Thiết kế vector biểu hiện các gen mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin trong e coli

Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra vanillin tự nhiên, bảo vệ môi trường

LÊ THỊ QUỲNH HOA

Tên đề tài:

“THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CÁC GEN MÃ HÓA ENZYME SINH TỔNG HỢP VANILLIN TRONG ESCHERICHIA COLI”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : CNSH & CNTP

Khoá học : 2010 – 2014

Giảng viên hướng dẫn : TS Dương Văn Cường

Khoa CNTP – CNSH - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014

Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này cùng với sự nỗ lực của cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp

đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình Nhân dịp hoàn thành luận văn:

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Dương Văn Cường, kĩ sư

Ma Thị Trang, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Khoa CNSH – CNTP đã dạy

dỗ và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ, anh chị làm việc tại Viện Khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện để tôi được học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Xin chân trọng cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Quỳnh Hoa

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Yêu cầu đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về vanillin 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Cấu trúc, đặc điểm lí hóa 4

2.1.3 Đặc tính sinh học 4

2.1.4 Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống 6

2.2 Các con đường sinh tổng hợp vanillin 9

2.2.1 Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật 9

2.2.2 Con đường sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic trong vi sinh vật 9

2.3 Các phương pháp sản xuất vanillin 14

2.3.1 Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật 14

2.3.2 Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học 15

2.3.3 Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học 17

2 4 Tiềm năng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất vanillin 20

2.4.1 Các gen mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic 20

2.4.2 Vi khuẩn E coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin 22

2.5.2 Các nghiên cứu trong nước 28

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Vật liệu nghiên cứu 29

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 29

3.1.2 Vật liệu 29

3.1.3 Hoá chất 34

3.1.4 Dụng cụ 35

3.1.5 Thiết bị 36

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 36

3.3 Nội dung 37

3.4 Phương pháp nghiên cứu 38

3.4.1 Quy trình thực hiện 38

3.4.2 PCR 40

3.4.3 Điện di trên gel agarose 41

3.4.4 Tách chiết DNA plasmid 42

3.4.5 Lập bản đồ giới hạn (Restriction mapping) 43

3.4.6 Thu nhận DNA từ gel 44

3.4.7 Phản ứng nối DNA 45

3.4.8 Chuẩn bị tế bào khả biến 45

3.4.9 Biến nạp DNA vào tế bào khả biến 46

3.4.10 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 46

4.1 Tách dòng và giải trình tự gen ech, fcs từ P fluorescens VTCC-B-668 48

4.1.1 Kết quả tách dòng và giải trình tự gen ech 48

4.1.2 Kết quả tách dòng gen fcs và giải trình tự 52

4.2 Thiết kế vector biểu hiện chứa 3 gen gltA, ech, fcs dựa trên nền tảng vector pET22b(+) 55

4.2.1 Kết quả gắn gen gltA vào pET22b+ tạo tổ hợp pET22-G 55

4.2.2 Kết quả gắn gen ech vào vector pET22-G tạo tổ hợp pET22-GE 57

4.2.3 Kết quả gắn gen fcs vào vector pET22-GE tạo tổ hợp pET22-GEF 60

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

5.1 Kết luận 61

5.2 Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

I Tiếng Việt 62

II Tiếng Anh 62

Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanilin (Ravendra, Sharma et al 2012) 4

Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin trong các hạng mục thực phẩm 7

Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm 8

Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên các cơ chất 19

Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T 30

Bảng 3.2: Các thành phần của vector pET22b (+) 32

Bảng 3.3: Trình tự mồi khuếch đại gen ech, fcs 33

Bảng 3.4: Danh mục các thiết bị 36

Bảng 3.5: Thành phần phản ứng PCR 40

Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt enzyme 44

Bảng 3.7: Thành phần phản ứng nối 45

Hình 2.2: Công thức cấu tạo 4

Hình 2.3: Vanillin dạng bột 4

Hình 2.4 : Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) 10

Hình 2.5: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) 11

Hình 2.6: Con đường Non-oxidation decarboxylataion 12

Hình 2.7: Con đường CoA-Independent Deacetylation 13

Hình 2.8: Con đường Side-Chain Reductive 14

Hình 2.9: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol 16

Hình 2.10: Sơ đồ con đường phân hủy acid ferulic trong P fluorescens BF13 21

Hình 2.11: Con đường sinh tổng hợp vanillin trong chủng E coli tái tổ hợp 22

Hình 2.12 Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA 23

Hình 2.13: Cấu trúc plasmid pBB1 chứa gen từ Pseudomonas fluorescens BF13 25

Hình 3.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T 29

Hình 3.2: Cấu trúc vector pTZ-gltA 31

Hình 3.3 Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+) 31

Hình 3.4: Sơ đồ quy trình tách dòng gen ech, fcs từ P fluorescens VTCC-B-668 38

Hình 3.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu hiện chứa các gen 39

Hình 3.6: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen ech 40

Hình 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen fcs 41

Hình 4.1: Kết quả PCR khuếch đại gen ech 48

Hình 4.2: Kết quả sàng lọc các dòng mang vector pTZ-ech 49

Hình 4.5: Kết quả sàng lọc dòng mang vector pTZ-fcs 53

Hình 4.6: Kết quả PCR khuếch đại gen fcs 53

Hình 4.7: Kết quả cắt đồng thời 2 enzyme EcoRI và SacI 54

Hình 4.8: Kết quả điện di các dòng plasmid 55

Hình 4.9: Kết quả cắt đồng thời 2 enzyme HindIII và SacI 56

Hình 4.10: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gen gltA trong pET22-G 56

Hình 4.11: Kết quả cắt pET22-G dòng 1,7 bằng enzyme NcoI 57

Hình 4.12: Kết quả điện di các dòng plasmid của tế bào biến nạp sản phẩm gắn nối giữa gen ech và pET22-G 58

Hình 4.13: Kết quả cắt plasmid đồng thời bằng 2 enzyme SacI và EcoRI 58

Hình 4.14: Minh hoạ cơ sở kiểm tra chiều gắn gen ech trong pET22-GE 59

Hình 4.15: Kết quả cắt các dòng đồng thời bằng EcoRI và BamHI 60

4-CL : 4-hydroxycinnamate-CoA ligase

DNA-PK : DNA protein kinase

E coli : Escherichia coli

5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-galactoside

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm, dinh dưỡng (Ranadive, 1994) Mức độ tiêu thụ hàng năm trên thế giới vào khoảng hơn 12000 tấn (Lomascolo, Stentelaire, Asther, & Lesage-Meessen, 1999) Vanillin còn thể hiện các đặc tính chống khuẩn và chống oxy hóa vanillin (Sinha, Sharma, & Sharma, 2008), đồng thời đã có nghiên cứu chứng minh vanillin có tác dụng chống đột biến và ung thư (Sinha et al., 2008)

Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả của loài lan

Vanilla planifolia và tổng hợp nhân tạo từ eugenol, lignin…Trong đó, vanillin được

tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, còn lại là tổng hợp hóa

học Giá trị kinh tế của vanillin tự nhiên từ Vanilla planifolia có giá lên tới 4000

đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân tạo chỉ vào khoảng 15 đôla trên một

kilogam (S.-H Yoon et al., 2005) Tuy nhiên, vanilin nhân tạo không được đánh

giá tương đương như vanillin tự nhiên theo quy định của Mỹ và Châu Âu do thiếu hẳn các hương vị thuần khiết của vanillin tự nhiên và quá trình tổng hợp gây ảnh hưởng xấu tới môi trường (Muheim & Lerch, 1999)

Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin tự nhiên với vanillin tổng hợp đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra vanillin

tự nhiên, bảo vệ môi trường và hiệu quả kinh tế bằng các con đường sinh tổng hợp thông qua các chuyển hóa sinh học nhờ vi sinh vật từ các nguồn cơ chất như acid ferulic, eugenol, isogenol, lignin,…

