xác định và định lượng các vi sinh vật gây bệnh nhiễm trong thực phẩm

xác định và định lượng các vi sinh vật gây bệnh nhiễm trong thực phẩm

M C L C

M Đ U 1

I TÌNH HÌNH NG Đ C TH C PH M TRÊN TH GI I VÀ VI T NAM 2

II M T S VI SINH V T CÓ TH GÂY NG Đ C TH C PH M 6

2.1 Salmonella 6

2.2 Campylobacter 6

2.3 Clostridium perfringens 7

2.4 Clostridium 7

2.5 Staphylococcus 8

2.6 Vibrio spp 9

2.7 Escherichia coli 10

2.8 Shigella 10

2.9 Listeria monocytogenes 11

2.10 Các virus gây b ệnh trong thực phẩm 12

2.11 Coliforms 13

2.12 N m men và n m m c 13

III CÁC PH NG PHÁP Đ NH L NG VI SINH V T 15

3.1 Đ nh l ng vi sinh v t bằng ph ng pháp đ m tr c ti p 15

3.1.1 Đ m bằng buồng đ m hồng c u 15

3.1.2 K ỹ thu t đ m Breed 17

3.1.3 Đ m bằng kính hi n vi huỳnh quang 18

3.2 Các k ỹ thu t đ nh l ng vi sinh v t trong m u bằng ph ng pháp nuôi c y 19

3.2.1 Ph ng pháp đ m khu n l c 20

3.2.2 Ph ng pháp c đoán s l ng vi sinh bằng kỹ thu t MPN (Most Probable Number): 28

3.2.3 Ph ng pháp lai khu n l c 29

3.3 Ph ng pháp đo đ đ c 31

IV ÁP D NG Đ I V I M T S VI SINH V T GÂY B NH TRONG TH C PH M 32

4.1 Đ nh l ng Fecal Coliform và E Coli bằng ph ng pháp đ m đĩa 32

4.2 Đ nh l ng Vibrio Parahaemolyticus 33

4.3 Đ nh l ng Coliforms, Coliforms ch u nhi t, E Coli gi đ nh (Fecal Coliforms) bằng ph ng pháp MPN 35

4.4 Đ nh l ng Enterococci đ ng ru t trong n c bằng ph ng pháp màng lọc 37

Thi t b : 37

4.5 Đ nh l ng Clostridium khử sunfite trong n c bằng ph ng pháp tăng sinh trong môi tr ng c y l ng 38

K T LU N 40

TÀI LI U THAM KH O 41

PH L C 42

M Đ U Các vi sinh v t gây b nh nhi m trong th c ph m th ng gặp gồm các vi

khu n Salmonella Shigella, E.coli, Bibrio choterea, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens; các vius Hepatis, virus Hepatis virus A, Rotavirus;

các ký sinh trùng Amip, sán lá gan, sán bò, trùng lông; các n m m c và n m

men Aspergillus, candida, Furanium

Vi sinh v t gây b nh nhi m trong th c ph m bằng 4 con đ ng chính: qua súc v t, qua môi tr ng, ch bi n và b o qu n M c đ nguy hi m và tri u

ch ng c a b nh có th gây nên do đ c t c a vi sinh v t ti t vào th c ph m hay

do chính t bào c a chúng gây nên Đ có th gây ng đ c th c ph m, vi sinh

ph i hi n di n v i s l ng t bào l n và ph thu c li u l ng c a từng ch ng

lo i nhi m vào, th c ph m ph i có các đ u ki n lý hoá thích h p cho vi sinh v t

đó phát tri n, nhi t đ và th i gian ph i thích h p cho quá trình tăng tr ng c a chúng từ khi chúng nhi m vào cho đ n khi tiêu th đ vi sinh v t nhân lên đ n

đ li u l ng hay s n xu t đ l ng đ c t gây h i Khi nhi m th c ph m, vi sinh v t gây h h ng làm th c ph m b đổi màu, đổi v , có mùi Tuy nhiên cũng

có m t s lo i gây nhi m th c ph m nh ng không làm thay đổi màu, mùi, v hay hình d ng bên ngoài c a th c ph m Vì v y r t khó nh n bi t bằng c m quan Do đó, vi c xác đ nh và đ nh l ng các vi sinh v t gây b nh nhi m trong

th c ph m là đi u r t c n thi t

I TÌNH HÌNH NG Đ C TH C PH M TRÊN

TH GI I VÀ VI T NAM

các n c phát tri n có t i 10% dân s b ng đ c th c ph m và mắc

b nh truy n qua th c ph m m i năm; v i các n c kém phát tri n tỷ l này cao

h n nhi u Nhi u n c có quy đ nh báo cáo nh ng ch đ t 1% s ca b ng đ c

th c ph m Ng đ c th c ph m Mỹ chi m 5% dân s /năm (>10 tri u ng i/năm), trung bình 175 ca/100.000 dân, m i năm ch t 5.000 ng i; Anh: 190 ca/100.000 dân; Nh t: 20-40 ca/100.000 dân; Úc là 4,2 tri u ca/năm

-Th c tr ng vi ph m v sinh an toàn th c ph m n c ta r t đáng báo

đ ng Ng đ c th c ph m c p tính trong nh ng năm qua v n có chi u h ng gia tăng c v s v và quy mô mắc Tỷ l mắc/100.000 dân trung bình từ năm

2001 – 2005 là 5,48 Có nhi u nguyên nhân gây ra các v ng đ c th c ph m trong toàn qu c nh th c ph m ô nhi m, môi tr ng ô nhi m; th c ph m có

đ c; đi u ki n s n xu t, ch bi n th c ph m không b o đ m an toàn, nh n th c – hành vi đúng v phòng ch ng ng đ c th c ph m c a c ng đồng còn nhi u

h n ch …

Trung bình m i năm có 202.2 v ng đ c th c ph m x y ra v i 5.525,1

ng i mắc và 55.2 ng i ch t S v ng đ c x y ra nhi u nh t là từ tháng 4 - 7

và tháng 9 – 11 Tỷ l mắc ng đ c trung bình là 7.14/100.000 dân, tỷ l ch t là 0,06/100.000 dân/năm

S v ng đ c l n (≥ 30 ng i) chi m 26,8% v i s mắc chi m 83,2%

V ng đ c nh và vừa (<30 ng i) chi m 73,2% v i s mắc chi m 16,8% Tỷ

l mắc ng đ c chi m 18.7% tổng s đ i t ng cùng ăn chung b a ăn; tỷ l

ch t là 0,8% tổng s đ i t ng b mắc ng đ c th c ph m Mọi l a tuổi đ u có

th b ng đ c, tuổi nh (0 - 4 tuổi) và tuổi cao ≥ 50 có nguy c mắc và ch t cao do ng đ c Bi u hi n chung trong các v ng đ c là buồn nôn (81,0%), nôn (83,9%), đau b ng chi m 79.0%, a ch y 72.2 %, đau đ u chi m 53.2%, chóng

mặt 43,4%, s t 26,3%…

C s nguyên nhân ng đ c ch y u là gia đình (54,6%), b p ăn t p th (15,6%), đám c i/gi (16,6%), th c ăn đ ng ph (5,4%), b p ăn tr ng học (4,0%) Th c ăn nguyên nhân ch y u là th c ph m h n h p (40,0%); thuỷ s n 14,1%; n m 13,2%; ngũ c c và các s n ph m là 7,8%…

