Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trong cấy ghép và tái tạo xương trên cơ sở hydrogel composite sinh học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan)

MỞ ĐẦU Vật liệu y sinh đã và đang đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ để đáp ứng nhu cầu thay thế các bộ phận cơ thể, cấy ghép mô, xƣơng của con ngƣời, hứa hẹn cho việc chữa trị và tái tạo các mô và cơ quan bị mất hoặc bị tổn thƣơng do chấn thƣơng, bệnh tật hoặc lão hóa. Trong lĩnh vực vật liệu dùng cho xƣơng, nhiều loại vật liệu dùng trong cấy ghép và thay thế xƣơng đã phát triển đáng kể trong những thập kỷ qua nhƣ kim loại và hợp kim (titan, hợp kim của titan, thép không rỉ...). Những vật liệu này tuy tƣơng hợp sinh học nhƣng tính chất cơ lý của kim loại, hợp kim khác biệt nhiều so với xƣơng dẫn đến nguy cơ gãy xƣơng do kém tƣơng thích giữa phần xƣơng tiếp xúc với kim loại ghép. Vì vậy, các nhà khoa học trên thế giới hiện nay quan tâm đến vật liệu trên cơ sở Hydroxyapatite (HAp) và biphase calcium phosphate (BCP). HAp và BCP có tính tƣơng hợp sinh học, hoạt tính sinh học cao, và khả năng chữa lành xƣơng do thành phần tƣơng tự thành phần khoáng trong xƣơng. Mặt khác, HAp và BCP có thể từ từ hòa tan trong cơ thể giải phóng ion calcium và phosphate có lợi trong việc hình thành và phát triển xƣơng. Tuy nhiên HAp và BCP ở dạng bột nên khó tạo hình có thành phần, cấu trúc xốp tƣơng tự nhƣ xƣơng. Hydrogel composit trên cơ sở BCP và polymer sinh học có thành phần, cấu trúc xốp tƣơng tự xƣơng, tƣơng hợp sinh học, suy giảm sinh học và BCP thúc đẩy sự tạo khoáng, cải thiện tính chất cơ học của vật liệu. Nhƣng các vật liệu này suy giảm nhanh, chƣa phù hợp với sự phát triển của xƣơng. Để giải quyết vấn đề trên cần thiết phải biến tính các polymer sinh học nhằm giảm khối lƣợng suy giảm, hƣớng tới ứng dụng các vật liệu hydrogel composit này trong cấy ghép và tái tạo xƣơng. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trong cấy ghép và tái tạo xƣơng trên cơ sở hydrogel composit sinh học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan)”. Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trên cơ sở hydrogel composit sinh học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan) nhằm mục đích tạo ra vật liệu có khả năng tƣơng hợp sinh học, kích thích sự phát triển xƣơng, có thời gian suy giảm phù hợp với thời gian xƣơng phát triển để có thể ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xƣơng. Nội dung nghiên cứu luận án bao gồm: - Nghiên cứu tổng hợp nano BCP bằng phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm ứng dụng trong vật liệu sinh y. - Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin gelatin (TA-Gelatin) và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP. - Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin polyethyleneglycol gelatin (TA-PEG-Gelatin) và hydrogel composit TAPEG-Gelatin/BCP. - Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel hydroxyphenyl acetic chitosan (HPA-Chitosan) và hydrogel composit HPAChitosan /BCP. - Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin tetronic chitosan (TA-TE-Chitosan) và hydrogel composit TA-TEChitosan/BCP. - Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin polyethyleneglycol chitosan (TA-PEG-Chitosan) và hydrogel composit TAPEG-Chitosan/BCP.

VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU MỚI TRONG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO XƯƠNG TRÊN CƠ SỞ HYDROGEL COMPOSIT SINH HỌC GỒM BIPHASIC CALCIUM PHOSPHATE VÀ POLYMER SINH HỌC (GELATIN, CHITOSAN)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH KHOA HỌC VẬT LIỆU

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2015

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU MỚI TRONG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO XƯƠNG TRÊN CƠ SỞ HYDROGEL COMPOSIT SINH HỌC GỒM BIPHASIC CALCIUM PHOSPHATE VÀ POLYMER SINH HỌC (GELATIN, CHITOSAN)

Chuyên ngành: VẬT LIỆU CAO PHÂN TỬ VÀ TỔ HỢP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

LỜI CÁM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa và TS Trần Ngọc Quyển, những người Thầy đã dành cho tôi sự động viên giúp đỡ tận tình và những định hướng khoa học hiệu quả trong suốt quá trình thực hiện luận án này

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và khích lệ của các cán bộ, đồng nghiệp khác trong Viện Khoa học vật liệu ứng dụng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Viện Khoa học vật liệu đối với tôi trong quá trình thực hiện luận án

Luận án này được hỗ trợ kinh phí của đề tài nghiên cứu cơ bản của Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), mã số 104.04-2011.49

Sau cùng, tôi xin cảm ơn và thực sự không thể quên được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, bạn bè, anh em xa gần và sự động viên, tạo điều kiện của những người thân trong gia đình trong suốt quá trình tôi hoàn thành luận

án này

Tp HCM, tháng 01 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Phương

LỜI CAM ĐOAN

Công trình được thực hiện tại phòng Hóa dược − Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng − Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tại Thành phố

Hồ Chí Minh

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Nguyễn Cửu Khoa và TS Trần Ngọc Quyển Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực, được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Phương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1.GIỚI THIỆU VẬT LIỆU DÙNG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO XƯƠNG 4

1.1.1.Thành phần, cấu tạo của xương 4

1.1.2.Vật liệu dùng cấy ghép và tái tạo xương 8

1.2.HYDROGEL 12

1.2.1.Giới thiệu về hydrogel 12

1.2.2.Tính chất của hydrogel 20

1.3.HYDROGEL COMPOSIT 23

1.3.1.Giới thiệu về hydrogel composit 23

1.3.2.Biphasic calcium phosphate 27

1.3.3.Polymer sinh học và các phản ứng biến tính, polyethyleneglycol hóa polymer sinh học (gelatin và chitosan) 32

1.3.4.Ứng dụng của hydrogel composit trong cấy ghép và tái tạo xương 37

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 42

2.1 HÓA CHẤT 42

2.2 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ 43

2.3 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 44

2.3.1 Tổng hợp BCP 44

2.3.2 Tổng hợp hydrogel composit TA-Gelatin/BCP 45

2.3.3 Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 46

2.3.4 Tổng hợp hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 48

2.3.5 Tổng hợp hydrogel composit TA-Te-Chitosan /BCP 50

2.3.6 Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 52

2.3.7 Tổng hợp hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 55

2.4 CÁC KHẢO SÁT CÁC TÍNH CHẤT CỦA HYDROGEL VÀ

HYDROGEL COMPOSIT 58

2.4.1 Khảo sát thời gian tạo gel của hydrogel và hydrogel composit 58

2.4.2 Khảo sát hình thái của hydrogel và hydrogel composit 58

2.4.3 Khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel và hydrogel composit 58

2.4.4.Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel và hydrogel composit 58

