Xây dựng phương pháp định lượng felodipin trong huyết tương bằng GC MS

ĐẶT VẤN ĐỀHiện nay cùng với sự phát triển của xã hội ngày càng nhanh, mô hình bệnh tật ởnƣớc ta đang có nhiều biến động to lớn. Các bệnh không lây nhiễm, trong đó có các bệnh tim mạch đang có khuynh hƣớng tăng lên rõ rệt. Những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu là: bệnh lý tim mạch đặc biệt là tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, tai biến mạch máu não và ung thƣ. Trong đó, các bệnh lý tim mạch chiếm vị trí đứng đầu. Theo điều tra gần đây nhất (2008) của Viện Tim mạch Việt Nam, thì tỷ lệ tăng huyết áp của những ngƣời từ 25 tuổi trở lên ở nƣớc ta đã là 25,1%.Felodipin là một trong những thuốc đang đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị, nó là chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu. Hiện nay, nhóm nghiên cứu ở Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đang triển khai nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo dài của Felodipin. Để so sánh chất lƣợng của chế phẩm nghiên cứu với chế phẩm lƣu hành trên thị trƣờng thì việc đánh giá sinh khả dụng (SKD) của thuốc là rất cần thiết.Để thực hiện đƣợc các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng quy trình chiết tách, xử lý mẫu và phân tích, định lƣợng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tƣơng, nƣớc tiểu...). Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thƣờng gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thƣờng rất thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hƣởng tới quá trình phân tích thuốc. Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dƣợc chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tƣơng tự với dƣợc chất nên việc phân tách để định lƣợng gặp rất nhiều khó khăn. Chính vì vậy, phƣơng pháp phân tích phải đƣợc xây dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy.

NGUYỄN VĂN MẠNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT

TƯƠNG BẰNG GC-MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN MẠNH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FELODIPIN TRONG HUYẾT

TƯƠNG BẰNG GC-MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :

1 PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

2 DS Ngô Thị Quỳnh Nga Nơi thực hiện:

1 Bộ môn hóa phân tích và độc chất - Đại học Dược Hà Nội

2 Trung tâm Giám Định Ma Túy – Viện Khoa Học Hình sự - Bộ Công An

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và sự chân thành, tôi xin được bày tỏ niềm biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Phó trưởng phòng Quản lý khoa học, Trường Đại Học Dược Hà Nội và DS Ngô Thị Quỳnh Nga - những người đã trực tiếp

hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân Tích và Độc chất – Trường Đại Học Dược Hà Nội, các anh chị ở Trung tâm Giám Định Ma Túy – Viện Khoa học Hình Sự đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dìu dắt, dạy bảo tận tình trong suốt năm năm tôi học tập tại đây

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ kính yêu, người thân, bạn

bè – những người đã luôn bên cạnh động viên, yêu quý và chăm lo cho tôi trong cuộc sống

Tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Văn Mạnh

MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về Felodipin 3

1.1.1 Công thức và tính chất lý hóa [5] 3

1.1.2 Dược động học [2] [10] 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 4

1.1.4 Chỉ định [2] 4

1.1.5 Chống chỉ định [2] 5

1.1.6 Một số chế phẩm trên thị trường 5

1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong dịch sinh học 6

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS 10

1.3.1 Khái niệm [3] 10

1.3.2 Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng [3] 10

1.3.3 Sơ đồ hệ thống sắc ký khí [3] 11

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 16

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 17

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18

2.3.3 Xử lý và biểu thị kết quả nghiên cứu 24

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp phân tích 25

3.1.1 Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội 25

3.1.2 Khảo sát chương trình sắc ký 26

3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28

3.2 Kết quả thẩm định phương pháp phân tích 33

3.2.1 Độ đặc hiệu – chọn lọc 33

3.2.2 Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính 37

3.2.4 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày 40

3.2.5 Tỷ lệ thu hồi 43

3.2.6 Độ ổn định 46

3.3 Bàn luận 50

3.3.1 Phương pháp sử dụng 50

3.3.2 Kết quả thu được so với các phương pháp khác 51

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Đề xuất 54

TÀI LIÊU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

IS Nội chuẩn (Internal Standard)

