Xây dựng phương pháp và khảo sát hàm lượng chì trong một số mẫu dược liệu tại hà nội bằng kỹ thuật AAS

Xây dựng quy trình định lượng chì trong dược liệu bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa và thẩm định phương pháp vừa xây dựng.. Dược động học của chì trong cơ thể [3,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

1 ThS Nguyễn Trung Hiếu

2 ThS Nguyễn Thị Thanh Phương

Nơi thực hiện:

Phòng Độc chất - Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Mỹ phẩm Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô và nhà trường đã dạy dỗ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, song trong thời gian ngắn ngủi thực hiện đề tài, chắc chắn không tránh khỏi những sai sót và hạn chế Kính mong nhận được sự chia sẻ và những ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Phạm Thị Chính

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ ……… 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ………3

1.1 Tính chất của chì 3

1.1.1 Đặc tính nguyên tử của nguyên tố chì 3

1.1.2 Tính chất lý hóa của chì 3

1.1.3 Các hợp chất của chì 4

1.2 Độc tính của chì 5

1.2.1 Đường xâm nhập 5

1.2.2 Dược động học của chì trong cơ thể 6

1.2.3 Độc tính của chì đối với con người 7

1.2.4 Điều trị 8

1.3 Các phương pháp xác định chì 9

1.3.1 Phương pháp cực phổ 9

1.3.2 Phương pháp Von-Ampe hòa tan 9

1.3.3 Phương pháp đo quang 10

1.3.4 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử … 10

1.4 Kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử 11

1.4.1 Cơ sở lý thuyết 11

1.4.2 Kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử 13

1.4.3 Trang thiết bị của phép đo 13

1.5 Phương pháp xử lý mẫu phân tích xác định Pb 15

1.5.1 Phương pháp xử lý ướt 15

1.5.2 Phương pháp xử lý khô 15

1.5.3 Phương pháp xử lý khô - ướt kết hợp 16

1.5.4 Phương pháp xử lý bằng lò vi sóng 17

1.5.5 Phương pháp chiết 17

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ 18

2.2.1 Nguyên liệu, hóa chất 18

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 18

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.4.Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 19

2.4.3 Kết quả thu được xử lý thống kê 20

3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHÌ TRONG

DƯỢC LIỆU 23

3.1.1.Xử lý dụng cụ 23

3.1.2 Lựa chọn các thông số hoạt động của máy quang phổ 23

3.1.3 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu 25

3.1.3.1 Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô cơ hóa ướt 25

3.1.3.2 Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng……….………26

3.1.3.3 So sánh hai kỹ thuật xử lý mẫu 27

3.1.4 Xử lý các mẫu dược liệu bằng kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng ……….28

3.2.4.1 Xác định điều kiện vô cơ hóa mẫu 29

3.1.4.2 Xác định khối lượng dược liệu 29

3.1.4.3 Xác định tỷ lệ tác nhân vô cơ hóa mẫu 30

3.1.5 Quy trình định lượng chì trong dược liệu 31

3.2 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 32

3.2.1 Xây dựng khoảng tuyến tính 32

3.2.2 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp……… 33

3.2.3 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 34

3.2.4 Khảo sát độ đúng của phương pháp 35

3.2.5 Khảo sát độ ổn định hàm lượng chì trong dược liệu theo thời gian……… 36

3.3 ÁP DỤNG KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG CHÌ TRONG MỘT SỐ MẪU DƯỢC LIỆU TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI 38

BÀN LUẬN ………39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Hollow cathode lamp Electrodeless Discharge Lamp Limit of detection

Limit of quantanification Part per billion

Part per million

DANH MỤC CÁC BẢNG

số Bảng 1: Các mẫu dược liệu khảo sát hàm lượng chì 18 Bảng 2: Thông số làm việc của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử 23 Bảng 3: Chương trình nhiệt độ nguyên tử hóa được áp dụng 24 Bảng 4: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô cơ hóa

mẫu

30

Bảng 9: Độ hấp thụ quang của các dung dịch Pb chuẩn 32 Bảng 10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp với mẫu TT 34 Bảng 11: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp với mẫu CD 34 Bảng 12: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 36 Bảng 13: Kết quả định lượng chì trong ngày đầu tiên trên mẫu TT 37 Bảng 14: Kết quả định lượng chì sau 1 tháng trên mẫu TT 37 Bảng 15: So sánh hai kết quả thực nghiệm 37 Bảng 16: Kết quả khảo sát hàm lượng chì trong một số mẫu dược

liệu trên địa bàn Hà Nội

38

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH VẼ

Đồ thị, hình vẽ Trang số Hình 1: Cấu trúc tinh thể của chì 3 Hình 2: Cơ chế hấp thu và đào thải chì ra khỏi cơ thể 7 Hình 3: Cấu tạo của máy quang phổ AAS 14 Hình 4: Phổ hấp thụ của một số dung dịch chì chuẩn 24 Hình 5: Phổ hấp thụ nguyên tử khảo sát tỷ lệ tác nhân vô cơ hóa 30 Hình 6: Quy trình định lượng chì trong dược liệu bằng kỹ thuật

