“Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RTPCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ”

Bệnh viêm gan virus C do virus viêm gan C (Hepatitis C Virus HCV) gây ra. Hậu quả trầm trọng nhất của bệnh là tình trạng xơ gan và ung thư gan. Hiện nay trên thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV và mỗi năm lại có thêm hàng triệu người nhiễm mới. Khoảng 80% người nhiễm HCV sẽ chuyển sang tình trạng nhiễm mạn tính, trong đó 10 – 20% sẽ chuyển sang xơ gan và 1 – 5% sẽ chuyển thành ung thư gan. HCV còn làm trầm trọng thêm bệnh viêm gan do các loại virus khác khi đồng nhiễm. Theo đánh giá của các chuyên gia thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thì bệnh viêm gan virus C là một mối đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất trong thế kỷ này và có lẽ cả ở thế kỷ sau. HCV lan truyền trong cộng đồng qua con đường truyền máu và các sản phẩm của máu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang con. Hiện nay, chưa có vaccine để phòng chống HCV do tính biến động di truyền cao của virus này. Trước khi quyết định điều trị, việc xác định nồng độ HCVRNA trong cơ thể sẽ cung cấp các thông tin tiên lượng giúp cho việc quyết định phương cách và thời gian điều trị. Nếu người bệnh nhiễm HCV type 1 và có nồng độ HCVRNA trong cơ thể lớn hơn 2x106 copiesml máu thì thời gian điều trị là 48 tuần thay vì 24 tuần như các trường hợp khác. Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các biểu hiện lâm sàng, các xét nghiệm chức năng gan thậm chí cả hình ảnh mô học của gan cũng không cho phép xác định nguyên nhân gây viêm gan virus C. Việc chẩn đoán nhiễm HCV buộc phải dựa vào các xét nghiệm sinh học có tính đặc hiệu đó là các kỹ thuật miễn dịch học và các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện kháng nguyên, kháng thể và các acid nhân của virus . Các xét nghiệm miễn dịch hiện nay cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễm HCV mạn tính nhưng hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ”. Các kỹ thuật phân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho phép phát hiện bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiện trong máu, đặc biệt cần thiết cho các BN bị suy giảm miễn dịch. Mặt khác, một số kỹ thuật phân tử như Realtime PCR vừa cho phép xác định chính xác nồng độ HCVRNA trong máu, vừa cho phép xác định chính xác các type HCV, phục vụ hữu hiệu cho việc tiên lượng bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị. Do nguyên liệu di truyền của virus C là RNA nên muốn thực hiện PCR phải có một giai đoạn chuyển RNA sang cDNA nhờ men sao chép ngược RT (reverse transcriptase). Sau khi có được cDNA thì ta thực hiện phản ứng PCR trực tiếp với đoạn đặc hiệu của virus C. Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RTPCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ”

đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất trong thế kỷ này và có lẽ cả ở thế kỷ sau.

HCV lan truyền trong cộng đồng qua con đường truyền máu và các sản phẩm củamáu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang con Hiện nay, chưa có vaccine để phòng chốngHCV do tính biến động di truyền cao của virus này

Trước khi quyết định điều trị, việc xác định nồng độ HCVRNA trong cơ thể sẽcung cấp các thông tin tiên lượng giúp cho việc quyết định phương cách và thời gian điềutrị Nếu người bệnh nhiễm HCV type 1 và có nồng độ HCVRNA trong cơ thể lớn hơn2x106 copies/ml máu thì thời gian điều trị là 48 tuần thay vì 24 tuần như các trường hợpkhác

Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các biểu hiện lâm sàng, các xét nghiệm chức nănggan thậm chí cả hình ảnh mô học của gan cũng không cho phép xác định nguyên nhân gâyviêm gan virus C Việc chẩn đoán nhiễm HCV buộc phải dựa vào các xét nghiệm sinhhọc có tính đặc hiệu đó là các kỹ thuật miễn dịch học và các kỹ thuật sinh học phân tửnhằm phát hiện kháng nguyên, kháng thể và các acid nhân của virus

Các xét nghiệm miễn dịch hiện nay cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễmHCV mạn tính nhưng hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ” Các kỹ thuậtphân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệucao cho phép phát hiện bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiệntrong máu, đặc biệt cần thiết cho các BN bị suy giảm miễn dịch Mặt khác, một số kỹthuật phân tử như Realtime PCR vừa cho phép xác định chính xác nồng độ HCVRNA

trong máu, vừa cho phép xác định chính xác các type HCV, phục vụ hữu hiệu cho việctiên lượng bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị Do nguyên liệu di truyền của virus C làRNA nên muốn thực hiện PCR phải có một giai đoạn chuyển RNA sang cDNA nhờ mensao chép ngược RT (reverse transcriptase) Sau khi có được cDNA thì ta thực hiện phảnứng PCR trực tiếp với đoạn đặc hiệu của virus C

Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ” nhằm các mục tiêu sau:

1.2 Mục tiêu đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR trên

BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định tỉ lệ (+) HCV qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

- Xác định nồng độ HCVRNA trên BN qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

- Xác định type HCV gây bệnh qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

- Tìm mối liên quan giữa type, nồng độ HCVRNA và một số xét nghiệm cận lâm sàngkhác của bệnh nhân

CHƯƠNG II

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về virus gây viêm gan C

2.1.1 Cấu trúc virus viêm gan C

Hepatitis C virus (HCV) thuộc họ Flaviviridae, có đường kính 55 – 65 nm Trọng lượngphân tử vào khoảng 4.016 Dalton, hệ gen gồm một dây xoắn đơn RNA, nằm bên trong phầnnucleocapsid hình đa diện Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 (Hình 2.1)

Hình 2.1 Cấu trúc của HCV (www.expertreviews.org/)

Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ Ở protein E2 có haivùng siêu biến (HVR: hypervariable region) là HVR1 và HVR2 Vùng siêu biến này thườngxuyên bị biến đổi qua mỗi lần virus nhân đôi tạo ra sự khác biệt giữa các genome của HCV(Bùi Hữu Hoàng, 2000)

Trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men RNA polymerase mà men nàykhông có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp RNA từ đó làm cho bộ gen của virus khá

đa dạng nên người ta đã phân lập được nhiều type khác nhau(www.drthuthuy.com/research/VGClipa.htm)

Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), genome của HCV là một chuỗi đơn RNA, gồm khoảng

9400 nucleotide, được chia làm 3 vùng (hình 2.2):

Hình 2.2 Những protein mã hóa cho bộ gen của HCV (www.expertreviews.org/)

- Đầu 5’ không mã hóa (5' NCR: non-coding region, 5' UTR: untranslated region,5’NTR: non-translated region) gồm 341 – 344 nucleotide

- Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’ Vùng này chỉ có một khung đọc duynhất gồm 9379 – 9481 nucleotide

- Đầu 3’ không mã hóa gồm: vùng đầu tiên có chiều dài từ 28 – 42 nucleotide, tiếp theo

là vùng poly U hoặc poly A để báo hiệu kết thúc quá trình giải mã

Cho đến  nay, theo Dev (2002) và Mindie H Nguyen (2004), để thực hiện chính xáctype HCV là phải phân tích trên đoạn Core hoặc NS5B của bộ gen HCV(http://www.hcvadvocate.org/news/reports/DDW_2004/wednesday.htm.)