LLOQ Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantitation)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LQC Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control Sample) MeOH Methanol

MQC Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Medium Quality Control

Sample)

MS Phương pháp phổ khối lượng

NIF Nifedipin

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

SKD Sinh khả dụng của thuốc

TDSH Tương đương sinh học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trường 5

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng GC 6

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu

Bảng 2.1 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2 19

Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương 20

Bảng 3.3 Kết quả độ chọn lọc – đặc hiệu của phương pháp 37

Bảng 3.4 Kết quả xác định khoảng nồng độ tuyến tính 38

Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới 40

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày 41

Bảng 3.10 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau ba

Bảng 3.11 Độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng 47

Bảng 3.13 Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 49

Hình 3.4 Sơ đồ tóm tắt quy trình xử lý mẫu FEL và IS trong

huyết tương băng phương pháp chiết lỏng-lỏng 29

Hình 3.5 Biểu đồ hiệu suất chiết của FEL theo thể tích chiết 32

Hình 3.6 Sắc kí đồ mẫu huyết tương trắng

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ FEL trong

huyết tương (ng/ml) với tỉ lệ diện tích FEL /IS 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay cùng với sự phát triển của xã hội ngày càng nhanh, mô hình bệnh tật ở nước ta đang có nhiều biến động to lớn Các bệnh không lây nhiễm, trong đó có các bệnh tim mạch đang có khuynh hướng tăng lên rõ rệt Những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu là: bệnh lý tim mạch đặc biệt là tăng huyết áp, bệnh động mạch vành, tai biến mạch máu não và ung thư Trong đó, các bệnh lý tim mạch chiếm vị trí đứng đầu Theo điều tra gần đây nhất (2008) của Viện Tim mạch Việt Nam, thì tỷ lệ tăng huyết áp của những người từ 25 tuổi trở lên ở nước ta đã là 25,1%

Felodipin là một trong những thuốc đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị, nó là chất ức chế kênh calci chọn lọc trên mạch máu Hiện nay, nhóm nghiên cứu ở Trường Đại học Dược Hà Nội đang triển khai nghiên cứu bào chế dạng thuốc giải phóng kéo dài của Felodipin Để so sánh chất lượng của chế phẩm nghiên cứu với chế phẩm lưu hành trên thị trường thì việc đánh giá sinh khả dụng (SKD) của thuốc là rất cần thiết

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD các thuốc, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng quy trình chiết tách, xử lý mẫu và phân tích, định lượng thuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu ) Quá trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốc trong mẫu thường rất thấp, mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích thuốc Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dược chất bị chuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá lý tương tự với dược chất nên việc phân tách để định lượng gặp rất nhiều khó khăn Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được xây dựng và thẩm định chặt chẽ theo những quy định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy

Nhằm đóng góp một quy trình phân tích thuốc trong dịch sinh học đơn giản, hiệu

quả và kinh tế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp định

lượng Felodipin trong huyết tương bằng sắc kí khí” với các mục tiêu sau:

Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Felodipin trong huyết tương bằng GC-MS

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về Felodipin

+ Bột tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt

+ Thực tế không tan trong nước, tan tự do trong aceton, ethanol khan, methanol và methylen chlorid

1.1.2 Dược động học [2] [10]

Hấp thu: Felodipin hấp thu gần như hoàn toàn qua đường tiêu hoá sau khi uống

nhưng chuyển hoá lần đầu ở gan và có sinh khả dụng tuyệt đối (SKD) khoảng 15% ( thay đổi từ 10-25 %)

