Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm lượng azithromycin trong chế phẩm bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang

Vì vậy nhằm mục đích cung cấp một phương pháp định lượng AZTR đơn giản, nhanh chóng , có độ chính xác cao và tại Việt Nam chưa được sử dụng nhiều, để đảm bảo công tác kiểm nghiệm, đảm bả

NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT

ĐỒNG BỘ PHỔ HUỲNH QUANG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

NGUYỄN THỊ HIỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT QUÉT

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths.Nguyễn Trung Hiếu và

Ths Bùi Đình Sơn là những gười thầy đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn , giúp đỡ

em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm , giúp đỡ của thầy cô, anh chị kỹ thuật viên

bộ môn Hóa Phân Tích –Độc Chất Trường Đại Học Dược Hà Nội trong thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn

Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm của Ban giám hiệu nhà trường, thầy cô đã tạo cho em những điều kiện tốt nhất để hoàn thành khóa học tại trường

Cuối cùng em xin cảm ơn Gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian em học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, Tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Nguyễn Thị Hiền

Bảng 1 Một số chế phẩm chứa AZTR lưu hành trên thị trường 7

Bảng 3 Ảnh hưởng của các nhóm thế đến hiệu quả huỳnh quang của

các dẫn chất Benzen

12

Bảng 3.1 Kết quả về cường độ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong

HCl ở các nồng độ khác nhau tại thời điểm 30 phút

28

Bảng 3.2 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR

10mg/L trong HCl 9M, ở nhiệt độ 21-230C , Δλ=30nm tại các

thời điểm khảo sát

30

Bảng 3.3 Kết quả về cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR

10mg/L trong HCl 9M ở các nhiệt độ khác nhau tại các thời

điểm khảo sát

32

Bảng 3.4 Kết quả về cường độ huỳnh quang của các dung dịch dẫn

xuất AZTR ở các Δλ khác nhau tại thời điểm 30 phút

AZTR : Azithromycin

Kl/kl : Khối lượng / khối lượng

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối

TB: Trung bình

Gr (+): Vi khuẩn gram dương

Gr (-) : Vi khuẩn gram âm

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hình 1 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang- Tăng cường độ huỳnh

quang bằng hệ thống gương 13 Hình 2 Sơ đồ giải thích quét đồng bộ phổ huỳnh quang 19 Hình 3.1 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M

Δλ=30nm, t=21-23 0C, tại thời điểm 30 phút

25

Hình 3.2 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong H 2 SO 4 9M,

Δλ=30nm, t=21-23 0 C, tại thời điểm 30 phút

26

Hình 3.3 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HNO 3 9M,

Δλ=30nm, t=21-23 0 C, tại thời điểm 30 phút

26

Hình 3.4 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 7M,

Δλ=30nm t=21-23 0 C tại thời điểm 30 phút

28

Hình 3.5 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 5M,

Δλ=30nm t=21-23 0 C tại thời điểm 30 phút

28

Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng nồng độ acid HCl lên cường độ

huỳnh quang của dẫn xuất AZTR

29

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian tạo dẫn xuất lên

cường độ huỳnh quang của dẫn xuất AZTR

30

Hình 3.8 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M,

t=40 0 C, Δλ=30, tại thời điểm 30 phút 31 Hình 3.9 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M,

t=55 0 C, Δλ=30, tại thời điểm 30 phút 32 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên

cường độ huỳnh quang của dung dịch AZTR 10mg/L trong HCl 9M

33

Hình 3.11 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở

t=21-23 0C, Δλ=40nm, tại thời điểm 30 phút 34

Hình 3.12 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở

t=21-230C, Δλ=35nm, tại thời điểm 30 phút 34

hình 3.13 Phổ đồng bộ huỳnh quang của AZTR 10mg/L trong HCl 9M ở

t=21-230C, Δλ=50nm, tại thời điểm 30 phút 34

Hình 3.14 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của Δλ=λem-λex lên cường độ

huỳnh quang của dung dịch AZTR ở các nồng độ khác nhau trong HCl 9M

35

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và cường

độ huỳnh quang của dung dịch AZTR trong HCl 9M

38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Năm 1929 khi Alexander Fleming tìm ra và sau đó phân tách được penicillin đã mở ra một kỷ nguyên mới trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng, mà trước đó được coi là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới đặc biệt là ở các nước kém và đang phát triển trong đó có Việt Nam Trong suốt những thập kỷ tiếp theo và cho đến tận ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học - kỹ thuật nhiều kháng sinh mới đã được tìm