Trong các nguồn cơ chất trên, acid ferulic được nghiên nhiều về các con đường chuyển hóa để tạo ra vanillin có thể được ghi nhãn tự nhiên Acid ferulic có nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ các phế phụ phẩm nông nghiệp Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy acid ferulic để tạo ra

vanillin như Amycolatopsis sp strain HR167 (Achterholt, Priefert, & Steinbuchel, 2000), Delftia acidovorans (R Plaggenborg, Steinbuchel, & Priefert, 2001), Pseudomonas putida (R Plaggenborg, Overhage, Steinbüchel, & Priefert, 2003), Streptomyces setonii (Sutherland, Crawford, & Pometto, 1983), Pseudomonas

fluorescens (Narbad & Gasson, 1998),… Vanillin mặc dù được tổng hợp từ các vi

sinh vật trên song nó bị phân hủy thành các hợp chất khác, do vậy làm giảm nồng

độ vanillin tạo ra Đồng thời quá trình lên men một số xạ khuẩn thường gặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và bào tử

Dưới sự phát triển của khoa học công nghệ, các nhà khoa học trên thế giới

đã thành công trong việc tổng hợp vanillin trong các vi khuẩn không mang gen sinh tổng hợp cũng như không có con đường phân hủy vanillin bằng kĩ thuật DNA tái tổ

hợp Trong số đó, E coli được xem là một ứng cử viên tiềm năng cho sản xuất

vanillin bằng các hệ thống vector biểu hiện chứa các gen liên quan tới con đường

chuyển hóa sinh học từ acid ferulic đến vanillin (fcs, ech) và gen tham gia vào sự tăng cường tổng hợp vanillin (gltA)

Ở Việt Nam, sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp còn

là một vấn đề mới, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở tổng hợp hoá học Xuất phát từ

thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “ Thiết kế vector biểu hiện các gen mã hóa enzyme

sinh tổng hợp vanillin trong E coli”, sử dụng gen fcs và ech được tách dòng từ

Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam và gen gltA từ E coli

1.2 Mục tiêu đề tài

- Tách dòng và giải trình tự 2 gen ech và fcs từ chủng Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 được phân lập tại Việt Nam

- Thiết kế vector biểu hiện 3 gen mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp vanilin

1.3 Yêu cầu đề tài

- Tách dòng và giải trình tự được gen fcs, ech từ chủng Pseudomonas fluorescens

VTCC-B-668

- Gắn được 3 gen fcs, ech, gltA vào vector biểu hiện pET22b(+)

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Tách dòng và tạo ra vector biểu hiện các gen tạo tiền đề cho các nghiên cứu

về biểu hiện vanillin trong E coli sau này

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sản phẩm cuả nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới cho sản

xuất vanillin tự nhiên

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về vanillin

2.1.1 Nguồn gốc

Vanila là hỗn hợp chất thơm tự nhiên phổ biến trên thế giới được tách chiết

từ vỏ quả loài lan Vanilla planifolia Trong số hơn 250 thành phần chất hóa học

khác nhau được tách chiết từ vỏ quả vanillin chiếm thành phần chủ yếu (Daphna Havkin-Frenkel & Belanger, 2007)

Lịch sử về nguồn gốc vanilin bắt đầu từ sự khám phá ra loài lan Vanilla planifolia ở Mesoamerica suốt những năm 1930 Người Aztecs (Mexico) được coi

là cái nôi đầu tiên trong việc sử dụng vanilla cho đồ uống của họ Sau đó, người Tây Ban Nha xâm chiếm và mang nó về Châu Âu song mọi cố gắng để có thể trồng

được cây Vanilla planifolia đều thất bại do không có sự thụ phấn tự nhiên Cho đến

khi nhà thực vật học Charles Morren phát hiện ra bí mật của sự miễn cưỡng sinh sản ở những vùng đất ngoài Mexico, điều này đã dẫn tới khám phá ra sự thụ phấn nhân tạo cho hoa cuả vanila (Sinha et al., 2008)

Ngày nay, vanila được trồng phổ biến ở một số quốc gia như Indonesia, Trung Quốc, Madagascar, Mexico,…(Daphna Havkin-Frenkel & Belanger, 2007)

Hình 2.1: Sơ đồ phân bố vanila trên thế giới

2.1.2 Cấu trúc, đặc điểm lí hóa

Vanillin có dạng bột kết tinh màu trắng với mùi thơm mạnh, dễ chịu Về mặt hóa học vanillin là một phenolic aldehyde (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde), có công thức phân tử là C8H8O3, bao gồm các nhóm aldehyte, ete, phenol (Converti, Aliakbarian, Dominguez, Bustos Vazquez, & Perego, 2010)

Hình 2.2: Công thức cấu tạo Hình 2.3: Vanillin dạng bột

(Converti, Aliakbarian, Dominguez, Bustos Vazquez, & Perego, 2010)

Các đặc tính lí hóa của vanillin được thể hiện dưới bảng sau:

Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí của vanilin (Ravendra, Sharma, & Prem Shanker, 2012)

2.1.3 Đặc tính sinh học

Các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra những đặc tính của vanillin như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, chống bệnh hồng cầu lưỡi liềm,…(Sinha et al., 2008)

2.1.3.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật

Vanillin và dẫn xuất thể hiện mức độ khác nhau về hoạt tính kháng nấm bao gồm các loại nấm men, nấm mốc gây hư hại thực phẩm (Fitzgerald, Stratford, Gasson, & Narbad, 2005) Vanillin còn ức chế sự sinh trưởng của nấm men và nấm mốc trong nước hoa quả ép, thạch hoa quả (López-Malo, Alzamora, & Argaiz, 1995) và trong bảo quản xoài chế biến tươi (Ngarmsak et al., 2006) và chống lại

một số nấm men gây bệnh quan trong trong y học như Candida albicans, Cryptococcus neoformans (Boonchird & Flegel, 1982)

Vanillin đóng vai trò như một tác nhân kháng khuẩn chống lại Escherichia coli, Lactobacillus p lantarum, Listeria innocua Schiff bases (thuốc nhuộm

fuchsin) có nguồn gốc từ vanillin được đánh giá là một chất kháng khuẩn chống lại

một số chủng Gram dương và gram âm như Pseudomonas pseudoalcaligens, Proteus vulgaris, Citrobacter freundii, Enterobacter aero-gens, Staphylococcus subfava, Bacillus megaterium (Vaghasiya, Nair, Soni, Baluja, & Shanda, 2004)

Tuy nhiên cần có hướng nghiên cứu xác định nồng độ nhỏ nhất mà ở đó vanillin hoạt động như một chất kháng vi sinh vật cũng như chất bảo quản tự nhiên

2.1.3.2 Hoạt tính kháng oxy hóa

Vanillin đã được công nhận với khả năng chống oxy hóa cũng như hoạt tính phân hủy các gốc tự do Vanillin có khả năng chống lại các tổn thương ở não dưới

sự cảm ứng của carbon tetrachloride (CCl4) tác nhân gây oxy hóa ở chuột (Makni, Chtourou, Barkallah, & Fetoui, 2012), bảo vệ lớp màng ty thể gan khỏi quá trình oxy hóa được cảm ứng bởi sự nhạy cảm ánh sáng trên ty thể gan chuột (Kamat, Ghosh, & Devasagayam, 2000) Sự có mặt của vanillin với lượng nhỏ trong thực phẩm cũng giúp chống lại oxy hóa, ức chế sự tự oxy hóa ở sữa béo

2.1.3.3 Hoạt tính chống ung thư và đột biến

Vanillin đã được nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư và đột biến Vanillin ức chế

đột biến ở locus CD59 trên NST 11 ở người được cảm ứng bởi hydrogen peroxide, N-methyl-N-nitrosoguanidine và mitomycin C (Gustafson et al., 2000) Vanillin ức

chế con đường Non-homologous DNA end- joining (NHEJ) gây ra sự đứt gãy trên mạch kép DNA bởi ức chế hoạt tính của DNA-PK (DNA protein kinase) (Durant & Karran, 2003), làm giảm số lượng khối u ruột cảm ứng bởi nhiều tác nhân trong mô hình chuột (Akagi et al., 1995)

2.1.3.4 Hoạt tính hạ lipid trong máu

Vanillin được sử dụng để ngăn chặn sự phát triển tình trạng bệnh lí như siêu

mỡ trong máu Hoạt tính dược lí của vanillin như một tác nhân hạ lipid trong máu khi nồng độ vượt quá phạm vi cho phép trong điều trị bệnh tiểu đường (type 2), rối loạn tim mạch, béo phì Trước đó đã có nghiên cứu vanillin làm giảm lượng triglycerin trong huyết tương, triglycerin liên kết với lipoprotein và triglycerin trong gan trên đối tượng chuột (Srinivasan & Chandrasekhara, 1992)