2.1.2 Các loại type và yếu tố nguy cơ nhiễm HCV

2.1.2.1 Các loại type của HCV

Theo Châu Hữu Hầu (2006), các tương đồng trình tự giữa các thành viên của các typekhác nhau là 55 – 72% Các type được gọi bằng chữ số Ả Rập (type 1, 2…) Việc xếp loại cáctype dựa trên sự so sánh các vùng khác nhau trên bộ gen

Theo P Simmonds (2002), tới nay có 6 type (1 – 6) và hơn 50 subtype (a, b, c ) đãđược xác định, phổ biến là 1a, 1b, 2a, 2b (hình 2.3)

Hình 2.3 Các loại type và subtype của HCV theo P.simmonds

Để chuẩn hoá nhiều hệ gọi tên khác nhau, các chuyên gia đã so sánh trình tự ở vùngNS5 của các biến dị HCV Các trình tự giữa các thành viên của các type giống nhau từ 55 –72% Sự giống nhau giữa chúng với các subtype có liên quan khoảng 75 – 86% và thể phânlập riêng biệt trong mỗi cụm có các trình tự giống nhau 88% 6 type (1, 2, 3, 4, 5, 6) với cácsubtype (a, b, c ) (bảng 2.1) được xem là hệ thống chuẩn gọi tên các type HCV (McGarvey,1998)

Bảng 2.1 Các subtype của virus viêm gan C

2.1.2.2 Các yếu tố nguy cơ nhiễm HCV

 Chủng tộc và giới tính

Chủng tộc và giới tính có thể cũng ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm HCV mạn Chủngtộc Mỹ Phi được cho là có khả năng nhiễm bệnh cao hơn Một nghiên cứu trên 57 trường hợpcho thấy, nếu BN là nam, thì diễn tiến bệnh xảy ra nhanh hơn.(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114); điều này phù hợp với mộtnghiên cứu ở châu thổ sông Nile, nơi có tần suất viêm gan C mạn khá cao thì nam có nguy cơnhiễm viêm gan C mạn cao gấp 2,5 lần nữ (Habib et al., 2001).

Theo Lorenzo Rosaro, M.D Đại học California, những tác nhân ảnh hưởng đến bệnhviêm gan virus C là: nam, tuổi, HBV và HIV (www.youtube.com/watch?v=kfIu9uQODgQ)

số liệu nghiên cứu còn ít

Một nghiên cứu ở Mỹ cho thấy chỉ có 30% trẻ mang anti-HCV (+) là có HCVRNA, chothấy tỷ lệ mạn tính của HCV ỏ trẻ em chỉ bằng phân nửa ở người lớn Điều này khác với viêmgan B, tỷ lệ trở thành viêm gan B mạn ở trẻ em cao hơn rất nhiều so với người lớn (Châu HữuHầu, 2006)

 Các yếu tố nguy cơ khác

Theo Bùi Hữu Hoàng (2000) và Châu Hữu Hầu (2006), liên quan với các yếu tố nguy

cơ lây truyền bệnh, người ta nhận thấy type 1b thường gặp ở những BN bị nhiễm HCV dotruyền máu, còn type 3a thường thấy ở những BN chích xì ke (bảng 2.2)

Bảng 2.2 Type của HCV và các yếu tố nguy cơ lây nhiễm

Chích xì ke Chứng Chích xì ke Truyền máu Khác 1a

85

-14,5%

37%

32%

11,6%

103

-36%

12%

4%

-44%

4%

5-10%

-5%

5%

-4%

-2%

-2%

53

1 Silini J Hepatol, 1994: 21: S33 (A); 2 Pol Gastroenterology, 1995

3 Nousbaum, Ann Inter Med, 1995; 122:161-8

Nc: không xếp loại được; Bn: bệnh nhân

Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), hiện nay ở các nước Tây Âu, nhờ việc tầm soát nguy cơlây nhiễm HCV ở những người hiến máu đã làm giảm rõ rệt tỉ lệ nhiễm HCV thuộc type 1bsau truyền máu Tuy nhiên, type 3a lại có khuynh hướng gia tăng do việc chích xì ke đã trởthành cách lây nhiễm HCV chủ yếu ở các nước này Nếu tiếp xúc nhiều lần với nguy cơ lâybệnh, ví dụ như BN truyền máu nhiều lần có thể sẽ bị nhiễm nhiều loại type khác nhau(Bendinelli et al., 1999)

Một số tác giả cũng ghi nhận rằng sự khác biệt về type có liên quan đến các tổn thươngtiến triển ở gan, ví dụ như type 1b có nguy cơ tương đối bị ung thư gan gấp 3 lần so với cáctype khác nhau (bảng 2.3) (Bùi Hữu Hoàng, 2000)

Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Pháp và Ý lại thấy các tổn thương mô học ở gan độc lậpvới các kiểu gen, như tình trạng xơ gan thường gặp ở những BN lớn tuổi bị nhiễm HCV dotruyền máu từ hàng chục năm nên thường là type 1b; còn các type khác thường bị nhiễm ởngười trẻ cho nên ít gặp các tổn thương xơ hóa gan nặng ở gan (Bùi Hữu Hoàng, 2000)

Bảng 2.3 Type 1b và nguy cơ ung thư gan

Nơi nghiên cứu Số BN Khoảng tin cậy 95%

2.1.3 Cách thức xâm nhập và sinh sản của HCV

2.1.3.1 Cách thức xâm nhập

HCV xâm nhập thẳng vào cơ thể qua đường máu; rồi tấn công tế bào gan và sinh sôinẩy nở tại đây HCV làm cho tế bào gan sưng lên và đồng thời phá vỡ các tế bào gan Có đến85% những người bị nhiễm HCV có khả năng trở thành bệnh mạn tính (có nghĩa là 6 tháng saukhi bị nhiễm, bệnh vẫn không hết) Ða số những người bị viêm gan C mạn tính không thấy cótriệu chứng nào và vẫn có cuộc sống bình thường Tuy nhiên, trong số 10 – 25% người cóHCV mạn tính, bệnh sẽ âm thầm tiến triển trong khoảng 10 – 40 năm, và có thể làm hư gantrầm trọng, xơ gan, hoặc ung thư gan (http://www.youtube.com/watch?v=kfIu9uQODgQ)

2.1.3.2 Sự sinh sản của HCV

HCV có thể xâm nhập vào tế bào gan và các tế bào khác như: tế bào đơn nhân máungoại vi và hạch bạch huyết Tuy nhiên, sự sao chép của HCV chưa được biết nhiều (ChâuHữu Hầu, 2006)