Phân bố: Liên kết với protein huyết tương xấp xỉ 99%, chủ yếu là albumin

Chuyển hóa và thải trừ : Felodipin chuyển hoá mạnh qua ruột và gan và được bài

tiết gần như hoàn toàn các chất chuyển hóa, khoảng 70% của liều được bài tiết qua nước tiểu và phần còn lại được thải trừ qua phân

1.1.3 Tác dụng dược lý

Tác dụng hạ áp động mạch: Felodipin là thuốc chẹn kênh calci chậm có tính chất

chọn lọc thuộc nhóm dihydropyridin Felodipin làm giảm trương lực động mạch (nhất

là trên tiểu động mạch), dẫn đến tác dụng giãn mạch gây hạ huyết áp [2]

Tác dụng chống đau thắt ngực: Felodipin cải thiện sự cân bằng trong cung và cầu

oxy của cơ tim Lưu lượng động mạch vành cũng như lượng cung cấp oxy cho cơ tim tăng lên nhờ giãn mạch vành Felodipin giảm huyết áp toàn thân nên làm giảm hậu gánh thất trái, do đó giảm nhu cầu oxy của cơ tim Felodipin làm tăng khả năng gắng sức và giảm số cơn đau thắt ngực ở người bệnh đau thắt ngực ổn định [2]

Giãn mạch não nên tăng máu vào não, được dùng cho những người tai biến mạch máu não [1]

1.1.4 Chỉ định [2]

- Bệnh tăng huyết áp

- Điều trị dự phòng cơn đau thắt ngực ổn định

1.1.5 Chống chỉ định [2]

- Quá mẫn với dihydropyridin

- Nhồi máu cơ tim cấp

- Suy tim mất bù hoặc chưa kiểm soát được

Bảng 1.1: Một số chế phẩm chứa Felodipin trên thị trường Việt Nam

STT Tên biệt dược Thành phần Dạng thuốc Nhà sản xuất

Korea United Pharm Inc - HÀN QUỐC

Công ty TNHH Dược phẩm Vellpharm Việt Nam - VIỆT NAM

1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin trong dịch sinh học

Trên thế giới, nhiều phương pháp đã được xây dựng để định lượng FEL trong dịch sinh học được tổng hợp

ở bảng 1.2 và bảng 1.3 sau:

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu định lượng Felodipin bằng GC

Tài liệu Mẫu

H 165/04

- Nhiệt độ Detector: 300 0C - 380 0C

Toluen:H2O (1:1)

mm, 5 µm) với pha tĩnh Methylsilicon ( HP-1,

mm, Ultra 1, Hewlett-Packard)

D6- Felodip

- Khí mang: He Áp suất 0,25 kg/cm2

- Kỹ thuật ion hóa phun sương điện tử ion dương ( PIEI) với mức năng lượng electron :70 eV

-Nhiệt độ nguồn ion hóa : 300 0C

- Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion mẹ

có m/z=238

n-hexan: toluene (4:1)

m x 0,32 mm) GC-MS Cột mao quản

(12 m x 0,2

mm, HP-1, Hewlett-Packard)

- Khí mang: He Khí bổ trợ: N2

- Tốc độ: 40 ml/ph

- Mảnh ion mẹ có m/z=238

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu định lƣợng Felodipin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

Tài liệu Mẫu thử Detector Cột sắc ký Chuẩn

- Tốc độ dòng 0,8 mL/phút

- Thể tích tiêm mẫu 40 µl

- Thời gian phân tích 5 phút

Diethyl ether/hexan (80:20 v/v)

Eclipse XDB-C18 (3,0 mm, i.d.975 mm,

l, 3,5 µm;

Agilent,

Amlodipin

- Pha động: hỗn hợp acetonitril và acid formic 0,1% (75/25, v/v)

HT chó

MS-MS

C8 Capcell Pak column (2,0

mm ×150

mm, 5,0 µm particle)

