Gốc tự do, nguyên nhân sinh ra gốc tự do và các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

Gốc tự do, nguyên nhân sinh ra gốc tự do và các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

MỤC LỤC Lời mở đầu 2

1 Gốc tự do 3

1.1 Định nghĩa 3

1.2 Nguyên nhân sinh ra gốc tự do 4

1.3 Các loại gốc tự do 5

1.3.1 Các loại gốc tự do (ROS) 5

1.3.2 Các loại gốc tự do (RNS) 7

1.4 Tác hại của gốc tự do 8

2 Hoạt tính chống oxi hóa 11

2.1 Hoạt chất chống oxy hóa 11

2.1.1 Khái niệm 11

2.1.2 Cơ chế của chất chống oxi hóa 11

2.1.3 Phân loại chất chống oxy hóa (antioxidant) 11

2.1.4 Phân loại chất chống oxi hóa trong thực phẩm 13

2.2 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa 13

2.2.1 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH 13

2.2.2 Phương pháp thu hoạt tính ức chế gốc tự do NO 16

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 18

2.2.4 Phương pháp đo MDA 20

2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng trong các dịch trích từ thực vật 21

2.2.6 Phương pháp ORAC 22

2.2.7 Phương pháp FRAP 25

2.2.8 Phương pháp TRAP 25

Tài liệu tham khảo 26

LỜI MỞ ĐẦU

Như chúng ta đã biết: Oxy là một phần tử bắt buộc đối với cuộc sống, các hệ thống sống đã tiến hóa để tồn tại trong sự hiện diện của phân tử oxy và đối với hầu hết các hệ thống sinh học Tính chất oxy hóa của oxy đóng một vai trò quan trọng trong hiện tượng đadạng sinh học Oxy có tính hai lưỡi, là phần thiết yếu cho cuộc sống; nó cũng có thể làm trầm trọng thêm những thiệt hại bên trong các tế bào bằng sự kiện oxy hóa Các gốc tự do hay nói chính xác hơn là các chất hoạt động chứa oxy(reactive oxygen species-ROS) là cácdẫn xuất dạng khử của oxy Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm cho con người

Khoảng vài chục năm về đây, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxihóa ngày càng được chú trọng nhiều trong ngành Y, Dược và Sinh học

Gốc tự do gia tăng quá mức là nguyên nhân phát sinh bệnh tật hiện có hơn 60 loại bệnh ở người có liên quan đến gốc tự do Nhiều loại thuốc là các chất chống oxi hóa có khảnăng loại bỏ các gốc tự do đang được dùng để dự phòng và điều trị các bệnh viêm nhiễm, bệnh tim mạch, ung thư, lão hóa…

Theo tiến sĩ Bruce Ames của Đại học Berkley, California thì mỗi tế bào đơn lẻ của cơ thể mỗi ngày phải chịu khoảng 10.000 cú tấn công Rất nhiều cuộc tấn công trong số

này nhắm vào các DNA, việc này đưa đến một trong những hậu quả là làm gia tăng tốc độ biến đổi của gen, từ đó dẫn đến sự biến đổi tế bào và gây nguy cơ ung thư

Ngoài ra, màng tế bào, protein và mỡ cũng bị các gốc tự do bắn phá và gây tổn hại.Gốc tự do rất nguy hiểm vì thế để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống ôxi hóa bổ sung như vitamin A, vitamin C, vitamin E, polyphenol,… Chất chống oxi hóa là một loại phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng Chất chống oxi hóalàm giảm tác dụng của cách quá trình oxi hóa nguy hiểm bằng cách liên kết với nhau với các phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt của chúng

Nhận thấy sự nguy hiểm của các gốc tự do và để hiểu rõ hơn về nó nhóm em sẽ nghiên cứu đề tài: ‘‘Các gốc tự do, nguyên nhân sinh ra gốc tự do và các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa’’ Với những hiểu biết còn hạn chế nên trong quá trình làm tiểu luận không tránh khỏi những sai sót thế nên nhóm em rất mong nhận được sự thông cảm cũngnhư những góp ý của Thầy để có thể tốt hơn trong quá trình học tập