Theo PG, AKI, Zurich (2002) và Châu Hữu Hầu (2006), HCV xâm nhập vào các tế bàotheo cơ chế nhập bào Tuy nhiên, sự nhập bào cũng như các thụ thể liên quan chưa được biếtnhiều Khi HCV vào bên trong, glycoprotein E2 không đủ để dung hợp màng tế bào và một

vùng kỵ nước của glycoprotein E2 được cho là giúp dung hợp vỏ ngoài virus vào màng Lúcnhập bào, sự kết hợp của lõi virus với tiểu đơn vị 60S của ribosom vật chủ có thể góp phầnvào việc cởi bỏ vỏ ngoài của RNA và khởi đầu dịch mã HCV Sự chế biến phân giải HCVpolyprotein có thể cùng một lúc với dịch mã hoặc sau dịch mã và qua trung gian bởi proteasecủa vật chủ cũng như của virus Trước khi phóng thích ra khỏi tế bào chủ, HCV tạo vỏ ngoàicho mình và các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương HCV kết hợp chủ yếuvới lưới nội bào tương, không có protein virus định vị trong nhân Cuối cùng virion HCV đượcphóng thích ra ngoài lưới nội bào tương với khoảng 1012 virion HCV mỗi ngày Giả sử 10% tếbào gan bị nhiễm HCV, mỗi tế bào gan phóng thích 50 hạt HCV mỗi ngày Các tế bào gan duytrì nồng độ RNA nội tế bào thấp; khoảng 3x1011 phân tử RNA được sản xuất mỗi ngày Cũngnhư HBV, các thành phần quan trọng của các hạt HCV được phóng thích có thể là các virionsao chép khiếm khuyết, hoặc các cấu trúc lõi trần Với thời gian bán tồn của một virion chỉ 4 –

7 giờ, đa số BN có nồng độ HCVRNA trong huyết thanh thấp là có thể hiểu được

2.2 Tình hình dịch tễ học của bệnh viêm gan virus C

Hình 2.4 Phân bố HCV trên thế giới

(http://international_abbotmolecular.com/HepatitisCDemographics_2562.aspx)

Theo WHO, tình hình nhiễm HCV trên thế giới cho thấy có sự khác nhau nổi bật giữacác vùng, các nước

Các nước Dân số (triệu) Tỷ lệ nhiễm (%) Số người nhiễm (triệu)

chiếm tỉ lệ không đáng kể (Trần Ngọc Bảo, 2000) HCV là tác nhân gây bệnh viêm gan C mạntính lây truyền qua đường máu phổ biến nhất ở Mỹ Theo Trần Ngọc Bảo (2000), xấp xỉ 40%những ca viêm gan mạn có liên quan đến nhiễm HCV, và ước tính 8.000 – 10.000 người chếtmỗi năm liên quan đến HCV (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114;www.hcvadvocate.org/hepatitis/hepC/Vietnamese_info.htm)

Theo Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát bệnh (Center for Disease Control andPrevention, CDC), số người chết do HCV có thể nhiều hơn những người chết do HIV/AIDShàng năm vào năm 2010 Ở Mỹ cứ 1 giờ sẽ có 3 người chết do HCV.(www.youtube.com/watch?v=J4TCo-qVoKk) Số ca mới/năm ở Mỹ là 30.000, Pháp 15.000,

Úc 11.000 ca (Trần Ngọc Bảo, 2000)

Tỷ lệ nhiễm HCV đã giảm vào thập niên 90 Từ 1980 - 1989, ước tính trung bình230.000 ca mỗi năm nhưng đến 2001 đã giảm xuống còn 25.000 ca mỗi năm(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114), trong đó 60% ở ngườinghiện hút, đường tình dục chỉ xấp xỉ 10% của các trường hợp mới mắc mỗi năm Điều cầnquan tâm là lây truyền HCV trong bệnh viện tương đối cao (10-30%) ở các BN thẩm tách máu(www.thongnhathospital.org.vn/nckh/2005_58_HNKH.pdf, 2005)

Người ta nhận thấy type 1, 2, 3 là các type được phân bố rải rác khắp nơi trên thế giới(Bùi Hữu Hoàng, 2000; P.Simmonds, 2002; Châu Hữu Hầu, 2006) Năm 2000, 73% BNngười Mỹ nhiễm HCV type 1; 14% nhiễm type 2; 8% nhiễm type 3; 4% đồng nhiễm nhiềutype và nhiễm mỗi type 4, 5 và 6 < 1% (Adrian, 2009)

Hình 2.5 Những loại genotype ở các nước trên thế giới

Người ta ghi nhận có sự phân bố khác nhau về type và subtype theo các vùng địa dư.Hiện tượng này hình thành nên dịch tễ học phân tử của nhiễm HCV (Bùi Hữu Hoàng, 2000)

Theo Lauer (2001), Simmonds (2005) và Châu Hữu Hầu (2006), các nghiên cứu trình

tự và xác định type chứng minh các subtype liên quan khá chặt chẽ và phân bố theo địa dư nhưsau (http://diss.kib.ki.se/2004/91-7349-588-3/thesis.pdf):

+ Subtype 1a thường gặp ở Bắc và Nam Mỹ, cũng như ở Úc

+ Subtype 1b thường gặp ở Châu Âu và Châu Á (Nhật)

+ Subtype 2a thường gặp ở Nhật và Trung Quốc

+ Subtype 2b thường gặp nhất ở Mỹ và Bắc Âu

+ Subtype 2c thường gặp nhất ở Tây và Nam Âu

+ Subtype 3a thường gặp ở Úc và Nam Á

+ Subtype 4a có vẻ trội ở Ai Cập và Zaire

+ Subtype 4c thường gặp ở Trung Phi Châu

+ Subtype 5a chỉ hay gặp ở Nam Phi, nhưng hiếm gặp ở nhiều nơi trên thế giới

+ Subtype 6a giới hạn ở Nam Á (Hồng Kong, Macau và Việt Nam)

+ Subtype 7a và 7b thường gặp ở Thái Lan

+ Subtype 8a, 8b và 9a được tìm thấy ở Việt Nam

+ Subtype 10a và 11a gặp ở Indonesia

Dựa vào phân tích trình tự protein E1 và vùng NS5B, các biến dị HCV mới được tìmthấy ở Việt Nam, cũng như các nước Đông Nam Á khác được xếp vào các type 7, 8, 9, 10 và

11 Ngày nay, các type 7, 8, 9, 11 được nhập chung vào kiểu 6a và type 10 được xếp chung vớikiểu 3a

Sự phân bố type theo các vùng địa dư tương đối ổn định Tuy nhiên, hiện nay do vấn đề

di dân và du lịch xảy ra khá phổ biến cho nên có thể ảnh hưởng phần nào đến bản đồ phân bốtype của HCV trên thế giới