Nifedipin

- Pha động: hỗn hợp ammonium : acetate–acetonitrile (20:80), PH 6,0

đã được khử khí trước khi sử dụng

- Tốc độ dòng: 200 µL/phút

- Tổng thời gian chạy 5,0 phút

Diethyl ether

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ GC-MS

1.3.1 Khái niệm [3]

Sắc ký khí là phương pháp tách các chất ở thể khí bay hơi trong hỗn hợp, trong đó pha động là một chất khí thường là khí trơ Mẫu phân tích được đưa vào đầu cột và quá trình rửa giải được thực hiện chủ yếu nhờ chương trình nhiệt độ cột sắc ký Khác với các dạng sắc ký khác, trong GC pha động không tương tác với chất phân tích mà chỉ làm chức năng vận chuyển chất phân tích qua cột

Trong sắc ký khí-lỏng (GLC), pha tĩnh là chất lỏng Pha này được bao hay gắn lên một chất mang là pha rắn, ta có sắc ký khí phân bố Trong sắc ký khí-rắn (GCS), pha tĩnh là chất rắn: pha tĩnh rắn là chất hấp phụ, đó là sắc ký khí khí hấp phụ

1.3.2 Nguyên tắc sắc ký khí-lỏng [3]

Trong GLC, chất tan chỉ có thể di chuyển theo pha động qua cột khi nó ở thể khí Vì vậy kỹ thuật này được dùng để tách các chất tan bền với nhiệt Quá trình tách phụ thuộc vào tính bay hơi của chất tan- tức là điểm sôi

Hệ số phân bố x/p phụ thuộc vào áp suất hơi của chất tan và hệ số hoạt độ của chất tan

Vì vậy, có thể tách được hai chất tan có áp suất hơi như nhau nhưng có hệ số hoạt độ trong pha tĩnh lỏng khác nhau

Quá trình rửa giải theo thứ tự điểm sôi tăng dần, ngoại trừ có tương tác đặc biệt giữa chất tan và pha tĩnh Pha động đưa chất tan ra khỏi cột đến detector Nhiệt độ cột dao động trong khoảng 50÷350 ℃ đảm bảo chất tan bay hơi và đẩy nhanh quá trình rửa giải

và tiếp tục tương tác với các phần khác của bề mặt pha tĩnh

Điều kiện của khí mang:

-Trơ về mặt hóa học

-Thuận lợi cho detector sử dụng

-Có khả năng giảm thiểu sự khuếch tán khí

-Tinh khiết

 Buồng tiêm mẫu

Buồng tiêm mẫu là nơi khi mẫu được bơm vào sẽ hóa hơi và bị lôi cuốn theo dòng khí mang

Có ba kỹ thuật tiêm mẫu : Chia dòng, không chia dòng, tiêm thẳng vào cột Trong

đó kỹ thuật tiêm chia dòng thường được sử dụng nhất Các cách tiêm mẫu trong GC

đươc trình bày ở bảng 1.4:

Bảng 1.4: Cách tiêm mẫu trong sắc kí khí

Loại cột Kỹ thuật tiêm Cách thực hiện Đánh giá

Mao quản

Chia dòng (split) Chia dòng khí mang 1:10

đến 1:100 để giảm lượng mẫu vào cột (giảm 90%

hoặc hơn)

Thích hợp cho cột mao quản Độ nhạy giảm vì chỉ một phần rất nhỏ của mẫu vào cột

Không chia

dòng (splitless)

Toàn bộ mẫu ngưng tụ ở đàu cột đã làm lạnh, sau

đó tăng nhiệt độ làm bay hơi mẫu

Độ nhạy tăng Nhưng có nguy cơ giãn rộng pic

Thẳng vào cột

(on – column)

Mẫu được ngưng tụ ở đầu cột, sau đó làm bay hơi theo chương trình nhiệt độ

Tăng độ nhạy, giảm phân hủy mẫu do nhiệt

Mẫu bay hơi nhanh, có thể xảy

ra phân hủy mẫu do nhiệt độ cao

o Độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định

o Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền ở nhiệt độ cao

 Detector

Detector là bộ phận ghi nhận sự xuất hiện và nồng độ các chất trong khí mang Các loại Detector thường dùng trong sắc ký khí:

-Detector ion hóa ngọn lửa (FID): Khi chất hữu cơ đi qua ngọn lửa trong detector

(ngọn lửa H2 ở nhiệt độ 25000C) sẽ bị đốt cháy, bị nguyên tử hóa và ion hóa thành ion FID là detector vạn năng, rất nhạy và đáp ứng với tất cả các chất hữu cơ trừ formaldehyd, acid formic và các chất đã halogen hóa hết Đây là detector có khoảng tuyến tính rộng nhất trong các detector sắc ký khí

-Detector nitơ- phốt pho (NPD) : Là một dạng FID đặc biệt Detector này có ưu thế

về độ nhạy và độ chọn lọc cho phân tích định lượng các hợp chất có chứa nitơ hoặc phospho

- Detector cộng kết điện tử (ECD):

ECD củng là một detector ion hóa sử dụng tia β từ một nguồn phóng xạ, thường là Niken – 63

28Ni63 → 29Cu63 + e

Electron trong phản ứng phân hủy này sẽ kết hợp với các chất phân tích ái electron

có mặt trong khí mang tạo ra ion âm, cho nên tạo ra sự thay đổi cường độ dòng ở mạch điện ngoài Sự thay đổi này tạo ra tín hiệu, nó được được khuếch đại và ghi lại Người

ta thường dùng argon chứa 10% methan làm khí mang thay cho nitơ để tăng độ nhạy của ECD

- Detector khối phổ (MS): Phát hiện và định lượng các chất phân tích dựa vào ion phân

tử và các ion mảnh của chúng Detector MS đáp ứng với hầu hết các hợp chất hữu cơ + Nguyên tắc:

Khối phổ là kỷ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử mẫu Tỷ số này biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của carbon 12C) hoặc bằng dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên tử hydro)

+ Sơ đồ khối của máy khối phổ:

Hình 1.3:Sơ đồ hệ thống máy khối phổ

Hệ chân không (áp suất 10-3÷10-6

Pa)

Bơm chân không

Xử lý dữ liệu

Máy khối phổ gồm 5 bộ phận sau:

 Bộ nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy

 Bộ nguồn ion: Ion hoặc các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi

 Bộ phân tích khối: Tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector

 Detector: Detector có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

 Bộ xử lý dữ liệu: tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng,

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

- Chất chuẩn :

Felodipin (FEL): Chuẩn làm việc, hàm lượng 99,76%, độ ẩm 0,01%

- Chất chuẩn nội:

+ Nifedipin (NIF): Chuẩn làm việc, hàm lượng 99,51%, độ ẩm 0,02%

+ Amlodipin (AMLO): Chuẩn làm việc, hàm lượng 99,71%, độ ẩm 0,00%

- Dung môi hóa chất:

MeOH, toluen, n-hexan, đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho GC-MS

- Huyết tương trắng không có Felodipin: của viện Huyết học- Truyền máu Trung ương

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị

- Máy sắc ký khí khối phổ Brucker, Mỹ

- Cân phân tích Sartorius (d= 0,1 mg), Đức

- Máy ly tâm EBA 20 – Hettich, Đức

- Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí nitơ có gia nhiệt Reacti-Therm III (Thermo scientific), Mỹ

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP Scientifica (3000 vòng/phút), Đức

- Tủ lạnh sâu ( -40 oC), Sanyo MDF -236

- Micropipet 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl, Nhật

- Bình định mức, dụng cụ thủy tinh (class A) dùng trong phân tích

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng phương pháp định lượng FEL trong HT bằng phương pháp GC-MS: lựa chọn chất chuẩn nội, điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu để chiết tách FEL từ

HT

- Thẩm định phương pháp phân tích: thẩm định về các chỉ tiêu: độ đặc hiệu - chọn lọc, đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng, độ đúng - độ chính xác, độ ổn định