Nguyên nhân ng đ c ch y u là nguyên nhân vi sinh v t (34,0%), đ c t

t nhiên (24,0%), hoá ch t (10,0%) Còn 32,0% s v không xác đ nh đ c nguyên nhân Vi sinh v t gây ng đ c là Salmonella, Streptoccocus, E.coli,

Staphylococcus aurerus và Vibrio parahaemolyticus; đ c t t nhiên ch y u là

đ c t c a n m đ c (13,2%)

Th i gian báo cáo trung bình c a v ng đ c là 9.74 ngày V i v ng đ c

B ảng 2 Tình hình ngộ độc tại Hà Nội trong 3 năm gần đây

S v ng đ c Nguyên nhân gây ng đ c

th c

ph m

Đ c t

t nhiên

Nguyên nhân khác

B ảng 3: Nguyên nhân trong các v ng đ c th c ph m trong năm 2007

Salmonella Shigella E coli Vibrio

II M T S VI SINH V T CÓ TH GÂY NG

Đ C TH C PH M

2.1 Salmonella

Salmonella Tr c năm 1983 các nhà khoa học chia Salmonella ra làm 3

loài d a theo ph n ng sinh hóa mà chúng tham gia : S.typhi, S.choleraesuis,S enteridis

Salmonella là tr c khu n garm (-), hi u khí và k khí tùy ý, có kh năng di

đ ng không t o bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nh ng không lên men sacarose và lactose, không sinh indole, không phân gi i urê không có kh

năng tách nhóm amin từ tryptophane, h u h t các ch ng đ u sinh H2S pH t i

u cho chúng phát tri n nằm trong vùng trung tính, tuy nhiên đôi khi phát tri n trong vùng pH từ 4 ÷ 9, không có kh năng phát tri n nồng đ mu i cao

Vi khu n Salmonella tồn t i trong c th nhi u loài đ ng v t và có th gây

b nh cho ng I Vi khu n Salmonella có th gây b nh truy n nhi m cho đ ng

v t nh phó th ng hàn bò, phó th ng hàn l n, b nh s y thai cừu và ng a,

b nh b ch lỵ gà, b nh viêm ru t bò,… Nh ng b nh k trên do Salmonella gây

ra ng i ta gọi là b nh truy n nhi m nguyên phát, ngoài ra có th phá hi n

đ c Salmonella trong ch t bài ti t c a đ ng v t

S l ng Salmonella đ đ gây ng đ c là khi chúng hi n di n c tri u t bào trong m t gam th c ph m Các tri u ch ng do Salmonella gây ra th ng là tiêu ch y, ói mửa, buồn nôn Th i gian b nh cho đ n khi các tri u ch ng bi u

hi n th ng sau 12-36 gi k từ khi tiêu th th c ph m b nhi m Tri u ch ng

th ng kéo dài ít nh t từ 2-7 ngày Không ph i t t c mọi ng i khi tiêu th

th c ph m b nhi m Salmonella đi u có bi u hi n b nh, ng c l i m t s ng i không có tri u ch ng lâm sàng khi tiêu th ph i th c ph m nhi m vi sinh v t này khi đó chúng đ c bài ti t ra ngoài Các lo i th c ph m có nguy c b

nhi m Salmonella nh th t gia c m, s n ph m th t, tr ng và các s n ph m c a

tr ng, th y s n Nguồn nhi m vi sinh v t vào các lo i th c ph m th ng có nguồn g c từ đ ng ru t c a ng i và các loài đ ng v t, chúng có th đ c

nhi m gián ti p hay tr c ti p Salmonella gây nên b nh s t th ng hàn thu c

các serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C các dòng này

th ng không gây b nh cho các loài đ ng v t

C, đây là vi sinh v t a nhi t bắt bu t S n ph m

s a và th t gia c m là nh ng nguồn có th gây nên ng đ c do vi sinh v t này

N c cũng là m t trong nh ng nguồn mang b nh này Campylobacters là vi

sinh v t r t nh y v i nhi t đ , chúng b tiêu di t hoàn toàn bằng ph ng pháp thanh trùng Pasteur, chúng không th s ng sót trong th c ph m có môi tr ng acid Chúng không th phát tri n trong th c ph m b o qu n trong đi u ki n

hi u khí mà ch phát tri n trong các lo i th c ph m hút chân không

Khi xâm nhi m Campylobacter, th i gian b nh th ng từ 2-11 ngày Các tri u ch ng do vi sinh v t này gây nên nh đau nh c, tiêu ch y, s t, đau

đ u, khó ch u, chu t rút, l nh cóng, mê s n Th nh tho ng có nh ng bi u hi n

b nh gi ng nh c m cúm

2.3 Clostridium perfringens

Quan ni m v s ng đ c th c ph m do Clostridium perfringens gây ra đã

có nh ng thay đổi trong nh ng năm g n đây Theo nh ng quan ni m tr c đây cho rằng các dòng C.perfringens kháng nhi t, t o bào tử và không làm tan máu

m i có th gây ng đ th c ph m Nh ng trong nh ng năm gây đây các dòng

nh y c m v i nhi t, không làm tan máu cũng đ c tìm th y trong các v ng

đ c do vi sinh v t này gây nên

Vì các bào tử c a C perfringen kháng nhi t nên chúng th ng s ng sót

qua quá trình n u chín Tuy nhiên cũng ph thu c vào th i gian ti p xúc v i nhi t N u nh ng bào tử s ng sót, khi gặp đi u ki n thích h p chúng s n y

m m và nhân lên Khi đun n u th c ăn nhi t đ th p và th i gian ngắn có th làm cho các dòng kháng nhi t tồn t i vì th chúng s gây tái nhi m sau khi b o

qu n Các nguồn th c ph m có th gây ng đ c v i các vi sinh v t này th ng

là th t gia c m, nh t là các lo i gia c m l n đông l nh sâu, th t trong các h m

ch a C perfringens cũng đ c tìm th y trong đ t, trong phân ng i và trong các lo i th c ph m khác Các tri u ch ng do vi sinh v t này gây ra th ng là đau thắt vùng b ng, tiêu ch y Th i gian b nh từ 12-24 gi Các tri u ch ng lâm sàng gây nên do đ c t c a chúng

2.4 Clostridium

Clostridium là các vi khu n garm (+), hình que, k khí sinh bào tử , không

di đ ng, có th th y gi i saccaride và protein trong các ho t đ ng thu nh n

năng l ng t o ra các s n ph m nh acid acetic, butiric, r u, t o ra các mùi

khó ch u trong s n ph m Clostridium phát tri n m nh nhi t đ 55o

C, nhi t đ

t i u là 43 ÷ 47oC Nhi t đ 15 ÷ 20o

C làm ch m hoặc làm ng ng s phát tri n

c a vi khu n này Không phát tri n pH h n 5,0 hoặc trên 9,0, b c ch b i

5% NaCl Clostridium hi n di n trong đ t, m t s loài trong nhóm này gây

b nh cho ng i và đ ng v t, m t s loài khác gây h h ng th c ph m, khử sunphit thành sunphur t o ra màu đem và gây mùi khó ch u