1 Gốc tự do

1.1 Định nghĩa:

Gốc tự do là các nguyên tử, phân tử hoặc ion có các điện tử lẻ đôi ở vòng ngoài nênmang điện tích âm và có khả năng ôxy hóa các tế bào, các phân tử, nguyên tử khác Các gốc tự do có thể liên quan đến nhiều phản ứng trong các mô sống với vai trò như những chất trung gian có hoạt tính mạnh trong thời gian ngắn, ví dụ như trong hiện tượng quang hợp

Do bị mất điện tử nên gốc tự do rất không ổn định và luôn có xu hướng chiếm đoạt

điện tử từ các cấu trúc lân cận, tạo ra hàng loạt gốc tự do mới Quá trình này diễn ra theo

phản ứng dây chuyền, gây tổn thương màng tế bào, các phân tử protein và ngay cả ADN Hậu quả là xuất hiện những biến đổi làm tổn hại, rối loạn chức năng, thậm chí gây chết tế bào.(1)

Mỗi ngày một tế bào phải hứng chịu 10.000 đợt tấn công của các gốc tự do Và trong suốt 70 năm cuộc đời, chúng ta sẽ phải liên tục chống chọi với 17 tấn gốc tự do

1.2 Nguyên nhân sinh ra gốc tự do:

Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH. , O2.-, NO. ,…) như tia UV, bức xạ ion hóa,

ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là

nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch…Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống ôxi hóa bổ sung như Vitamin A, vitamin C, vitamin E, polyphenol,…

Gốc tự do hình thành từ hai nguồn, đó là nguồn nội sinh và nguồn ngoại sinh.(2,3)+ Ở nguồn nội sinh, gốc tự do hình thành:

- Từ chuỗi chuyền điện tử trong ty thể (các phản ứng phosphoryl oxy hóa của

mitochondria): superoxide anion (O2●), peroxynitrate (ONO-), hydrogen peroxide (H2O2), gốc hydroxyl (●OH)

- Từ hoạt động hô hấp của leucocyte, gốc tự do hình thành để giết vi khuẩn

- Từ quá trình tự chết của tế bào (apoptosis): bằng in vitro, người ta thấy chất oxy

hóa nội sinh AXO có thể ngăn trở apoptosis

+ Ở nguồn ngoại sinh, gốc tự do hình thành từ khí ozone, bức xạ tử ngoại, khói thuốc lá.(3)

1.3 Các loại gốc tự do

1.3.1 Các loại gốc tự do (ROS)

ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của cơ thể và đóng vai trò quan trọng trong liên lạc tế bào và cân bằng nội môi Tuy nhiên, trong thời gian bị tác động stress từ môi trường (như UV hay tiếp xúc với nhiệt độ cao,…), nồng độ ROS có thể tăng lên 1 cách đột ngột Nó có thể làm tổn thương các cấu trúc của tế bào Đó được gọi là stress do oxi hóa (oxidative stress) ROS ngoại sinh cũng có thể được tạo thành do các bức xạ ion hóa.(4)

* ROS ngoại sinh.

ROS ngoại sinh có thể được tạo ra từ chất ô nhiễm, thuốc lá, khói bụi, các chất độc hóa học hoặc phóng xạ

Các phóng xạ ion hóa có thể phản ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tứccho sinh vật, một quá trình được gọi là sự phân ly do phóng xạ Vì nước chiếm tới 55-60%

cơ thể nên khả năng xảy ra sự phân ly do phóng xạ là rất cao trong trường hợp có sự hiện diện của các phóng xạ ion hóa Trong quá trình này, nước bị mất một electron và trở nên rất hoạt động Và sau đó một chuỗi phản ứng 3 bước, nước được chuyển thành gốc

hydroxy (-OH), hydrogen peroxide (H2O2), gốc superoxide (O2-) và oxygen phân tử (O2) Gốc hydroxy rất hoạt động, có thể di chuyển electron ở bất kì phân tử nào nằm trên đường

đi của nó, chuyển phân tử này thành gốc tự do và vì vậy hoạt hóa một chuỗi phản ứng tiếp tục nhưng hydrogen peroxide thì nguy hiểm với DNA hơn là gốc hydroxy vì khả năng hoạt động thấp hơn của nó cho phép nó có đủ thời gian để cho phân tử di chuyển vào nhân,rồi sau đó tiến hành phá hủy các đại phân tư như DNA.(5)

* ROS nội sinh.