Các type được nhận diện nhờ vào các phương pháp như: PCR gián biệt, định type huyếtthanh, phương pháp lai ghép đặc hiệu của các subtype, RFLP…

Type HCV phân bố khác nhau tùy theo vùng địa dư, mỗi châu lục hay mỗi nước cónhững type HCV vượt trội riêng (Dev et al., 2002; Doris B Strader et al., 2004; Eugene R.Schiff et al., 1999; Johannes Bircher et al., 1999; Mindie H Nguyen et al., 2004; Hepatitis-central.com/hcv/genotype)

Việt Nam là nước nằm trong vùng dịch tễ của virus gây bệnh viêm gan C(www.drthuthuy.com/research/VGClipa.htm) Theo các số liệu đã được công bố, tỉ lệ nhiễmHCV ở Việt Nam là từ 4 – 9% (Trần Ngọc Bảo, 2000; Châu Hữu Hầu, 2006) Theo ghi nhận

về tình hình nhiễm HCV thì tỷ lệ người bình thường ở Việt Nam nhiễm HCV là khoảng 5 –10% (Alter MJ, 1995), xem như là thuộc nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HCV cao thứ nhìtrên thế giới

Theo một nghiên cứu của Châu Hữu Hầu tại cộng đồng dân cư huyện Tân Châu, AnGiang thì tỷ lệ nhiễm HCV là 4,1% Theo Nataka và cộng sự khảo sát trên người không cóbệnh gan ở 2 thành phố lớn là Hồ Chí Minh và Hà Nội thì thấy tỷ lệ nhiễm anti-HCV lần lượt

là 9% (43/491) và 4% (18/511) Phân bố anti-HCV không phụ thuộc theo tuổi

Hình 2.6 Sự phân bố tỷ lệ nhiễm HCV ở Việt Nam

Tại bệnh viện Chợ rẫy tại TPHCM, tỉ lệ nhiễm HCV là 10,95% (Nguyễn Hữu Chí,1998) Theo Hoàng Thuỷ Long và cs (1998) khi nghiên cứu trên 1.563 BN ở Thanh Hóa, đượcxét nghiệm anti-HCV chỉ có 6 đối tượng (chiếm tỷ lệ 0,38%) có kết quả dương tính và không

có đối tượng nào là trẻ em Như vậy, Thanh Hóa là vùng có tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C ởmức độ thấp (www.pasteur-hcm.org.vn/ng_cuu/viemgan/viemgan.htm)

Nghiên cứu tình hình nhiễm HCV ở Bệnh viện Thống nhất ở TPHCM trên 910 ngườinăm 2005 cho thấy tỷ lệ nhiễm HCV là 2,4%, tỷ lệ này phù hợp với nghiên cứu của TrươngXuân Liên (2,53%) (www.thongnhathospital.org.vn/nckh/2005_58_HNKH.pdf, 2005), so vớicộng đồng người Việt Nam khỏe mạnh (0,4 – 1,35%) có cao hơn, nhân viên y tế 3,28%; nhómcao nhất là nhóm chích ma túy 96,2% (Châu Hữu Hầu 2006; Nguyễn Hữu Chí, 1998; TrươngXuân Liên, 1994)

Hình 2.7 Tình hình nhiễm HCV ở một số đối tượng tại TPHCM (Trương Xuân Liên)

Trong 6 type của HCV thì ở Việt Nam có 3 type chính là: 1b, 2 và 6 (P Simmonds, P.Marcellin 2002) Tuy nhiên, theo nghiên cứu về type HCV ở người Việt Nam của nhiều tác giảkhác nhau, type HCV ở người Việt Nam là 1b và 6a (bảng 6)

Bảng 2.5 Type HCV lây nhiễm ở người Việt Nam

Tác giả - Địa

điểm

Sốtrườnghợp

Sequencing.Core.Type 1b:36% là type 7,8, type 9: 10%

Uc (type7), 1,4% (type 9) (www.drthuthuy.com/research/VNgenotype.html)

Type 6 thường chỉ gặp ở vùng Đông Nam Á (Dev et al., 2002; Johannes Bircher et al.,1999) nên khả năng đáp ứng điều trị đặc hiệu chưa có nhiều nghiên cứu Type 6 không phổbiến ở Mỹ, Châu Âu nhưng phổ biến ở một số nước châu Á: Trung Quốc, Thailand, HongKong, Việt Nam (Hui CK et al., 2003)

Theo Mindie Nguyen (2004), type 6 chiếm tỷ lệ 14% người Mỹ gốc Việt; theo nghiêncứu của Trung tâm Y khoa Medic tại TPHCM, type 6 chiếm 24%(www.drthuthuy.com/research/peg_rib_geno6.html)

Nghiên cứu của Phạm Song và cs cho thấy trong 83 người nhiễm HCV, 1a chiếm 29%,5% kiểu 2a, 2% hỗn hợp kiểu 1a và 1b và số còn lại không xếp vào các loại 1a, 1b, 2b và 3a

Hồ Tấn Đạt và cs ( 2005) dùng kỹ thuật Lipa, tại Trung tâm Y Khoa Medic, khi phântích 327 trường hợp viêm gan C mạn ở Việt Nam cho thấy type 1 nhiều nhất 58,4%, type 6(6a) 23,9%; 13,1% các type 2 và 4,3% không xác định được kiểu gen

2.3 Diễn tiến nhiễm HCV và các triệu chứng của bệnh viêm gan virus C

2.3.1 Diễn tiến nhiễm HCV

Với những BN nhiễm HCV, ở tuần 1 – 3 một số BN có biểu hiện tăng nồng độ ALT.Trong năm đầu tiên nhiễm HCV, nồng độ ALT và HCV RNA có chiều hướng giảm một cách

ổn định Tuy nhiên, không có sự phù hợp tuyệt đối giữa ALT và HCVRNA Chẳng hạn,HCVRNA có trong máu một số BN nhiễm HCV với nồng độ ALT ở mức bình thường Hơnnữa, nồng độ ALT huyết thanh dao động ở cả những trường hợp đã nhiễm bệnh và đã hồi phục

từ khi bắt đầu nhiễm bệnh cho đến 12 tháng Những kháng thể với HCV xuất hiện từ tuần thứ

8 hoặc 9 sau khi nhiễm (Adrian, 2009) Theo số liệu đã được công bố, trong 100% ngườinhiễm virus viêm gan C lần đầu tiên có 85% BN diễn tiến thành mạn tính, thời gian kéo dàithường khoảng 10 năm và 15% người bị nhiễm tự khỏi trong vài tuần hay vài tháng Trong85% BN mạn tính có 20% người bệnh chuyển sang xơ gan và 80% BN duy trì ở giai đoạn mạntính Trong số 20% BN diễn tiến xơ gan có 75% BN bị suy gan và biến chứng khác; ung thưgan chiếm 25% (hình 2.8)