ra và cho hiệu quả điều trị ngày càng cao Trong đó có Azithromycin (1980)

là một kháng sinh macrolid bán tổng hợp được sử dụng để điều trị các loại nhiễm khuẩn như nhiễm khuẩn đường hô hấp, da, đường tiêu hóa, đường sinh dục, đặc biệt AZTR có tác dụng tốt trên vi khuẩn nội bào, các vi khuẩn

cơ hội ở bệnh nhân bị nhiễm HIV [4], [15] Hiện nay trên thị trường dược phẩm Việt Nam có nhiều loại biệt dược chứa AZTR có xuất xứ khác nhau cả trong và ngoài nước Để kiểm tra, kiểm soát , đảm bảo chất lượng của từng loại biệt dược đang lưu hành trên thị trường và để việc sử dụng được đúng liều, đảm bảo hiệu quả điều trị thì công tác kiểm nghiệm định lượng AZTR trong chế phẩm đóng một vai trò rất quan trọng

Vì vậy nhằm mục đích cung cấp một phương pháp định lượng AZTR đơn giản, nhanh chóng , có độ chính xác cao và tại Việt Nam chưa được sử dụng nhiều, để đảm bảo công tác kiểm nghiệm, đảm bảo chất lượng chúng tôi

thực hiện đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng và khảo sát hàm

lượng Azithromycin trong chế phẩm bằng kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang” với các mục tiêu:

- Xây dựng phương pháp định lượng AZTR bằng kỹ thuật quét đồng bộ

phổ huỳnh quang

- Thẩm định phương pháp vừa xây dựng

- Ứng dụng phương pháp vừa xây dựng để định lượng một vài chế phẩm

chứa AZTR đang lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1.TỔNG QUAN VỀ AZITHROMYCIN (AZTR)

1.1.1 Công thức cấu tạo [5]

- Công thức phân tử: C38H72N2O12

- Khối lượng phân tử: 748,98

- Tên khoa học : 10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA

1.1.2.Tính chất vật lý và hóa học

 Tính chất vật lý [4],[5]

- Bột kết tinh màu trắng đến trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng

- Thực tế không tan trong nước rất dễ tan trong methanol, ethanol, methylen clorid, aceton, chloroform, dung dịch acid hydroclorid loãng…

- Năng suất quay cực từ -450 đến -490 (dung dịch 20mg/ml trong Ethanol)

- Trong cấu trúc của AZTR không có các dây nối liên hợp và các nhóm mang màu nên nó hấp thụ UV kém và không phát huỳnh quang

 Tính chất hóa học [4], [5]

- Tính base do các Osamin (đường amin) gây ra và một nhóm amin như

là một phần của vòng macrolacton có pKa= 8,74

- Tạo được muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ

- Phản ứng màu với acid HCl, H2SO4 Hòa tan AZTR vào HCl đặc để yên khoảng 10 phút thấy xuất hiện màu vàng

1.1.3 Dƣợc động học.[4], [15]

Hấp thu:

- AZTR hấp thu nhanh, sinh khả dụng đường uống đạt 40%

- Thức ăn làm giảm hấp thu AZTR khoảng 50%,

- Sau khi dùng thuốc , nồng độ đỉnh huyết tương đạt được trong vòng từ

2 đến 3 giờ

Phân bố:

- Phân bố rộng rãi trong cơ thể, chủ yếu vào các mô như phổi, amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt, đại thực bào… Với nồng độ cao hơn trong máu nhiều lần (khoảng 50 lần nồng độ tối đa tìm thấy trong huyết tương) , vì vậy dùng để điều trị nhiễm khuẩn nội bào tốt

- Tuy nhiên nồng độ thuốc trong hệ thống thần kinh trung ương rất thấp

Chuyển hóa- Thải trừ:

- Một lượng nhỏ AZTR bị khử metyl trong gan, được đào thải qua mật ở dạng không biến đổi và một phần ở dạng chuyển hóa

- Khoảng 6% liều uống thải trừ qua nước tiểu trong vòng 72h ở dạng không biến đổi

- Một số chủng vi khuẩn khác cũng rất nhạy cảm với AZTR như Corynebacterium diphteriae, Clostridium perfringens, Peptostreptococcus, Propionibacterium acnes…