quang phổ hấp thụ nguyên tử

31

Hình 7: Đồ thị khoảng tuyến tính của chì 33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở nước ta, từ thời xa xưa, con người đã biết đến tác dụng chữa bệnh của cây cỏ, thực vật Trong những năm gần đây, con người có xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu để phòng ngừa bệnh tật và chăm sóc sức khỏe, vì nó được cho là ít độc hại và ít tác dụng phụ Tuy nhiên, hiện nay, một phần vì sự ô nhiễm môi trường, ô nhiễm nguồn nước, đất đai ngày càng tăng lên, phần khác do lợi nhuận kinh tế nên chất lượng các loại dược liệu có ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người do nhiễm các chất độc kim loại nặng như Pb, Cd, As…

Độc tính của chì được ghi nhận từ năm 200 TCN Ngay từ thời La Mã cổ đại, hội chứng nhiễm độc chì đã xảy ra và bùng phát ở không ít nơi trên Thế giới như Đức, Hy Lạp…[3] Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), nhiễm độc chì là một trong những vấn đề về sức khỏe cộng đồng đáng báo động, nó gây

ra những hậu quả rất nghiêm trọng về sức khỏe, đặc biệt là đối với trẻ em Thống kê của WHO cho thấy khoảng 600,000 các ca chậm phát triển hàng năm ở trẻ em đều do nhiễm độc chì[24] Đến đầu thế kỷ 20, độc tính của chì đối với trẻ em đã trở thành xu hướng nghiên cứu trên Thế giới[3] Tại Việt Nam, ngộ độc chì do hấp thu qua đường tiêu hóa hay gặp do uống các loại thuốc cam, đặc biệt là các thuốc không rõ nguồn gốc Từ cuối năm 2011 trở lại đây, số trẻ bị nhiễm độc chì do dùng thuốc cam liên tục tăng lên Đa số các trường hợp nhập viện trong tình trạng hôn mê, co giật và đã có một số ca tử vong Do đó, công tác quản lý chất lượng dược liệu cần phải được giám sát chặt chẽ, cần xây dựng phương pháp tiêu chuẩn xác định các chỉ tiêu về độ an toàn như dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, kim loại nặng…từ đó, đưa ra giới hạn cho phép của các chỉ tiêu đó

Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng phương pháp

và khảo sát hàm lượng chì trong một số mẫu dược liệu tại Hà Nội bằng kỹ thuật AAS” với ba mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình định lượng chì trong dược liệu bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa và thẩm định phương pháp vừa xây dựng

2 Áp dụng quy trình xây dựng được để định lượng chì trong một số mẫu dược liệu tại Hà Nội

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tính chất của chì

1.1.1 Đặc tính nguyên tử của nguyên tố chì [8, 9, 15]

 Cấu hình electron: [Xe] 4f14 5d10 6s2 6p

 Trạng thái oxy hóa: Phổ biến nhất là +2

 Năng lượng ion hóa thứ nhất: 7.415 eV

 Cấu trúc tinh thể: Lập phương tâm diện

Chì không mùi, không vị, không hòa tan trong nước và không cháy

Chì có khả năng phản ứng với các acid mạnh như acid nitric đặc, acid sulfuric đặc, nóng, acid hydroclorid đặc nóng,…và bị ăn mòn bởi nước tinh khiết, các acid hữu cơ yếu trong môi trường có oxy

Chì có mật độ phân tử cao, hấp thụ tia X tốt Đồng thời, các đồng vị của chì là những đồng vị bền vững nhất trong dãy phóng xạ: sự phân rã liên tục của các nguyên tố trong dãy phóng xạ cuối cùng đều tạo thành đồng vị của chì

Hình 1: Cấu trúc tinh thể của chì

Chì có 18 đồng vị trong đó có 4 đồng vị bền: 208Pb (52.3%), 207Pb (22.6%), 206Pb (23.6%), 204Pb (1.48%), đồng vị phóng xạ bền nhất là 202Pb có chu kỳ bán hủy là 3.105 năm

 PbO2 là chất rắn màu nâu thẫm, khi đun nóng PbO2 mất dần oxy biến thành các oxit trong đó chì có số oxy hóa thấp hơn

 Pb3O4 hay còn gọi là minium, là hợp chất của Pb có số oxi hóa +2, +4

Nó là một chất bột màu đỏ da cam được dùng chủ yếu là để sản xuất thủy tinh pha lê, men đồ sứ và đồ sắt, làm chất màu cho sơn ( sơn trang trí và sơn bảo

vệ cho kim loại không bị rỉ)

