

Số lô: 03

Ngày sản xuất: trước 15 tháng 05 năm 2009

-Mẫu viên Thiên Bảo Giảo Cổ Lam do công ty cô phần Dược Liệu TW

Mediplantex sản xuất, công ty dược phẩm Đông Á phân phối

Số lô: 251209

Ngày sản xuất: Trước ngày 06 tháng 9 năm 2009

2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Hóa chất ~ thuốc thử

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong DĐVN III hoặc đạt tiêu chuẩn tỉnh khiết sắc ký bao gồm:

- Chất chuẩn Mgricetin đối chiếu hóa học (chất chuẩn làm việc của Viện Kiểm

Nghiệm thuốc T.U')

Số lô: KC.10.16 - 04.07

Hàm lượng chuẩn: 99,69%

- Dung môi tinh khiết HPLC: Methanol Acetonitril, nước cắt

- Hoa chat: Kali dihydrophotphat, acid Phosphoric

- Thuốc thử: Các thuốc thử được pha theo tiêu chuân DĐVN II

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies 1200

Cột sắc ký: Purospher” Star RP-18 ( 250 x 4.6 mm : Š um)

Máy lắc siêu âm: Elmasonia

Cân phân tích: Mettler Toledo AB 204

Thiết bị lọc hút chân không

Bình nón; bình định mức: pipet và các dụng cụ khác:

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp chuẩn bi mau[3]

- Ap dụng phương pháp ngâm lạnh hoặc ngâm nóng với methanol để chiết

myricetin trong lá chè đây và các chế phẩm có chứa chè dây

- _ Áp dụng phương pháp chiết rắn lỏng đựa vào tính tan của myricetin để tách riêng myricetin ra khỏi hỗn hợp chất rắn

Phương pháp định lượng bằng HPLC

Tối ưu hóa chương trình sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng myricetin

trên cơ sở các nghiên cứu định tính và định lượng flavonoid trong chè dây trước đây Myricetin dễ tan trong methanol, dựa theo câu trúc hóa học và đặc tính của myricetin, chúng tôi dự kiến sử dụng chương trình sắc ký pha đảo với cột RP 18 ít phân cực Để xây dựng phương pháp HPLC định lượng myricetin, chúng tôi dự

kiến tiến hành khảo sát các bước sau:

- Khao sat pha dong

- Khảo sát bước sóng phát hiện để chọn chương trình sắc ký thích hợp cho

phép tách được các tạp chất khác ra khỏi myricetin

Chúng tôi dự kiến áp dụng điều kiện sắc ký như sau:

- Cot RP 18: 250 x 4.6 mm: 5um

- Toe d6 dong: | ml/phiit

- Detector: Diod array quét phé tir 190 dén 400nm dé chon bước sóng cho độ

hap thụ cực đại

- Thétich tiém: 20 ul

- Pha mau: Pha trong methanol

- Pha dong:

+ Pha dong 1: Dung dich acid Phosphoric 0,01M — acetomitril (7:3)

+ Pha động 2: Dung dịch KH;PO¿ 0.025M pH 3.0 — Acetonitril (7:3)

- - Bước sóng phát hién: 254 nm va 376 nm

N to

Thắm định phương pháp

Các tiêu chuẩn cân xác định:

- Xác định độ ôn định của hệ thống sắc ký ;

- Khoảng tuyến tính (yêu cầu r > 0.999):

Độ lặp lại (yêu cầu RSD < 2.0%) :

Xác định giới hạn phát hiện (LOD)

Xác định giới hạn định lượng (LOQ)

Độ đúng (yêu cầu > 97.0%)

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Tiên hành chạy SK với các điêu kiện như trên, ghi lại sắc ký đô

- §o sánh thời gian lưu của pic chính trên phố đô của mẫu chuẩn va mẫu thử

- Tính toán kết quả theo công thức:

Xi A Sk m,.100 St «100

Trong dé:

X : Hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử (%)

S,, Sc : Lần lượt là diện tích pic của chất cần xác định tương ứng trên SKĐ

Mi ® VÀ ` 7 - a

cua mau thu va cua mau chuan

k, k, : Lan lượt là hệ sô pha loãng của mâu thử và của mâu chuân

m, m, : Lân lượt là khôi lượng của mâu thử và của mâu chuân (g)

C; : Hàm lượng của mẫu chuẩn (%4):

Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc các hàm số trong