Clostridium botulinum là vi sinh v t sinh đ c t gây b nh ng đ c th t cho

ng i (botulism) B nh bi u hi n r t nghiêm trọng ng i B nh gây ra do đ c

t đ c hình thành b i C.botulinum nhi m trong th c ph m Tri u ch ng lâm

sàng c a b nh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có nh ng bi u hi n r i lo n thành kinh nh choáng váng, r i lo n th giác, r i lo n các c cổ và mi ng, đau vùng ng c, khó th và tê li t, có th d n đ n tử vong Các tri u ch ng trên bi u

hi n sau 12-36 gi sau khi tiêu th th c ph m nhi m đ c t Các tri u ch ng

th ng kéo dài 2-6 ngày tuỳ theo tình tr ng nhi m đ c và s c khoẻ c ng từng

b nh nhân

Các lo i th c ph m nh th t, rau qu không đ c b o qu n đúng qui đ nh hay lây nhi m từ đ t, phân đ ng v t hay do ch bi n không đ nhi t đ tr c khi dùng, các s n ph m đóng h p không đúng qui cách cũng có nguy c nhi m

vi sinh v t này r y cao Đi u ki n thích h p cho vi c hình thành đ c t c a vi sinh v t này đi u ki n môi tr ng kỵ khí, pH trung tính, không có các vi sinh

v t khác c nh tranh Đ c t botuline do C botulinum ti t ra gồm m t s lo i

khác nhau nh A, B, C1, C2, D, E, F, G các đ c t này là nh ng protein có

trọng l ng phân tử l n kho ng 1 tri u danton Nh ng nh ng d ng có tác đ ng

m nh đ n con ng i là A, B, và E đây cũng là m t trong nh ng lo i đ c t sinh học có c ng đ m nh nh t Trong nh ng năm g y đây, các v ng đ c

botulism gây ra do C.botulinum dòng E th ng đ c phát hi n khi tiêu th cá

và các s n ph m th y s n Dòng vi sinh v t này th ng xuyên phân l p đ c từ các m u bùn đáy t i các cửa sông

2.5 Staphylococcus

Staphylococcus là lo i c u khu n gram (+), các t bào c a chúng liên k t

thành hình chùm nho Khi phát tri n trong môi tr ng, Staphylococcus có kh

năng t o ra sắc t từ màu trắng đ n vàng s m, nhi t đ 20 ÷ 25o

C thích h p

nh t cho chúng t o màu Staphylococcus không di đ ng, không t o bào tử, nhi t đ thích h p cho s phát tri n là 37o

C, ch u đ c s khô h n, h i nóng ( nhi t đ 50o

C chúng v n s ng trong 30 phút), có kh năng s ng nồng đ

mu i 9 ÷ 10% Staphylococcus phát tri n pH r t r ng (pH = 4,0 ÷ 9,8)

Kho ng pH t i u c a chúng là 6 ÷ 7 và aw t i u kho ng 0,83 ÷ 0,86

Staphylococcus có kh năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose,

sucrose Staphylococcus đ c phân b khắp n i nh ng ch y u đ c phân l p

Staphylococcus aureus là VSV có kh năng s n sinh m t s lo i đ c t

đ ng ru t b n nhi t, không b phân huỷ khi đun 100o

C trong kho ng 30

phút Khi vi sinh v t này xâm nhi m vào trong th c ph m, chúng ti t đ c t vào trong s n ph m và gây đ c Khi con ng i tiêu th lo i th c ph m có ch a

đ c t này, sau 4-6 gi b nh s b c phát các tri u ch ng lâm sàng nh tiêu

ch y, nôn m a, các tri u ch ng này kéo dài từ 6-8 gi Các lo i th c ph m có

ch a hàm l ng mu i cao th ng có nguy c nhi m vi sinh v t này nh jambon, kem tổng h p, n c soup… vì các lo i th c ph m này ít khi đ c xử

lý nhi t đ cao h n 40o

C Các lo i thuỷ s n hay th c ph m đóng h p cũng

th ng hay b nhi m loài vi sinh v t này Các nguồn lây nhi m vào th c ph m

ch yêu từ các khâu ch bi n trong nhà b p Trong t nhiên các vi sinh v t này

th ng tình th y trên da, mũi, tóc hay lông c a các loài đ ng v t máu nóng

2.6 Vibrio spp

Các loài Vibrio có nguồn g c từ bi n, chúng c n ion Na+ đ phát tri n

Gi ng Vibrio có m t s loài có kh n ăng gây b nh cho ng i nh V cholerae,

V parahaemolyticus, V vulnificus, V hollisae, V furnsii, V mimicus, V fluvialis, V alginolyticus

V cholerae là tác nhân gây nên các v d ch t trên toàn th gi i Loài vi

sinh v t này đ c chia thành hai ki u huy t thanh chính đó là O1 và non-O1,

ki u huy t thanh O1 bao gồm ba ki u huy t thanh ph nh sau: Ogawa; Inaba (hai ki u này đ c gọi chung là ki u cổ đi n – Classic) và ki u Eltor (ki u Eltor còn đ c gọi là ki u O139) Hai ki u huy t thanh Inaba và Ogawa ngày nay ch còn đ c tìm th y t i các n c thu c khu v c châu A Trong khi đó các

v d ch t trên khắp th gi i gây ra do ki u Eltor Khi có các tr n d ch do V cholerae gây ra th ng lan truy n r t nhanh vào trong n c, gây nhi m vào

th c ph m, n u đi u ki n v sinh kém, vi khu n s lan truy n qua con ng i và

d ch b nh càng thêm nghiêm trọng Vi sinh v t này s n sinh đ c t cholaratoxin, đây là lo i đ c t đ ng ru t có c ng đ m nh, ch c n 5µg gây nhi m qua đ ng mi ng có th gây tiêu ch y cho ng i tr ng thành M t s

đ c t khác cũng đ c vi sinh này ti t ra nh hemolysine có đ c tính t ng t tetrodotoxin (đ c t cá nóc) hay đ c t t ng t shiga-toxin