2.1.3.5 Hoạt tính chống tạo hồng cầu lưỡi liềm

Vanillin trong các thí nghiệm in vitro đã chứng minh khả năng chống tạo

hồng cầu lưỡi liềm bởi tác động của nhóm aldehyde với hemoglobin trong tế bào hồng cầu (Abraham et al., 1991) Tuy nhiên vanillin được hấp thụ theo đường uống không có tác động trị liệu bởi vì nó có sự phân hủy nhanh chóng trong dịch tiêu hóa Để khắc phục vấn đề này, chế phẩm vanillin MX- 1520 đã được tổng hợp Lợi ích sinh học của loại thuốc này chống tạo thành hồng cầu lưỡi liềm mạnh gấp 5 lần

so với vanillin tự nhiên (C Zhang et al., 2004)

2.1.3.6 Các hoạt tính khác

Các loại dầu dễ bay hơi tách chiết từ nghệ, cỏ xả, húng quế kết hợp với 5% vanillin có tác dụng hiệu quả chống lại các loài muỗi (Tawatsin, Wratten, Scott, Thavara, & Techadamrongsin, 2001)

2.1.4 Vai trò vanillin trong công nghiệp và đời sống

Vanillin được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất nước hoa, mỹ phẩm và dược phẩm (Sinha et al., 2008)

Trong công nghiệp thực phẩm, vanilla là một phụ gia rất thông dụng, đặc biệt trong sản xuất kem đá lạnh (ice cream) Ngoài sử dụng trong sản xuất kem, vanillin còn được dùng rất nhiều để làm tăng hương vị và tạo mùi thơm cho bánh, kẹo, cho các loại đồ uống

Hương thơm đặc trưng của vanillin được sử dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm như tạo mùi cho nước hoa, kem, sữa dưỡng ẩm, nước hoa xịt phòng, xà phòng ,…

Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có trong các mặt hàng thực phẩm và mỹ phẩm

NV

Chocolate sữa Lên tới 0.03%

Đường cô Lên tới 0.015%

Mứt kẹo Lên tới 0.055%

Vanillin còn được sử dụng trong tổng hợp thuốc một số loại thuốc như: Aldomet (thuốc chống tăng huyết áp), L-dopa (điều trị di chứng của bệnh Parkinson) và Trimethoprim (điều trị chứng viêm đường hô hấp cấp và một số biến dạng của bệnh hoa liễu) (Converti et al., 2010)

Vanilin còn là một chấl khử mùi hữu hiệu để che giấu mùi khó chịu của nhiều loại mặt hàng như đồ may mặc, sản phẩm cao su, giấy và chất dẻo,…Thông thường chỉ cần đến một lượng nhỏ, vì mùi của vanilin có thể cảm nhận được ngay ở

độ pha loãng khoảng 0,0000002 mg trong 1 m3

không khí (Đinh Thị Ngọ và cộng

sự, 1991) Ngoài ra, vanillin còn được sử dụng ngăn chặn tạo bọt trong sự bôi trơn nhiều loại dầu, làm sáng trong lớp phủ kẽm bồn tắm, hỗ trợ sự oxi hóa tinh dầu hạt lanh, hấp dẫn côn trùng, ngăn chặn xỉn màu răng gây ra bởi khói thuốc lá, hòa tan vitamin B1 và xúc tác phản ứng trùng hợp methyl methacrylate (Kirk & Othmer, 1983)

2.2 Các con đường sinh tổng hợp vanillin

2.2.1 Con đường sinh tổng hợp vanillin trong thực vật

Quả vanilla được thu hoạch khoảng từ 6 đến 8 tháng sau qua trình thụ phấn

và ở giai đoạn này chúng chưa bộc lộ ra hương vanilla (Walton, Mayer, & Narbad, 2003)

Mùi hương chỉ được giải phóng ra trong quá trình lên men, được gọi là

“curing” Khi glucoside, glucovanillin, các ß-glucoside liên quan bị thủy phân bởi enzyme ß-D-glucosidase sẽ giải phóng ra vanillin tự do và các chất liên quan (Odoux, Escoute, Verdeil, & Brillouet, 2003)

Mặc dù vanillin là một trong số những chất hóa học được nghiên cứu nhiều song những con đường sinh tổng hợp chúng trong thực vật vẫn còn gây nhiều tranh luận, bởi vì chưa có nghiên cứu chính xác nào xác định và nêu ra đặc trưng của tất

cả các bước trong con đường được đề xuất Có một giả thiết nói rằng vanillin là sản phẩm của con đường acid shikimic Ở con đường này, phenylalanine hoặc tyrosine trải qua khử amin hóa tới C6 – C3 phenylpropanoid, tiếp đó đóng vai trò như một cơ chất cho vanillin (Daphna Havkin-Frenkel, Podstolski, & Knorr, 1996)

2.2.2 Con đường sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic trong vi sinh vật

Một số vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đã được nghiên cứu để xác định các gen mã hóa các enzyme xúc tác phản ứng tổng hợp vanillin từ các cơ

chất khác nhau như lignin, eugenol, isoeugenol, acid ferulic, glucose,…Trong đó đáng chú ý nhiều là các chuyển hóa sinh học từ acid ferulic

Acid ferulic (acid 4-hydroxy-3-methoxycinnamic) là một thành phần phổ biến trong thực vật được tạo ra từ sự trao đổi chất phenylpropanoid, kết hợp với acid dihydroferulic tạo nên tính vững chắc của thành tế bào bằng liên kết chéo giữa lignin và polysacchatide (Ou & Kwok, 2004)

Acid ferulic là thành phần phenolic chủ yếu được tìm thấy trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm, nên nó có thể được thu từ các nguồn phế phẩm nông nghiệp như vỏ ngô, cám ngô, củ cải đường, thành tế bào nội nhũ gạo, lúa mì, lúa mạch Acid ferulic còn là cơ chất ít độc tính nhất với vi sinh vật trong số các cơ chất được nghiên cứu Vì vậy có thể coi đây là cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin sinh học (Mathew & Abraham, 2006)

Các nhà nghiên cứu đã đưa ra 5 con đường chuyển hóa acid ferulic thành vanillin, đó là con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), β-oxidative deacetylation (CoA-dependent), Non-oxidative decarboxylation, CoA-Independent Deacetylation, Side-Chain Reductive

2.2.2.1 Con đườngNon-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

Các gen mã hóa enzyme cần cho con đường Non-β-oxidative deacetylation

đã được xác định và xác nhận hoạt tính của chúng (Gasson et al., 1998)

Hình 2.4 : Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

(D Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Con đường này có ba bước xúc tác với sự tham gia của hai enzyme: hydroxycinnamate-CoA ligase (4-CL) hay feruloyl-CoA synthetase, mã hóa bởi gen

4-fcs và 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase (HCHL) hay enoyl-CoA

hydratase/aldolas được mã hóa bởi gen ech Đầu tiên, enzyme HCHL chuyển acid

ferulic thành feruloyl-ScoA, sau đó 4-CL xúc tác thủy phân feruloyl-ScoA thành một chất trung gian tạm thời 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-hydroxypropionyl-ScoA và tách chuỗi bên theo kiểu retro-aldol thành vanillin và acetyl-ScoA(Gasson

et al., 1998) Một gen khác liên kết với gen fcs và gen ech mã hóa enzyme

vanillin-xidoreductase gây oxi hóa vanillin thành sản phẩm khác (Gasson et al., 1998)

Các gen và enzyme tham gia vào các phản ứng tương ứng đã được xác định

ở các chủng Pseudomonas fluorescens AN103 (Gasson et al., 1998), Pseudomonas

sp HR199 (Overhage, Priefert, & Steinbuchel, 1999) Streptomyces setonii (Muheim & Lerch, 1999), Amycolatopsis sp HR167 (Achterholt, Priefert, & Steinbuchel, 2000), Delftia acidovorans (R Plaggenborg et al., 2001), and Pseudomonas putida KT2440 (R Plaggenborg et al., 2003) Sự nhận biết về đặc

trưng của các gen mã hóa cho các enzyme đưa ra cơ hội mới cho điều hướng trao đổi chất và cấu trúc các chủng tái tổ hợp