 Ion Pb (II) có thể tạo nhiều phức với các hợp chất hữu cơ như Amoni Pyrilodyn Dithiocacbamat (APDC), điển hình là với Dithizon ở pH 8.5 – 9.5 tạo phức màu đỏ gạch

 Các đihalogenua chì (PbX2) đều là chất rắn không màu, trừ PbI2 màu vàng, tan ít trong nước lạnh nhưng tan nhiều trong nước nóng

 Các hợp chất Pb(II) có khả năng tạo phức với ion halogen, dạng [PbX]2 Sự tạo thành phức này giải thích khả năng dễ hòa tan của chì đihalogenua trong dung dịch đậm đặc của acid halogenhydric và muối của chúng

PbI2 + 2KI → K2[PbI]4

PbCl2 + 2HCl → H2[PbCl4]

1.2 Độc tính của chì

Trong đời sống hàng ngày chúng ta tiếp xúc nhiều với chì do nó được ứng dụng khá rộng rãi, đặc biệt trong các ngành công nghiệp Chì có mặt trong thực phẩm, dược phẩm, sơn nhà, đồ chơi trẻ em…Vì vậy, chì có khả năng xâm nhập vào cơ thể con người bất cứ lúc nào và gây ra những hậu quả nghiệm trọng cho sức khỏe con người, thậm chí có thể tử vong, đặc biệt là trẻ

em và phụ nữ có thai

1.2.1 Đường xâm nhập [3, 21]

 Đường hô hấp: Đây là con đường hấp thu chủ yếu do hít phải bụi và hơi chì trong không khí Sự xâm nhập qua đường hô hấp của chì phụ thuộc vào kích thước hạt bụi chì, vị trí được giữ lại trên đường hô hấp và tính tan của các hợp chất trong bụi chì Khoảng 30-50% lượng chì trong không khí do con người hít phải được lắng đọng trong phổi Sau đó, phần lớn bụi chì được hấp thụ và tiếp tục xâm nhập vào các bộ phận cơ thể người

 Đường tiêu hóa: Sự hấp thu của chì qua đường tiêu hóa khác nhau giữa các cá thể, phụ thuộc vào tuổi, thể chất, tình trạng dinh dưỡng của cơ thể,

tình trạng đường tiêu hóa Cơ thể người trưởng thành có khả năng hấp thu 5% hàm lượng chì có trong thức ăn hoặc nước uống Nó có thể tăng tới 50%-60% tùy thuộc vào trạng thái no hay đói của cơ thể Trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ là những đối tượng nhạy cảm với chì, khoảng 50% lượng chì có trong thức ăn và nước uống được cơ thể trẻ hấp thụ Chế độ ăn nghèo canxi, sắt, đồng, kẽm, photpho

sẽ làm tăng khả năng hấp thụ chì qua đường tiêu hóa

 Đường da: Chì thấm qua da và đi vào máu Khả năng hấp thu qua đường này không nhiều nhưng sẽ tăng lên nếu da bị trầy xước hay có thương tích

 Đường qua nhau thai: Sự thâm nhiễm chì qua nhau thai người xảy ra rất sớm từ tuần thứ 20 của thai kỳ và tiếp diễn suốt thời kỳ mang thai

1.2.2 Dược động học của chì trong cơ thể [3, 21]

Sau khi được hấp thu qua đường hô hấp và đường tiêu hóa, một lượng chì sẽ được chuyển vào máu và từ đó được phân bố tới nhiều bộ phận của cơ thể Tốc độ phân bố chì trong cơ thể không đều và phụ thuộc vào hướng phân

bố Chì được chuyển nhanh tới các mô mềm như cơ, não, đặc biệt là gan, thận

và sau đó được bài tiết qua phân, nước tiểu và mồ hôi Đối với người trưởng thành, khoảng 99% lượng chì hấp thụ vào trong cơ thể được thải ra ngoài qua con đường bài tiết, đối với trẻ em dưới 2 tuổi thì con số này chỉ là 30-40% Chì được chuyển đến các mô cứng như xương, răng, tóc, móng với tốc độ chậm, khoảng vài tuần Có tới 94% lượng chì vào cơ thể người trưởng thành

và 73% trong cơ thể trẻ em được tích lũy trong xương và răng

Hình 2: Cơ chế hấp thu và đào thải chì ra khỏi cơ thể

1.2.3 Độc tính của chì đối với con người [3, 13, 18, 21]

 Hệ tạo máu: Ức chế tổng hợp HEM, rối loạn tổng hợp globulin, sản sinh tế bào hồng cấu hạt kiềm, giảm tuổi thọ hồng cầu, gây thiếu máu, ảnh hưởng đến sự tổng hợp máu và phá vớ hồng cầu

 Hệ tiết niệu: Thận là cơ quan đào thải chì nhưng cũng là cơ quan hấp thu chì nhiều nhất, quá trình hấp thu kéo dài có thể gây suy thận