Hình 2.8 Diễn tiến nhiễm HCV

Tỷ lệ viêm gan mạn ở nữ thấp hơn nam và có sự tương quan tỷ lệ nghịch về tuổi (Adrian,2009)

2.4 Xét nghiệm đặc hiệu chẩn đoán bệnh viêm gan virus C

2.4.1 Các xét nghiệm sinh hóa

2.4.1.1 Tăng aminotransferase trong nhiễm HCV

Aminotransferase được dùng thường nhất và là chỉ thị đặc hiệu của hoại tử tế bào gan.Các enzyme này bao gồm:

+ Aspartate aminotransferase (AST, SGOT): có ở nhiều mô khác nhau: tim, cơvân, thận, não và gan Trong gan, AST hiện diện ở ty thể và phần bào tương tế bào

+ Alanine aminotransferase (ALT, SGPT): chủ yếu ở trong gan và trong phầnbào tương tế bào

Các enzyme này chuyển nhóm α–amino của aspartate và alanine thành nhóm α–ketocủa ketoglutaric acid Các tổn thương chức năng gan nhẹ, trung bình và nặng được xác địnhnhư sau:

Xét nghiệm Bình thường U/Ia Nhẹb Trung bìnhb Nặngb

AST

ALT

GGT

11-323-302-65

≤ 2-3

≤ 2-3

≤ 2-3

2-3 đến 202-3 đến 202-3 đến 10

> 20

> 20

> 10

a Giới hạn bình thường tùy theo xét nghiệm được dùng do nhà bào chế cung cấp

b Số trong bảng được nhân cho giới hạn trên của số liệu bình thường

Aminotransferase giảm xuống nhanh có thể do số lượng tế bào gan còn sống giảm vàđây là một tiên lượng xấu trong viêm gan bạo phát Aminotransferase tăng cao có thể là bằngchứng đầu tiên của bệnh gan và việc sàng lọc là cần thiết nhằm phát hiện bệnh gan dưới lâmsàng Bởi vậy, BN có mức amintransferase bình thường vẫn có thể có tổn thương gan nặng

Tỷ suất AST/ALT có thể hữu ích trong chẩn đoán:

+ AST/ALT > 2: bệnh gan do rượu Lý do tăng AST do với ALT có thể do thiếuhụt một đồng yếu tố, đó là pyridoxine-5-phosphate Thực vậy, khi BN bệnh gan do rượu uốngđồng yếu tố này thì thấy ALT huyết thanh tăng

+ AST/ALT ≤ 1: bệnh gan ứ mỡ không do rượu thường có ALT lớn hơn AST.Trong viêm gan virus, tỷ suất AST/ALT thường ≤ 1 nhưng có thể tăng > 1 khi có xơ gan

2.4.1.2 Bilirubin trong nhiễm HCV

Bilirubin là anion hữu cơ nội sinh có nguồn gốc chủ yếu từ sự thoái biến hemoglobincủa hồng cầu Tăng bilirubin huyết được xếp vào hai loại: liên kết hay không liên kết

+ Bilirubin liên kết: ở BN tăng bilirubin huyết do rối loạn chức năng tế bào gan hoặc ứmật, và vì tan trong nước, cho phép bài tiết dễ dàng qua thận

+ Bilirubin không liên kết: tăng bilirubin huyết quá cao (> 25mg/dL) thường giải thíchcho bệnh gan nặng kết hợp với một nguyên nhân tăng bilirubin huyết không liên kết (như bệnhtan máu)

2.4.1.3 Albumin huyết thanh trong nhiễm viêm gan virus

Albumin là một protein lưu thông quan trọng nhất được tổng hợp bởi gan, chiếm ¾ áplực thẩm thấu dạng keo của huyết tương Gan là nơi tổng hợp duy nhất với khoảng 12-15 gammỗi ngày ở người lớn khỏe mạnh Nồng độ albumin huyết tương giảm xuống ở bệnh gan cấpnặng và bệnh gan mạn và là một trong các tiểu chuẩn xếp loại của Child-Pugh được dùng đểphân độ xơ gan Mặt khác, giảm albumin máu có thể do rối loạn tiêu hóa, rối loạn chức năngthận, biến đổi kích tố, tăng thoái biến và tăng γ globulin huyết, có thể ức chế tổng hợpalbumin

2.4.1.4 Thời gian protromblin (PT) và các yếu tố đông máu trong nhiễm HCV

Trừ yếu tố VIII, tất cả các yếu tố đông máu được tổng hợp ở gan Các yếu tố đông máuxác định PT có đời sống ngắn, làm xét nghiệm phù hợp để đánh giá tổn thương gan cấp PT làmột trong các thành phần then chốt trong tiên lượng suy gan bạo phát và viêm gan cấp dorượu PT kéo dài từ 2 giây trở lên hơn lô chứng được xem là bất thường PT không phải là chỉ

số độ nhạy của bệnh gan mạn tính, vì PT có thể bình thường ngay cả ở BN xơ gan Hơn nữa,

độ đặc hiệu của xét nghiệm thấp nếu có chứng kém hấp thu, vì các yếu tố II, VII và X phụthuộc vào vitamin K Hiện nay, người ta dùng tỷ suất bình thường hóa quốc tế (INR) thay thế

PT, vì tỷ suất này dựa trên các kiểu thromboplastin có nhiều thay đổi ở các nước khác nhau

2.4.1.5 Vai trò của dấu ấn huyết thanh AFP trong nhiễm HCV

AFP là dấu ấn chẩn đoán đặc hiệu với ung thư tế bào gan (UTTBG) và là một phươngtiện theo dõi trong điều trị ở các BN UTTBG Tuy nhiên, không phải tất cả BN UTTBG đều

có AFP tăng, và gần 40% BN UTTBG có nồng độ huyết thanh bình thường

AFP là kháng nguyên ung thư thai nhi đầu tiên được phát hiện và hiện nay là một dấu

ấn về u thường dùng trong UTTBG nguyên phát và các ung thư tế bào mầm không sinh tinhcủa dịch hoàn AFP là một glycoprotein chuỗi đơn, trọng lượng phân tử 79 kD), được tổnghợp bởi túi noãn hoàng thai nhi, các tế bào nhu mô gan và các mô đường tiêu hóa có nguồngốc lá thai trong khác Nồng độ đỉnh của AFP huyết thanh (3mg/ml) xảy ra trong tuần mangthai thứ 12, sau đó AFP giảm xuống còn khoảng 0,1 mg/ml vào lúc sanh và tiếp tục giảm chođến nồng độ bình thường ở người lớn (≤ 10 ng/ml) vào lúc 1 tuổi