2.2.2.2 Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

Con đường β-oxidation deacetylation được đề xuất cho P putida (Zenk, Ulbrich, Busse, & Stockigt, 1980) và Rhodotorula rubra (Huang, Dostal, &

Rosazza, 1993a)

Hình 2.5: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent)

(D Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Bước đầu là sự hình thành feruloyl-ScoA từ acid ferulic được xúc tác bởi enzyme 4-CL Bước thứ hai enzyme HCHL xúc tác phản ứng cộng nước để tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-b-ketopropionyl-ScoA và trải qua quá trình lưu phân (thyolytic) thành vanillyl-SCoA và acetyl-ScoA Tiếp theo, vanillyl-ScoA cộng nước (hydrate) và loại CoASH hình thành vanilin, bước này được xúc tác bởi

enzyme b-ketoacyl-CoA-thiolase (aat)

2.2.2.3 Con đường non-oxidative decarboxylation

Đầu tiên là sự tham gia của enzyme decarboxylase xúc tác phản ứng đồng phân hóa acid ferulic thành một chất quinoid trung gian và sau đó loại gốc cacboxyl tạo thành 4-vinylguaiacol (Huang, Dostal, & Rosazza, 1993b)

Hình 2.6: Con đường Non-oxidation decarboxylataion

(D Havkin-Frenkel & Belanger, 2010) Các chất trung gian của các phản ứng xuôi dòng tiếp theo giữa 4-vinylguanicol và vanillin chưa được xác định Đặc trưng của mỗi loại enzyme decarboxylase phụ thuộc vào từng vi sinh vật (Barthelmebs, Divies, & Cavin,

2000) Trong số đó ở nấm men Brettanomyces anomalus, enzyme được sản xuất ở

mức độ thấp và được cảm ứng nhờ sự bổ sung của cơ chất (Edlin, Narbad, Gasson, Dickinson, & Lloyd, 1998)

Rhodotorul aglutinis và Rhodotorula rubra đã được báo cáo về cơ chế trao

đổi chất acid ferulic qua quá trình loại nhóm cacboxyl (Huang et al., 1993a)

2.2.2.4 Con đường CoA-Independent Deacetylation

Trong suốt con đường này, liên kết đôi dạng trans của acid ferulic cộng nước tạo thành một chất trung gian tạm thời là acid 4-hydroxy-3-methoxy-b-hydroxypropionic

Hình 2.7: Con đường CoA-Independent Deacetylation

(D Havkin-Frenkel & Belanger, 2010) Tiếp theo bước này enzyme aldolase phân tách acetate giải phóng trực tiếp vanillin Ngoài ra, chất trung gian tạm thời còn có thể mất đi một hydro thành acid 3(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)3-ketopropionic và sau đó loại nhóm acetyl

(deacetylation) thành vanillin Một enzyme có khả năng loại nhóm acetyl (fca) đã được xác nhận ở chủng Pseudomonas putida WCS358 (Venturi, Zennaro, Degrassi,

Okeke, & Bruschi, 1998)

Sự tồn tại của chất trung gian tạm thời và cơ chế chính xác của con đường

này chưa được xác nhận nhận đầy đủ Con đường CoA-Independent Deacetylation

được đề xuất cho các loài Delftia acidovorans, Pseudomonas sp., Pseudomonas mira, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, E coli, Streptomyces setonii, Aspergillus niger, Fomes fomentarius, Fusarium solani, Polysporus versicolor, và Rhodotorula rubra (D Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

2.2.2.5 Con đường Side-Chain Reductive

Đồng thời với phản ứng loại nhóm cacboxyl, acid ferulic bị đồng phân hóa thành một chất quinoid trung gian tạm thời mà chính nó bị khử thành acid dihydroferulic (4-hydroxy-3-methoxyphenylpropionic acid) (Rosazza, Huang, Dostal, Volm, & Rousseau, 1995)

Hình 2.8: Con đường Side-Chain Reductive

(D Havkin-Frenkel & Belanger, 2010)

Con đường này đã được đề xuất cho sự biểu hiện cuả S cerevisiae dưới điều kiện yếm khí (Huang et al., 1993b) hoặc Lactobacillus plantarum (Barthelmebs et

khí ở Phanerochaete chrysosporium (Gupta, Hamp, Buswell, & Eriksson, 1981)

Phụ thuộc vào vi sinh vật mà acid dihydroferulic được trao đổi chất tiếp theo thành homovanillic hoặc acid vanillic Sau đó, acid vanillic có thể được hoàn nguyên thành vanillin

Acid ferulic ngoài là một cơ chất thích hợp cho sản xuất vanillin mà còn biểu hiện nhiều chức năng sinh lí bao gồm các hoạt tính chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống viêm, chống nghẽn mạch, chống ung thư Acid ferulic chống lại các chứng động mạch vành, cholesterol thấp, tăng cường khả năng sống của tinh trùng và còn được đánh giá là chất có khả năng chống lại các gốc tự do làm giảm thiểu các tác động gây hại của quá trình oxi hóa (Kanski, Aksenova, Stoyanova, & Butterfield, 2002)

2.3 Các phương pháp sản xuất vanillin

2.3.1 Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật

Vanillin tự nhiên được thu chủ yếu từ nguồn hạt và vỏ quả của loài lan nhiệt

đới Vanilla planifolia (Anandarai et al 2005) Thời gian thu hoạch thông thường từ sáu đến tám tháng sau khi thụ phấn Quá trình chế biến vanilla để sản xuất vanillin bắt đầu bằng việc ủ vỏ quả đã thu hoạch còn tươi, mục đích là để làm ngừng lại các quá trình dinh dưỡng tự nhiên bên trong vỏ quả và thúc đẩy nhanh chóng sự hình thành chất thơm Mỗi vùng miền có phương pháp ủ (curing) khác nhau, điều này có thể là tác động chính đến sự khác biệt về chất lượng vanillin trong vỏ quả

Có một vài phương pháp chế biến vanilla song chủ yếu là chế biến theo kiểu Mexico (Sun method) và Madagascar (Bourbon method) đều bao gồm bốn giai đoạn chính (Ramachandra Rao & Ravishankar, 2000):

- Làm héo: Làm ngừng các quá trình tự nhiên trong vỏ quả sau thu hoạch, đồng thời thúc đẩy các phản ứng enzyme xúc tác sự hình thành hợp chất thơm Điều này được nhận biết bởi các đốm nâu trên vỏ quả

- Xông hơi: Ở bước này, nhiệt độ tăng lên nhằm thú đẩy các phản ứng enzyme và làm khô nhanh chóng ban đầu tránh quá trình len men gây hại xảy ra

- Làm khô: Bước này thực hiện ở nhiệt độ thường cho đến khi khối lượng vỏ quả đạt một phần ba so với ban đầu

- Đóng gói: Vỏ quả được lưu trữ trong các hộp đóng khoảng ba tháng, vào thời điểm này vanillin sẽ được tạo ra

Để thu được vanillin, vỏ quả sẽ được ngâm trong hỗn hợp ethanol và nước bằng các phương pháp tách chiết khác nhau như ngâm chiết, xử lí nhiệt, … sản phẩm có thể ở dạng lỏng hay bột tùy mục đích sử dụng

Sản xuất vanillin tự nhiên từ nguồn thực vật không chỉ mất nhiều công lao động mà còn bị giới hạn bởi sự dao động thất thường về năng suất cùng với điều kiện nông nghiệp và các vấn đề về kinh tế và chính trị Để tạo ra 1 kg vanillin tách chiết phải cần tới 500 kg vỏ quả tương đương với gần 40000 hoa được thụ phấn (Ramachandra Rao & Ravishankar, 2000) Do vậy, số lượng vanillin tách chiết tự nhiên chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường (Zamzuri & Abd-Aziz, 2013)