- AZTR có tác dụng tốt trên vi khuẩn Gr(-) như Haemophilus influenza, Neissria gonorrhoeae, Legionella pneumophilia…Và có tác dụng vừa phải trên các vi khuẩn Gr(-) như Escheria coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Klebsiella spp…

- Nhìn chung AZTR tác dụng trên vi khuẩn Gr(+) yếu hơn 1 chút so với Erythromycin nhưng lại mạnh hơn trên 1 số vi khuẩn Gr(-) trong đó có Haemophilus

1.1.6.Tác dụng không mong muốn.[4]

- AZTR dung nạp tốt, tỷ lệ tác dụng không mong muốn thấp Hay gặp nhất là chứng rối loạn tiêu hóa (khoảng 10%) với các triệu chứng như buồn nôn, đau bụng, nôn, ỉa chảy, đầy hơi, nhưng thường nhẹ và ít xảy ra hơn Erythromycin

- AZTR gây ảnh hưởng trên thính giác: Sử dụng lâu dài AZTR ở liều cao

có thể làm giảm sức nghe có hồi phục ở một số người bệnh

1.1.7.Sự kháng AZTR của vi khuẩn.[4]

- Các nghiên cứu tiến hành ở Việt Nam cho thấy các loài vi khuẩn Gram(+) như Streptococcus,Pneumococcus,Staphylococcus aureus… Kháng nhóm Macrolid ở tỷ lệ khoảng 40%

- Các chủng Gr(-) thường kháng AZTR là Proteus, Serratia, Pseudomonas aeruginosa, Morganella

- Các chủng vi sinh vật kháng Erythromycin cũng có thể kháng AZTR như những chủng Gr(+) ở trên, kể cả loài Enterococcus và hầu hết các chủng Staphylococcus kháng Methicilin đã hoàn toàn kháng AZTR

- Dùng mỗi ngày 1 lần, uống trước khi ăn 1 giờ hoặc sau khi ăn 2 giờ

- Người lớn: ngày đầu uống 1 liều 500mg và dùng tiếp 4 ngày nữa với liều 250mg/ ngày

- Trẻ em: liều gợi ý cho trẻ là 10mg/kg thể trọng, và 4 ngày tiếp theo là 5mg/kg thể trọng, ngày uống 1 lần

1.1.10.Các dạng bào chế của AZTR [10], [11]

- Viên nang AZTR (dạng dihydrat) tương đương AZTR 250mg và 500mg

- Viên nén và viên nén bao phim AZTR 125mg, 250mg, 500mg

- Viên nén phân tán tương đương AZTR 100mg

- Bột pha hỗn dịch uống AZTR dạng dihydrat tương đương 200mg AZTR/ 5ml

- Lọ bột đông khô pha tiêm 500mg

1.1.11 Một số chế phẩm chứa AZTR lưu hành trên thị trường [10] Bảng 1.Một số chế phẩm chứa AZTR lưu hành trên thị trường

500mg Pfizer

3 Azithromycin Viên nén bao phim 250mg DHG Pharma

5 Azithromycin Viên nang 250mg Traphaco

6 Azithral Viên nén phân tán

Bột pha truyền tĩnh mạch

250mg, 500mg

Alembic

7 Aziphar Viên nang

Viên nén bao phim

250mg 500mg

Bột pha tiêm 500mg Cipla Medpro

11 Azimon Viên nén 500mg Monicopharma

1.1.12.Một số phương pháp định lượng AZTR trong chế phẩm

Detector Quang phổ tử ngoại đặt ở

Được pha ở nồng độ khoảng 2mg/mL trong pha động

 Phương pháp vi sinh vật [9], [13]

- Khuếch tán trên thạch,nuôi cấy và chế tạo nhũ dịch, đo đường kính vòng vô khuẩn, có thể dùng các vi khuẩn chỉ thị: Bacillus pumilus NCTC (B)

63202, Bacilus pumilus NCTC 8241 , Micrococcus luteus ATCC 9341.[9]

- Xác định hoạt lực của azithromycin trong dung dịch ophthalmic Pha loãng dung dịch azithromycin ophthalmic bằng đệm kali phosphat pH 8 tới nồng độ thích hợp Định lượng trên môi trường thạch với chủng vi khuẩn chỉ thị là Bacillus subtilis ATCC 9372 [13]

 Phương pháp tạo cặp ion chiết – đo quang.[7]