 Hệ enzyme: rối loạn hệ thống enzyme, nhất là enzyme nhóm hoạt động chứa sulfuahydro, ức chế một số enzyme trong quá trình tổng hợp máu

 Hệ thần kinh trung ương và ngoại biên:

 Trên hệ thần kinh trung ương: Tùy thuộc vào thời gian, mức độ tiếp xúc với chì và sự khác biệt giữa trẻ em và người lớn Tiếp xúc lâu dài có thể

bị giảm trí nhớ, giảm khả năng mắc bệnh não do chì, phù não, tồn thương tuần hoàn mạch dẫn đến tử vong

 Trên thần kinh ngoại vi: Chì phá hủy myelin gây rối loạn dẫn truyền, viêm dây thần kinh và giảm trương lực cơ hoặc liệt, biểu hiện ở nhóm cơ co duỗi, cơ delta, cơ ngửa dài

 Ngoài ra hệ thần kinh vận mạch cũng bị tổn thương: Co thắt mao mạch đầu ngón tay, rối loạn cảm giác đầu chi và đau dọc các dây thần kinh

 Hệ tiêu hóa: Ảnh hưởng đến gan, mật và gây các cơn đau bụng do chì

 Hệ tim mạch: Chì gây co mạch ngoại vi, các mạch nhỏ, gây xơ vữa động mạch và do đó chì gây tăng huyết áp, ảnh hưởng đến cơ tim và động mạch vành

 Trên xương: Biến đổi tủy, đau cơ, yếu cơ, đau khớp

 Đặc biệt đối với trẻ em, ngay cả việc tiếp xúc với chì ở nồng độ thấp cũng gây ra những tai hại nghiêm trọng trong quá trình phát triển của trẻ như trở ngại trong ngôn ngữ, thiếu sự tập trung, giảm trí thông minh, hạn chế sự phát triển của cơ và xương, lãng tai

 Phụ nữ có thai: Đây là đối tượng nhạy cảm nhất đối với những ảnh hưởng có hại của chì Bị nhiễm độc chì trong thời gian mang thai sẽ đe dọa đến tính mạng của người mẹ, kìm hãm sự phát triển của thai nhi, để lại những

di chứng cho đứa trẻ

1.2.4 Điều trị [1]

 Với ngộ độc cấp: Rửa dạ dày bằng dung dịch Natri sulfat hoặc Magie sulfat Cho uống thuốc chống độc kim loại nặng Có thể tiêm truyền tĩnh mạch dung dịch natri clorid đẳng trương có chứa CaNa2(EDTA)

 Với ngộ độc mạn tính: Trước hết cần tìm nguồn tiếp xúc để loại bỏ nguồn gốc và nguy cơ Bệnh nhân cần làm xét nghiệm trước khi dùng các

chất gắp: nồng độ chì trong máu, protoporphyrin, điện giải đồ máu, công thức máu, chức năng gan – thận, định lượng acid delta aminolevulinic nước tiểu, làm test gây tăng chì niệu Điều trị bằng chất gắp nếu nghiệm pháp gây tăng chì niệu dương tính và chức năng gan thận bình thường Sau 3 – 4 tuần cần làm lại nghiệm pháp gây tăng chì niệu để quyết định đợt điều trị tiếp theo hay không

1.3 Các phương pháp xác định chì

1.3.1 Phương pháp cực phổ [2, 7, 16]

Nguyên tắc: Dựa vào sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thế

trong quá trình điện phân dung dịch phân tích Giá trị của dòng khuếch tán giới hạn phụ thuộc vào nồng độ chất tham gia quá trình điện cực

Ưu điểm: Định lượng được dung dich đục, độ nhạy cao, xác định được

chất phân tích có nồng độ lớn hơn 10-6M

Nhược điểm: Máy móc phức tạp và độc do có kim loại thủy ngân

1.3.2 Phương pháp Von-Ampe hòa tan [2, 7, 16]

Nguyên tắc:

Giai đoạn 1: Làm giàu chất phân tích lên bề mặt cực đo dưới dạng một kết tủa nhờ điện phân chất phân tích ở một thế nhất định không đổi Eđp trong suốt quá trình điện phân Quá trình này được tiến hành trên máy cực phổ thông thường với điều kiện phù hợp với chất phân tích

Giai đoạn 2: Hòa tan kết tủa bằng phương pháp điện hóa hòa tan kết tủa, diễn ra ngược với giai đoan 1 Trên đường cong Von-Ampe xuất hiện pic của chất cần xác định Chiều cao hoặc diện tích pic trong điều kiện thích hợp tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích

Ưu điểm: Phương pháp có độ nhạy cao, xác định lượng vết với nồng độ

khoảng 10-6 _ 10-8 M với độ lặp lại và độ chính xác cao, cho phép xác định

được đồng thời 6 ion kim loại trong một dung dịch trong thời gian rất ngắn, dùng các chất hóa tan thông thường