2.3.2 Sản xuất vanillin bằng tổng hợp hoá học

Quá trình hóa học đầu tiên để thu vanillin được thực hiện bởi Tiemann vào năm 1876 Nguyên liệu là eugenol có trong tinh dầu cây đinh hương và được sử dụng thương mại cho đến những năm 1920 Sau đó vanillin được tổng hợp bằng dịch kiềm sunphit giàu lignin là sản phẩm phụ của ngành công nghiệp giấy Quá trình tổng hợp vanillin bao gồm xử lí dung dịch lỏng chứa lignin bằng các chất oxi hóa, pH kiềm, nhiệt độ và áp suất cao Các chất oxi hóa có thể là không khí, oxi, nitrobenzene hoặc không có sự hỗ trợ của các chất xúc tác Lignin bị phân hủy và oxi hóa, vanillin được tạo thành kèm theo các sản phẩm phụ khác (Bjørsvik & Liguori, 2002)

Sự có mặt cuả các chất tạp nhiễm đòi hỏi phải sử dụng các quá trình tinh sạch cao Ngày nay sản xuất vanillin từ lignin không phổ biến nữa bởi vì tác động xấu tới môi trường Hơn nữa, dù là cơ chất có nguồn gốc từ tự nhiên song tổng hợp vanillin từ lignin vẫn bị ghi nhãn là vanillin nhân tạo bởi vì có sự biến đổi hóa học

để thu được sản phẩm cuối cùng (Hopp & Rabenhorst, 2000)

Ngày nay hầu hết vanillin tổng hợp được sản xuất từ nguyên liệu hóa dầu guaiacol và acid glyoxylic (Kumar, Sharma, & Mishra, 2012) Đây là một quá trình gồm hai bước bắt đầu với phản ứng ngưng tụ trong môi trường kiềm giữa guanicol

và acid glyoxylic tạo thành acid vanillylmandelic và tiếp đó được chuyển thành vanillin bởi quá trình loại nhóm CO2 oxi hóa Thứ tự của các phản ứng được chỉ ra

ở hình 2.9

Hình 2.9: Thứ tự các phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol

(Kirk & Othmer, 1983) Vanillin thu được từ guaiacol bằng kĩ thuật này gần như không có các sản phẩm phụ, do vậy vai trò của qui trình tinh sạch sản phẩm sẽ được đơn giản hóa Mặc dù quá trình này làm giảm tác động mạnh tới môi trường khi so sánh với sản xuất từ lignin, song guaiacol là một sản phẩm hóa dầu cũng như vanillin khi tổng

hợp từ lignin đều có sự thay đổi hóa học mạnh tạo ra sản phẩm cuối cùng nên chúng vẫn bị ghi nhãn “ nhân tạo” (Xu, Hua, & Ma, 2007)

2.3.3 Sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ sinh học

2.3.3.1 Sử dụng enzyme

Những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme tham

gia tạo cơ sở cho việc thiết lập một hệ thống enzyme in vitro để sản xuất vanillin

Dignum và cộng sự đã mô tả việc sử dụng chế phẩm enzyme chứa ßglucosidase xúc tác phản ứng thủy phân vanillin từ glucovanillin để thu được vanillin giải phóng từ vỏ quả vanila như một sự thay thế quá trình ủ truyền thống, rút ngắn thời gian (Dignum, Kerler, & Verpoorte, 2001)

-Ngoài enzyme trên còn có một số enzyme khác được sử dụng để tạo ra vanillin từ các nguyên liệu thực vật khác bằng các biến đổi sinh học Năm 1989, Kamoda và cộng sự đã sử dụng enzyme lignostilbene αβ-dioxygenase được thu

nhận từ Pseudomonas sp TMY1009 xúc tác sự oxi hóa giải phóng vanillin từ

Xtinben tìm thấy phổ biến trong vỏ gỗ (Kamoda, Habu, Samejima, & Yoshimoto, 1989)

Các enzyme được tạo ra bởi tách dòng gen mã hóa enzyme lipoxygenase từ đậu tương đã được biểu hiện trong một số vi sinh vật biến đổi gen để thăm dò khả năng tổng hợp vanillin từ este của coniferyl alcohol (Markus, Peters, & Roos, 1994)

Vanillin còn được giải phóng từ creosol (một thành phần chính của creosote được thu từ xử lí nhiệt gỗ hoặc than đá) và vanillylamine (được thu bởi quá trình thủy phân capsaicin là phần cay chủ yếu của hồ tiêu) Năm 2001, Van den Huevel

và cộng sự sử dụng enzyme vanillyl alcohol oxidase (VAO), một flavoenzyme đặc

trưng của Penicillium biến đổi cả creosol và vanillylamine thành vanillin với hiệu

suất cao Sự chuyển đổi trung gian VAO của creosol trải qua một quá trình gồm hai bước trong đó ban đầu là sự hình thành vanillyl alcohol sau đó bị oxi hóa thành vanillin Tuy nhiên creosol không thể được xem như một cơ chất tự nhiên bởi vì có

sự biến đổi hóa học mạnh của gỗ hoặc than đá (van den Heuvel, Fraaije, Laane, & van Berkel, 2001)

2.3.3.2 Nuôi cấy mô tế bào thực vật

Có một số nghiên cứu khám phá ra khả năng trao đổi chất ở thực vật để sản xuất chất thơm trong đó có vanillin trong nuôi cấy mô tế bào như lá và cuống lá cuả

Vanilla planifolia Chiến lược nuôi cấy mô tế bào bao gồm dinh dưỡng cuả cơ chất,

sử dụng hoormon ức chế các con đường cạnh tranh, cố định tế bào, điều chỉnh điều kiện môi trường và sử dụng chất hấp phụ như than hoạt tính, nhựa để thu hồi vanillin được tạo ra (Walton et al., 2003)

Năm 1991, Knuth và Sahai đã phát hiện rằng bản chất và nồng độ của các cơ chất

được thêm vào môi trường là một yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy V.fragrans

Phenyladenine và acid ferulic cho kết quả ít tăng cường tạo vanillin, trong khi đó thêm vanillyl alcohol lại cho kết quả tăng hàm lượng vanillin (Knuth & Sahai, 1991)

Năm 1993, Westcott và cộng sự đã cải tiến một quy trình sản xuất vanillin

tự nhiên từ các rễ khí sinh sử dụng acid ferulic như một chất xúc tác sinh học Than hoạt tính cũng được sử dụng đóng vai trò như một chất hấp phụ vanillin tạo ra, do vậy có thể giảm thiểu được sự ức chế quá trình xảy ra Các mô rể khí sinh có thể được dùng lại một vài lần nhưng hoạt tính sẽ giảm qua mỗi lần sử dụng Nồng độ của vanillin tạo ra cao hơn khoảng 35 lần so với lượng vanillin ban đầu có trong mô

rễ khí sinh và chiếm khoảng 40% vanillin có trong quả vanila trưởng thành Sử dụng rễ khí sinh bổ sung acid ferulic, vanillin tạo ra nhanh hơn tổng hợp bình thường trong quả từ 5 đến 10 lần Mặc dù đã có nghiên cứu mô tả thành công sự tích lũy vanillin từ nuôi cấy mô tế bào, song năng suất thực tế không đủ để sản xuất thương mại (Westcott, Cheetham, & Barraclough, 1993)

Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy mô tế bào còn gặp phải một số vấn đề như tính không ổn định của tế bào, tỉ lệ sinh trưởng thấp, đòi hỏi điều kiện vô trùng Do vậy, đó không phải là lý tưởng cho sản xuất vanillin thương mại Hơn thế nữa, ứng

dụng kĩ thuật di truyền trong Vanilla còn là một vấn đề mơ hồ bởi vì còn thiếu

những hiểu biết về con đường sinh tổng hợp vanillin và các enzyme tham gia (Walton et al., 2003)

2.3.3.3 Lên men vi sinh vật

Vi sinh vật với khả năng sinh trưởng nhanh chóng và tuân theo di truyền học phân tử là những mục tiêu lý tưởng cho công nghệ sinh học và có thể được tuyển chọn cho sản xuất vanillin bởi khả năng sinh trưởng trên các cơ chất như một nguồn cacbon và năng lượng

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về quá trình lên men vi sinh vật sản xuất vanillin

từ các cơ chất khác nhau, dưới đây là bảng tóm tắt một số kết quả của các tác giả

Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả năng sản xuất vanillin trên các cơ chất

Cơ chất Vi sinh vật

Số lượng (g/L)

Nguồn tham khảo

Pseudomonas aeruginosa 1.62 (M Ashengroph, Nahvi,

Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2011c)

Bacillus subtilis B2 0.9 (Shimoni, Ravid, & Shoham, 2000)

Bacillus subtilis HS8 8.1 (Y Zhang, Xu, Han, Yan, & Ma, 2006)

Pseudomonas putida IE27 16.1 (Yamada, Okada, Yoshida, &

Nagasawa, 2007)

Candida galli PG06 0.58 (M Ashengroph, Nahvi,

Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2011a)

Psychrobacter sp CSW4 1.28

(Morahem Ashengroph, Nahvi, Zarkesh-Esfahani, & Momenbeik, 2012)

Acid

ferulic

Amycolatopsis sp

(DSM9991 or DSM9992) 11.5 (Rabenhorst & Hopp, 1997)

Streptomyces setonii ATCC

(Muheim, MÜLLER, Münch, & Wetli, 2012)

P fluorescens AN103 ** (Martínez-Cuesta, Payne, Hanniffy,

Gasson, & Narbad, 2005)

P fluorescens BF13 ** (Calisti et al.2008)

** : tác giả không công bố

Mặc dù các vi sinh vật trên có khả năng tạo ra vanillin từ các cơ chất khác nhau song chúng có nhược điểm là đều có con đường phân hủy vanillin thành các sản phẩm phụ như acid vanillic, vanillyl alcohol, Đối với một số xạ khuẩn do sinh trưởng của hệ sợi nấm làm môi trường trở lên nhớt, khó kiểm soát sự vỡ ra từng mảnh và phân giải của sợi nấm nên gây khó khăn cho quá trình lên men

Do vậy, yêu cầu đặt ra là phải tìm được vật chủ thích hợp để tạo chủng tái tổ hợp biểu hiện các gen tổng hợp vanillin từ các cơ chất có sẵn, có quá trình lên men đơn giản, không có con đường phân hủy vanillin

2.4 Tiềm năng ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất vanillin

Công nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp các kĩ thuật tạo nên các DNA tái tổ hợp để đưa các gen mong muốn vào các tế bào và cơ thể sống

DNA tái tổ hợp là phân tử ADN được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự ADN của các loài sinh vật khác nhau Trong kỹ thuật di truyền, ADN tái tổ hợp thường được tạo thành từ việc gắn những đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau vào trong vector tách dòng hay vector biểu hiện Những vector biểu hiện mang gen có thể tạo thành các protein tái tổ hợp trong các sinh vật

Đã có những nghiên cứu về sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để tổng hợp

các hợp chất sinh học quan trọng phục vụ cho con người như: insulin (Keen et al.,

1980), hoocmon sinh trưởng ở người (Rezaei & Zarkesh-Esfahani, 2012), vacxin viêm gan B (Berza, Dishlers, Petrovskis, Tars, & Kazaks, 2013), interlerkin (Nausch et al., 2013),…

Như vậy để tổng hợp vanillin theo con đường tái tổ hợp cần tách dòng các gen mã hóa enzyme có khả năng chuyển hóa các cơ chất thành vanillin từ vi sinh vật đã biết, sau đó đưa các gen đó vào vector biểu hiện, biến nạp vào tế bào vật chủ thích hợp cho phép sự biểu hiện

2.4.1 Các gen mã hóa các enzyme sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic

Các gen mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin được xác định là gen fcs mã hóa enzyme feruloyl-coA synthetase và gen ech mã hóa enzyme enoyl-CoA

hydratase/aldolase Hai gen trên có thể được tách dòng từ một số vi sinh vật như:

Pseudomonas fluorescens (Narbad & Gasson, 1998), Pseudomonas sp strain HR199 (Overhage et al., 1999), Amycolaptosis sp strain HR167 (Achterholt, Priefert,

& Steinbüchel, 2000), Delftia acidovorans (S H Yoon et al., 2005), Rhodococcussp I24

(Rainer Plaggenborg et al., 2006),…

Để lựa chọn chủng vi sinh vật phù hợp cho tách dòng gen fcs và ech, cần căn

cứ vào một số cơ sở như:

- Chủng vi sinh vật đó có hiệu suất tổng hợp vanillin cao ( mức độ biểu hiện

của 2 gen fcs, ech mạnh)

- Con đường sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic đã được xác định

- Hai gen fcs, ech trong các chủng đã được giải trình tự và công bố trên

Genbank, đây là cơ sở để thiết kế mồi cho tách dòng gen

- Các chủng được lưu giữ trong bảo tàng vi sinh vật, giảm bớt thời gian, chi phí phân lập

Trong số những chủng vi vật được đề xuất, P fluorescens có thể được xem

là đối tượng nghiên cứu thích hợp Đây là một loài vi khuẩn gram âm, hình roi thuộc chi Pseudomonas, dựa vào phân tích vùng trình tự 16S rRNA nó được đặt vào nhóm Pseudomonas fluorescens của chi, mà nó cho mượn tên Các nghiên cứu thực hiện trên Pseudomonas fluorescens đã cho thấy tiềm năng của loại vi khuẩn có lợi

trong xử lý sinh học chống lại các tác nhân gây bệnh của nhiều giống cây trồng

Năm 2010, Di Gioia và cộng sự đã đề xuất sử dụng chủng của P fluorescens BF13 để sản xuất vanillin từ acid ferulic Chủng này tạo ra 8.41 mM vanillin, cao nhất trong số các chủng của Pseudomonas (Di Gioia et al., 2010)

Dữ liệu phân tử và sinh hóa chỉ ra rằng ở chủng P fluorescens BF13 (một thành viên của chi Pseudomonas, acid ferulic bị phân hủy qua con đường non-oxidative CoA-

dependent dẫn đến sự hình thành vanillin (Calisti, Ficca, Barghini, & Ruzzi, 2008)

Hình 2.10: Sơ đồ con đường phân hủy acid ferulic trong P fluorescens BF13

(Calisti et al., 2008)

Trong Pseudomonas fluorescens BF13, các gen tham gia vào sự phân hủy acid ferulic được định vị trong operon ech-vhd-fcs, dưới sự điều khiển của gen điều

hòa FerR với chức năng vừa kích hoạt vừa ức chế và được cảm ứng bởi acid ferulic

(Calisti et al., 2008) Các gen ech, fcs đã được tách dòng từ Pseudomonas fluorescens BF13 và xác định trình tự, kết quả được công bố trên ngân hàng GenBank số AJ536325 Đây là cơ sở cho nghiên cứu tách dòng gen fcs và ech ở chủng Pseudomonas fluorescens được phân lập tại Việt Nam.

2.4.2 Vi khuẩn E coli và khả năng sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin

Hiện nay, trong số các hệ biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram

âm E coli vẫn là một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm nhất

vì chúng có tốc độ sinh trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên môi cơ chất không đắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu đầy đủ Trên thị trường hiện nay thương mại nhiều loại vector tách dòng, vector biểu hiệu

và chủng đột biến đối với hệ biểu hiện này Đồng thời, trong E coli kiểu dại

không có sự tổng hợp vanillin tự nhiên nhưng chúng có thể tiếp nhận các gen ngoại lai để tạo ra vanillin mà không có con đường phân hủy vanillin Đây là cơ sở để lựa

chọn chủng E coli để làm đối tượng nghiên cứu

Các tế bào E coli mang vector tái tổ hợp chứa 2 gen fcs và ech trong điều

kiện môi trường có chứa acid ferulic và các chất cần thiết cho sự sinh trưởng của tế

bào diễn ra quá trình tổng hợp vanillin theo sơ đồ ở hình 2.11

Hình 2.11: Con đường sinh tổng hợp vanillin trong chủng E coli tái tổ hợp

(S H Yoon et al., 2005) Acid ferulic bị chuyển hóa thành feruloyl-CoA dưới sự xúc tác của enzyme

feruloyl-CoA (mã hóa bởi gen fcs) sử dụng ATP và CoA, sau đó feruloyl-CoA

cộng nước tạo thành 4-hydroxy-3-methoxyphenyl-hydroxypropionyl-CoA và phân

tách tạo ra vanillin và acetyl-CoA dưới sự xúc tác xủa enzyme enoyl-CoA

hydratase/aldolase mã hóa bởi gen ech

Sự tích lũy acety-CoA trong tế bào gây ra hai vấn đề chính: Một là làm giảm nồng độ vanillin tạo ra; hai là gây thiếu CoA cho phản ứng chuyển hóa acid ferulic thành feruloyl-CoA, dẫn đến dư thừa cơ chất có thể gây ức chế phản ứng Do vậy, cần có quá trình tái sử dụng tối đa lượng acety-CoA dư thừa tạo thành CoA để khắc phục hai vấn đề trên cũng như giảm bới tiêu hao năng lượng, tăng cường chuyển hóa acid ferulic thành vanillin Quá trình đó đã được Lee và cộng sự (2007) báo cáo liên quan tới một chuỗi các phản ứng trong chu trình TCA và con đường vòng