2.4.5 Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel composit 59

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 62

3.1 TỔNG HỢP BCP 62

3.1.1 Kết quả phân tích XRD của BCP 62

3.1.2 Kết quả phân tích IR của BCP 65

3.1.3 Kết quả khảo sát hình thái của BCP bằng hình ảnh SEM 66

3.2 HYDROGEL COMPOSIT TA-Gelatin/BCP 68

3.2.1 Tổng hợp TA-Gelatin 68

3.2.2 Tổng hợp hydrogel Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP 70

3.2.3 Khảo sát hình thái hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP 73

3.2.4 Khảo sát khối lượng suy giảm sinh học của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP 73

3.3 HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-GELATIN/BCP 74

3.3.1 Tổng hợp TA-PEG-Gelatin 75

3.3.2 Tổng hợp hydrogel PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 80

3.3.3 Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 82 3.3.4 Khảo sát khối lượng suy giảm sinh học của hydrogel TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 83 3.3.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-Gelatin

và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 84 3.3.6 Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG-Gelatin và

hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 86 3.4 HYROGEL COMPOSIT HPA-CHITOSAN/BCP 89 3.4.1 Tổng hợp HPA-Chitosan 89 3.4.2 Tổng hợp hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 91 3.4.3 Khảo sát hình thái hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 93 3.4.4 Khảo sát khối lượng suy giảm sinh học của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 93 3.5 HYROGEL COMPOSIT TA-Te-Chitosan 95 3.5.1 Tổng hợp TA-Te-Chitosan 95 3.5.2 Tổng hợp hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 100 3.5.3 Khảo sát hình thái hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 101 3.5.4 Khảo sát khối lượng suy giảm sinh học của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 102 3.5.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel TA-Te-Chitosan

và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 104

3.5.6 Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 106 3.6 HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-CHITOSAN/BCP 108 3.6.1 Tổng hợp TA-PEG-Chitosan 108 3.6.2 Tổng hợp hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 111 3.6.3 Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 113 3.6.4 Khảo sát khối lượng suy giảm sinh học của hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 113 3.6.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 114 3.6.6 Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 117 3.7 HYROGEL COMPOSIT TA-PEG-CHITOSAN OXI HÓA/BCP 119 3.7.1 Tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa 119 3.7.2 Tổng hợp hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 122 3.7.3 Khảo sát hình thái hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 124 3.7.4 Khảo sát khối lượng suy giảm sinh học của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 125 3.7.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 126 3.7.6 Khảo sát khả năng tạo khoáng của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 128

3.8 SO SÁNH CÁC HỆ HYDROGEL VÀ HYROGEL COMPOSIT TRÊN CƠ SỞ POLYMER SINH HỌC (GELATIN, CHITOSAN) VÀ

BCP 130

KẾT LUẬN 135

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 137

TÀI LIỆU THAM KHẢO 139 PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Sơ đồ tổng hợp BCP P1 Phụ lục 2: Sơ đồ tổng hợp TA-Gelatin P2 Phụ lục 3: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Gelatin P3 Phụ lục 4: Sơ đồ tổng hợp HPA-Chitosan P4 Phụ lục 5: Sơ đồ tổng hợp TA-TE-Chitosan P5 Phụ lục 6: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Chitosan P6 Phụ lục 7: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa P7 Phụ lục 8: Xây dựng đường chuẩn β-TCP P8 Phụ lục 9: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,57 tại các pH:

(a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 P9 Phụ lục 10: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,61 tại các pH:

(a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 P10 Phụ lục 11: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,57: (a) pH=7, (b)

pH=9 và (c) pH=11 P11 Phụ lục 12: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,61: (a) pH=7, (b)

pH=9 và (c) pH=11 P12 Phụ lục 13: Xây dựng đường chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ Tyramin P13 Phụ lục 14: Phổ FTIR của gelatin P14 Phụ lục 15: Phổ FTIR của TA-PEG-gelatin P14

Phụ lục 16: Giản đồ XRD (a) hydrogel TA-PEG-gelatin và hydrogel composit TA-PEG-gelatin/BCP trước khi ngâm dung dịch SBF, (b) hydrogel composit TA-PEG-gelatin/10%BCP sau khi ngâm dung dịch SBF P15 Phụ lục 17: Xây dựng đường chuẩn của độ hấp thu A và nồng độ HPA P16

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 Danh mục các ký hiệu

HPA-Chitosan Hydroxyl phenylacetic axit-Chitosan

UV-Vis Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible Spectrum)

PLGA poly(lactic-co-glycolic) axit

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Cấu tạo của xương 4

Hình 1.2: Thành phần, cấu trúc của collagen (hydroxylysyl pyridinoline và lysyl pyridinoline) 6

Hình 1.3: Liên kết ngang 14

Hình 1.4: Phản ứng Michael 15

Hình 1.5: Phản ứng liên kết ngang hình thành hydrogel giữa các protein dưới xúc tác của enzyme transaminase 16

Hình 1.6: Phản ứng liên kết ngang hình thành hydrogel giữa các protein dưới xúc tác của enzyme tyrosinase 16

Hình 1.7 Enzyme HRP và cơ chế xúc tác hình thành gốc tự do phenoxyl tham gia tạo liên kết ngang 17

Hình 1.8: Phản ứng tạo gel bằng enzyme horseradish peroxidase (HRP) 17

Hình 1.9: Tương tác kỵ nước 18

Hình 1.10: Tương tác ion 19

Hình 1.11: Sự trương nở của hydrogel 20

Hình 1.12: Các giai đoạn của quá trình lành xương 25

Hình 1.13: Phản ứng oxi hóa cellulose: (a) oxi hóa alcohol bậc một; (b) oxi hóa cắt diol 34

Hình 1.14: Phản ứng oxi hóa chitosan 35

Hình 1.15: Ảnh minh họa sự tương tác giữa hydrogel trên cơ sở chitosan oxi hóa với collagen trong mô 36

Hình 2.1: Các bước tổng hợp TA-PEG-Gelatin 46

Hình 2.2: Các bước tổng hợp Tyramin-Tetronic-Chitosan 50

Hình 2.3: Các bước tổng hợp TA-PEG-Chitosan 49

Hình 2.4: Các bước tổng hợp TA-PEG-Chitosan oxi hóa 55

Hình 3.1: Giản đồ XRD của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53 tại các pH: (a)

pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 62

Hình 3.2: Phổ FTIR của HAp và β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53: (a) pH=7, (b) pH=9 và (c) pH=11 65

Hình 3.3: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp bằng phương pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm với tỉ lệ mol ca/P=1,61 tại pH=9 66

Hình 3.4: Hình ảnh SEM của HAp tổng hợp theo phương pháp kết tủa không sử dụng sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P= 1,67 tại pH=8 (h-1) và pH=9 (i-1) 67