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.1.1 Lựa chọn chất chuẩn nội

Dựa vào công thức hóa học, tính chất lý hóa của các chất để lựa chọn chất chuẩn nội (IS), đảm bảo IS bền vững, có thể tách chiết cùng chuẩn, đồng thời phù hợp khi phân tích cùng FEL Dự kiến nội chuẩn lựa chọn gồm NIF và AMLO Hai chất này được pha trong MeOH (800 µg/ml) sau đó được pha loãng bằng MeOH thành nồng độ ( 4 µg/ml) và được bơm trực tiếp vào máy GC-MS để xác định mảnh phổ và thời gian lưu cùng với FEL

Pha hỗn hợp ba chất FEL (1µg/ml), NIF (4µg/ml) và AMLO (4µg/ml) trong MeOH

và được bơm trực tiếp vào máy GC để xác định diện tich pic và hình ảnh pic của ba chất, từ đó lựa chọn IS cho phù hợp

2.3.1.2 Khảo sát chương trình sắc ký

Qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống GC-MS với các điều kiện sắc ký như:

+ Cột mao quản, nhiệt độ cột, chương trình nhiệt độ

+ Tiêm mẫu chia dòng, không chia dòng, nhiệt độ buồng tiêm

+ Thể tích tiêm mẫu

+ Detector, nhiệt độ detector

+Lựa chọn khí mang: N2, H2, He

+Tốc độ khí mang

2.3.1.3 Khảo sát quy trình xử lí mẫu

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu, chiết tách FEL từ huyết tương trên các mẫu chuẩn pha trong dung môi phù hợp; mẫu huyết tương trắng và các mẫu FEL trong huyết tương có nồng độ xấp xỉ Cmax, bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng bằng dung môi hữu cơ (toluen, n-hexan, hỗn hợp toluen-n-hexan(1:1)…)

Từ kết quả khảo sát, sơ bộ tiến hành lựa chọn phương pháp phân tích FEL gồm lựa chọn chất chuẩn nội, điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu phù hợp

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát theo hướng dẫn về thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học [4] để đảm bảo phương pháp nghiên cứu là phù hợp Tiến hành thẩm định trên các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu QC (Quality control sample) tự tạo

 Mẫu chuẩn:

+ Các dung dịch chuẩn gốc: Tiến hành cân chính xác một lượng tương ứng khoảng

20 mg mẫu chuẩn FEL hòa tan trong 100 ml MeOH để thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ khoảng 200 µg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha các dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ FEL chính xác 400 ng/ml HT (WS1) và 50 ng/ml HT (WS2)

+ Dung dịch chuẩn nội: Cân một lượng chính xác khoảng 40 mg NIF chuẩn hòa tan

trong 50 ml methanol Hút 0,5ml pha loãng trong 100ml methanol để được dung dịch chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 4 µg/ml

Bảng 2.1 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc WS1 và WS2

Dung dịch Cách pha

Nồng độ chính xác khoảng

Chuẩn làm việc WS1

Lấy 20 µl dd chuẩn gốc + Huyết tương trắng vừa đủ 10ml

400 ng/ml

Chuẩn làm việc WS2

Lấy 1,25 ml dd WS1 + Huyết tương trắng vừa đủ

10 ml

50 ng/ml

Từ các dung dịch chuẩn làm việc chuẩn bị các mẫu chuẩn FEL có nồng độ dự kiến

2-40 ng/ml HT theo bảng sau:

Bảng 2.2 Cách chuẩn bị các mẫu đường chuẩn trong huyết tương

2.3.2.1 Độ đặc hiệu-chọn lọc của phương pháp

Tiến hành xử lý và phân tích theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 6 mẫu chuẩn trong huyết tương FEL ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn và chuẩn nội (mẫu LLOQ) Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ

lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/ mẫu chuẩn tại thời gian lưu của FEL và IS [4]