Nhược điểm: Độ nhạy phụ thuộc vào độ sạch của dụng cụ, hóa chất và

môi trường làm viêc, điện cực làm việc, bình điện phân

1.3.3 Phương pháp đo quang [1, 2, 7, 16]

Nguyên tắc: Chất phân tích tác dụng với một thuốc thử trong một dung

môi thích hợp để tạo ra một hợp chất có phổ hấp thụ UV-VIS nhậy Chì có khả năng tạo phức với thuốc thử hữu cơ dithizon, phức này tan trong dung môi CCl4 có màu đỏ và có cực đại hấp thụ ở bước sóng 520nm

Ưu điểm: Khả năng áp dụng rộng, độ nhạy cao, giới hạn dò tìm trong

khoảng 10-4 – 10-5M, độ chính xác cao, dễ thao tác với các máy móc hiện đại

Nhược điểm: Độ chọn lọc không cao do dithizon có khả năng tạo phức

với nhiều kim loại

1.3.4 Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [2, 6, 7, 16, 19, 20, 22,

23]

Nguyên tắc: Trong điều kiện bình thường nguyên tử không thu và cũng

không phát năng lượng dưới dạng các bức xạ Lúc này nguyên tử ở trạng thái

cơ bản Đó là trạng thái bền vững và nghèo năng lượng nhất của nguyên tử Nhưng khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu ta chiếu một chùm sáng có những bước sóng phù hợp, thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ của nó Phổ này gọi là phổ hấp thụ của nguyên tử

 Do độ nhạy cao nên trong nhiều trường hợp không phải làm giàu nguyên tố Do đó, tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít hóa chất, thời gian, tránh được sự nhiễm bển mẫu khi xử lý qua các giai đoạn phức tạp

 Các động tác thực hiện nhẹ nhàng, kết quả phân tích được lưu lại trên thiết bị lưu giữ

 Kết quả phân tích rất ổn định, sai số nhỏ

Nhược điểm:

 Hệ thống máy đo AAS tương đối đắt tiền

 Môi trường phòng thí nghiệm phải không có bụi

 Cần người có chuyên môn kỹ thuật cao để bảo dưỡng, chăm sóc, cần cán bộ làm phân tích công cụ thành thạo để vận hành máy

 Chỉ cho biết thành phần nguyên tố mà không chỉ ra trạng thái liên kết của nguyên tố trong mẫu

Đối tượng và phạm vi áp dụng: Phân tích lượng nhỏ (lượng vết) các

kim loại trong các loại mẫu khác nhau của các chất vô cơ và hữu cơ Phương pháp phân tích này có thể định lượng được hầu hết các kim loại (khoảng 65 nguyên tố) và một số á kim đến giới hạn ppm bằng kỹ thuật F-AAS và đến giới hạn ppb bằng kỹ thuật ETA-AAS Ở nhiều nước trên thế giới, phương pháp phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử trở thành phương pháp tiêu chuẩn để định lượng nhiều kim loại

1.4 Kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử

1.4.1 Cơ sở lý thuyết [2, 6, 16, 22]

Cở sở của phân tích định lượng theo AAS là dựa vào mối quan hệ giữa cường độ của một vạch phổ hấp thụ của một nguyên tố phân tích và nồng độ của nó trong môi trường hấp thụ cũng tuân theo định luật hấp thụ quang Lamber-Beer:

A = Log = 2,303.Kv.N.L

Ở đây A là độ tắt nguyên tử của chùm tia sáng Io sau khi qua môi trường hấp thụ A phụ thuộc vào nồng độ nguyên tử N trong môi trường hấp thụ và bề dày L của lớp hấp thụ (bề dày chùm sáng đi qua)

Trong máy đo độ hấp thụ nguyên tử , L là không đổi nên cường độ của vạch hấp thụ là : A = k.N với k = 2,303.Kv.L

Lý thuyết và thực nghiệm chỉ ra rằng, nồng độ nguyên tử N có mối quan hệ với nồng độ C của nguyên tố phân tích theo công thức sau:

N = Cb 3.1012Trong đó:

F: Tốc độ dẫn mẫu vào hệ thống nguyên tử hóa mẫu (ml/phút)

W: Hiệu suất aerosol hóa mẫu

s: Hiệu suất nguyên tử hóa

n.Ro: Số phân tử khí ở nhiệt độ ban đầu, To (oK)

nT: Số phân tử khí ở nhiệt độ T của ngọn lửa nguyên tử hóa

Q: Tốc độ của dòng khí mang mẫu vào buồng aerosol hóa (lít/phút) Kết quả thực nghiệm cho thấy, trong một giới hạn nhất định của nồng