Hình 3.5: Hình ảnh SEM của HAp và β-TCP tại các điều kiện phản ứng khác nhau 67 Hình 3.6: Sơ đồ tổng hợp TA-Gelatin 68

Hình 3.7: Phổ 1HNMR của TA-Gelatin 68

Hình 3.8: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP theo lượng H2O2/TA-Gelatin tại lượng HRP/TA-Gelatin là 0,00025% và nồng độ TA-Gelatin 10% 71

Hình 3.9: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP theo lượng HRP/TA-Gelatin tại lượng H2O2/TA-Gelatin là 0,01% và nồng độ TA-Gelatin 10% 71

Hình 3.10: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-Gelatin và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP với các lượng BCP khác nhau 73

Hình 3.11:Đồ thị % khối lượng suy giảm của hydrogel và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP theo thời gian 74

Hình 3.12: Sơ đồ tổng hợp PEG  NPC 75

Hình 3.13: Phổ 1H NMR của NPCPEGNPC 75

Hình 3.14: Sơ đồ tổng hợp TA- PEG  NPC 76

Hình 3.15: Phổ 1H NMR của TAPEGNPC 77

Hình 3.16: Sơ đồ tổng hợp TA-PEG-Gelatin 78 Hình 3.17: Phổ 1H NMR TAPEGgelatin 78 Hình 3.18: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và

hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lượng H2O2PEG-Gelatin tại lượng HRP/TA-PEG-Gelatin là 0,00025% và nồng độ TA-PEG-Gelatin 10% 80 Hình 3.19: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Gelatin và

/TA-hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo lượng PEG-Gelatin tại lượng H2O2/TA-PEG-Gelatin là 0,0125% và nồng độ TA-PEG-Gelatin 10% 81 Hình 3.20: Hình ảnh SEM của TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-

HRP/TA-PEG-Gelatin/BCP với các lượng BCP khác nhau 82 Hình 3.21: Đồ thị % khối lượng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Gelatin và

hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP theo thời gian 83 Hình 3.22: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Gelatin và

hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP 84 Hình 3.23: Sự bám dính và phát triển của tế bào xương MG-63 trên hydrogel

TA-PEG-Gelatin và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP sau thời gian 5 ngày 85 Hình 3.24: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Gelatin sau 2 tuần

ngâm trong dung dịch SBF 86 Hình 3.25: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-

Gelatin/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 87 Hình 3.26: Sơ đồ tổng hợp HPA-Chitosan 88 Hình 3.27: Phổ 1H NMR của HPA-Chitosan 89 Hình 3.28: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel

composit HPA-Chitosan/BCP theo lượng H2O2/HPA-Chitosan

tại lƣợng HRP/TA-PEG-Gelatin là 0,00025% và nồng độ

HPA-Chitosan 5% 91

Hình 3.29: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP theo lƣợng HRP/HPA-Chitosan tại lƣợng H2O2/TA-PEG-Gelatin là 0,005% và nồng độ HPA-Chitosan 5% 92

Hình 3.30: Hình ảnh SEM của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 93

Hình 3.31: Đồ thị thời gian suy giảm của hydrogel HPA-Chitosan và hydrogel composit HPA-Chitosan/BCP 94

Hình 3.32: Sơ đồ tổng hợp Tetronic  NPC 95

Hình 3.33: Phổ 1H NMR của TetronicNPC 95

Hình 3.34: Sơ đồ tổng hợp TA  Tetronic  NPC 96

Hình 3.35: Phổ 1H NMR của TyraminTetronicNPC 97

Hình 3.36: Sơ đồ tổng hợp TA  Tetronic  Chitosan 98

Hình 3.37: Phổ 1H NMR của TyramintetronicChitosan 98

Hình 3.38: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP theo lƣợng H2O2/TA-Te-Chitosan tại lƣợng HRP/TA-Chitosan là 0,0025% và nồng độ TA- Te-Chitosan 10% 101

Hình 3.39: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP theo lƣợng HRP/TA-Te-Chitosan tại lƣợng H2O2/TA-Chitosan là 0,05% và nồng độ TA- Te-Chitosan 10% 101

Hình 3.40: Hình ảnh SEM của hydrpgel TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP với các lƣợng BCP khác nhau 102

Hình 3.41: Đồ thị % khối lượng suy giảm của hydrogel TA-Te-Chitosan và

hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP theo thời gian 103 Hình 3.42: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-Te-Chitosan và

hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP 104 Hình 3.43: Sự bám dính và phát triển của tế bào xương MG-63 trên hydrogel

TA-Te-Chitosan và hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP sau thời gian 5 ngày 105 Hình 3.44 Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-Te-Chitosan sau 2 tuần

ngâm trong dung dịch SBF

Hình 3.45.Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit

TA-Te-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 107 Hình 3.46: Sơ đồ tổng hợp TAPEGChitosan 109 Hình 3.47: Phổ 1H NMR TAPEGChitosan 109 Hình 3.48: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan và

hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo lượng H2O2PEG-Chitosan tại lượng HRP/TA-PEG-Chitosan là 0,005% và nồng độ TA-PEG-Chitosan 10% 111 Hình 3.49: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan và

/TA-hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo lượng PEG-Chitosan tại lượng H2O2/TA-PEG-Chitosan là 0,08% và nồng độ TA-PEG-Chitosan 10% 112 Hình 3.50: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-PEG-Chitosan và hydrogel

HRP/TA-composit TA-PEG-Chitosan/BCP với các lượng BCP khác nhau 113 Hình 3.51: Đồ thị % khối lượng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Chitosan và

hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP theo thời gian 114 Hình 3.52: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Chitosan và

hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP 115

Hình 3.53: Sự bám dính và phát triển của tế bào xương MG-63 trên hydrogel

TA-PEG-Chitosan và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP

sau thời gian 5 ngày 116

Hình 3.54: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Chitosan sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 117

Hình 3.55: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 118

Hình 3.56: Sơ đồ phản ứng oxi hóa chitosan 119

Hình 3.57: Sơ đồ tổng hợp PEG ghép chitosan oxi hóa 120

Hình 3.58: Phổ 1H NMR của TAPEGchitosan oxi hóa 120

Hình 3.59: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP theo lượng H2O2/TA-PEG-Chitosan oxi hóa tại lượng HRP/TA-PEG-Chitosan oxi hóa là 0,008% và nồng độ TA-PEG-Chitosan oxi hóa 10% 123

Hình 3.60: Đồ thị thời gian gel hóa của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP theo lượng HRP/TA-PEG-Chitosan oxi hóa tại lượng H2O2/TA-PEG-Chitosan oxi hóa là 0,08% và nồng độ TA-PEG-Chitosan oxi hóa 10% 123

Hình 3.61: Hình ảnh SEM của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP với các lượng BCP khác nhau 124

Hình 3.62: Đồ thị % khối lượng suy giảm của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP theo thời gian 125