ROS nội bào được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau, các nguồn chính gồm có ti thể, peroxisome, hệ võng nội bào và phức hợp NADPH oxidase (NOX) ở màng tế bào Ti thể sản xuất năng lượng cho tế bào, adenosine triphotphate (ATP) Quá trình sản xuất ATP gọi là sự phosphorin hóa oxide hóa, gồm có chuỗi vận chuyển proton (ion hydrogen) xuyênmàng ti thể, gọi là chuỗi truyền electron Trong chuỗi vận chuyển electron, electron được truyền qua một chuỗi các protein thông qua các phản ứng oxi hóa – khử mà mỗi chất nhận sau lại có tình khử lớn hơn chất trước Chất nhận electron cuối cùng là oxygen Trong điều kiện bình thường, oxigen bị khử để tạo thành nước; tuy nhiên, vẫn có 1 tỉ lệ nhỏ từ 0,1% – 2% electron vượt qua được chuỗi truyền điện tử (con số này dựa vào kết quả nghiên cứu trên những ti thể độc lập và cũng xem như là tỉ lệ trên cơ thể sống), oxygen bị khử không hoàn toàn và tạo thành gốc superoxide tự do (·O2-), được đề cập đầy đủ ở phức hợp I và phức hợp III Superoxide không thể tự nó hoạt hóa, nhưng có thể bất hoạt các men đặc hiệuhoặc bắt đầu quá trình lipid peroxidation ở dạng hoạt động của nó, HO2· pKa của

hydroperoxyl là 4.8, vì vậy, trong điều kiện sinh lí bình thường, dạng tồn tại chính của nó

là superoxide

Nếu có quá nhiều tổn thương ở ti thể, tế bào sẽ đi vào quá trình tự chết Protein

Bcl-2 nằm trên bề mặt của ti thể, phát hiện tổn thương và hoạt hóa một nhóm các protein có têngọi chung là Bax nằm sâu trong màng ti thể, gây tiết ra chytochrome C chất này sẽ gắn vớiApaf-1, hay apoptotic protease activating factor-1, một chất tự do trong bào tương Sử

dụng năng lượng từ ATP của ti thể, cytochrome C và Apaf-1 kết hợp với nhau tạo thành apoptosome Apotosome tiếp tục gắn với một protein tự do trong bào tương khác là

capase-9 Capase-9 sẽ đâm xuyên qua protein màng của ti thể, phá vỡ chúng và bắt đầu chuỗi phản ứng gây biến tính protein và cuối cùng là sự thực bào.(5)

1.3.2 Các loại gốc tự do (RNS):

NO• là một phân tử nhỏ có chứa một electron lẻ trên antibonding 2π *y quỹ đạo và, do

đó, nó là một gốc tự do NO• được tạo ra đặc biệt trong các mô sinh học bởi synthases oxit nitric (NOSs), trong đó chuyển hóa arginine thành citrulline với sự hình thành của NO• qua một phản ứng oxy hóa năm electron(6) Nitric oxide (NO•) là một phản ứng cực đoan hoạt động như một phân tử oxy hóa sinh học quan trọng báo hiệu phân tử có trong một lượng lớn các quá trình sinh lý khác nhau, bao gồm cả truyền dẫn thần kinh, điều chỉnh huyết áp, cơ chế bảo vệ, thư giãn cơ trơn và sự điều chỉnh miễn dịch(7) Do tính chất đặc biệt của nó, trong năm