Các lo i th c ph m có th lan truy n V cholerae nh n c u ng, n c trái cây, rau qu , s a và các s n ph m s a, th m chí bia cũng có kh năng nhi m vi sinh v t này Các lo i s n ph m thuỷ s n t i s ng, không qua gia nhi t, gia nhi t nhẹ hay do s nhi m chéo sau khi gia nhi t cũng đ c khuy n

các là có nguy c mang V.cholerae khá nghiêm trọng

V parahaemolyticus là loài vi sinh v t tồn t i và phát tri n trong môi

tr ng có hàm l ng mu i cao, chúng th ng xuyên đ c phân l p từ các s n

ph m th y s n, trong các vùng n c m ven b bi n Chúng s n sinh đ c t hemolysine b n nhi t, ch t này ch u trách nhi m cho đặc tính kháng nguyên Kanagawa Nh ng trong nh ng năm g n đây các dòng V.parahaemolyticus có

ph n ng Kanagawa âm tính cũng có th gây b nh Tri u ch ng bi u hi n c a

b nh có th xu t hi n trong kho ng 2-96 gi sau khi tiêu th th c ph m b nhi m, th i gian này ph thu c vào li u l ng xâm nhi m và th tr ng c a từng

b nh nhân, lo i th c ph m tiêu th và hàm l ng acid trong d dày Các bi u

hi n b nh lý khi vi sinh v t này xâm nhi m và đau thắt vùng b ng, viêm nhi m

đ ng ru t và tiêu ch y nhẹ

Các loài Vibrio khác khi xâm nhi m vào trong th c ph m cũng có th gây nên các b nh đ ng ru t và có bi u hi n b nh lý t ng t nh hai loài trên Dĩ nhiên tuỳ từng loài và li u l ng mà có nh ng bi u hi n b nh nặng nhẹ khác

nhau Ch riêng loài V vulnificus không gây các tri u ch ng b nh đ ng ru t

mà chúng gây nhi m trùng máu cho ng i

2.7 Escherichia coli

E.coli thu c h ọ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), tr c

khu n ngắn, không t o bào tử, ch u đ c nhi t, không b h y khi đun nóng

100oC trong 2 gi E.coli có th kháng cồn, không b h y khi ti p xúc v i cồn 50%, b h y b i focmol 5%, có kh năng phát tri n nhi t đ từ 30 ÷ 50o

C, nhi t đ phát tri n t i u c a chúng là 37o

C, phát tri n pH t i u là 4,4 và aw

t i u là 0,95

E coli là vi sinh v t hi u khí phổ bi n trong đ ng tiêu hoá c a ng i và các loài đ ng v t máu nóng H u h t các dòng E coli tồn t i m t cách t nhiên

và không gây h i trong đ ng tiêu hoá, ng c l i chúng còn đóng vai trò quan

trọng trong vi c ổn đ nh sinh lý đ ng tiêu hoá Tuy nhiên có ít nh t 4 dòng sau đây có th gây b nh cho ng i và m t s loài đ ng v t:

Enterobathogenic E coli (EPEC)

Enterotocigenic E coli (ETEC)

Enteroinvasive E coli (EIEC)

Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli

O157: H7

Các dòng E coli gây b nh khi chúng xâm nhi m vào ng i qua con

đ ng th c ph m có th gây nên các b nh r i lo n đ ng tiêu hoá, các bi u

hi n lâm sàng bi n đ ng có th từ nhẹ đ n r t nặng, có th đe do m ng s ng

c a con ng i ph thu c vào li u l ng, dòng gây nhi m và kh năng đáp ng

c a từng ng i

2.8 Shigella

Gi ng Shigella cũng là m t thành viên c a họ vi khu n đ ng ru t

Enterobacteriacae, chúng g ồm có 4 loài sau: S dysenteriae, S sonnei, S plexneri, S boydii Đây là gi ng vi sinh v t có t bào ch đặc hi u, chúng ch thích nghi và phát tri n trong t bào ch là ng i và các loài linh tr ng S

hi n di n c a chúng trong môi tr ng là do s nhi m phân c a ng i và các

loài mang vi sinh v t này Shigella có th tồn t i h n 6 tháng trong môi tr ng

n c Các v ng đ c th c ph m do Shigella gây ra ch y u t p trung các

n c kém phát tri n, ch bi n th c ph m trong đi u ki n kém v sinh B nh

cũng có th truy n tr c ti p từ ng i qua ng i

Shigella ch y u gây nên các b nh l tr c trùng Th i gian b nh sau khi

tiêu th th c ph m b nhi m là 1-7 ngày Các bi u hi n tri u ch ng b nh có th

nhẹ, bi u hi n không rõ, ch thoáng qua nh tiêu ch y nhẹ, nh ng đôi khi cũng

có nh ng bi u hi n nghiêm trọng nh đi tiêu ra máu, có nh ng m nh niêm m c

ru t, m t n c, s t cao và b co rút thành b ng Các tri u ch ng trên có th kéo dài 12-14 ngày hay lâu h n Đ i v i ng i l n, các tr ng h p tử vong do

Shigella hi m khi di n ra, nh ng b nh bi u hi n r t nghiêm trọng đ i v i trẻ

em và ng i già Hàng năm có kho ng nửa tri u ng i tử vong do vi sinh v t gây ra trên khắp th gi i

S lây nhi m vi khu n Shigella ch y u đ ng mi ng N c là m t môi

tr ng truy n b nh quan trọng, đặc bi t nh ng n i kém v sinh Tuy nhiên các lo i th c ph m cũng là nguyên nhân gây nên các b nh do Shigella Vi sinh

v t này nhi m vào th c ph m qua nguyên li u hay quá trình ch bi n Ðôi khi nhi m b nh do v sinh cá nhân kém

2.9 Listeria monocytogenes

Trong nh ng năm g n đây L monocytogenes nổi lên nh m t m t tác

nhân gây b nh nguy hi m Đ i t ng gây b nh c a vi sinh v t này là trẻ em,

ph n mang thai hay nh ng ng i già Đ i v i nh ng vi sinh v t gây b nh g

đ c th c ph m khác, chúng b c phát b nh khi con ng i h p thu đ li u l ng, sau th i gian b nh các tri u ch ng lâm sàng bi u hi n Ng c l i L monocytogenes hi n di n v i m t s l ng nh trong th c ph m, khi đ c đ a vào c th , chúng tồn t i và ch c h i Khi có đi u ki n thu n l i, chúng nhân lên xâm nhi m vào các mô sâu và gây b nh Các b nh do vi sinh v t này gây nên bắt đ u từ đ ng tiêu hoá nh tiêu ch y, s t nhẹ Sau đó chúng xâm nhi m vào các đ i th c bào gây nên b nh nhi m trùng máu, tác đ ng lên h th n kinh trung ng, tim mắt, và có th xâm nh p vào bào thai gây nên s y thai, đẻ non hay nhi m trùng thai nhi

L monocytogenes thu c lo i vi sinh v t a l nh, chúng có th phát tri n

nhi t đ từ 2-44o

C Chúng th ng đ c phân l p từ các lo i th c ph m nh phomat s a, th t cá rau qu và th m chí phân l p đ c từ trong n c mặt Trong t t c các công đo n ch bi n th c ph m, s a hay rau qu đ u có kh

năng xâm nhi m vi sinh v t v t này Đặt bi t trong công đo n b o qu n các s n

ph m nhi t đ th p, vi sinh v t này có c h i phát tri n thành s l ng l n Các s n ph m thanh trùng Pasteur và đ c b o qu n nhi t đ th p trong các

t l nh có nguy c nhi m vi sinh v t này r t cao

2.10 Các virus gây b ệnh trong thực phẩm

Các đ t d ch b nh gây ra từ th c ph m do tác nhân virus cho đ n nay v n

là v n đ bí n Nh ng m t s tác gi v n tin rằng virus trong th c ph m là tác nhân gây nên các b nh hi m nghèo Nh ng ti n b trong các nhiên c u v virus

th c ph m v n còn h n ch Cho d n nay các đặc đi m sinh lý c a virus đ ng

ru t v n còn bi t r t h n ch Cho đ n nay các ph ng pháp nuôi c y đ phát

hi n virus trong th c ph m cho đ n nay v n ch a th th c hi n đ c Nh ng

v i các ti n b v kỹ thu t sinh học phân tử nh kỹ thu t lai phân tử, kỹ thu t PCR có th phát hi n đ c các virus có h i cho con ng i trong th c ph m