Hình 3.63: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP 126

Hình 3.64: Sự bám dính và phát triển của tế bào xương MG-63 trên hydrogel

Chitosan oxi hóa và hydrogel composit Chitosan oxi hóa/BCP sau thời gian 5 ngày 127 Hình 3.65: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel TA-PEG-Chitosan oxi hóa

TA-PEG-sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 128 Hình 3.66: Hình ảnh SEM và EDS của hydrogel composit TA-PEG-Chitosan

oxi hóa/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 129

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất 42 Bảng 2.2 Các chất để pha 1000mL SBF có pH=7,4 61 Bảng 3.1: Tổng hợp các thông số và phần trăm khối lƣợng của β-TCP và HAp

theo tỉ lệ mol Ca/P 64 Bảng 3.2: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-Gelatin 69 Bảng 3.3: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Gelatin 79 Bảng 3.4: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 87 Bảng 3.5: Tính toán lƣợng HPA có trong HPA-Chitosan 90 Bảng 3.6: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-Te-Chitosan 99 Bảng 3.7: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của hydrogel composit TA-Te-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 107 Bảng 3.8: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Chitosan 110 Bảng 3.9: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 118 Bảng 3.10: Tính toán lƣợng tyramin có trong TA-PEG-Chitosan oxi hóa 121 Bảng 3.11: Thành phần % khối lƣợng các nguyên tố trong phân tích EDS của

hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP sau 2 tuần ngâm trong dung dịch SBF 129 Bảng 3.12: So sánh các hydrogel và hydrogel composit trên cơ sở polymer

sinh học (gelatin, chitosan) và BCP 132

MỞ ĐẦU

Vật liệu y sinh đã và đang được nghiên cứu mạnh mẽ để đáp ứng nhu cầu thay thế các bộ phận cơ thể, cấy ghép mô, xương của con người, hứa hẹn cho việc chữa trị và tái tạo các mô và cơ quan bị mất hoặc bị tổn thương do chấn thương, bệnh tật hoặc lão hóa

Trong lĩnh vực vật liệu dùng cho xương, nhiều loại vật liệu dùng trong cấy ghép và thay thế xương đã phát triển đáng kể trong những thập kỷ qua như kim loại và hợp kim (titan, hợp kim của titan, thép không rỉ ) Những vật liệu này tuy tương hợp sinh học nhưng tính chất cơ lý của kim loại, hợp kim khác biệt nhiều so với xương dẫn đến nguy cơ gãy xương do kém tương thích giữa phần xương tiếp xúc với kim loại ghép

Vì vậy, các nhà khoa học trên thế giới hiện nay quan tâm đến vật liệu trên cơ sở Hydroxyapatite (HAp) và biphase calcium phosphate (BCP) HAp

và BCP có tính tương hợp sinh học, hoạt tính sinh học cao, và khả năng chữa lành xương do thành phần tương tự thành phần khoáng trong xương Mặt khác, HAp và BCP có thể từ từ hòa tan trong cơ thể giải phóng ion calcium và phosphate có lợi trong việc hình thành và phát triển xương Tuy nhiên HAp

và BCP ở dạng bột nên khó tạo hình có thành phần, cấu trúc xốp tương tự như xương

Hydrogel composit trên cơ sở BCP và polymer sinh học có thành phần, cấu trúc xốp tương tự xương, tương hợp sinh học, suy giảm sinh học và BCP thúc đẩy sự tạo khoáng, cải thiện tính chất cơ học của vật liệu Nhưng các vật liệu này suy giảm nhanh, chưa phù hợp với sự phát triển của xương

Để giải quyết vấn đề trên cần thiết phải biến tính các polymer sinh học nhằm giảm khối lượng suy giảm, hướng tới ứng dụng các vật liệu hydrogel composit này trong cấy ghép và tái tạo xương

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu

mới trong cấy ghép và tái tạo xương trên cơ sở hydrogel composit sinh học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan)”

Mục tiêu của luận án:

Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trên cơ sở hydrogel composit sinh

học gồm biphasic calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan)

nhằm mục đích tạo ra vật liệu có khả năng tương hợp sinh học, kích thích sự phát triển xương, có thời gian suy giảm phù hợp với thời gian xương phát triển để có thể ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương

Nội dung nghiên cứu luận án bao gồm:

- Nghiên cứu tổng hợp nano BCP bằng phương pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm ứng dụng trong vật liệu sinh y

- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin gelatin (TA-Gelatin) và hydrogel composit TA-Gelatin/BCP

- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin polyethyleneglycol gelatin (TA-PEG-Gelatin) và hydrogel composit TA-PEG-Gelatin/BCP

- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel hydroxyphenyl acetic chitosan (HPA-Chitosan) và hydrogel composit HPA-Chitosan /BCP

- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin tetronic chitosan (TA-TE-Chitosan) và hydrogel composit TA-TE-Chitosan/BCP

- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin polyethyleneglycol chitosan (TA-PEG-Chitosan) và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan/BCP

- Nghiên cứu tổng hợp và xác định các tính chất của hydrogel tyramin polyethyleneglycol chitosan oxi hóa (TA-PEG-Chitosan oxi hóa) và hydrogel composit TA-PEG-Chitosan oxi hóa/BCP

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VẬT LIỆU DÙNG CẤY GHÉP VÀ TÁI TẠO XƯƠNG

1.1.1 Thành phần, cấu tạo của xương

Xương của động vật có chức năng cơ học và chức năng cân bằng nội

môi (biological homeostasis) Xương đảm nhận các vai trò trong việc tạo hình

cơ thể, tạo các khoang chứa cơ quan nội tạng, hỗ trợ quá trình vận động, là nơi sản sinh các tế bào máu, lưu trữ và cung cấp các ion khoáng

Xương là vật liệu dạng composit có thành phần bao gồm chất nền hữu

cơ (organic matrix), các khoáng chất, tế bào và nước [1] Sự tích hợp của các

khoáng chất trong chất nền hữu cơ làm cho xương có tính chất cơ học cao do kết hợp giữa các tính chất giòn của khoáng chất và tính đàn hồi của chất nền hữu cơ [2]

Hình 1.1: Cấu tạo của xương

(http://humananatomypics.com/tag/the-skeleton-of-a-human-body-laboratory-exercise)

Xương tương đối cứng được tạo bởi hydroxyapatite Ca5(PO4)3OH Xương có sức nén tương đối cao nhưng sức căng kém, khá giòn và có độ co giãn phụ thuộc vào thành phần sinh học Xương có thành phần, cấu trúc mắt

lưới và từng vùng khác nhau của xương có độ đặc khác nhau Cơ thể người có

206 xương và được chia làm 3 phần: xương đầu, xương mình và xương chi

Xương có hai loại rắn chắc và xốp Vỏ (lớp ngoài) xương rắn chắc chiếm phần lớn khối lượng của xương Vỏ xương đặc nên có diện tích bề mặt thấp Xương xốp có thành phần, cấu trúc tổ ong, có diện tích bề mặt lớn, nhưng chỉ chiếm phần nhỏ khối lượng của xương