1992, NO• đã được đánh giá là "phân tử của năm" bởi Tạp chí Khoa học(8)

NO• có chu kỳ bán rã của chỉ một vài giây trong môi trường nước NO• có độ ổn định trong môi trường có nồng độ oxy thấp (halflife > 15 s) Tuy nhiên, kể từ khi nó được hòa tan trong dung dịch nước và môi trường lipid, nó dễ dàng khuyếch tán qua các tế bào chất và màng plasma(9) NO• có tác dụng dẫn truyền thần kinh cũng như sự mềm dẻo của khớp thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ương Trong môi trường ngoại bào, NO• phản ứng với ôxy và nước để tạo thành nitrat và anion nitrit

Việc sản xuất quá mức các loài nitơ phản ứng được gọi là căng thẳng nitrosative(10) Điều này có thể xảy ra khi các thế hệ của các phản ứng loài nitơ trong một hệ thống lớn hơn của hệ thống về khả năng trung hòa và loại bỏ chúng Căng thẳng Nitrosative có thể dẫn đến các phản ứng nitrosylation làm thay đổi cấu trúc của protein và do đó ức chế chức năng bình thường của protein

Các tế bào của hệ thống miễn dịch sản xuất cả các superoxide anion và oxit nitric trong

sự bùng nổ oxy hóa kích hoạt trong suốt quá trình viêm Theo các điều kiện, oxit nitric và các anion superoxide có thể phản ứng với nhau để tạo ra một lượng đáng kể của một lượng lớn phân tử oxi hóa hoạt động, anion peroxynitrite (ONOO-), đó là một chất oxy hóa mạnh, có thểgây ra sự phân mảnh DNA và oxy hóa lipid(11):

NO• + O2•- → ONOO-

Phản ứng có một trong các hằng số tốc độ cao nhất được biết đến cho phản ứng của

NO•, 7.0 × 109M-1 s-1 Như vậy độc tính NO• là chủ yếu liên quan tới khả năng kết hợp với các anion superoxide Nitric oxide dễ dàng liên kết với một số kim loại chuyển tiếp ion; trong thực tế, nhiều hiệu ứng sinh lý của NO• có tác dụng như là một kết quả của sự liên kết ban đầu với Fe2+ - nhóm Haem trong cyclase enzyme hòa tan guanylate (SGC) (12)

Fe2+{sGC} + NO• → Fe2+{sGC}–NO

1.4 Tác hại của gốc tự do.

Các gốc tự do có thể tấn công vào cơ thể vào mọi lúc Dược sĩ Bruce Ames, Đại học California, đã ước lượng mỗi tế bào trong cơ thể chúng ta phải hứng chịu khoảng

10.000 gốc tự do tấn công mỗi ngày Trải qua 70 năm cuộc đời, cơ thể hình thành ước

chừng đến 17 tấn gốc tự do Rất nhiều trong số đó nhắm vào DNA (deoxyribonucleic acid)

và các chất liệu di truỵền Một trong những hậu quả là làm tăng tỷ lệ đột biến Người già

có tỷ lệ đột biến cao gấp 9 lần so với trẻ nhỏ Chính những những đột biến này làm tăng tỷ

lệ ung thư Thêm vào đó, các gốc tự do có thể gây ra tổn thương cho tất cả các chất liệu và

mô trong cơ thể như màng tế bào, protein và mỡ Mô mỡ là nơi bị tổn thương sớm nhất và thường gặp nhất, vì đó là loại mô rất dễ bị oxy hóa Các chuyên gia dùng thuật ngữ “sự peroxide hóa Lipid” để mô tả sự oxy hóa của mỡ trong cơ thể Sự peroxide hóa lipid làm khởi phát một chuỗi phản ứng liên tục trên các chất mỡ và chỉ có thể bị chặn đứng bởi một chất chống oxy hóa