- Thuốc thử : Dung dịch lục bromocresol CT2

- Môi trường tạo cặp ion: Dung dịch đệm acetat pH=4.5

- Dung môi chiết: Cloroform CHCl3

F= K I0 C L

Trong đó:

Chú ý: Việc đo phổ huỳnh quang chỉ nên tiến hành với dung dịch loãng

C < 10-4 Mđể tránh ảnh hưởng suy giảm cường độ của bức xạ phát ra

1.2.1.2.Đặc điểm của huỳnh quang [1]

- Thời gian huỳnh quang rất ngắn chỉ khoảng 10-9 giây và sự huỳnh quang là đa hướng

- Hiệu suất huỳnh quang là một đặc trưng vật lí cho biết khả năng huỳnh quang của một chất và được tính bằng tỷ số giữa số photon phát xạ và số photon hấp thụ

- Cường độ huỳnh quang là hiệu suất thực nghiệm hoạt tính phát huỳnh quang của một chất khi nó được kích thích do được hấp thụ một bức xạ thích hợp Cường độ huỳnh quang tỷ lệ với cường độ bức xạ kích thích, hiệu suất huỳnh quang và nồng độ chất phát huỳnh quang

- Vì huỳnh quang đa hướng nên cường độ huỳnh quang đo dược chỉ là một phần của cường độ huỳnh quang và người ta thường đo theo phương vuông góc với chùm tia kích thích

- Nói chung cường độ huỳnh quang phụ thuộc tuyến tính với nồng độ ở vùng nồng độ thấp Sự tuyến tính mất đi khi độ truyền qua chỉ còn dưới 90% (hay mật độ quang vượt quá 0.05)

- Trong huỳnh quang người ta dùng 2 khái niệm phổ phát xạ huỳnh quang ( em) và phổ kích thích huỳnh quang ( ex)

 Phổ phát xạ huỳnh quang là đường biểu diễn mối quan hệ giữa cường độ huỳnh quang của chất đã được hoạt hóa và bước sóng của bức xạ huỳnh quang

 Phổ kích thích phát huỳnh quang là đường biểu diễn cường độ hấp thụ của một chất và bước sóng của bức xạ hấp thụ

 Vì chênh lệch năng lượng giữa các trạng thái dao động ở cả trạng thái cơ bản lẫn kích thích nên phổ kích thích và phổ phát xạ huỳnh quang của các hợp chất thường đối xứng theo kiểu ảnh gương

1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng huỳnh quang

- Hầu hết các Hidrocacbon thơm đều phát huỳnh quang trong dung dịch Hiệu quả huỳnh quang tăng lên cùng với số vòng thơm và độ tập trung của chúng trong cấu trúc

- Những dị vòng đơn giản nhất như pyridine, furan, thiophen, pyrrol…không có huỳnh quang phân tử nhưng các cấu trúc ngưng tụ nhiều vòng như quinolin, isoquinolin, indol…lại thường có huỳnh quang

- Các nhóm thế trên vòng thơm có thể gây ra sự dịch chuyển bước sóng cực đại kích thích và thay đổi tương ứng các pic trong phổ huỳnh quang

Bảng 3 Ảnh hưởng của các nhóm thế đến hiệu quả huỳnh quang của các dẫn

chất Benzen

huỳnh quang tương đối

huỳnh quang tương đối

- Nói chung các chất vô cơ không có huỳnh quang trừ một số nguyên tố đất hiếm và các lantanit

 Các hợp chất hữu cơ có khả năng phát huỳnh quang chủ yếu là các hydrocacbon thơm, các alpha diceton

 Các hợp chất đa vòng làm cho bước sóng của huỳnh quang dài hơn

 Những nhúm cho electron như: -OH, -NH2, alkyl, aryl….làm tăng hiệu suất huỳnh quang

 Ngược lại những nhúm hỳt huỳnh quang như: NO2, -COOH, Cl, Br….lại làm giảm hiệu suất huỳnh quang

 Cỏc yếu tố về mụi trường [1]

- Nhiệt độ và dung mụi là 2 yếu tố cú ảnh hưởng đến huỳnh quang Hầu hết với cỏc phõn tử hiệu suất huỳnh quang giảm khi nhiệt độ tăng bởi vỡ khi