Xương có thể mềm hay cứng Xương mềm với thành phần, cấu trúc không đồng nhất, sức chịu nén kém có thể thay thế trong quá trình phát triển hoặc hồi phục xương Xương mềm thường được thay thế bởi xương cứng trong quá trình phát triển xương

a Chất nền hữu cơ

Như trên đã nói, xương bao gồm những tế bào sống (living cells) nằm bên trong chất nền hữu cơ-khoáng (mineralized organic matrix) Chất nền này

chứa thành phần hữu cơ (phần lớn là collagen) và thành phần vô cơ (chủ yếu

là các hydroxyapatite) Thành phần hữu cơ chiếm khoảng 30% khối lượng xương và 70% khối lượng xương là hydroxyapatite Các bó sợi collagen tạo

nên tính co dãn (tensile strength) và kết hợp với (synergistic) các tinh thể

hydroxyapatite phân bố bên trong giữa các sợi collagen tạo nên tính chịu nén

(compressional strength) của xương

Collagen loại I là thành phần chính của chất nền hữu cơ của xương,

chiếm khoảng 30% của chất nền khô không khử khoáng (dry

nondemineralized matrix) Collagen loại I là một dị polymer (heteropolymer)

của hai chuỗi giống nhau và một chuỗi riêng biệt, mỗi chuỗi đều có thành phần, cấu trúc chính (Gly-X-Y)n, trong đó X và Y thường là proline hoặc hydroxyproline [3] Mô tip phổ biến nhất trong dãy axit amino của collagen là glycin-proline-X và glycin-X-hydroxyproline, với X là axit amino bất kỳ nào

đó khác với glycin, proline hay hydroxyproline

Hình 1.2: Thành phần, cấu trúc của collagen (hydroxylysyl

pyridinolinevà lysyl pyridinoline) [3]

Collagen được biến tính vị trí dịch mã (post-translationally modified)

để chứa hydroxylysine, hydroxyproline, và glycosylated hydroxylysine

Trong mạng ngoại bào (extracellular matrix), các hydroxylysine còn lại được tham gia vào sự hình thành liên kết ngang collagen ổn định (stable collagen

cross-links) (Hình 1.2)

Ngoài ra, chất nền hữu cơ của xương còn chứa một lượng nhỏ các collagen loại III, loại V và loại XII Những collagen này ảnh hưởng đến các tính chất của mô xương Các tinh thể chất khoáng của xương được liên kết với trục dài song song với trục collagen Trong trường hợp các phân tử collagen bị thay đổi (như trong trường hợp của các đột biến di truyền trong bệnh xương dẫn đến xương dễ gãy, hay còn gọi là bệnh xương giòn), tinh thể khoáng có kích thước nhỏ hơn so với tinh thể ở những người trong độ tuổi xương khỏe mạnh và các khoáng chất cũng có thể được tìm thấy bên ngoài sợi collagen Collagen làm thay đổi các tính chất của xương và khoáng chất

cho thấy tầm quan trọng của collagen đối với sự tạo khoáng thích hợp của xương

b Các khoáng chất của xương

Thành phần khoáng vô cơ của xương (bone mineral) là các muối của

calcium và phosphate, trong đó thành phần chính là hydroxyapatite với công thức hóa học Ca10(PO4)6(OH)2 [4] Phân tích các khoáng chất trong xương cho thấy tỉ lệ mol Ca:P từ 1,3 đến 1,9 Tỉ lệ này phụ thuộc sự đóng góp của các phosphate hữu cơ trong chất nền xương, và bản chất của các khoáng chất trong xương

Ngoài ra, thành phần khoáng vô cơ của xương còn có các vết của các nguyên tố magnesium, sodium, potassium và muối carbonate

Hiện tượng tạo khoáng xương được đặc biệt quan tâm bởi sự tạo khoáng xương có tính chất quan trọng trong quá trình hình thành xương Các kết quả của nhiều nghiên cứu khoa học cho thấy cơ chế tạo khoáng xương được thực hiện thông qua các quá trình tạo khoáng sinh học trong môi trường

tế bào (cell-mediated biomineralization) Nét chung của tạo khoáng sinh học

xương đều được thực hiện thông qua trung gian tế bào ở cả bên ngoài và bên

trong bộ khung xương (exo- and endo-skeleton) Chất nền protein, thường là

anion, hoạt động như hạt nhân tạo mầm kết tinh và chất điều chỉnh các quá trình khoáng hoá

Trong quá trình hình thành xương, sự tạo khoáng ban đầu xảy ra tại nhiều vùng dọc theo chất nền collagen và được coi là mầm của sự hình thành apatite đầu tiên Khi các tinh thể khoáng chất đầu tiên được hình thành ở những vị trí riêng rẽ, chúng phát triển bằng một quá trình kéo dài bằng sự kết

tụ Kích thước của các tinh thể khoáng chất trong xương rất nhỏ, các nhà khoa học cho rằng khoảng cách giữa các sợi collagen và khoảng cách giữa các chất nền protein hoạt động như chất ức chế điều chỉnh kích thước và hình dạng của

các tinh thể khoáng chất Các chất nền protein này ổn định các mầm tinh thể đầu tiên, làm cho quá trình tăng sinh khoáng chất thuận lợi hơn, cũng có thể bao phủ những tinh thể này và ảnh hưởng đến hình dạng, kích thước của tinh thể

Sự lắng đọng khoáng chất trong xương trong quá trình phát triển và tái tạo xương là một quá trình phức tạp liên quan đến các tế bào, các chất nền ngoại bào hữu cơ, và các quá trình hóa lý Khoáng chất của xương có nhiều thành phần và kích cỡ khác nhau, nhưng các tinh thể khoáng chất luôn gắn liền với chất nền collagen [6]

1.1.2 Vật liệu dùng cấy ghép và tái tạo xương

Vật liệu y sinh đã và đang được nghiên cứu mạnh mẽ để đáp ứng nhu cầu thay thế các bộ phận cơ thể, cấy ghép mô, xương của con người, hứa hẹn cho việc chữa trị và tái tạo các mô và cơ quan bị mất hoặc bị hư do chấn thương, bệnh tật hoặc lão hóa Trong những năm gần đây, con người đã đạt được những tiến bộ đáng kể trong việc cấy ghép nội tạng, phẫu thuật tái tạo

và sử dụng mô nhân tạo để điều trị, cấy ghép các cơ quan nội tạng hoặc mô xương [7] Sự phát triển không ngừng của khoa học công nghệ đã cho ra đời rất nhiều vật liệu dùng trong cấy ghép, tái tạo xương

a Các phương pháp ghép xương

Phương pháp ghép xương tự thân (xương từ cơ thể người nhận ghép từ nhiều vùng khác nhau) là tốt nhất bởi vì vật liệu này có khả năng tạo xương rất cao và không xảy ra phản ứng thải ghép, nhưng nhược điểm là bệnh nhân phải chịu thêm phẫu thuật để lấy xương và có thể xảy ra các biến chứng do lấy xương