S lan truy n virus cho ng i qua con đ ng th c ph m đ c bi t từ

nh ng năm 1950 Các virus gây b nh đ ng ru t cho ng i ch y u có nguồn

g c từ các s n ph m thuỷ s n Cho đ n nay đ c bi t có kho ng h n 100 lo i virus đ ng ru t Nh ng ch m t vài loài trong s đó có kh năng gây b nh cho

ng i Theo Kilgen và Cole (1991) các loài virus sau đây có th gây nguy hi m cho ng i

Hepatitis type A (HAV)

Virus Norwalk

Calicivirus

Astrovirus

Virus NonA và Non B

Virus tồn t i th không ho t đ ng khi bên ngoài t bào, chúng không

th t nhân lên trong n c hay trong các s n ph m th c ph m cho dù b t kỳ

đi u ki n hoá lý nh th nào Chúng xâm nhi m vào th c ph m hoàn toàn do quá trình ch bi n, từ n c b ô nhi m Các loài nhuy n th ăn lọc có kh năng tích luỹ nhi u virus trong n c Hàng ngày m t con nguy n th có th lọc 1500 lít n c, theo đó m t s l ng l n virus có th vào c th c a con v t này và tích luỹ t i đó Vì th m t đ virus trong c th nhuy n th cao h n r t nhi u so

v i môi tr ng n c chúng đang sinh s ng

Li u l ng gây b nh c a virus có th th p h n r t nhi u so v i vi khu n khi con ng i tiêu th th c ph m b nhi m Li u l ng gây nhi m t i thi u c a m t

s loài vurus đ ng ru t t ng đ ng v i s l ng hi n di n trong th c ph m

mà các phòng thí nghi n có th phát hi n đ c bằng ph ng pháp nuôi c y

C th ng i và các loài đ ng v t là nguồn ch a các virus đ ng ru t Virus

đ c tìm th y v i s l ng l n trong phân c a nh ng ng i b nhi m và tồn t i trong nhi u ngày đ n nhi u tu n S nhi m phân vào trong th c ph m bằng con

đ ng gián ti p hay tr c ti p là con đ ng xâm nhi m virus vào th c ph m

S s ng sót c a virus trong môi tr ng hay trong th c ph m ph thu c vào y u t nh nhi t đ , nồng đ mu i, c ng đ b c x mặt tr i hay s hi n

di n c a các thành ph n h u c khác Virus đ ng ru t cũng có kh năng tồn

t i nhi u tháng trong n c bi n nhi t đ < 10o

C th m chí có th lâu h n Vì

th đây cũng là nhân t ch th ô nhi m phân T t c các virus đ ng ru t đ u kháng v i acid, các enzym th y gi i, hay mu i m t có trong đ ng tiêu hoá

M t s virus có th kháng nhi t nh Hepatits type A, m t s khác có th kháng

v i các ch t t y u nh phenolic, ethanol … Ozon và chlorine là nh ng tác nhân có th làm b t ho t m t vài lo i virus đ ng ru t

Đ ngăn ngừa các b nh do virus từ th c ph m, các lo i th c ăn ph i đ c

n u chín,khử virus tr c khi tiêu th , các lo i nhuy n th ăn lọc ph i đ c khai thác tronng nh ng vùng n c không nhi m virus hay đ c nuôi trong các vùng

n c s ch tr c khi tiêu th

2.11 Coliforms

Coliforms là nh ng tr c khu n hình g y, gram âm (-), không sinh bào tử,

hi u khí hoặc kỵ khí tùy ý Chúng có kh năng phát tri n nhi t đ r t r ng từ -2oC đ n 50o

C, pH trong kho ng 4,4 ÷ 9,0 Coliforms có kh năng lên men lactose sinh acid và sinh h i 37oC trong 24 ÷ 48gi

Coliforms hi n di n r ng rãi trong t nhiên trong ru t ng i, đ ng v t

Khi s Coliforms c a th c ph m cao thì kh năng hi n di n c a các vi sinh v t gây b nh khác cũng cao…

Coliforms ch u nhi t là nh ng Coliforms có kh năng lên men lactose sinh

h i trong kho ng 24 gi khi đ c 44o

C tromg môi tr ng canh EC

Coliforms phân là Coliforms ch u nhi t có kh năng sinh indole khi đ c kho ng 24 gi 45,5oC trong canh Trypton Coliforms phân là m t thành ph n

và, nhóm này đ c gọi là Coliform phân và nhóm không có nguồn g c từ phân

đ ng v t Trên th c t , các ph ng pháp ki m nghi m ch xác đ nh Coliform

phân là xác đ nh nhóm coliform có nguồn ng c từ ru t ng i và các đ ng v t

máu nóng bao gồm các gi ng nh Escherichia; Klebsiella và Enterobater

2.12 N ấm men và nấm m c

N m men và n m m c là nhóm vi sinh v t r t đa d ng, đây là nhóm vi sinh v t nhân th t có vách t bào và l p v chitin, có nhân và các bào quan khác T t c các loài n m men và n m móc đ u thu c nhóm vi sinh v t d

d ng Chúng ch có kh năng nh n các ch t dinh d ng d ng hòa tan Trong quá trình trao đổi ch t x y ra t bào chúng l i có kh năng chuy n hóa các

ch t hòa tan thành các ch t không hòa tan nh lignocellulose,… Ngoài ra, chúng còn có th t o ra các ch t đ c, các ch t đ c c a chúng đ c gọi chung là

đ c t vi n m (mycotoxins) Tiêu bi u có Aspegillus flavus, Aspegillus parasiticus, Aspegiluus moninus, Penicillium italicum, Penicillium digitatum, Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii Trong th c ph m n m m c

và n m men hi n di n có th tăng tr ng làm thay đổi màu c a th c ph m, làm phát sinh muồi hay v l , làm h h ng hay thay đổi c c u c a th c ph m, m t

s có th t o đ c t gây ng đ c th c ph m

đ m Có r t nhi u lo i buồn đ m vi sinh v t khác nhau phù h p v i từng th tích và kích th c c a từng nhóm vi sinh v t Ví d có th sử d ng buồng đ m

hồng c u Petroff – Hauser đ đ m vi khu n Đ i v i các m u n c và các m u khác, buồng đ m Holber đ c sử d ng r ng rãi nh t

Buồng đ n Holber là m t lam kính dày 2-3mm có m t vùng đĩa đ m nằm

gi a lame kính vùng này đ c bao quanh b i m t rãnh Đĩa đ m th p h n b

mặt c a lame kính kho ng 0,02mm, có hình tròn vì th khi ph lên trên bằng kính đ y v t thì đ sâu c a đĩa đ m s đồng đ u nhau Vùng đĩa đ m có đi n tích 1mm2 và đ c chia thành 400 ô vuông nh h n, m i ô có di n tích 0.0025mm2 th tích c a m i ô là 0,02 x 0,0025 mm2, th tích này t ng đ ng

v i 0,00005ml Thêm vài giọt formalin vào trong nh ng lọ ch a m u, tr n đ u Pha loãng m u c n đ m sao cho trong m i ô nh c a buồng đ m có khoãng 5 -