đú tần suất va chạm tăng lờn và sự hồi phục do va chạm dễ dàng xảy ra

- Việc giảm độ nhớt của dung mụi cũng cho kết quả tương tự

1.2.1.4 Mỏy quang phổ huỳnh quang.[1], [2]

Bộ đơn sắc kích thích

Bộ đơn sắc huỳnh quang

Nguồn sáng

G-ơng

Hỡnh 1 Sơ đồ cấu tạo mỏy quang phổ huỳnh quang - Tăng cường độ huỳnh

quang bằng hệ thống gương

Cấu tạo mỏy

- Nguồn sỏng trong mỏy quang phổ huỳnh quang cú nhiệm vụ tạo ra cỏc bức xạ kớch thớch cần thiết Nguồn sỏng thường dựng là đền xeon cú khả năng phỏt ra bức xạ trong khoảng rộng 200-800nm nhưng phổ bức xạ khụng đều cỏc tia UV mạnh hơn cỏc tia VIS Ngoài ra cũn dựng nguồn cảm ứng laser, đền xeon kộm nhạy hơn laser

- Bộ phận đơn sắc húa gồm 2 phần đơn sắc húa bức xạ kớch thớch và đơn sắc húa bức xạ huỳnh quang.Hai bộ phận này bố trớ trước và sau buồng đo Sử dụng cỏch tử

- Buồng đo được bố trí sao cho phương nguồn sáng và phương thu tín hiệu vuông góc với nhau

- Cuvet thường dùng thạch anh (1x1 cm) có 4 mặt trong suốt vuông góc với nhau

- Để tăng tín hiệu đến bộ phận thu người ta có thể bố trí thêm gương ở phía đối diện

Chuẩn hóa máy

- Máy quang phổ huỳnh quang phải được chuẩn hóa thường xuyên với chất chuẩn

- Tiến hành chuẩn máy theo tài liệu hướng dẫn của nhà sản xuất máy

1.2.1.5.Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang.[1], [2]

- Với những chất không phát huỳnh quang có thể tác dụng với thuốc thử không huỳnh quang để tạo ra các dẫn chất có huỳnh quang hay dùng các thuốc thử có huỳnh quang để đo và sử dụng các cách xử lý thích hợp

- Đối với các hợp chất vô cơ, phương pháp đo huỳnh quang có thể được tiến hành theo 2 kiểu trực tiếp và gián tiếp

 Phương pháp trực tiếp dựa trên phản ứng của chất phân tích với một tác nhân tạo phức để tạo ra phức chất phát huỳnh quang

 Phương pháp gián tiếp dựa trên sự giảm hay tắt huỳnh quang của tác nhân do sự phản ứng của nó với chất phân tích Sự tắt huỳnh quang đầu tiên được sử dụng để phát hiện các anion

- Để xác định các cation, tác nhân sử dụng để đo huỳnh quang chủ yếu là các hợp chất thơm có 2 hay nhiều nhóm cho khả năng huỳnh quang mà cho phản ứng tạo phức với ion kim loại như 8-hydroxyquinolin.Với hầu hết tác nhân này cation được chiết vào dung dịch của tác nhân trong CHCl3 trước khi

đo huỳnh quang

- Đối với hợp chất hữu cơ và hóa sinh: Phương pháp huỳnh quang có ứng dụng quan trọng trong phân tích thực phẩm, dược phẩm, mẫu bệnh phẩm, các hợp chất tự nhiên nhờ độ nhậy và chọn lọc của phương pháp

 Nhiều nghiên cứu tiến hành với các chất hữu cơ như Adenin, Cystein, Indol, Tryptophan…

 Các thuốc như Adrenalin, Penicillin, Phenobarbital, Procain,…

 Với các Enzym, coenzyme và các hợp chất tự nhiên như các Alkaloid, Flavonoid,…

Một số phương pháp dùng trong định lượng bằng huỳnh quang

Nguyên tắc của các phương pháp định lượng: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với cường độ huỳnh quang

Trong khuôn khổ của khóa luận này chúng tôi xin trình bày cụ thể 3 phương pháp định lượng bằng huỳnh quang là: Phương pháp so sánh, phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn

 Phương pháp so sánh

- Mẫu thử luôn luôn được so sánh với mẫu chuẩn

- Kiểm tra vùng tuyến tính của cường độ huỳnh quang và điều chỉnh độ nhạy của thiết bị với độ pha loãng thích hợp của dung dịch chuẩn

- Ghi cường độ huỳnh quang của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và các mẫu trắng tương ứng của chúng