Phương pháp ghép xương đồng chủng (xương lấy từ cơ thể người khác), vật liệu này có tính tạo xương, tương hợp sinh học tốt, lượng xương không hạn chế, tránh được phẫu thuật lấy xương Tuy nhiên vật liệu này có

thể có tính kháng nguyên, dẫn đến phản ứng miễn dịch của mô chủ và nguy

cơ lây nhiễm bệnh

Phương pháp ghép xương dị chủng (xương ghép từ sinh vật khác loài), vật liệu này thường có nguồn gốc từ xương bò, heo hoặc san hô, được xử lý

và xét nghiệm nghiêm ngặt để đảm bảo không mang mầm bệnh Vật liệu có tính kích tạo xương, bệnh nhân không phải chịu thêm phẫu thuật lấy xương Tuy nhiên vật liệu này có tính tương hợp sinh học kém do khác biệt về loài và khả năng bị thải trừ cao do phản ứng miễn dịch Ở một số nước loại vật liệu này không được chấp nhận do quan niệm tôn giáo

Phương pháp ghép xương bằng vật liệu y sinh tổng hợp được các nhà nghiên cứu quan tâm vì chúng có một số ưu điểm như: vật liệu có tính tương hợp sinh học, lượng vật liệu không hạn chế và không có nguy cơ lây nhiễm bệnh

Công nghệ mô xương sử dụng những vật liệu có những yếu tố sinh học như: tế bào, gene và protein hỗ trợ cho việc tái tạo xương [6] Để đảm bảo việc điều trị thành công các khuyết tật xương thì vật liệu phải có ba chức năng chính Đầu tiên, các vật liệu cung cấp các hình dạng giải phẫu chính xác để xác định và duy trì không gian cho việc tái tạo mô Thứ hai, vật liệu phải đáp ứng được tính cơ lý tạm thời trong các mô khuyết Thứ ba vật liệu tăng cường khả năng tái tạo của các yếu tố sinh học đã được chọn

Điều đầu tiên trong thiết kế tính toán là vật liệu phải đạt được sự cân bằng giữa khả năng chịu tải lực và yêu cầu về khả năng tái tạo mô của vật liệu Đối với mục đích chịu lực, vật liệu xốp phải đáp ứng được độ cứng tương đương với mô xương Về khả năng tái tạo mô, vật liệu thích hợp cho phép sự di chuyển của tế bào, sự phân phối mạch máu và hình thành mô [8-9]

Điều thứ hai cho tính toán thiết kế là vật liệu dựa trên các nghiên cứu chứng minh rằng thành phần, cấu trúc của vật liệu ảnh hưởng đến việc tái tạo

mô Kühne và cộng sự [10] chỉ ra rằng tế bào xương phát triển trên hydroxyapatite corraline với đường kính lỗ xốp trung bình 500 µm tốt hơn so với đường kính lỗ trung bình 200 µm Grenga và cộng sự [11] báo cáo rằng thành phần, cấu trúc HAp ảnh hưởng tới sự phân bố mạch máu cũng như tới

sự hình thành xương Kuboki [12] cho thấy con đường phát triển của xương khác nhau khi đường kính lỗ xốp trung bình của HAp khác nhau Lỗ xốp với đường kính trung bình 90-100 µm thuận lợi cho việc hình thành sụn, trong khi

lỗ trung bình 300-400 µm thuận lợi cho quá trình hình thành xương không có sụn Hui và cộng sự [13] đã báo cáo rằng làm tăng sự hình thành xương trong xương ghép ở thỏ tăng lên đáng kể với độ dẫn chất lỏng cao, một thông số phụ thuộc vào thành phần, cấu trúc lỗ xốp và các liên kết của vật liệu ghép Tuy nhiên, những báo cáo trên chỉ giới hạn nghiên cứu về kích thước lỗ xốp của vật liệu nhưng nghiên cứu về liên kết trong vật liệu chưa rõ ràng

Điều thứ ba cho tính toán thiết kế là vật liệu phải có hình dạng phù hợp với khuyết tật của xương Điều này rất quan trọng trong lĩnh vực giải phẫu tái tạo các ca chấn thương sọ, mặt và chỉnh hình phức tạp cũng như các ca liên quan tới xương sống Những dạng hình học phức tạp sẽ được nhận dạng bởi các phương pháp hiện đại là chụp cắt lớp (CT) hoặc chụp cộng hưởng từ (MRI) Các thông tin kỹ thuật số được giải mã và chuyển thành dạng thông tin có thể được sử dụng để tạo ra hình dạng của vật liệu

b Mô phỏng sinh học xương

Mô phỏng sinh học rất được quan tâm trong việc tạo ra vật liệu ứng dụng trong tái tạo mô [14] Phỏng sinh học là một thuật ngữ biểu thị sự mô phỏng thành phần, cấu trúc và quy trình sinh học Về mặt thiết kế vật liệu, phỏng sinh học đề cập đến vật liệu sao chép thành phần, cấu trúc và chức năng của mô xương

Việc thiết kế vật liệu mô phỏng sinh học rất phức tạp và khó khăn, đặc biệt trong việc thiết kế xương nhân tạo Với các vật liệu mô xương xốp nhân tạo, các thiết kế mới chỉ dừng ở cấp độ một của thành phần, cấu trúc vi mô mà thiếu hẳn yếu tố thành phần, cấu trúc mô phỏng sinh học Thiết kế thành phần, cấu trúc phỏng sinh học đơn giản nhất được thực hiện thông qua các dữ liệu chụp ảnh CT ba chiều Việc tạo ra vật liệu thành phần, cấu trúc với thành phần, cấu trúc mô phỏng sinh học cần phải lưu ý tới các điểm sau:

-Đầu tiên, độ cứng của vật liệu sinh học cần phải phù hợp với độ cứng của xương nếu muốn các vật liệu phù hợp với tính chất của xương

-Thứ hai, thành phần, cấu trúc xốp của vật liệu phải phù hợp thành phần, cấu trúc xương tự nhiên

-Thứ ba, các mô tái tạo sẽ có thành phần, cấu trúc và thành phần giống

mô xương tự nhiên

c Những yêu cầu đối với vật liệu dùng trong kỹ thuật mô xương

Theo ASTM F2150-02 (ASTM 2002), vật liệu dùng trong kỹ thuật mô

xương được sử dụng như chất hỗ trợ, chất vận chuyển thuốc, hoặc chất nền

thuận tiện cho sự chuyển vị, sự liên kết, sự vận chuyển của tế bào hay các phân tử có hoạt tính sinh học, sử dụng trong thay thế, sửa chữa và tái tạo mô xương [15] Ứng dụng của vật liệu có thể tăng quá trình phục hồi vết thương Các vật liệu này như chất nền nhân tạo có thể đóng vai trò như một khuôn mẫu tạm thời dùng cho tế bào bám dính và phát triển Vật liệu còn có thể tổng hợp mạng protein ngoại bào (ECM) và sinh ra các mô mới Ngoài ra, vật liệu

có thể suy giảm để các cơ quan và mô tự nhiên hình thành thay thế vật liệu cấy ghép