2.4.2 Các xét nghiệm sinh học phân tử (SHPT)

Các kỹ thuật SHPT gồm có: khuếch đại mục tiêu và khuếch đại tín hiệu

2.4.2.1 Định tính virus C bằng kỹ thuật SHPT

 Nhóm kỹ thuật khuếch đại mục tiêu

Có rất nhiều kỹ thuật đang được sử dụng như: NASBA (nucleic acid sequence basedamplification), LCR (ligase chain reaction) và RT-PCR (Reverse transcription polymerasechain reaction)

 Kỹ thuật NASBA (nucleic acid sequence based amplification)

Là kỹ thuật khuếch đại trực tiếp RNA của virus ở nhiệt độ thường Thực tế khi sử dụngvới virus C không cho kết quả như mong muốn nên còn ít được sử dụng NASBA đã đượcdùng để phát hiện HIV với độ nhạy cao và độ tin cậy lớn

 Kỹ thuật LCR (ligase chain reaction)

Là kỹ thuật chuyển RNA của virus sang cDNA và cũng dùng mồi và các chu kỳ nhiệttương tự như PCR nhưng enzyme để nhân DNA lên là DNA ligase Kỹ thuật bị giới hạn về độnhạy và tính đặc hiệu nên chưa được ứng dụng nhiều

 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)

Đây là kỹ thuật mà RNA đích phải được phiên mã ngược thành cDNA, rồi sau đó sẽdùng kỹ thuật PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tựnày Kỹ thuật RT-PCR dùng để phát hiện RNA của virus C với độ nhạy cao có thể cho kết quảdương tính với 100 đến 1000 bản sao RNA trong 1ml (Phạm Hoàng Phiệt, 2000)

Ngày nay, một số nhà sản xuất đã thành công tạo các bộ kit chẩn đoán các bệnh dựavào kỹ thuật RT-PCR Trong đó, có bệnh viêm gan virus C, B, bệnh sốt xuất huyết Dengue…

 Nhóm kỹ thuật khuếch đại tín hiệu: kỹ thuật DNA nhánh

Kỹ thuật bDNA (branched DNA) có hạn chế là độ nhạy thấp hơn, mức phát hiện làkhoảng 200.000 bản sao/ml Bởi lý do này nên không dùng để chẩn đoán (sót các trường hợplượng virus thấp: âm tính giả) cũng như theo dõi đáp ứng sau điều trị (âm tính chưa đảm bảo

có đáp ứng về virus ) Tuy nhiên kỹ thuật bDNA áp dụng vào định lượng virus có độ lặp lại

và độ chính xác cao

2.4.2.2 Định lượng virus C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR

Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các thử nghiệm phát hiện kháng thể (cả EIA và RIBA)không cho phép ước định lượng virus, kỹ thuật phát hiện kháng nguyên hiện chưa được áp

dụng trong thực tế nên kỹ thuật sinh học phân tử có vị trí độc tôn trên lãnh vực này Cả hainhóm kỹ thuật: khuếch đại mục tiêu và khuếch đại tín hiệu đều có thể dùng để định lượngvirus

Kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặc hiệu cho HCV Một cặp mồiđược thiết kế trong vùng 5’UTR của bộ gen HCV để nhân bản một trình tự mục tiêu có kíchthước 103 cặp base Phản ứng Realtime PCR còn sử dụng thêm mẫu dò Taqman đặc hiệu choHCV được đánh dấu huỳnh quang Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản sẽ tươngứng với một tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu này sẽ được đầu dò của máy ghi nhận Như vậy,

số lượng bản sao trình tự mục tiêu HCV tạo ra ở từng thời điểm sẽ được ghi nhận chính xáctrong suốt quá trình PCR Dựa vào một đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bảnsao HCV xác định, có thể tính được số lượng bản sao HCV hiện diện trong mẫu ban đầu

2.4.2.3 Định type HCV

 Kỹ thuật SHPT xác định đặc hiệu type của cấu trúc gen

Thực ra kỹ thuật phân tích trình tự chuỗi acid nhân là chuẩn mực vàng, song kỹ thuậtnày không thể áp dụng trong thực tế do tốn kém tiền của và thời gian Bởi lý do trên nên các

kỹ thuật khác như chỉ phân tích một đoạn gen của virus có các thay đổi đặc hiệu với typethường được dùng phổ biến Các vùng gen thuờng được khuếch đại rồi phân tích là vùng5’NCR (ít thay đổi nhất); vùng C và vùng NS5B (tương đối ít thay đổi) Sau khi khuếch đạivới kỹ thuật PCR, sản phẩm có được cho lai với các đầu dò đặc hiệu type hoặc PCR tổ(nested-PCR) với đặc hiệu type ở vùng C và NS5B hoặc phân tích RFLP của vùng 5’ NCRhay NS5B Các kỹ thuật này cho kết quả phù hợp với nhau cao (94%) nhưng vẫn có một tỉ lệ

từ 3-17% không định type được (Phạm Hoàng Phiệt, 2000)

 Kỹ thuật định type huyết thanh

Đáp ứng miễn dịch có những khác biệt giữa các type Đặc biệt ở các kháng nguyên ởvùng NS4, E1, NS5 và phần thay đổi của vùng C có các epitop đặc hiệu type Bởi lý do nàynên có thể dùng epitop đặc hiệu type gắn vào giá cứng để chẩn đoán nhờ vào sự phát hiệnkháng thể đặc hiệu Martinot so sánh kỹ thuật định type huyết thanh với kết quả INNOLIPAtrên 220 BN nhiễm HCV mạn tính: độ nhạy của định type huyết thanh là 78% và của định type

là 98% Có 8% type huyết thanh cho kết quả không phù hợp Định type huyết thanh là một kỹthuật đơn giản và ít tốn kém nên vẫn có giá trị trên lâm sàng (Phạm Hoàng Phiệt, 2000)

 Định type HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR

 Phương pháp Realtime PCR

Taqman probe được gắn một chất phát huỳnh quang (reporter) ở đầu 5’ và một chất dậptắt (quencher) ở đầu 3’ sao cho tín hiệu huỳnh quang của chất phát huỳnh quang bị hấp thu bởichất dập tắt Trong bước bắt cặp và kéo dài mạch của một chu kỳ PCR, Taqman probe đặchiệu cho một type HCV sẽ bắt cặp với mạch bổ sung của trình tự tương ứng Hoạt tính 5’-3’exonuclease của Taq polymerase trong phản ứng sẽ loại bỏ nucleotide ở đầu 5’ có gắn chấtphát huỳnh quang của Taqman probe Chất này tách rời khỏi probe, không còn chịu tác độngcủa chất dập tắt và sẽ phát huỳnh quang

Các Taqman probe đặc hiệu cho từng type HCV sẽ được đánh dấu bằng các chất pháthuỳnh quang khác nhau (Cy5, VIC, TAMRA, FAM, HEX…) Mỗi tín hiệu huỳnh quang đặchiệu sẽ đánh dấu sự có mặt của một type HCV trong mẫu thử