Các gốc tự do còn gây tổn hại cho các acid nucleic cơ bản (adenine, thymine, guanine và cytosine), là những thành phần cơ bản cấu trúc DNA Tổn thương này làm DNA sao mã không chính xác theo các thông tin sinh học – và tế bào ung thư được hình thành Gốc tự

do còn làm tổn thương protein, dẫn đến sự rối loạn chức năng của nhiều cơ quan trong cơ thể Ví dụ như, các protein collagen ở da, gây tổn hại da; hay các enzyme (bản chất là

protein) bị tổn thương sẽ không hoạt động hiệu quả để xúc tác các phản ứng sinh hóa trong

cơ thể Các enzyme sẽ không được sửa chữa phục hồi vì nồng độ các gốc tự do cao, vòng xoắn bệnh lý này dần dần làm cơ thể lão hóa nhanh hơn và có thể tạo ung thư

Bình thường, tế bào có thể tự chống lại ROS bằng các emzyme như

α-1-microglobulin, superoxide dismutases, catalases, lactoperoxidases, glutathione

peroxidases và peroxiredoxins Một số phân tử nhỏ như ascorbic acid (vitamin

C), tocopherol (vitamin E), uric acid, và glutathione cũng đóng vai trò quan trọng trong chống oxi hóa trong tế bào Tương tự, chất chống oxy hóa polyphennol cũng giúp chống lại ROS bằng cách thanh lọc các gốc tự do Ngược lại, khả năng của các chất chống oxi hóa ở ngoại bào lại rất hạn chế, ví dụ chất chống oxi hóa quan trọng nhất trong huyết tương

là acid uric

Vai trò của ROS được đề cập đến trong rất nhiều tài liệu, không chỉ liên quan đến

sự chết theo chương trình của tế bào mà còn tạo ra các kháng thể trong cơ thể và khởi độngcác bơm ion Điều này làm ROS trở thành 1 chất kiểm soát chức năng của tế bào Đặc biệt,các tiểu cầu tham gia vào việc làm lành vết thương và duy trì cân bằng của máu tiết ra ROS

để tạo thêm các tiểu cầu mới tại vị trí vết thương Chúng cũng nói lên sự liên quan đến các đáp ứng miễn dịch thông qua việc tạo mới thêm các bạch cầu

ROS cũng liên quan đến các hoạt động của tế bào trước mỗi đáp ứng viêm khác nhau, bao gồm cả các bệnh lí tim mạch Chúng cũng có thể liên quan đến việc suy giảm chức năng nghe thông qua tổn thương ốc tai gây ra bởi tăng tần số âm thanh, trong sử dụngcác thuốc gây độc lên tai như cisplatin, và trong tật điếc bẩm sinh ở cả người và động vật ROS cũng có dính líu đến cơ chế gây chết tế bào theo chương trình cũng như tổn thương thiếu máu cục bộ, ví dụ như đột quỵ và đau tim

Gây tổn thương oxy hóa

Ở các sinh vật hiếu khí, năng lượng được tạo thành tại ti thể thông qua chuỗi truyềnelectron Để tạo thêm năng lượng, ROS được tạo thành, tuy nhiên đây là chất có khả năng

gây tổn thương tế bào, các cấu trúc DNA , RNA, protein và, trên cơ sở lí thuyết, nó góp phần gây nên sự lão hóa.

ROS được tạo thành như là 1 sản phẩm của chuyển hóa trong tế bào Tuy nhiên nó lại là nguyên nhân chính gây ra các tổn thương, và tác nhân chính thường là H2O2, được tạothành từ superoxide của ti thể Catalase và superoxide dismutase có thể làm giảm khả năng gây tổn thương của ROS bằng cách đưa chúng về lại những phân tử cấu thành ban đầu là nước, oxygen và hydrogen Tuy nhiên, như những phản ứng khác, hiệu suất không bao giờ đạt 100% và phần superoxide dư vẫn tồn tại trong tế bào Nếu ROS được tạo thành như là