Glyoxylate với sự tham gia của gen gltA (citrate synthase)

Hình 2.12 Sơ đồ con đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA

(Lee et al., 2009)

Các gen và enzyme tương ứng:

fcs: feruloyl-CoA synthetase

ech: enoyl-CoA hydratase/aldolase

gltA: citrate synthase

icdA: isocitrate dehydrogenase

iclR: transcription repressor

aceA: isocitrate lyase

aceB: malate synthase

Gen gltA mã hóa enzyme citrate synthase xúc tác phản ứng đầu tiên của chu trình TCA nơi có sự tiêu thụ acetyl-CoA giải phóng ra CoA Sự khuếch đại gen gltA

làm tăng cường tiêu thụ acetyl-CoA để tạo ra nhiều CoA từ đó sẽ chuyển hóa tối đa lượng acid ferulic Ngoài con đường trên thì còn có một con đường nữa để chuyển acetyl-CoA thành CoA đó là con đường vòng glycoxylate nơi mà isocitrate chuyển thành glycoxylate và malate mà không thông qua α-ketoglutarate Như vậy, con đường vòng glucoxylate ngắn hơn chu trình TCA vì thế có thể sẽ giảm bớt tiêu hao năng lượng (Lee et al., 2009)

Để thực hiện con đường này cần có sự tham gia của hai enzyme isocitrate

lyase và malate synthase mã hóa bởi gen aceA, aceB Tuy nhiên, sự phiên mã của operon aceAB bị ức chế bởi gen điều hòa iclR Do vậy để sử dụng tập trung acetyl- CoA theo con đường này cần giải ức chế hai gen aceA và aceB bằng cách xóa bỏ gen iclR, đồng thời xóa bỏ gen icdA bởi vì isocitrate có ái lực với enzyme isocitrate dehydrogenase (icdA) hơn enzyme isocitrate lyase (aceA)

Gen gltA được xác định nằm trong nhiễm sắc thể của E coli (Ner et al., 1983) và đã được tách dòng và giải trình tự, kết quả được công bố trên ngân hàng

GenBank số EG10402

Như vậy để tăng cường hiệu suất sản xuất vanillin trong E coli cần kết hợp

ba gen fcs, ech, gltA trên cùng một hệ thống vector biểu hiện trong điều kiện nuôi

cấy được tối ưu hóa

2.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin bằng ứng dụng công nghệ DNA tái

tổ hợp trong nước và ngoài nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu sản xuất vanillin từ các chủng E coli

tái tổ hợp

Năm 2003, Converti và cộng sự đã đề xuất chủng E coli tái tổ hợp JM109 mang plasmid pBB1 bao gồm các gen trao đổi chất acid ferulic từ Pseudomonas

fluorescens BF13 Plasmid tái tổ hợp pBB1 được tạo ra bằng việc tạo dòng một đoạn 5098 bp chứa gen ech và fcs từ chủng P fluorescens BF13 đột biến gen vdh

dưới sự điều khiển của promoter chủ Pfer vào vector có số bản copy thấp pJB3Tc19

Các tế bào E coli chủng JM109/pBB1 được sử dụng cho cho sự chuyển hóa sinh

học acid ferulic tới vanillin với năng suất 0.851 mol/l (Torre et al., 2004)

Hình 2.13: Cấu trúc plasmid pBB1 chứa gen từ Pseudomonas fluorescens BF13

(Converti et al., 2010) Barghini và cộng sự đã báo cáo rằng sử dụng các plasmid có số bản sao thấp

sẽ khắc phục sự giảm nhanh chóng sản phẩm cuối trong chủng E coli tái tổ hợp do

tính không ổn định di truyền của đột biến sản xuất vanillin Các tế bào E coli

JM109/pBB1 với plasmid có số bản copy thấp dẫn đến nồng độ cuối cùng của vanillin là 3.5 mM sau 6 giờ nuôi cấy với sự cảm ứng của acid ferulic 1.1 mM Các tác giả còn chỉ ra việc tái sử dụng thành công các tế bào đó trong bốn chu kì chuyển hóa sinh học tiếp theo, điều đó cho phép tăng nồng độ sản phẩm cuối cùng lên 2.52

g vanillin trên mỗi lít dịch nuôi cấy Sự tái sử dụng sinh khối có thể là một chiến lược thích hợp vừa để củng cố năng suất bằng hệ thống lên men liên tục vừa làm giảm chi phí thu hồi vanillin bằng sự cô đặc sản phẩm cuối trong môi trường (Barghini, Di Gioia, Fava, & Ruzzi, 2007)

Để khai thác một chủng tái tổ hợp ổn định hơn, E coli JM109 được thiết kế bởi sự tách dòng gen ech và fcs từ Pseudomonas fluorescens BF13 vào một vector

(pFR12) với một đơn vị sao chép cảm nhiệt, được thiết kế cho sự hợp nhất gen vào

locus lacZ trên nhiễm sắc thể của E coli Chủng được tạo ra mang tên FR13, đã

được xác nhận là hiệu quả và ổn định hơn trong sản xuất vanillin so với những chủng biểu hiện cùng các gen đó từ một vector plasmid có sổ bản copy thấp (Luziatelli

acid ferulic thành vanillin (Achterholt, Priefert, & Steinbüchel, 2000)

Hai plasmid tái tổ hợp mang tên pDAHEF và pDDAEF mang gen fcs và ech

từ 2 chủng tương tứng Amycolatopsis sp strain HR104 và Delftia acidovorans được biến nạp vào E coli Theo như báo cáo của tác giả, trong cùng một điều điều

kiện lên men thì chủng mang plasmid pDAHEF thu được 160 mg/l vanillin trong

khi đó chủng còn lại chỉ thu được 10 mg/l Sự tối ưu hoá quá trình lên men E coli

mang pDAHEF đã được thực hiện bởi sự bổ sung arabinose 13.3 mM như một chất cảm ứng trao đổi chất và acid ferulic 0.2% trong 18 giờ nuôi cấy, kết quả thu được

là 580 mg/l vanillin được tạo ra (S.-H Yoon et al., 2005)

Cũng trong một nghiên cứu song song, Yoon và cộng sự báo cáo rằng

vanillin được thu với hiệu suất cao hơn từ chủng E coli tái tổ hợp thiết kế bởi tách dòng gen fcs và ech từ Amycolatopsis sp HR104 dưới sự điều khiển của promoter trc (được cảm ứng bởi IPTG) Nồng độ vanillin thu được là 1,1 g/L trong điều kiện

48h nuôi cấy, môi trường 2YT với acid ferulic 0.2%, không IPTG và không bổ sung nguồn cacbon (S H Yoon et al., 2005)

Để củng cố sự sản suất vanillin bằng cách giảm độc tính của nó đối với các

tế bào nuôi cấy, có hai chiến lược được đề xuất Đó là tạo ra một đột biến kháng vanillin mang tên NTG-VR1 bằng phát sinh đột biến nitrosoguanidine và loại bỏ vanillin ra khỏi môi trường bằng nhựa hấp phụ XAD-2 Sử dụng 5 g/L acid ferulic, vanillin thu được với đột biến NTG-VR1 tăng gấp 3 lần so với chủng hoang dại Kết hợp thêm 50% (w/v) nhựa XAD-2 vào môi trường nuôi cấy, từ 10g/L acid

ferulic thu được 2.9 g/L vanillin Nồng độ sản phẩm cuối cùng cao hơn 2 lần so với không bổ sung nhựa hấp phụ (Yoon et al., 2007)