10 t bào vi sinh v t Đ đ t đ c đ pha loãng nh v y c n ph i c l ng

đ c s l ng vi sinh v t trong m u, đồng th i ph i thử vài l n trong quá trình pha loãng M u ph i đ c pha loãng bằng dung d ch pha loãng ch a 0,1% pepton và 0,1% laurylsulphat và 0,01% methyl blue T t c các dung d ch pha loãng đ u ph i c n lọc tr c khi sử d ng

Đặt m t giọt m u đ c pha loãng vào trong đĩa đ m trên buồng đ m, đ y

bằng kính đ y v t T t c các buồng đ m và kính đ y v t ph i đ c lau th t

s ch Th tích m u ch a trong buồng đ m là kho ng không gian gi a đĩa đ m

và kính đ y v t, không đ m u tràng ra bên ngoài rãnh c a đĩa Sau khi đ t

m u, đ yên kho ng 5 phút đ ổn đ nh v trí c a các t bào trong buồng đ m

Đ m ng u nhiên kho ng 50-100 ô nh Tính trung bình s l ng vi khu n trong

t t c các ô đã đ m Sau đó nhân v i 20 000 và v i đ pha loãng m u tr c khi

đ m đ có đ c s l ng t bào trong 1ml Lặp l i hai l n hay nhi u h n đ l y giá tr s đ m trung bình Đ i v i các vi sinh v t t thành từng c m, không th phân bi t từng t bào thì m i c m đ c xem là m t vi khu n

V i nh ng kinh nghi m c a m i cá nhân v đ pha loãng, thao tác kỹ thu t thành th o có th nh n đ c các s đ m chính xác Tuy v t k t qu có chính xác hay không còn ph thu c vào s s ch s c a buồng đ m, kính đ y

v t nhằm đ m b o không có vi khu n khác không ph i từ m u hi n di n trong

buồng đ m và trong kính đ y v t

3.1.2 K ỹ thu t đ m Breed

Kỹ thu t này r t h u ích trong vi c xác đ nh tổng s vi sinh v t bằng

ph ng pháp đ m tr c ti p Lame kính Breed có m t vùng có di n tích 1cm2

đ c đánh d u trên lame Dùng b m tiêm, hay que c y vòng cho 0,01ml m u

c n đ m vào trong vùng này, s y khô bằng ngọn lửa sau đó nhu m v i methyl blue Khi đ m, cho d u nhúng lên di n tích vùng c n đ m Thông th ng vùng này có đ ng kính 0,16 mm Di n tích vùng đ m là pr2 hay 3,14 x 0,08 x 0,08

= 0,02mm2 V i di n tích này chi m 1/5000 trong tổng di n tích đặt m u là 100mm2 hay th tích trong vùng đ m là 1/5000 x 0,01ml Nh v y n u có 1 vi sinh v t trong vùng đ m thì t ng đ ng v i 5000/0,01ml hay 500 000 t bào/ml S đ m c a các vi sinh v t trong các vùng khác nhau c a vùng qui c

đ c tính bằng công th c nh sau:

4 2

đ đ m s l ng vi khu n trong n c cho k t qu t t h n khi sử d ng ch t nhu m AODC khi trong m u n c có nhi u ch t dinh d ng và nhi u phiêu sinh v t khác V đ b n tính phát huỳnh quang c a DAPI cũng cao h n

AODC Hai tác gi trên cũng ch ng minh rằng khi nhu m v i DAFI có th b o

qu n trong t i đ n 24 tu n mà c ng đ phát quan không thay đổi Trong khi

đó AODC c ng đ và s l ng phát quang b gi m khi b o qu n trong vòng 1

tu n c ng đi u ki n

3.1.3 Đ m bằng kính hi n vi huỳnh quang

M t kỹ thu t khác d a trên nguyên tắc nhu m màu đặc hi u DNA đ c

gọi là Hoechst 33258 cũng đ c sử d ng đ nhu m và đ m s l ng vi sinh v t trên kính hi n vi huỳnh quang Ph ng pháp này nh sau: Bisbenzumide k t

h p v i vùng DNA giàu adenine và thyamine sau khi gắn ph c h p này s phát

huỳng quang Hoechst 33258 đ c sử d ng nhi u trong vi c đ nh l ng vi sinh

v t trên b mặt Đặt bi t trên b mặt có gắn các acridine orange M t s thu n

l i khác khi sử d ng ph ng pháp nhu m màu bisbenzimide cho phép đ m s

l ng vi sinh v t trong các d ng d ch ch t t y rửa, trong mu i dùng cho các phòng thí nhi m hay trong các ch ph m sinh học khác mà không có s hi n

có th gi l i t t c các vi sinh v t trên b mặt c a chúng Màng Nuclepore có

th nhu m v i thu c nhu m Irgalan đen hay các lo i thu c nhu m phù h p khác đ t o nên m t n n màu đen t ng ph n v i màu phát quang c a vi sinh

v t vì th vi c đ m đ c th c hi n d dàng Khi sử d ng thu c nhu m là acridine cam vi khu n và các vi sinh v t khác phát quang màu xanh hay màu cam Màu phát quang xanh hay cam là ph thu c vào tình tr ng sinh lý c a

từng vi sinh v t Nh ng kh năng phân bi t t bào đang s ng hay t bào đã ch t

b i m u phát quang đôi khi đ a đ n s nh m l n Sử d ng ADPI nhu m DNA

c a t bào vi khu n chúng đ a đ n s phát quang màu xanh d ng đ c cho là

t i u h n so v i vi c sử d ng acridin cam đ nhu m các vi khu n có kích

th c nh

S đ m nh n đ c từ ph ng pháp đ m tr c ti p trên kính hi n vi phát

huỳnh quang luôn cho k t qu cao t ng đ ng hai l n so v i k t qu nh n

đ c bằng kỹ thu t nuôi c y khác Nh ng vi khu n có kích th c nh , có hình

d ng b t th ng khác cũng đ u có th nhìn th y bằng ph ng pháp phát huỳnh quang M t s d ng vi sinh v t không th nuôi c y trong các môi tr ng tổng

h p trong phòng thí nghi m Hi n t ng không th nuôi c y c a các vi sinh v t cho đ n nay v n ch a rõ là do chúng thoái hoá, không th nhân lên trong các môi tr ng nhân t o hay do không đáp ng đ c các đi u ki n sinh lý c n thi t

cho s phát tri n c a chúng Trong m t s tr ng h p, s t ng quan cao gi a

ph ng pháp đ m tr c ti p bằng ph ng pháp phát huỳnh quang và ph ng pháp đ m khu n Tuy nhiên trong m t s tr ng h p khác s t ng quang này

r t kém S khác bi t gi a ph ng pháp đ m tr c ti p và ph ng pháp đ m khu n l c ph n ánh s chọn lọc c a môi tr ng và đi u ki n nuôi c y, m t

ph n t bào b ch t hay b th ng tổn và s loài c th trong m u

Giá tr c a s đ m tr c ti p bằng ph ng pháp phát huỳnh quang trên kính

hi n vi t ng đ ng v i v i s l ng vi sinh v t th t s có th có v i t t c các loài khác nhau Đi u đó cho phép c đoán đ c đ c s l ng th t s trong