1 sản phẩm chuyển hóa bình thường, thì sự tích tụ 1 lượng lớn có khả năng gây độc Suy giảm trí nhớ, biểu hiện trong bệnh được tìm thấy ở người cao tuổi – Alzheimer – có liên quan đến sự tích tụ các tổn thương oxi hóa Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự tích tụ ROS gây nên sự lão hóa Đặc biệt, sự tích tụ các tổn thương oxy hóa có thể gây nên sự suy giảm khả năng nhận thức, lí thuyết này được chứng minh thông qua thí nghiệm trên những con chuột già được tiêm các chất chuyển hóa từ ti thể sau đó kiểm tra về nhận thức của chúng Kết quả cho thấy nhận thức của chúng cải thiện tốt hơn sau khi được tiêm, gợi ý rằng các chất chuyển hóa làm giảm tổn thương oxi hóa và cải thiện chức năng ti thể Sự tích tụ các tổn thương oxi hóa làm suy giảm chức năng của ti thể và làm tăng thêm tốc độ sản sinh của ROS trong tế bào Sự tích tụ các tổn thương oxi hóa và những liên quan đến lão hóa của nó còn tùy thuộc vào từng loại mô khác nhau Một vài kết quả thí nghiệm khác cho thấy sự tích tụ các tồn thương oxi hóa là nguyên nhân của suy giảm chức năng não theo tuổi Những con chuột nhảy già thì có hàm lượng protein bị oxi hóa cao hơn những con trẻ Điều trị những con chuột với hợp chất spin trapping (từ này dịch ra là bẫy quay, nhưng mình chưa nghe thấy bao giờ nên không dám dịch bừa) cho thấy những con chuột già có đáp ứng, đó là sự giảm của nồng độ protein bị oxi hóa trong khi các con chuột trẻ thìlại không Thêm nữa, những con chuột già có kết quả đo nhận thức tốt hơn và kết quả đó giảm xuống ngay khi dừng điều trị, nồng độ các protein bị oxi hóa tăng trở lại Kết quả này đưa đến một kết luận rằng sự oxi hóa trong tế bào có liên quan mật thiết đến chưc năngcủa não bộ (Carney, 1991)(13)

Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60

bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh vữa xơ động mạch, ung thư, Alzheimer,

Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan

Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại Đôi khi chúng cũng có một vài hành động hữu ích Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể; tạo ra chất mầu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt

2 Hoạt tính chống oxi hóa

2.1 Hoạt chất chống oxy hóa

2.1.1 Khái niệm

Chất chống oxi hóa là một loại phụ gia giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxihóa chất khác Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự

do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng

Chất chống oxi hóa làm giảm tác dụng của cách quá trình oxi hóa nguy hiểm bằng cách liên kết với nhau với các phân tử có hại, giảm sức mạnh hủy diệt của chúng

Bất kỳ chất nào ngăn ngừa hay làm chậm sự oxi hóa đều được gọi là chất chống oxihóa.(14)

2.1.2 Cơ chế của chất chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa là chất dinh dưỡng, có thể làm sạch các gốc tự do bằng các đưa lên một electron Khi một phân tử gốc tự do nhận thêm một electron từ một phân tử chống oxi hóa, các gốc tự do trở nên ổn định và không còn khả năng gây hại

Ngoài ra, chất chống oxi hóa còn giúp hạn chế sự phân hủy của các

hydroperoxide(14)

2.1.3. Phân loại chất chống oxy hóa (antioxidant) (15)

Chất chống oxy hóa là một phân tử có khả năng làm chậm hay ngăn ngừa sự oxy hóa những phân tử khác Oxy hóa là phản ứng giữa một phân tử với oxy, hoặc bất cứ khi nào một phân tử mất một điện tử trong phản ứng hóa học Những phản ứng oxy hóa có thể sản sinh các gốc tự do và khởi động những phản ứng liên hoàn gây tổn hại tế bào Các chấtchống oxy hóa ngăn chặn các phản ứng liên hoàn này bằng cách tách các gốc tự do và ức chế những phản ứng oxy hóa khác

Chất chống oxy hóa được xếp thành hai nhóm, nhóm hòa tan trong nước và nhóm hòa tan trong lipid Nói chung nhóm hòa tan trong nước phản ứng với các chất oxy

hóa trong tế bào chất, trong huyết tương, trong khi đó nhóm hòa tan trong lipid thì bảo vệ

màng tế bào không bị peroxide hóa Các chất chống oxy hóa có thể được tổng hợp trong cơthể hay nhận từ thực phẩm.