 Định type HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR

Kit HCV định type dựa trên kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng mẫu dò Taqman đặchiệu cho HCV Một cặp mồi được thiết kế trong vùng 5’ không mã hóa của bộ gen HCV đểnhân bản một trình tự mục tiêu có kích thước 103 cặp base Phản ứng Realtime PCR còn sửdụng thêm mẫu dò Taqman đặc hiệu cho các type HCV 1, 2 và 6 được đánh dấu huỳnh quang.Mỗi bản sao của trình tự mục tiêu được nhân bản tương ứng với một tín hiệu huỳnh quang Tínhiệu này sẽ được đầu dò của máy ghi nhận Như vậy, số lượng bản sao trình tự mục tiêu HCVtạo ra ở từng thời điểm sẽ được ghi nhận chính xác trong suốt quá trình PCR Dựa vào mộtđường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản sao HCV xác định, có thể tính được sốbản sao HCV hiện diện trong mẫu ban đầu và xác định chính xác các type HCV

CHƯƠNG III

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Dụng cụ, thiết bị

Máy ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút dùng cho tube 1,5 ml, tủ thao tác vô trùng, máyRealtime PCR và hệ thống máy tính, máy vortex, máy ủ nhiệt khô, máy luân nhiệt các loại ốngtube, tủ lạnh -200C, bộ micropipette …

3.1.2 Hóa chất

- Bộ kit Realtime RT-PCR định lượng HCV

- Bộ kit Realtime RT-PCR định type HCV

+ Bộ kit tách chiết RNA bằng phenol/chloroform

+ Bộ kit tổng hợp cDNA

+ Bộ kit xây dựng đường chuẩn cho kit định lượng

Các bộ kit trên do công ty cổ phần thương mại – sản xuất và dịch vụ Việt Á sản xuất vàcung cấp

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

3.2.1.1 Đối tượng chọn mẫu

- BN được chẩn đoán viêm gan C dựa vào những dấu hiệu lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ

3.2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

- BN có anti-HCV (+) và có hoặc không kèm theo những dấu hiệu lâm sàng sau:

+ BN có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, có thể vàng da, vàng mắt, nước tiểu đậm màu + BN có dấu hiệu lâm sàng của xơ gan và ung thư gan

3.2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- BN không đồng ý tham gia nghiên cứu

- BN có anti-HCV dương tính nhưng có các bệnh lý mạn tính khác kèm theo như : bệnhphổi mạn tính, bệnh lý tim mạch, bệnh về thận

3.2.2 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang

3.2.3 Cỡ mẫu

Chọn mẫu toàn bộ những BN theo tiêu chuẩn chọn mẫu trong thời gian từ 1/2009 đến8/2010

3.2.4 Cách chọn mẫu

- Chọn mẫu nghiên cứu ngẫu nhiên không xác suất

3.2.5 Các biến số cần thu thập

+ Thông tin chung về bệnh nhân: tuổi, giới, địa dư

+ Dấu hiệu lâm sàng của BN khi được chẩn đoán

+ Ghi nhận kết quả anti-HCV (+)

+ Tiến hành kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng và định type HCV tại phòng thínghiệm SHPT, khoa Vi sinh, BVĐKTWCT

3.2.7 Các bước tiến hành kỹ thuật Realtime RT-PCR

- Rút máuRút 1ml máu cho vào ống nghiệm

- Ly trích huyết thanhMẫu máu được quay ly tâm 1.500 vòng/phút/15 phút Sau đó, tách huyết thanh và tiếnhành làm các xét nghiệm cần thiết

- Kỹ thuật Realtime RT-PCR định lượng và định type HCVĐịnh lượng hay định type HCV đều cần tiến hành 2 giai đoạn chung là: tách chiết RNA

và thực hiện phản ứng RT Sau khi thực hiện kỹ thuật RT, dùng sản phẩm cDNA này tiến hành

kỹ thuật Realtime PCR định lượng hoặc định type HCV

3.2.7.1 Tách chiết RNA

+ Chuẩn bị tube eppendorf 1,5ml và đánh dấu bằng ký hiệu mẫu

+ Cho 200 µl huyết thanh BN vào 1 eppendorf có sẵn 900 µl dung dịch pER1

+ Vortex 30 giây, để yên 10 phút

+ Thêm vào 200 µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tubephải chuyển thành màu trắng đục

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút

+ Hút 600µl dịch nổi có chứa RNA vào tube biopure có sẵn 600µl dung dịch pEX3+ Trộn đều – để yên trong 10 phút

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút/10 phút

+ Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi và thu cặn màu xanh

+ Cho từ từ 900µl dung dịch EX4 vào tube có cặn màu xanh

+ Ly tâm 13.000 vòng/phút/5 phút Hút bỏ dịch cẩn thận không chạm vào cặn lắng.+ Làm khô cặn ở 600C/15 phút

+ Thêm 50 µl dung dịch ER5 Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khi phầncặn tan hoàn toàn

+ RNA sau khi ly trích sẽ tiến hành kỹ thuật RT hoặc trữ ở -200C

+ Muốn lưu trữ lâu phải bảo quản ở -700C với RNA inhibitor

Chú ý: Trộn đều các dung dịch trước khi sử dụng

3.2.7.2 Phản ứng RT

+ Thực hiện bước này với các tube RT-tube được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.+ Trước và sau khi đặt phản ứng RT phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáytube

+ Đánh dấu các tube bằng ký hiệu mẫu

+ Cho 8 µl RT-Mix vào 1 tube RT-Tube

+ Cho tiếp 15 µl chứng (+), chứng (–) hoặc dịch RNA tách chiết vào tube

+ Đậy nắp tube thật kỹ và đặt vào máy PCR

+ Sinh tổng hợp cDNA được thực hiện trên máy PCR với quy trình 250C/5 phút,

420C/30 phút và 850C/5 phút, giữ ở 40C

+ Sản phẩm cDNA sẽ được sử dụng trong phản ứng khuếch đại gen

3.2.7.3 Phản ứng Realtime RT-PCR định lượng HCV

+ Định lượng HCV bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR sử dụng Taqman probe

+ Cho 2,5l dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào từng tube iVAHCVqPCR mix

+ Đặt tube ở trên vào máy Realtime PCR cùng với chứng dương, chứng âm và 1 bộstandard với 3 nồng độ khác nhau (102, 104, 106).