2.3.2.2 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn FEL trong huyết tương có nồng độ từ 0,2-40 ng/ml như ở trên Từ đáp ứng pic của FEL và IS ở các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic của FEL/IS và nồng độ của FEL có trong mẫu Đường chuẩn phải có hệ số tương quan r > 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả điểm nồng độ thấp nhất và nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85-115 %, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số nhưng không quá 20%, đồng thời 4/6 điểm phải nằm trên đường chuẩn [4]

2.3.2.3 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Tiến hành phân tích 6 mẫu trắng, 6 mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ thấp nhất của đường chuẩn (nồng độ FEL 0,2 ng/ml) Ghi lại sắc ký đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng/mẫu chuẩn, tính nồng độ FEL có trong mẫu dựa vào đường chuẩn được phân tích cùng ngày Tính độ đúng của các mẫu chuẩn bằng cách so sánh nồng độ định lượng được (tính từ đường chuẩn) với nồng độ thực

Nồng độ được coi là LLOQ của phương pháp trên nếu sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ

đó cho pic FEL tách biệt với các tạp, có độ đúng từ 80-120 %; độ lặp lại với giá trị RSD ≤ 20% và đáp ứng pic ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng [4]

2.3.2.4 Độ đúng – độ chính xác trong ngày và khác ngày

 Độ đúng được xác định bằng tỷ lệ % giá trị nồng độ tìm thấy so với giá trị nồng

độ thực Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng từ 85-115 %

 Độ chính xác được biểu hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữa các giá trị mỗi lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày Độ chính xác phải có RSD ≤ 15%

 Độ đúng – độ chính xác khác ngày [4]

Tiến hành tương tự như độ đúng độ chính xác ở trong ngày Tính RSD và tỷ lệ % tìm thấy trong ít nhất 3 ngày khác nhau Yêu cầu giá trị RSD ≤ 15 % và độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng từ 85-115 %

2.3.2.5 Tỷ lệ thu hồi hoạt chất và chất chuẩn nội [4]

- Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội: xử lý 6 mẫu huyết tương trắng có chứa chất chuẩn nội ở nồng độ như đã khảo sát trong quy trình xử lý mẫu Tiến hành phân tích, xác định diện tích chuẩn nội Song song, tiến hành phân tích mẫu chuẩn nội được pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) có nồng độ tương ứng Xác định tỷ lệ thu hồi bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu đã qua chiết tách với mẫu pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu

- Tỷ lệ thu hồi của hoạt chất: tiến hành phân tích các lô mẫu LQC, MQC, HQC Mỗi lô mẫu làm 6 mẫu độc lập Song song, tiến hành với các mẫu chuẩn pha trực tiếp trong dung môi pha mẫu (MeOH) ở các nồng độ tương ứng Xác định tỷ lệ thu hồi của

FEL bằng cách so sánh đáp ứng pic của mẫu QC đã qua chiết tách với các mẫu chuẩn pha trong dung môi pha mẫu (không qua chiết tách)

Tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn nội hay FEL được xác định theo công thức sau:

Trong đó:

St : Diện tích pic của IS/FEL có trong mẫu đã qua chiết tách

Sc : Diện tích pic của IS/FEL của mẫu chuẩn pha trong dung môi chạy sắc ký

n : Hệ số pha loãng của mẫu đã qua chiết tách

Phương pháp chiết tách, xử lý mẫu là thích hợp khi tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 30-110 %; RSD của các giá trị tỷ lệ thu hồi phải ≤ 15% và tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ±15%

- Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông: Bảo quản mẫu ở nhiệt độ - 40 OC và để

rã đông ở nhiệt độ phòng Sau khi huyết tương tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại tủ đông đó trong khoảng 12-24 giờ, làm lặp lại 3 lần như vậy Tiến hành xử lý và phân

tích mẫu xác định nồng độ FEL có trong mẫu So sánh nồng độ FEL xác định được trong mẫu xử lý và phân tích ngay sau khi pha Kết quả lượng FEL có trong mẫu sau ba chu kỳ đông – rã và mẫu phân tích ngay sau khi pha phải khác nhau không

bị Mẫu phải ổn định tại điều kiện bảo quản trong khoảng thời gian tối thiểu phải đủ