Năm 2009, Lee và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất vanillin trên chủng E.coli DH5α (pTAHEF-gltA) với sự khuếch đại gen gltA (mã hóa enzyme citrate synthase

cần cho sự chuyển đổi của acetyl-CoA), gen ech và fcs được tách dòng từ

Amycolaptosis sp strain HR104 Từ 3 g/L acid ferulic tạo ra 1.98 g/L vanillin trong

48 giờ nuôi cấy Trong cùng nghiên cứu đó, các tác giả chỉ ra sự xóa bỏ gen icdA

mã hóa enzyme isocitrate dehydrogenase của chu trình TCA làm tăng cường chuyển hóa acetyl-coA thành CoA khi so sánh với toàn bộ chu trình TCA Sự sản xuất

vanillin bởi chủng đột biến mới E coli BW25113 mang plasmid pTAHEF cùng với gen icdA bị xóa bỏ được tăng cường 2.6 lần Ảnh hưởng điều phối thực sự của việc khuếch đại gen gltA và sự xóa bỏ gen icdA được quan sát với việc bổ sung nhựa

XAD-2 làm giảm tính độc của vanillin Kết quả là 5.14 g/L vanillin được thu hồi trong 24h nuôi cấy với hiệu suất chuyển đổi 86.6% (Lee et al., 2009)

Trong phạm vi điều hướng trao đổi chất của E coli cho sản xuất vanillin, các gen

chịu trách nhiệm cho sự phân hủy eugenol và isoeugenol đã được phân lập và tách dòng trong các vật chủ tái tổ hợp

Năm 2003, Overhage và cộng sự đề xuất một quá trình gồm hai bước cho sự

chuyển hóa sinh học từ eugenol thành vanillin bằng hai chủng E coli điều hướng

trao đổi chất Trong bước thứ nhất, eugenol được chuyển tới 8.6 g/L acid ferulic

trong 15 giờ bởi E.coli XL1-Blue(pSKvaomPcalAmcalB) Chủng này mang một plasmid lai(pSKvaomPcalAmcalB) được cấu trúc bởi gen vaoA được tách dòng từ Penicillium simplicissimum CBS 170.90 dưới sự điều khiển của promoter lac cùng với gen calA và calB từ Pseudomonas sp strain HR199 Trong bước thứ hai, acid ferulic được chuyển hóa thành vanillin bởi chủng E coli XL1-Blue(pSKechE/Hfcs)

Kết thúc quá trình này thu được 0.3 g/L vanillin, 0.1 g/L vanillyl alcohol và 4.6 g/L acid ferulic

Chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp được tạo ra bằng đưa một plasmid chứa gen mã hóa enzyme isoeugenol monooxygenase của Pseudomonas putida

IE27 dưới sự điều khiển của promoter T7 Kết quả nuôi cấy cho thấy 28.3 g/L

vanillin được tạo ra từ isoeugenol 230 mM với hiệu suất chuyển đổi phân tử 81% sau 6 giờ nuôi cấy ở 20oC (Yamada, Okada, Yoshida, & Nagasawa, 2008)

2.5.2 Các nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, cũng đã có một số nghiên cứu về sản xuất vanillin bằng phương pháp hóa học

Năm 1991, tác giả Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thủy, Đào Văn Trường đã tổng hợp vanillin từ eugenol bằng cách đồng phân hoá eugenol tạo isoeugenol Sau

đó bằng quá trình oxy hoá để tiến hành trong môi trường axít hoặc kiềm Để nâng cao hiệu suất vanilin các tác giả đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến cả hai quá trình đồng phân hoá và oxy hóa với các điều kiện tối ưu hoá cho quá trình tạo ra vanilin (Đinh Thị Ngọ và cộng sự 1991)

Năm 1992, nhóm tác giả trên đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp vanillin bằng cách oxy hóa lignin bằng tác nhân nitrobenzen và oxít đồng Đây là tác nhân oxy hoá mềm, giữ nhân thơm nên cho hiệu suất valinin cao (Đinh Thị Ngọ và cộng

sự 1992)

Năm 1995, Đinh Thị Ngọ đã tiến hành tách và tinh chế vanillin và đến năm

1996, tác giả Đinh Thị Ngọ đã công bố tách chiết thành công vanillin từ tinh dầu lá quế(Đinh Thị Ngọ 1996)

Hiện ở Việt Nam chưa có công bố nào về việc ứng dụng công nghệ DNA tái

tổ hợp vào sản xuất vanillin Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ này là một chiến lược góp phần mở ra hướng sản xuất vanillin tự nhiên tại Việt Nam

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 được cung cấp bởi phòng

Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật – Viện Vi sinh vật và công nghệ sinh học, ĐHQGHN

Vector pTZ57R/T là vector tách dòng TA, có kích thước 2886 bp, được thiết

kế dựa vào hoạt tính terminal transferase cuả enzyme Taq-DNA polymerase trong

phản ứng PCR Vector pTZ57R/T có đầu dính là một nucleotide T (thymine), cho

phép tách dòng tất cả các trình tự khuếch đại của phản ứng PCR do enzyme

Taq-DNA polymerase tổng hợp

Trong cấu trúc của vector pTZ57R/T bao gồm hai hệ thống chọn lọc, cho phép chọn lọc các dòng tế bào mang plasmid đã gắn xen trình tự đích thành công

- Hệ thống chọn lọc thứ nhất là gen kháng kháng sinh ampicilin mã hóa cho enzyme phân giải kháng sinh ampicilin , điều này đồng nghĩa với việc các tế bào mang vector pTZ57R/T có thể sống sót và phát triển trên môi trường có chứa kháng sinh ampicilin

- Hệ thống chọn lọc thứ hai là hệ thống chỉ thị màu Lac-operon, hệ thống

này bao gồm gen LacZ mã hóa cho enzyme β-galactosidase và Lac-promoter cảm

ứng bởi IPTG Với các tế bào chủ mang vector pTZ57R/T tự đóng vòng hay không

có sự gắn xen xảy ra, Lac-operon hoạt động bình thường Trong môi trường có IPTG, enzyme β-galactosidase được tổng hợp Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa cơ chất X-gal thành chất có màu xanh, làm cho khuẩn lạc bao gồm các

tế bào này có màu xanh Trường hợp thứ hai là khi cấu trúc của Lac- operon bị phá

vỡ do gắn xen thành công, dẫn đến enzyme β-galactosidase không được tổng hợp, không có sự phân giải cơ chất X-gal nên các khuẩn lạc này sẽ có màu trắng Các thành phần của vector pTZ57R/T được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Các thành phần của vector pTZ57R/T

Vị trí đa tách dòng

(Multiple cloning site)

Cắt kiểm tra đoạn xen được nhân dòng, phục vụ cho công việc lập thư viện DNA

T7 promoter Phiên mã in vitro đoạn chèn

DNA với T7 RNA polymerase 697-716 Phage f1 origin Tổng hợp 1 chuỗi DNA đơn 2-457

Gen gltA được gắn trong vector pTZ57R/T

Gen gltA (1284 bp), mã hóa cho enzyme citrate synthase, xúc tác cho phản

ứng chuyển đổi acety-CoA thành CoA làm tăng hiệu quả tiêu thụ acid ferulic, được

tách dòng từ vi khuẩn E coli BL21 Ở 2 đầu gen gltA có chứa vị trí cắt của hai enzyme giới hạn HindIII và SacI Vector pTZ-gltA đã được tách dòng thành công

từ vi khuẩn E coli ở thí nghiệm trước đó, được sử dụng làm vật liệu cung cấp gen gltA

-

Hình 3.2: Cấu trúc vector pTZ-gltA

Vector pET22b(+)

Đây là một vector biểu hiện có các yếu tố cần thiết cho sự biểu hiện các gen

gltA, ech, fcs từ chủng Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668

Hình 3.3 Cấu trúc vector biểu hiện pET22b(+)

Các thành phần cấu tạo trong vector pRT22b(+) được thể hiện trong bảng 3.2