- Tính toán nồng độ của dung dịch thử:

CX = CS (IX– IOX) / ( IS – IOS)

Ở đây:

CX: nồng độ của dung dịch thử

CS: nồng độ của dung dịch chuẩn

IX: trị số đo được của dung dịch thử

IS: trị số đo được của dung dịch chuẩn

IOX và IOS: trị số đo được của các mẫu trắng tương ứng

Vùng trong đó cường độ huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của chất thường rất hẹp, cho nên tỉ số (IX – IOX) / ( IS – IOS) phải không được < 0,5 và không >2,0 Nếu tỉ số không nằm trong khoảng trên thì phải điều chỉnh nồng

độ và tiến hành đo lại

 Phương pháp đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành quét đồng bộ phổ huỳnh quang Đáp ứng thu được là cường độ huỳnh quang Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa cường độ huỳnh quang và nồng độ của chất chuẩn Sử dụng đoạn tuyến tính của đồ thị để tính toán nông

độ của chất cần phân tích theo 2 cách:

- Áp dữ kiện cường độ huỳnh quang của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra được nồng độ của nó

- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa cường

độ huỳnh quang với nồng độ chất cần phân tích

Y = aCx + b

Trong đó:

Y là cường độ huỳnh quang

Cx : Nồng độ chất thử

a, b là hệ số của phương trình hồi quy

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử:

Cx =

 Phương pháp thêm chuẩn.

Chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và chất chuẩn với lượng tăng dần Tiến hành quét đồng bộ phổ huỳnh quang Dựng đường chuẩn tương quan giữa cường độ huỳnh quang tổng (thử + chuẩn) với nồng

độ của chất chuẩn thêm vào Giao điểm của trục hoành và đường chuẩn kéo dài chính là nồng độ của chất cần phân tích

 Một số ứng dụng khác [1]

- Phương pháp huỳnh quang còn được sử dụng trong bộ phận phát hiện của sắc ký lỏng vì tính đặc hiệu cao và độ nhạy của nó, với nguồn sáng laser

có thể phát hiện tới 10-12 gam

- Đối với huỳnh quang nguyên tử có thể áp dụng để định lượng các kim loại có vạch cộng hưởng có cường độ đủ mạnh hay định lượng gián tiếp một

số chất hữu cơ có tham gia tạo phức như S, P, các halogen… Huỳnh quang nguyên tử có thể đạt đến độ nhạy 10-9 gam

1.2.2 Quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14]

1.2.2.1.Khái niệm về quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14]

Trong huỳnh quang thông thường phổ phát xạ thu được bằng cách quét các phát xạ đơn sắc ở các bước sóng phát xạ khác nhau, giữ đơn sác kích thích ở 1 bước sóng cụ thể

Còn phổ kích thích thu được bằng cách quét các đơn sắc kích thích ở các bước sóng kích thích khác nhau, giữ đơn sắc phát xạ không đổi ở 1 bước sóng

cụ thể

Khi quét cả 2 đơn sắc cùng lúc được gọi là quét đồng bộ phổ huỳnh quang

Nếu tốc độ quét là hằng số cho cả 2 đơn sắc kích thích và phát xạ và

= em - ex được giữ cố định thì được gọi là kỹ thuật liên tục bước sóng Đây là kĩ thuật đơn giản và được sử dụng thường xuyên nhất trong các chế

độ đồng bộ Vì vậy nói chung quét đồng bộ phổ huỳnh quang đề cập đến kỹ thuật này

1.2.2.2.Đặc điểm của quét đồng bộ phổ huỳnh quang [14]

- Thu hẹp dải quang phổ: Tác động này chủ yếu là kết quả của việc đồng thời tăng hoặc giảm cường độ huỳnh quang

- Đơn giản hóa phổ phát xạ :Trong phổ huỳnh quang thông thường tại 1 bước sóng kích thích cố định ( ex) nó có thể tăng cường độ của tất cả dải phổ cùng một lúc Nhưng quét đồng bộ cho phép pic có cường độ cao nhất được tăng lên một cách chọn lọc nếu sử dụng một phù hợp

- Co phạm vi quang phổ: trong một phân tích có thể không quan tâm đến toàn bộ phổ, nhiều phần không được xem xét, sự có mặt của chúng chỉ gây nhầm lẫn trong phổ do trùng với sự phát xạ của các thành phần khác trong mẫu

1.2.2.3.Ƣu điểm của quét đồng bộ phổ huỳnh quang [12], [14].