Các chất chống oxy hóa bao gồm:

+ Vitamin A, D, E, C

+ Các coenzyme như coenzyme Q10 (CoQ10) và các chất khoáng dưới dạng các metalloenzyme như superoxide dismutase (SOD) chứa Mn, catalase chứa Fe, glutathion peroxidase chứa Se…

+ Các carotenoid như α-carotene, β- carotene, lutein, canthaxanthin, zeaxanthin, lycopene…

+ Các flavonoid polyphenolic như flavone (apigenin, luteolin, tangeritin), flavonol (isohamnetin, kaemferol, quercetin, rutin…), isoflavone phytoestrogen (daizein, genistein, glycitein), các phenolic acid và ester của chúng (acid chicoric, acid cinamic, acid gallic…),các phenolic nonflavonoid (như curcumin, flavonolignan…), các chất chống oxy hóa hữu

cơ (như bilirubin, acid citric, acid oxalic…)

+ Các hormone như melatonin

+ Các chất chống oxy hóa tổng hợp như BHT, BHA, Ethoxyquin.

Các chất chống oxy hóa thấy trong thực phẩm như vitamin C có nhiều trong rau, quả; vitamin E có nhiều trong dầu thực vật, các polyphenolic acid có nhiều trong trà, café,

đỗ tương, dầu olive, chocolate, vang đỏ, quế, các carotenoid có nhiều trong rau quả và

trứng…

Các chất chống oxy hóa có tác động “hiệp đồng” Tác động “hiệp đồng” có nghĩa làtác động phối hợp của nhiều chất chất chống oxy hóa, phối hợp lại thì mạnh hơn là ở dạng đơn lẻ Một cầu thủ siêu sao không tạo nên sức mạnh của cả đội bóng

Như vậy dùng phối hợp nhiều loại thực phẩm trong bữa ăn, đặc biệt sử dụng nhiều

loại rau quả có tác dụng cung cấp nhiều loại chất chống oxy hóa khác nhau (Các gia vị như hạt tiêu, ớt, nghệ, tỏi… hay thảo dược như húng, thì là, kinh giới…cũng giầu các chất chống oxy hóa, nhưng số lượng dùng trong bữa ăn rất ít cho nên không phát huy được tác dụng).

Các chất chống oxy hóa có vai trò quét các gốc tự do bắn phá tế bào, nhờ đó ngăn chặn được sự tổn hại của tế bào Để minh họa cho cơ chế này hãy xem các phản ứng trung hòa gốc tự do peroxide (H2O2) của enzyme superoxide peroxidase (SODs) catalase và

glutathion peroxidase (GPx):

SODs xúc tác phân giải anion superoxide thành oxy và hydrogen peroxide (H2O2), catalase xúc tác phân giải H2O2 thành nước và oxy, GPx cũng phân giải H2O2 thành nước

(có hai loại superoxide dismutase, một trong ty thể chứa Mn, một trong tế bào chất chứa

Cu và Zn; catalase chứa Fe và glutathione peroxidase chứa Se; các nguyên tố Fe, Cu, Mn,

Nhờ hoạt động của hệ thống các chất chống oxy hóa trong cơ thể mà nhiều bệnh tậtđược ngăn ngừa như bệnh tim mạch (xơ vữa động mạch, suy tim, nhồi máu cơ tim, cao huyết áp ), các bệnh ung thư, các bệnh về mắt (thoái hóa hoàng điểm và đục thủy tinh thể), lão hóa (15)