n c bi n, trong n c t nhiên, trong trong m t lo i m u nào đó, mặt dù các loài này có s khác bi t l n v s l ng c a từng ch ng loài, khác bi t v đặc đi m sinh lý di n ra trong cùng đi u ki n c a m u S đ m tr c ti p th ng ph n ánh đúng v i sinh kh i, vì th th ng đ c dùng đ c l ng sinh kh i vi sinh v t

có trong m u Tuy nhiên đ có đ c s đ m chính xác bằng kính hi n vi phát

huỳng quang c n ph i đ m nhi u l n và nhi u v trí khác nhau trên m u

Thêm vào đó n u đ m nhi u t bào đang phân chia có th cho phép c đoán t c đ phát tri n c a vi sinh v t trong m u T n su t c a t bào đang phân chia đ c nhìn th y có m i liên h v i ch s đo khác c a t c đ phát tri n vi sinh v t nh t c đ tổng h p RNA đ c đo b i s phòng thích c a adenine đ c đánh d u T ng xu t c a t bào đang phân chia đ c tính bằng th i gian gi a lúc

bắt đ u s thắt c a t bào đ n khi t bào phân chia là m t hằng s Con s này không ph i là b t bi n Th t khó khăn đ nh n ra s phân chia t bào khi sử d ng kính hi n vi quang học mà không sử d ng kính hi n vi phát huỳnh quang

3.2 Các k ỹ thu t đ nh l ng vi sinh v t trong m u bằng ph ng pháp nuôi c ấy

Có hai cách đ xác đ nh s l ng vi khu n bằng ph ng pháp nuôi c y:

ph ng pháp đ m khu n l c và ph ng pháp c đoán s l ng vi khu n (MPN – Most probable number) T t c các ph ng pháp đ nh l ng vi khu n

trong m u bằng ph ng pháp nuôi c y đ u yêu c u các t bào ph i đ c tách

r i nhau, qua quá trình nuôi c y các t bào này phát tri n thành các dòng riêng

bi t T t các qui trình đ nh l ng bằng ph ng pháp nuôi c y nhằm chọn lọc

m t hay nhi u nhóm vi khu n nh t đ nh nào đó, m c đ chọn lọc ph thu c và

từng qui trình qui trình c th Đ xác đ nh tổng s vi sinh v t trong m u ph i

chọn qui trình gi m t i thi u kh năng chọn lọc Nh ng dù m c đ chọn lọc

m c t i thi u cũng ch đ nh l ng đ c s l ng vi sinh v t có th nuôi c y Còn m t s l ng l n vi sinh v t khác không th phát tri n đ c trong quá trình nuôi c y thì không th đ nh l ng đ c bằng ph ng pháp này Có các

ph ng pháp đ nh l ng nuôi c y nh sau nh sau:

3.2.1 Ph ng pháp đ m khu n l c

Ph ng pháp đ m khu n l c trên đĩa đ c sử d ng r ng rãi đ đ nh l ng

vi sinh v t, đặc bi t là vi khu n, nh ng pháp này có nh ng khuy t đi m và đã

có nh ng cách nhìn nh n khác nhau v mặt khoa học Khuy t đi m c a ph ng pháp này nằm trong s l m d ng đ bi u đ t sai các k t qu T t c mọi ng i

đ u mắc sai l m khi nh n ra rằng ph ng pháp này không th dùng đ thu đ c

k t qu tổng s vi sinh v t

Ph ng pháp đ m khu n l c sử d ng nhi u lo i môi tr ng và các đi u

ki n nuôi c y khác nhau Agar là ch t th ng đ c dùng đ làm đặc các môi

tr ng nuôi c y vì h u h r các vi sinh v t đ u m t các gen tổng h p enzym phân gi i agar Các m u đã đ c pha loãng đ trãi lên b mặt môi tr ng agar (ph ng pháp trãi) hay khuy t tán vào trong nôi tr ng tr c khi làm đặc (ph ng pháp đổ đĩa) M t v n đ c n ph i cân nhắc là các vi sinh v t c n xác

đ nh có th tồn t i và phát tri n trong môi tr ng agar hay không M t s vi sinh v t có th b ch t khi trãi trên b mặt môi tr ng trong qui trình c y tr i b

mặt M t s loài vi khu n khác không th s ng trong đi u ki n nhi t đ duy trì

tr ng thái l ng c a agar trong qui trình đổ đĩa B i vì agar ch là tác nhân làm

rắn môi tr ng nuôi c y trong qui trình đ nh l ng vi sinh v t vì th trong m t

s tr ng h p agar có th đ c thay th bằng các tác nhân làm rắn khác Trong

m t s tr ng h p các vi sinh v t có các nhu c u dinh d ng đặc bi t khác, các

ch t nh silicagel có th đ c thay th đ làm rắn môi tr ng Nh ng vì chu n

b môi tr ng silicagel khó khăn h n chu n b môi tr ng agar nên ch dùng môi tr ng silicagel khi không th thay th đ c môi tr ng agar

Ph ng pháp ng cu n đ c dùng đ đ nh l ng các vi sinh v t kỵ khí bắt

bu c Đây là m t ph ng pháp c i biên c a ph ng pháp đổ đĩa Các đĩa hay các ng sau khi c y vi khu n đ c trong đi u ki n nhi t đ đặc bi t trong m t

th i gian nh t đ nh đ cho sinh v t phát tri n thành các khu n l c có th nhìn

th y bằng mắt tr ng, s l ng khu n l c xu t hi n trên đĩa s đ c đ m S

l ng khu n l c s đ c gán cho s t bào đ n lẻ trong m u ban đ u Đ s

l ng khu n l c ph n ánh đ c s l ng t bào vi khu n, m u ph i đ c phân

tán đ u vào trong môi tr ng hay trên b mặt môi trt ng rắn Nh ng đĩa có quá nhi u khu n l c xu t hi n thì không th cho s l ng đ m chính xác b i vì chúng có th chồng l p lên nhau Nh ng đĩa có quá ít khu n l c cũng ph i b đi

đ nh, chúng đặt thù cho từng lo i môi tr ng và từng lo i m u nh t đ nh đ có

th nh n đ c s l ng vi sinh v t m c tiêu cao nh t Nh v y môi tr ng nuôi

c y ph i có các thành ph n dinh d ng phù h p v i từng yêu c u c a loài vi sinh v t, bao gồm c các nhân t c n thi t khác cho s phát tri n c a m t h vi sinh v t nh t đ nh M c đích chung c a môi tr ng là hàm l ng dinh d ng

ph i cao h n các thành ph n có trong các m u đang phân tích Hàm l ng dinh

d ng trong các lo i môi tr ng đ m tổng s vi sinh v t ph i đ cao, và đ c tính c a môi tr ng đ i v i sinh v t m c th p nh t

Đ nâng cao hi u qu c a qui trình đ nh l ng vi sinh v t bằng ph ng pháp đ m khu n l c, các đi u ki n c n ph i đi u ch nh sao cho ch có các thành viên vi sinh v t c n phát hi n theo đ nh nghĩa đ c đ m Các môi tr ng đ m đĩa đ c chọn lọc hay phân bi t v i các thành viên vi sinh v t khác Qui trình