+ Chọn màu FAM cho standard Màu FAM và HEX cho mẫu, chứng dương và âm+ Cài đặt chương trình cho máy Realtime PCR hoạt động: 1 chu kỳ 950C - 5 phút; 40chu kỳ: 950C-15 giây; 600C – 1 phút

Chứng dương và chứng âm phải đạt yêu cầu và tiếp tục các bước phân tích kết quả nếu:

 Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM vượt quá tín hiệunền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX âm tính(không vượt qua tín hiệu nền)

 Chứng âm có đường màu FAM (-) và màu HEX (+)

 Các kết quả dương tính được nhân với 150 sẽ thu được kết quả nồng độ HCVRNA/mlmáu (copies/ml) Ngưỡng phát hiện của bộ kit là 3x102 copies/ml

 Sau khi nhân với 150 nếu > 3x102 thì kết luận mẫu dương tính; nếu ≤ 3x102 thì kết luậnmẫu âm tính dưới ngưỡng phát hiện

+ Chọn màu FAM và HEX cho tất cả các mẫu, chứng dương và chứng âm

+ Cài đặt chương trình cho máy Realtime PCR hoạt động: 1 chu kỳ 950C - 5 phút; 40chu kỳ: 950C - 15 giây; 600C - 1 phút

+ Phân tích kết quả

Chứng dương và chứng âm phải đạt yêu cầu và tiếp tục các bước phân tích kết quả nếu:

 Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tínhiệu nền (đường biểu diễn dương tính) của màu FAM với type 2 và type 6 và màu HEX vớitype 1 và type 3.

 Chứng âm có đường biểu diễn (-) với cả 2 màu FAM và HEX

 Mẫu có đường biểu diễn (+) tương ứng với type nào thì kết luận mẫu nhiễm type

đó Một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều type Tín hiệu dương tính (hoặc tín hiệu dương tínhmạnh nhất nếu mẫu đồng nhiễm nhiều type) phải tương đương với tín hiệu dương tính đã xácđịnh trước đó của mẫu

 Mẫu có đường biểu diễn âm tính với tất cả các type thì kết luận: “Mẫu nhiễmHCV type khác ngoài 4 type 1, 2, 3, 6” (vì mẫu đã được xác định dương tính với HCV trướcđó)

 In đồ thị và kết quả

- Một số đồ thị biểu diễn tham khảo

Mẫu nhiễm type 1

1, 2, 3, 6: type 1, 2, 3, 6 D: Chứng âm

1

D

3 6 2

6 2

1

D 2

6 3

Mẫu nhiễm type 1

3

3.2.9 Sơ đồ nghiên cứu:

Chọn đối tượng nghiên cứu

Rút máu (điều kiện: anti-HCV (+))

Thu thập thông tin lâm sàng

CHƯƠNG IV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu viêm gan virus C

Từ 1/2009 đến 8/2010, chúng tôi thu thập 168 BN anti-HCV (+), các đặc điểm BNgồm:

4753

Tuổi ≤ 18

18-2526-4546-65

> 65

111578613

0,66,533,951,27,7

Địa chỉ An Giang

Cần Thơ

Hậu GiangVĩnh LongBạc Liêu

Cà Mau Tiền GiangKiên GiangSóc TrăngTrà Vinh

1982927322141

0,658,317,316,11,81,21,20,6

2, 40,6

Nhận xét: - 168 BN có anti HCV (+) có 79/168 nữ chiếm 53% cao hơn ở nam 47% (89/168).

- Nhóm tuổi 46 – 65 có tỷ lệ anti-HCV (+) cao nhất (51,2%)

- Số BN có anti-HCV (+) ở Cần Thơ chiếm tỷ lệ cao (58,3%)

4.1.2 Kết quả về tỷ lệ HCVRNA (+) qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

168 BN có anti-HCV (+) đến được làm xét nghiệm Realtime RT-PCR để xác định sự cómặt HCVRNA Ngưỡng phát hiện của máy Realtime PCR là: 3x102 copies/ml

Bảng 4.2 Tỷ lệ HCVRNA (+) qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

Âm tínhDương tính

Nhận xét: Tỷ lệ HCVRNA (+) chiếm 56% (74/168), âm tính chiếm 44% (94/168)

Bảng 4.3 Tỷ lệ HCVRNA (+) theo giới tính bệnh nhân

Nam Nữ

5143

54

46

Nhận xét: Tỷ lệ HCVRNA (+) ở nam 54% (51/94) cao hơn nữ 46% (43/94)

Bảng 4.4 Tỷ lệ HCVRNA (+) theo tuổi BN

< 1818-2526-4546-65

> 65

1326

56

8

1,23,227,6

59,5

8,5

Nhận xét: - Tỷ lệ HCVRNA (+) cao nhất ở nhóm tuổi từ 46-65, chiếm 59,5%; kế đó là nhóm

tuổi 26-45, chiếm 27,6%

- Ở nhóm tuổi < 26 và > 65, tỷ lệ HCVRNA (+) chiếm tỷ lệ thấp (4,4 % ở độ tuổi < 26

và 8,5% ở tuổi > 65)

Bảng 4.5 Tỷ lệ HCVRNA (+) theo địa dư

601516221112

Nhận xét:

- Tỷ lệ HCVRNA (+) cao nhất ở Cần Thơ (60%), kế đó là Hậu Giang (16%) và VĩnhLong (15%) Các tỉnh có tỷ lệ HCVRNA (+) thấp là Sóc Trăng, Tiền Giang, CàMau, Kiên Giang, Bạc Liêu và Trà Vinh

4.1.3 Kết quả nồng độ HCV-RNA qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

Dựa theo nghiên cứu của Nguyễn Thanh Tòng và cs (2004) ở Trung tâm Y khoa MedicTPHCM (http://www.drthuthuy.com/research/xetnghiemVGC.htm), chúng tôi phân loại nồng

độ HCV thành 2 nhóm Nhóm có nồng độ ≤ 2x106copies/ml và nhóm có nồng độ > 2x106copies/ml

Bảng 4.6 Nồng độ HCVRNA (+) qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

92,57,5

Nhận xét: - Nồng độ HCVRNA trong huyết thanh của BN viêm gan virus C phần lớn có nồng

độ HCVRNA ≤ 2x106 copies/ml, chiếm 92,5%

Bảng 4.7 Sự phân bố nồng độ HCVRNA (+) theo tuổi

Bảng 4.8 Sự phân bố nồng độ HCVRNA (+) theo giới tính

- Ở nồng độ > 2x106 copies/ml, sự khác biệt về giới rất rõ, nam chiếm tỷ lệ 85,7% (6/7BN)

Biểu đồ 4.1 Sự phân bố tỷ lệ nồng độ HCVRNA (+) theo giới tính

Xem hình ảnh về kết quả định lượng HCV bằng Realtime RT-PCR ở phụ chương phần III

4.1.4 Kết quả định type HCV

Trong số 94 BN có HCVRNA (+), có 85 BN được định type HCV, kết quả như sau:

4.1.4.1 Kết quả định type HCV qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

Bảng 4.9 Kết quả định type HCV qua kỹ thuật Realtime RT-PCR

Type HCVRNA (copies/ml)

Realtime RT-PCR

126Đồng nhiễm type 1 & 6

4018225

47,121,225,95,8

Nhận xét:

- Type 1 chiếm tỷ lệ cao nhất (47,1%); kế đó là type 6 (25,9%) và type 2 chiếm tỷ lệthấp hơn (21,2%)