Cần nghiên cứu các tính chất của vật liệu dùng trong mô xương như: tính chất bề mặt, tính chất vật lý, tính chất cơ học, tính chất suy giảm

- Tính chất bề mặt: bề mặt là một yếu tố quan trọng trong tương tác giữa

tế bào với vật liệu Vật liệu có bề mặt hóa học thích hợp sẽ thúc đẩy tế bào bám dính, phát triển và biệt hóa

- Tính chất vật lý: vật liệu có thành phần, cấu trúc xốp với kích thước lỗ xốp thích hợp ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào, sự vận chuyển chất dinh dưỡng và trao đổi chất Kích thước lỗ xốp thích hợp cho phép các tế bào di chuyển vào bên trong và phát triển, giúp xương phát triển bên trong vật liệu

- Tính chất cơ học: điều quan trọng trong thiết kế vật liệu là vật liệu có tính cơ học tương tự với mô tại vùng cấy ghép Tính chất cơ học phụ thuộc vào bản chất của vật liệu, thành phần, cấu trúc và chất nền của toàn bộ trạng thái xốp Tính chất cơ học có thể được thay đổi

- Tính chất suy giảm: vật liệu cần có tính suy giảm sinh học với khối lượng suy giảm phù hợp với sự phát triển của mô xương Theo ASTM F1635-04a (ASTM 2004), sự suy giảm của vật liệu chủ yếu là sự thủy phân trong điều kiện nhiệt độ cơ thể 37oC và pH xác định

1.2 HYDRGEL

1.2.1 Giới thiệu về hydrogel

a Khái niệm về hydrogel

Năm 1955, Giáo sư Lim và Wichterle, Prague, Cộng hòa Czech đã điều chế ra hydrogel đầu tiên với tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y sinh [16] Cho đến nay, hydrogel đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực

Hydrogel là các polymer được liên kết với nhau, bản chất ưa nước của polymer dẫn tới hydrogel có thể hấp thụ một lượng nước lớn Thành phần, cấu trúc của một hydrogel có thể được thiết kế cho ứng dụng chuyên biệt bằng cách lựa chọn các vật liệu ban đầu và quy trình kỹ thuật phù hợp [17, 18]

b Phân loại hydrogel

Có nhiều cách để phân loại hydrogel như dựa vào nguồn gốc, dựa vào thành phần polymer, dựa trên loại liên kết ngang Trong nghiên cứu này, hydrogel được phân loại theo cách thức hình thành các liên kết ngang bằng phương pháp vật lý hoặc phương pháp hóa học [19]

Có thể phân loại hydrogel theo những liên kết ngang hình thành gel hóa học (mối tương tác hóa học giữa các phân tử polymer) và gel vật lý (mối tương tác vật lý giữa các phân tử polymer) Những phương pháp tạo liên kết ngang khác nhau để tạo hydrogel được sử dụng để đạt được các đặc tính riêng biệt, như thời gian gel hóa, tính chất cơ lý, và tương hợp sinh học Các tính chất này của hydrogel rất quan trọng cho các ứng dụng trong cấy ghép và tái tạo mô

c Tổng hợp hydrogel

Tổng hợp hydrogel là quá trình tạo liên kết ngang giữa các phân tử polymer trong môi trường nước bằng các phương pháp khác nhau như: polymer hóa gốc tự do, tạo liên kết ngang bằng phản ứng trên các nhóm chức của polymer, tạo liên kết ngang bằng phản ứng xúc tác enzyme, tạo liên kết ngang bằng phức lập thể, tạo liên kết ngang bằng tác dụng nhiệt, tạo liên kết ngang bằng cách tạo siêu phân tử, tạo liên kết ngang bằng phức cyclodextrin, tạo liên kết ngang bằng cách kết hợp tương tác vật lý và tương tác hóa học

- Tạo liên kết ngang bằng sự polymer hóa gốc tự do

Tổng hợp các hydrogel ứng dụng trong sinh học, người ta thường dùng polymer hóa gốc tự do [20] Các chất dùng để tạo gốc tự do như chất khơi mào nhạy sáng, chất khơi mào oxi hóa khử…

Ưu điểm của chất khơi mào nhạy ánh sáng là tạo liên kết ngang nhanh,

và bất lợi là khi tiếp xúc với UV ở cường độ cao hoặc thời gian dài có thể ảnh hưởng xấu đến hoạt động trao đổi chất của tế bào Ngoài ra, nhiệt phát sinh

trong quá trình tạo liên kết ngang có thể gây hoại tử tế bào Vì vậy, cường độ của tia cực tím được giới hạn trong khoảng 5-10 mW/cm2 để ngăn sự hủy hoại tế bào

Ngoài ra, các chất khơi mào oxi hóa khử như: N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine (TEMED) và amoni peroxydisulfate (APS) được dùng làm chất khơi mào trong hydrogel Tăng nồng độ chất khơi mào sẽ giảm thời gian gel hóa và tăng cường tính cơ học Tuy nhiên, nồng độ chất khơi mào cao (10 mM) sẽ gây độc tế bào cao dẫn tới tỉ lệ sống của tế bào thấp (nhỏ hơn 30%) sau 3 ngày nuôi cấy tế bào

-Tạo liên kết ngang bằng phản ứng trên các nhóm chức của polymer Hydrogel có thể được tổng hợp thông qua các phản ứng giữa các nhóm chức như phản ứng Schiff-base, phản ứng cộng Michael

hydrogel dùng để tiêm trong kỹ thuật mô Hydrogel được tạo thành đơn giản bằng cách trộn hai polymer mang nhóm thân hạch và nhóm thân điện tử Các hydrogel được tạo thành qua phản ứng cộng Michael có thời gian gel hóa trung bình từ 0,5 đến 60 phút Thời gian gel có thể được điều chỉnh thông qua mật độ liên kết ngang Do phản ứng cộng Michael diễn ra trong điều kiện êm dịu nên các phản ứng không ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự tồn tại của tế bào trong suốt quá trình hình thành hydrogel Thông thường, các tế bào được kết hợp trong hydrogel vẫn có thể tồn tại từ vài ngày đến vài tháng Tuy nhiên, việc dùng dư các nhóm chức thiol vì thiol có thể gây chết tế bào [21-23]

Hình 1.4: Phản ứng Michael [22]

- Tạo liên kết ngang bằng phản ứng xúc tác enzyme

Enzyme thường cho thấy tính đặc hiệu cao, có khả năng tránh được phản ứng phụ trong quá trình tạo liên kết ngang Điều này giúp kiểm soát và

dự đoán các động học của sự gel hóa và làm tăng tỷ lệ liên kết ngang bằng cách điều chỉnh nồng độ enzyme Các enzyme thường được sử dụng để tổng hợp hydrogel như: Transglutaminase, Tyrosinase, Horseradish peroxidase