- Khả năng phân tích hỗn hợp phức tạp đa thành phần mà không cần tách riêng từng thành phần là cực kì hữu ích và là một ưu điểm quan trọng của quét đồng bộ phổ huỳnh quang Đo huỳnh quang đơn bước sóng để phân tích mẫu phức tạp nhiều thành phần có sự chồng chéo của phổ phát xạ hoặc kích thích Điều này có thể khắc phục bằng cách sử dụng quét đồng bộ, nơi chồng chéo của phổ có thể được giảm thiểu

- Phổ huỳnh quang thu được trong quét đồng bộ có độ phân giải cao hơn,

rõ ràng, sắc nét và đỉnh pic hẹp hơn so với phổ huỳnh quang thông thường Điều này có thể được giải thích dựa vào hình 2 dưới đây

- Với những chất phát huỳnh quang yếu quét đồng bộ làm tăng cường độ huỳnh quang

Hình 2 Sơ đồ giải thích về quét đồng bộ phổ huỳnh quang

Một phân tử có thể được kích thích trong toàn bộ dải hấp thụ bắt đầu từ bước sóng A1, A2……A9 và cho huỳnh quang trong khoảng bước sóng F1,

F2…… F9

Phổ phát xạ huỳnh quang không thay đổi, không phụ thuộc vào bước sóng kích thích ngoại trừ sự thay đổi trong cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào quá trình chuyển đổi điện tử của phân tử

Để có phổ phát xạ huỳnh quang các phân tử thường được kích thích ở sự hấp thụ của nó tối đa là A5 và thu được tất cả các bước sóng phát xạ F1,

và huỳnh quang thu được tại bước sóng F5 Trong các thời điểm tiếp theo các phân tử sẽ được kích thích ở A6, A7, A8, A9 , và co huỳnh quang tương ứng tại

F6, F7, F8, F9 Quá trình cứ tiếp tục cho đến khi một quang phổ đầy đủ được ghi lại

Cường độ phát xạ là một chức năng của bước sóng kích tích (liên quan đến quá trình chuyển đổi điện tử) và khi xác định được sự phù hợp giữa hấp thu và phát xạ ta có một đỉnh pic cao và sắc nét hơn so với quang phổ huỳnh quang tong thường

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Bảng 2.1: Đối tượng nghiên cứu

Tá dược vừa đủ 1 viên

2.2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

2.2.1.Nguyên liệu , hóa chất

- Chất chuẩn AZTR –Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, độ tinh khiết 97,27%

- Methanol tinh khiết loại dùng cho sắc ký (HPLC, Merck - Đức)

- Acid hydroclorid đặc HCl 36-38% kl/kl (HPLC, Merck - Đức)

- Acid sulfuric đặc H2SO4 98% kl/kl (HPLC, Merck - Đức)

- Acid nitric đặc HNO3 70% kl/kl (HPLC, Merck - Đức)

- Nước cất 2 lần

- Nhiệt kế, đồng hồ bấm giây Casio

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức 25mL, 50mL, 100mL….,ống đong 20mL, pipet các loại: Pipet chính xác 5mL, 10mL, micro pipet, pipet Pasteur…,đũa thủy tinh, phễu lọc

- Giấy lọc, giấy cân, bình tia nước cất

2.3.PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1.Phương pháp nghiên cứu

- Dựa vào công thức phân tử, tính chất lý hóa của AZTR để tạo dẫn chất của nó trong acid đặc tạo thành dung dịch có khả năng phát huỳnh quang

Cơ chế: Trong môi trường acid tạo sản phẩm màu có khả năng phát huỳnh quang do liên kết glycoside của AZTR bị cắt , đồng thời phản ứng tạo muối của nhóm amin bậc 3 với acid

- Dùng phương pháp quét đồng bộ phổ huỳnh quang để xây dựng phương pháp định lượng

- Tiến hành thực nghiệm, số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê

2.3.2.Nội dung nghiên cứu

2.3.2.1.Xây dựng phương pháp định lượng

- Lựa chọn dung môi để chiết AZTR từ trong chế phẩm

- Xây dựng điều kiện tạo dẫn xuất trong acid đặc của AZTR

 Loại acid dùng để tạo dẫn xuất

 Nồng độ acid sử dụng

 Thời gian cần thiết tạo dẫn xuất