để tiến hành lấy mẫu máu và phân tích hết số mẫu huyết tương

- Độ ổn định của mẫu sau xử lý (độ ổn định trong autosampler ở to phòng): Chuẩn bị

6 mẫu huyết tương ở nồng độ LQC và HQC, rồi xử lý theo quy trình đã xây dựng Tiến hành phân tích và so sánh nồng độ của FEL trong mẫu ngay sau khi chiết tách

và cùng mẫu đó nhưng để 12 giờ sau khi xử lý để trong autosample

2.3.3 Xử lý và biểu thị kết quả nghiên cứu

Các kết quả nghiên cứu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft 2010 và được biểu thị dưới dạng Trung bình ± độ lệch chuẩn

So sánh các số liệu thống kê: sử dụng phương pháp so sánh hai mẫu bằng test student trong office 2010

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội

Tiến hành sắc kí hỗn hợp ba chất FEL, NIF, AMLO trong MeOH, sắc kí đồ được ghi lại ở hình 3.1

Hình 3.1 Sắc kí đồ hỗn hợp ba chất Fel, NIF, AMLO trong methanol

NIF

Thời gian lưu của ba chất FEL, NIF và AMLO thu được như sau:

+ Thời gian lưu của FEL (tFEL) : 13,238 phút

+ Thời gian lưu của NIF (tNIF) : 12,498 phút

+ Thời gian lưu của AMLO (tAMLO) :15,461 phút

Kết quả khảo sát cho ta thấy:

Cả hai chất NIF và AMLO đều không có pic bị trùng với chất phân tích FEL nên đều

có thể lựa chọn làm chất chuẩn nội, tuy nhiên do:

- tNIF < tFEL < tAMLO : Dễ thấy nên lựa chọn chất chuẩn nội có thời gian lưu nhỏ hơn thời gian lưu của chất cần phân tích để sau khi phát hiện ra chất phân tích chúng ta có thể dừng quá trình phân tích lại do đó có thể giảm thiểu thời gian cần thiết để phân tích và tăng tuổi thọ của máy sắc ký

- Khoảng chênh lệch thời gian lưu của NIF- FEL (0,740 phút) nhỏ hơn nhiều so với AMLO- FEL (2,223 phút) nhưng vẫn đảm bảo pic tách được rõ ràng Nên việc sử dụng chất chuẩn nội NIF sẽ mang lại kết quả chính xác hơn so với AMLO

- Pic AMLO: Rộng chân, không sắc nhọn Do đó, AMLO không phù hợp trong quy trình phân tích này

Từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn NIF làm chuẩn nội để tiếp tục triển khai nghiên cứu

3.1.2 Khảo sát chương trình sắc ký

- Detector: MS

- Cột sắc ký: RTX-5MS (5% diphenyl, 95% dimethylpolysiloxan), 30m,

d=0,25mm, chiều dày pha tĩnh 0,25µm

- Chuẩn nội: Nifedipin

- Điều kiện sắc ký

+ Nhiệt độ buồng tiêm: 270 oC

+ Chương trình nhiệt độ: nhiệt độ ban đầu 100 oC, giữ trong một phút, sau đó tăng lên đến 270 oC (20 oC/phút) giữ trong 10 phút

+ Khí mang: N2

+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

+ Thể tích bơm: 1 µl, chế dộ không chia dòng

+ Chế độ chọn lọc ion (SIM) với mảnh ion mẹ có m/z=238 (FEL), m/z=224 (IS)

Phổ khối của FEL và NIF được trình bày ở hình 3.2 và hình 3.3:

Hình 3.2 Phổ khối của FEL

Hình 3.3: Phổ khối của IS

3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu

Tiến hành chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn FEL và IS với phương pháp chiết lỏng – lỏng