Transaminase có nhiều trong cơ thể người, enzyme này tham gia vào quá trình xúc tác cho phản ứng amide dẫn đến hình thành nối liên kết ngang N-C(g-glutamyl)lysine giữa 2 protein và dẫn đến hình thành hydrogel trên cơ

sở các protein có độ tương hợp sinh học cao [24]

Hình 1.5: Phản ứng liên kết ngang hình thành hydrogel giữa các protein

dưới xúc tác của enzyme Transaminase [24]

Enzyme Tyrosinase là enzyme phổ biến trong nấm rơm có thể oxi hóa các phenol có khối lượng phân tử thấp hoặc các phần tyrosine trong protein thành các quinone, sau đó những quinone này có thể phản ứng trực tiếp với các nhóm amine của các protein hoặc các hợp chất mang amine như chitosan tạo thành các hydrogel sinh học [25]

Hình 1.6: Phản ứng liên kết ngang hình thành hydrogel giữa các protein

dưới xúc tác của enzyme Tyrosinase [25]

Horseradish peroxidase (HRP) là enzyme (hemoprotein) được sử dụng

gần đây trong tổng hợp in situ nhiều loại hydrogel Trong phản ứng tạo

hydrogel, enzyme HRP xúc tác cho phản ứng ghép cặp của các hợp chất có phenol hoặc aniline trong sự hiện diện của lượng nhỏ chất oxi hóa H2O2 Cơ chế xúc tác hình thành gốc tự do phenoxyl của enzyme HRP có sự hiện diện của H2O2 thể hiện qua hình 1.7 Phản ứng tạo liên kết ngang carbon-carbon

hình thành ở vị trí ortho của 2 phân tử phenol hoặc carbon-oxygen ở vị trí

ortho của phenoxy và gốc tự do phenoxyl (hình 1.8) Nhiều loại hydrogel sinh

học trên cơ sở các polysaccharide, protein, polymer tổng hợp được biến tính nhóm phenoxy và sử dụng trong điều chế hydrogel xúc tác enzyme HRP [26-28]

Hình 1.7 Enzyme HRP và cơ chế xúc tác hình thành gốc tự do

phenoxyl tham gia tạo liên kết ngang [26]

Hình 1.8: Phản ứng tạo gel bằng enzyme horseradish peroxidase (HRP)

[26]

Nhìn chung phương pháp điều chế hydrogel bằng enzyme có những ưu điểm sau:

 Thời gian tạo gel ngắn

 Dễ điều khiển quá trình tạo gel

 Điều kiện phản ứng êm dịu (nhiệt độ cơ thể, môi trường trung tính)

 Không gây ra các phản ứng độc hại với mô, tế bào

- Tạo liên kết ngang bằng tác dụng nhiệt

Sự gel hóa nhạy nhiệt được kích hoạt bởi tương tác kỵ nước khi thay đổi nhiệt độ Hydrogel nhạy nhiệt như poly(ethylene oxid)-poly(propylene oxid)-poly(ethylene oxid) (PEO-PPO-PEO), tên thương mại là Pluronic và poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm) được sử dụng phổ biến nhất Tuy nhiên, do không suy giảm và có khả năng gây độc tế bào nên các polymer này

bị hạn chế ứng dụng vào kỹ thuật cấy mô Ví dụ, ở nồng độ 10% (w/w), dung dịch F127 Pluronic làm giảm đáng kể khả năng di chuyển các tế bào HepG2 Khi được giữ trong hydrogel với nồng độ F127 từ 15-20% các tế bào sẽ chết hoàn toàn trong vòng 5 ngày[29,30]

Những hydrogel nhạy nhiệt có khả năng suy giảm sinh học, chẳng hạn như các copolymer dạng khối hoặc dạng ghép có chứa các gốc PEO ưa nước

và các gốc kỵ nước PLA, khả năng gây độc thấp hơn Hydrogel nhạy nhiệt suy giảm sinh học cũng có thể được điều chế từ các polyme tự nhiên, chẳng hạn như gelatin và agarose Những polymer tự nhiên tan trong nước khác như polysaccharide, có thể được biến tính với một nhóm kỵ nước để tạo ra hydrogel vật lý [29-31]

Hình 1.9: Tương tác kỵ nước [31]

-Tạo liên kết ngang bằng tương tác ion

Tương tác ion đã được nghiên cứu rộng rãi để tạo liên kết ngang trong quá trình gel hóa Một lợi thế của phương pháp này là sự suy giảm sinh học

có thể xảy ra như sự phân ly ion trong ngoại bào, phá vỡ mạng lưới liên kết ngang

ví dụ khác về tương tác ion giữa hai phân tử polymer trái dấu là chuỗi peptide với các ion âm và ion dương xen kẽ có thể tự lắp ráp để tạo thành hydrogel [32, 33]

Tương tác ion cũng có thể được sử dụng để tạo liên kết ngang hạt nano gel, nhằm tạo ra chuỗi phân tử ba chiều thích hợp cho mang nhả thuốc Ví dụ,

vi cầu dextran được hình thành do tương tác phức tạp giữa các vi hạt tích điện trái dấu [34]

-Tạo liên kết ngang bằng liên kết hydro

Hydrogel hình thành nhờ tương tác tạo liên kết hydro có thể được thực hiện bằng cách tăng hoặc giảm nhiệt độ đến nhiệt độ đông đặc Poly(vinyl

ancohol) là một hydrogel điển hình được tạo thành theo phương pháp này Hỗn hợp của hai hay nhiều các polyme tự nhiên có thể có sự đồng bộ về tính lưu biến, có nghĩa là các tính đàn hồi, độ nhớt của hỗn hợp polymer giống gel nhiều hơn so với các tính chất này ở từng polymer riêng lẻ [31]

1.2.2 Tính chất của hydrogel

a Tính trương nở

Trong thành phần, cấu trúc của hydrogel các chuỗi polymer được liên kết với nhau qua các liên kết vật lý hoặc hóa học [20, 33] Do đó không có khái niệm về khối lượng phân tử của hydrogel Khả năng trương nở của hydrogel được xác định bởi khoảng không gian có sẵn bên trong hydrogel để chứa nước Các lực tương tác giữa polymer và nước quyết định sự trương nở của hydrogel Về cơ bản, tính ưa nước của hydrogel làm cho lực tương tác giữa polymer với nước trở nên mạnh hơn và hydrogel sẽ trương nở trong nước Độ trương nở của hydrogel bị ảnh hưởng bởi mật độ liên kết ngang và mật độ điện tích cũng như nồng độ của liên kết ngang trong polymer sau khi hình thành gel [35-37]

Hình 1.11: Sự trương nở của hydrogel [35]

Khả năng trương nở của hydrogel có thể được xác định bằng độ lớn của không gian bên trong mạng hydrogel sẵn có để chứa nước Tuy nhiên, xác định độ trương nở hydrogel là xác định các lực tương tác polymer-nước Khi