2.1.4 Phân loại chất chống oxi hóa trong thực phẩm

Hiện nay các chất chống oxi hóa được sử dụng trong hàng ngàn loại thực phẩm

khác nhau Các chất chống oxi hóa thực phẩm dựa trên hai dạng cơ bản sau:

+ Các chất chống oxi hóa có bản chất acid (bao gồm cả các muối và ester của

chúng) Ví dụ: acid ascorbic, acid citric

+ Các hợp chất gốc phenolic (cả tự nhiên lẫn tổng hợp) Ví dụ: BHA, tocopherol

(15)

2.2 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa

DPPH(16,17,18,19,20)Nguyên tắc:

Các chất có khả năng kháng oxy hoá sẽ trung hoà gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cự đại và màu của dung dịnh phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển

) 30 (

) 30 ( )

30 ( )

0

A

A A

A

phút control

phút blank phút

sample phút

) 30 ( )

30 (

x A

A A

phút control

phút blank phút

Acontrol(0 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng ngay sau khi pha chế

Acontrol(30 phút) = độ hấp thu của mẫu đối chứng sau 30 phút ủ

Asample(30 phút) = độ hấp thu của mẫu thí nghiệm sau 30 phút ủ

Ablank(30 phút) = độ hấp thu của mẫu trắng sau 30 phút ủ

Lượng mẫu cần thiết để phản ứng với một nửa lượng DPPH (hay độ hấp thu 50%) được gọi là lượng tương đối Trolox phản ứng Khi đó, hoạt tính chống oxi hóa của mẫu có

thể diễn tả bằng thuật ngữ là số micromole bằng Trolox/100g mẫu hay đơn vị Trolox/100g hay TE/100g (TE: trolox equivalent) hay IC50 (17)

Cách 2: Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau :

DPPH (%) = 100 × (ACT - ASP)/ACT

Trong đó:

ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết

ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết

Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc

tự do DPPH ở điều kiện xác định Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao

Cách 3: Khả năng chốngoxy hóa căn bản DPPH đã được tính toán bằng cách sử dụng

phương trình sau đây:

Ảnh hưởng chống oxy (%) = [1 - (Amẫu– Amẫu rỗng) / Akiểm soát] x 100

Ta có A kiểm soát là độ hấp thụ của các chất kiểm soát (dung dịch DPPH không mẫu),A mẫu là độ hấp thụ của mẫu thử nghiệm (DPPH dung dịch cộng với mẫu thử), và A mẫu rỗng

là độ hấpthụ của mẫu (mẫu mà không có dung dịch DPPH)

Cách 4: % ức chế gốc DPPH của các mẫu thực vật được tính toán theo công thức của Yen và Dul (1994) :

% Ức chế DPPH = [(AC(0) – AA(t))/AC(0)]x100

AC(0) là độ hấp thu của dung dịch DPPH ở thời điểm t = 0 phút

AA (t) là độ hấp thu của mẫu thử nghiệm ở thời t = 16 min.

Để xác định giá trị IC50, mỗi mẫu thử được pha thành 6 nồng độ: 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25 mg/ml; 0,125 mg/ml; 0,0625 mg/ml và 0,03125 mg/ml Giá trị IC50 của các mẫu được tính bởi phương pháp hồi qui tuyến tính của đồ thị biểu diễn phần trăm loại gốc tự do DPPH tương ứng với mỗi nồng độ của mẫu thử

a Chuẩn bị dịch chiết và hóa chất

Hóa chất: Dung dịnh DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ).

Dịch chiết: Khi tiến hành nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau thì có lượng mẫu

khác nhau, trung bình từ 1,5 -2 kg Từ nguồn mẫu lớn lấy ngẫu nhiên 3 mẫu nhỏ từ

nguyên liệu Quá trình chiết được thực hiện trên mỗi mẫu nhỏ, dịch chiết từ mỗi mẫu nhỏđược phân tích lặp lại ít nhất 2 – 3 lần Kết quả báo cáo cuối cùng là giá trị trung bình từ các mẫu nhỏ dùng để đánh giá kết quả cho mẫu lớn Trong quá trình chiết, nước được sử