đ m đĩa chọn lọc đ c thi t k cho thích h p v i s phát tri n c a vi sinh v t mong mu n S phát tri n c a các nhóm vi sinh v t khác đ c lo i b b i các thành ph n c a môi tr ng hay đi u ki n nuôi Môi tr ng phân bi t là môi

tr ng không lo i b các nhóm vi sinh v t không mong mu n mà ng c l i cho phép chúng phát tri n cũng trên môi tr ng đó nh ng có th bi t phân bi t các nhóm vi sinh v t mong mu n v i các nhóm khác bằng các đặc đi m nh n d ng Môi tr ng cũng có th đ c thi t l p đ chọn lọc các loài n m m c Mặt

dù kỹ thu t đ m khu n l c không ph i là ph ng pháp đ c chọn cho vi c xác

đ nh s l ng n m m c trong các m u th c ph m và trong môi tr ng B i vì

kỹ thu t này ch thích h p cho vi c đ nh l ng các loài vi sinh v t không có s i hay bào tử Dĩ nhiên ph ng pháp đ m khu n l c cũng thích h p cho vi c đ nh

l ng các loài n m men Vì s l ng c a vi khu n luôn nhi u h n s l ng c a

n m m c nên đ ngăn c n s phát tri n c a vi khu n trong các khu n l c c a

n m m c, các tác nhân c ch vi khu n đ c thêm vào trong các môi tr ng nuôi c y Các thu c nhu m bengal rose và các kháng sinh nh streptomycine, neomycine th ng đ c sử d ng là nh ng tác nhân c ch vi khu n M t bi n pháp đ n gi n đ c ch s phát tri n c a vi khu n là h th p pH c a môi

tr ng nuôi c y xu ng kho ng 4,5 - 5,5 H u h t các n m m c đ u không b tác

đ ng khi phát tri n trong kho ng pH này nh ng khi đó vi khu n b c ch

Môi tr ng chọn đ c xác l p công th c đ c ch s phát tri n c a nhóm

vi sinh v t và cho phép m t nhóm vi sinh v t khác phát tri n Ví d môi tr ng Saubouraud Dextrose Agar đ c dùng đ đ nh l ng n m m c d a trên nguyên

tắc pH th p và nguồn carbohydrate Bổ sung vào môi tr ng các ch t kháng sinh khác nh peniciline hay methyl bule là nh ng tác nhân c ch vi khu n gram âm Các vi sinh v t kháng kháng sinh cũng có th đ c đ nh l ng trên môi tr ng bằng cách thêm vào đó m t li u l ng kháng sinh

Môi tr ng phân bi t đ c thi t l p d a trên nhi u cách Các thu c thử

đ c thêm vào trong môi tr ng đ cho phép nh n ra các s khác bi t c a

nh ng vi sinh v t mong mu n Có th thêm thu c thử vào môi tr ng sau khi nuôi c y đ nh n ra các loài vi sinh v t đặc tr ng c n tìm Chìa khoá nâng cao

kh năng phân bi t c a môi tr ng là qui trình nuôi c y đ cho phép môi

tr ng phân bi t m t cách t t nh t v i vi sinh v t c n đ nh l ng và các vi sinh

v t khác có trong m u

Môi tr ng Eosin methyl blue (EMB) và MacConkey agar là nh ng môi

tr ng đ c sử d ng r ng rãi trong vi c phân tích vi sinh v t trong n c

Nh ng môi tr ng này bao gồm tính chọn lọc và tính phân bi t Chúng chọn

lọc cho s phát tri n c a các vi khu n gram âm b i trong đó có thêm vào các tác nhân c ch các vi khu n gram d ng Môi tr ng này có th phân bi t các

vi khu n có th sử d ng lactose b i s hình thành các khu n l c có th phân

bi t bằng màu sắc Trên môi tr ng EMB, vi khu n thu c nhóm coliforms là nhóm gram âm t o nên nh ng khu n l c có màu tím ánh kim Đ nh l ng s

l ng coliform bằng cách đ m s l ng khu n l c có các đặc đi m này Cách này th ng xuyên đ c s d ng trong vi c phân bi t các vi sinh v t ch th trong n c và trong th c ph m

V i kỹ thu t đ n khu n l c, các m u c n phân tích ph i đ c pha loãng thành chu i pha loãng liên ti p và đ c xác đ nh m t vài nồng đ pha loãng

nh t đ nh đ c y vào các môi tr ng đã chọn phù h p v i các đ i t ng c n xác đ nh Mổi khu n l c đ c hình thành đ c gán cho m t đ n v hình thành khu n l c (cfu-colony forming units) Kỹ thu t th ng qua các b c nh sau: Dung d ch pha loãng: m t s dung d ch dùng đ pha loãng có th làm ch t

t bào nh : n c mu i, n c c t Các dung d ch pha loãng không đ c dùng ngay khi l y ra từ t l nh có th gây s c và làm cho vi sinh v t không th phát tri n đ c Dung d ch pepton water là dung đ ch pha loãng đ c sử d ng nhi u

nh t và đ c xem là dung d ch pha loãng cho t t c các lo i m u N u trong

m u còn có m t ít các ch t khử trùng thì ph i thêm vào dung d ch pha loãng tác nhân gi m thi u kh năng khử trùng c a chúng, ví d : n u trong m u còn d

l ng c a các h p ch t amonium (NH4-) thì có th thêm vào đó Tween 80 hay lecithin Ng c l i n u trong m u có ch a các h p ch t chlorin hay iodin thì

c n thêm vào đó các mu i nh sodium thiosulphate

Chu ẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu

B m chính xác 9ml dung d ch pha loãng vào trong ng nghi m có nắp

đ y N u sử d ng các ng nghi m có nắp không đóng chặc đ c thì ph i khử

trùng ng nghi m, sau đó b m dung d ch pha loãng vào, các thao tác này ph i

đ c th c hi n m t cách vô trùng Phân ph i dung d ch pha loãng vào các ng

sau khi khử trùng còn có ý nghĩa đ m b o th tích dung d ch pha loãng không

b m t do quá trình khử trùng Các thao tác pha loãng tuỳ thu c vào từng lo i

m u C th nh sau:

- N u pha loãng các m u là ch t l ng, tr c khi pha loãng m u ph i đ c

lắc kỹ, cắm đ u pippette sâu vào trong m u kho ng 1” hút ra 1ml, cho vào

trong ng ch a dung d ch pha loãng đ u tiên, lắc kỹ ng nghi m ch a m u, b

pippette vừa sử d ng, dùng m t pipptte m i th c hi n l i thao tác nh trên v i

các đ pha loãng ti p theo C ti p t c nh v y cho đ n khi đ t đ c đ pha

loãng mong mu n M i đ pha loãng ch đ c phép sử d ng 1 pippette Hàm

l ng m u trong 1ml dung d ch các đ pha loãng c a dãy nh sau:

- Đ i v i các m u rắn hay bán l ng, các thao tác đ c ti n hành nh sau:

cân 10 g m u vào trong các bao d p m u hay các máy xay vô trùng, thêm 90ml