độ C, ta có mối quan hệ sau: N = Ka.Cb trong đó Ka là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào các điều kiện hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu; b là hằng số bản chất, phụ thuộc vào từng vạch phổ của từng nguyên tố, 0<b≤1

Kết hợp các mối quan hệ giữa A, N, C ta có: A=a.Cb trong đó a = k.Ka

được gọi là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào các yếu tố như trên

Phương trình A= a.C b được gọi là cơ sở của phép đo định lượng các nguyên tố theo phổ hấp thụ nguyên tử của nó

1.4.2 Kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử [2, 6, 16, 19, 20, 22]

Trong phép đo AAS người ta có thể tiến hành nguyên tử hóa mẫu theo

kỹ thuật ngọn lửa (F-AAS) hoặc không ngọn lửa (ETA-AAS)

 Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa: Theo kỹ thuật này,

người ta dùng năng lượng nhiệt của ngọn lửa đèn khí để hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu phân tích Vì thế mọi quá trình xảy ra trong khi nguyên tử hóa mẫu phụ thuộc vào các đặc trưng và tính chất của ngọn lửa đèn khí, nhưng chủ yếu

là nhiệt độ của ngọn lửa Đó là yếu tố quyết định hiệu suất nguyên tử hóa mẫu phân tích và mọi yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ của ngọn lửa đèn khí đều ảnh hưởng đến kết quả

 Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa: Kỹ thuật này ra đời sau

nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa nhưng phát triển rất nhanh và hiện nay được ứng dụng rất phổ biến vì kỹ thuật này có độ nhạy cao, có khi gấp hàng trăm lần phép đo trong ngọn lửa Quá trình nguyên tử hóa tức khắc trong thời gian rất ngắn nhờ năng lượng của dòng điện công suất lớn và trong môi trường khí trơ Quá trình nguyên tử hóa xảy ra theo ba giai đoạn kế tiếp nhau: sấy khô, tro hóa luyện mẫu, nguyên tử hóa để đo phổ hấp thụ và cuối cùng là làm sạch cuvet Trong đó, hai giai đoạn đầu là chuẩn bị cho giai đoạn nguyên

tử hóa để đạt kết quả tốt Nhiệt độ trong cuvet Graphit là yếu tố chính quyết định mọi sự diễn biến của quá trình nguyên tử hóa mẫu Độ nhạy của phương pháp này đạt đến 0.1ng Do vậy, lựa chọn kỹ thuật này để phân tích các mẫu dược liệu do hàm lượng chì trong dược liệu không lớn

1.4.3 Trang thiết bị của phép đo [2, 6, 20]

Hình 3: Cấu tạo của máy quang phổ AAS

a) Hệ 1 chùm tia ; b) Hệ 2 chùm tia

1 Nguồn phát bức xạ cộng hưởng của nguyên tố cần phân tích để chiếu vào môi trường hấp thụ chứa các nguyên tử tự do của nguyên tố Đó có thể là đèn Catod rỗng (HCL), đèn phóng điện không điện cực (EDL) hay nguồn phát bức xạ liên tục đã được biến điệu

2 Bộ phận nguyên tử hóa mẫu Hệ thống này được chế tạo theo 2

kỹ thuật: Kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu bằng ngọn lửa và kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa

3 Bộ phận đơn sắc hóa: thường đặt sau bộ phận nguyên tử hóa mẫu với mục địch chọn vạch cộng hưởng từ nguồn phát bức xạ nhiều vạch và loại

bỏ những vạch nhiễu do chính ngọn lửa phát ra

4 Bộ phận phát hiện và khuếch đại tín hiệu có kết nối với máy tính

1.5 Phương pháp xử lý mẫu phân tích xác định Pb

1.5.1 Phương pháp xử lý ướt [5, 17]

Nguyên tắc: Dùng các acid mạnh (HCl, H2SO4, HNO3) hoặc kiềm mạnh ( NaOH, KOH) hay hỗn hợp 2 – 3 acid (HNO3+H2SO4), (HNO3+H2SO4

+HClO4), hỗn hợp kiềm mạnh và muối kim loại kiềm (NaOH-NaHCO3)

-…hoặc hỗn hợp acid đặc và chất có tính oxy hóa mạnh như HNO3+H2O2…để phân hủy mẫu trong điều kiện đun nóng, được thực hiện trong bình Kendan hay trong ống nghiệm Lượng acid hoặc kiềm thường gấp 15-20 lần lượng mẫu, tùy loại mẫu.Thời gian hòa tan mẫu trong các hệ hở, bình Kendan, ống nghiệm, cốc…thường từ vài giờ đến vài chục giờ tùy thuộc vào loại mẫu, bản chất của các chất Thường khi phân hủy xong phải đuổi hết acid dư hoặc kiềm

dư trước khi định mức và tiến hành đo phổ

Ưu diểm: Không làm mất các chất phân tích, quá trình thực hiện đơn

giản

Nhược điểm:

 Thời gian phân hủy lâu

 Tốn nhiều acid đặc hoặc kiềm tinh khiết

 Phải đuổi acid dư hoặc kiềm dư nên dễ bị nhiễm bẩn do bụi hay mất mẫu

Ứng dụng: xử lý mẫu phân tích và một số anion vô cơ như halides,

asenate, sulfate…trong các loại mẫu sinh hoạt, mẫu hữu cơ, vô cơ, mẫu môi trường…

1.5.2 Phương pháp xử lý khô [5, 17]

Nguyên tắc: Nung mẫu trong điều kiện nhiệt độ cao ( 400-550 0 C) thành tro để giải phóng kim loại dưới dạng muối hay oxit của chúng Sau khi nung, mẫu bã còn lại được hòa tan bằng dung dịch muối hay dung dịch acid phù hợp

để chuyển chất phân tích vào dung dịch cho phương pháp phân tích đã chọn

Quá trình nung có thể không thêm chất phụ gia hoặc có thêm các chất này để giúp quá trình xử lý mẫu được xảy ra nhanh hơn, tốt hơn và hạn chế mất chất phân tích

Một số chất phụ gia bảo vệ thường dùng: KOH- Na2O2, KNO3-HNO3…

Ưu điểm:

 Thao tác và cách làm đơn giản

 Không phải dùng nhiều acid đặc và tinh khiết

 Xử lý mẫu được triệt để nhất là các mẫu nền hữu cơ

 Thời gian xử lý ngắn hơn xử lý ướt bình thường

Nhược điểm: Có thể mất một số chất dễ bay hơi như Cd, Pb, Zn, Sn…

nếu không dùng thêm chất phụ gia và bảo vệ

1.5.3 Phương pháp xử lý khô - ướt kết hợp [5, 17]

Nguyên tắc: Mẫu được phân hủy trong chén hay cốc nung Trước tiên

mẫu được xử lý sơ bộ trong cốc hay chén nung bằng một lượng nhỏ acid và chất phụ gia để phá vỡ sơ bộ cấu trúc ban đầu của mẫu và tạo điều kiện lưu giữu các chất dễ bay hơi khi nung Sau đó đem nung ở nhiệt độ thích hợp.Lượng acid cần dùng chỉ băng 1/4 – 1/3 lượng cần dùng cho xử lý ướt Quá trình nung sau đó sẽ nhanh hơn, triệt để hơn và hạn chế sự mất mát chất phân tích so với xử lý mẫu khô

Ưu điểm:

 Hạn chế được sự mất một số chất phân tích

 Sự tro hóa là triệt để, sau khi hòa tan tro sẽ được dung dịch mẫu trong

 Không tốn acid tinh khiết

 Thời gian xử lý nhanh hơn tro hóa ướt

 Không phải đuổi acid dư, hạn chế được sự nhiễm bẩn

 Phù hợp cho nhiều loại mẫu khác nhau để xác định được kim loại

 Không cần trang thiết bị hiện đại phức tạp

1.5.4 Phương pháp xử lý bằng lò vi sóng [5, 14, 17]

Nguyên tắc: Giống như vô cơ hóa ướt nhưng năng lượng đun nóng mẫu

được cung cấp bằng bức xạ vi sóng tần số cao, các phân tử mẫu đều được nhận năng lượng đồng đều và trực tiếp từ nguồn vi sóng, phá vỡ cấu trúc nền mẫu từ trong ra, vì thế quá trình xử lý mẫu nhanh và triệt để hơn

Ưu điểm:

 Xử lý nhanh và triệt để, không làm mất chất phân tích

 Tốn ít acid đặc tinh khiết, giảm nhiễm tạp vào mẫu

 Thao tác đơn giản, an toàn cho người lao động

Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền, phức tạp, không phải cơ sở nào cũng có

1.5.5 Phương pháp chiết [2, 6, 17]

Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở sự hòa tan khác nhau của chất phân tích vào

trong hai dung môi không trộn lẫn vào nhau Tức là chất phân tích tan tốt trong dung môi này nhưng lại không tan tốt trong dung môi kia, nhờ đó chúng

ta lấy được chất phân tích ra khỏi mẫu ban đầu, chuyển nó vào dung môi chúng ta mong muốn sau đó xác định nó trong dung môi chúng ta vừa chiết

Ưu điểm:

 Phương pháp chiết đơn giản, dễ thực hiện

 Chiết tách được chất phân tích triệt để và tinh khiết

 Loại được chất ảnh hưởng

 Thích hợp cho làm giàu lượng nhỏ chất phân tích

Nhược điểm: Điều kiện chiết nghiêm ngặt, thời gian dài, sử dụng nhiều

dung môi tinh khiết

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vì thời gian và điều kiện không cho phép, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng chì trên 4 mẫu dược liệu ở Hà Nội như bảng sau:

Bảng 1: Các mẫu dược liệu khảo sát hàm lượng chì

Dược liệu Mã hóa Ngày mua Bộ phận

Ngưu tất NT 15/9/2013 Rễ Công ty Dược liệu Hà Tây

2.2 Nguyên vật liệu, hóa chất, thiết bị, dụng cụ

2.2.1 Nguyên liệu, hóa chất

 Nước cất hai lần

 Acid đặc HNO3 (Merck), acid đặc H2SO4 (Merck), acid đặc HClO4 (Merck), dung dịch hydro peroxyd H2O2 (Merck) (tiêu chuẩn HPLC)

 Dung dịch chuẩn Pb 1000ppm (Merck)

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

 Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử Zeenit – 700P

 Lò vi sóng QLAB PRO (Canada)

 Bếp điện

 Các dụng cụ thủy tinh chính xác khác như: Pipet 1,2 ml, bình định mức 25ml, 100 ml, bình Kendal, cốc thủy tinh, phễu, giấy lọc

 Cân phân tích Sartorius, sai số 0.1mg

2.3 Nội dung nghiên cứu

 Xây dựng phương pháp định lượng chì trong dược liệu bằng kỹ thuật AAS:

 Xây dựng quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp xử lý ướt và xử lý bằng lò vi sóng So sánh hai phương pháp xử lý mẫu, từ đó, lựa chọn phương pháp tối ưu

 Lựa chọn chương trình của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS

để định lượng chì

 Thẩm định phương pháp định lượng vừa xây dựng

 Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng một số mẫu dược liệu tại Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu dược liệu được xử lý bằng hai kỹ thuật xử lý mẫu:

 Kỹ thuật vô cơ hóa ướt sử dụng tác nhân là acid HNO3 đặc và acid HClO4 đặc

 Kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng sử dụng tác nhân là hỗn hợp acid HNO3 đặc và dung dịch H2O2

Quá trình hóa học xảy ra:

Mẫu + HNO3 + H2O2 → Pb(NO3)x + H2O + CO2 +NO2

2.4.2 Phương pháp phân tích định lượng

 Xác định hàm lượng chì trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa ETA-AAS

 Định lượng chì trong dược liệu bằng phương pháp đường chuẩn

 Tiến hành xây dựng đường chuẩn, rồi dựa vào đồ thị tính nồng độ chì trong mẫu dược liệu

2.4.3 Kết quả thu được xử lý thống kê

Hàm lượng chì trong dược liệu: Hàm lượng Pb trong mẫu được quy

về đơn vị ppm và được tính theo công thức sau:

X=

Trong đó:

X: hàm lượng Pb trong mẫu phân tích (ppm)

C: nồng độ Pb trong dung dịch mẫu tính theo đường chuẩn (ppb) m: Khối lượng mẫu phân tích

V: thể tích dung dịch mẫu định mức sau khi vô cơ hóa mẫu (ml)

Giá trị trung bình:

Độ lệch chuẩn: S=

Độ lệch tương đối: % RSD= 100%

Giới hạn phát hiện: LOD =

Giới hạn định lượng: LOQ= 3 x LOD trong đó a là độ dốc của đường

chuẩn, SD là độ lệch chuẩn của mẫu trắng

Chuẩn F (Fisher)

Giả sử có 2 kết quả thu được từ hai dãy thí nghiệm hoặc từ 2 phương pháp với số lần n1 và n2, độ lệch chuẩn tương ứng là s1 và s2 Để so sánh độ

chính xác, ta so sánh 2 phương sai: Ftn= 2

2

2 1

s vì vậy Ftn luôn

lớn hơn 1

So sánh giá trị Ftn với giá trị F với độ tin cậy 95% và số bậc tự do f1= n1 –

1 và f2= n2 – 1 Nếu:

Ftn  F: độ chính xác của 2 kết quả khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Ftn > F: độ chính xác của 2 kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê

Chuẩn t ( Student)

Giả sử định lượng hoạt chất trong một mẫu bằng 2 phương pháp có kết quả x1 và x2 , với số lần thực nghiệm N1, N2 và độ lệch chuẩn s1 ,s2 Cần đánh giá xem hai kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê hay không, ta thực hiện các bước sau:

Trước hết so sánh độ chính xác của hai phương pháp theo chuẩn F ( độ tin cậy 95%):

Nếu Ftn F’: độ lệch chuẩn s1 ,s2 thuộc cùng 1 tập hợp, tính độ lệch chuẩn chung theo công thức:

Sd =

2 1 2

1

2 2 2 2 1

2

) 1 ( ) 1 (

N N N

N

s N s N

Giá trị t ứng với độ tin cậy 95% và f= N1 + N2 – 2

So sánh giá trị của  với x 1 x2 nếu:

2 1 1

2 2 1 1

v v

t v t v