Xây dựng phương pháp định lượng gentoipicrin trong chế phẩm kem viêm da AD bằng HPLC

Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác pha tĩnh-pha động và chất tan.. Cột bảo vệ được lắp trước cột sắc ký để

NGUYỄN THỊ DỊU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

NGUYỄN THỊ DỊU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG CHẾ PHẨM KEM VIEMDA AD BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, cô đã hướng dẫn trực tiếp, chỉ bảo tận tình

và giải quyết những khó khăn giúp em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các thầy cô giáo bộ môn Hóa Phân Tích và độc chất đã tạo điều kiện cho em bảo vệ khóa luận tại bộ môn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến DS Nguyễn Thị Quỳnh và DS.Ngô Quang Trung, người trực tiếp giúp đỡ và chỉ bảo em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin đồng cảm ơn các thầy cô và anh chị đang làm việc tại Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, các thầy cô trong bộ môn Vật lý-hóa lý đã tạo điều kiện cho em tiến hành thực nghiệm tại phòng thí nghiệm

Và không thể thiếu, em xin chân thành cảm ơn và gửi lới chúc sức khỏe đến toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà nội đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt năm năm học tại trường

Cuối cùng, em xin giửi lời cảm ơn đặc biệt này đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ủng hộ, theo sát và động viên em trong suốt thời gian qua

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày 20 tháng 4 năm 2014 Sinh viên

NGUYỄN THỊ DỊU

MỤC LỤC

Danh mục kí hiệu và chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục hình vẽ và đồ thị

Đặt vấn đề .1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Long đởm 2

1.2 Kem Viemda AD 4

1.3 Tổng quan về phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao 5

1.3.1 Khái niệm 5

1.3.2 Cấu tạo của hệ thống máy HPLC 6

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng……… 8

1.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong sắc ký phân bố 10

1.3.5 Phương pháp định lượng bằng HPLC 14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG- HÓA CHẤT- THIẾT BỊ-NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Thiết bị - hóa chất 16

2.2.1 Thiết bị……… 16

2.2.2 Hóa chất……… 16

2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng gentiopicrin trong chế phẩm

Kem Viemda AD 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Điều kiện xử lý mẫu 17

2.4.2 Điều kiện chạy sắc ký 18

2.4.3 Thẩm định phương pháp định lượng 19

2.4.4 Đánh giá kết quả……….22

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM-KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng hoạt chất gentiopicrin………23

3.1.1 Lựa chọn quy trình xử lý mẫu 23

3.1.2 Lựa chọn điều kiện chạy sắc ký 25

3.1.3 Kết quả lựa chọn……… 29

3.2 Thẩm định phương pháp định lượng băng HPLC 29

3.3 Định lượng gentiopicrin trong mẫu thử kem Viemda AD……….34

BÀN LUẬN……… 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AD: Viêm da cơ địa DĐVN IV: Dược điển Việt Nam IV HPLC: Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao DĐTQ: Dược điển Trung Quốc

H2O: Nước MeOH: Methanol EtOH: Ethanol A: diện tích pic

m : khối lượng cân tt/tt: thể tích trên thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang

1.1 Thành phần công thức kem Viemda AD 4 3.1 Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 23 3.2 Kết quả khảo sát thời gian đun cách thủy 24 3.3 Kết quả khảo sát thành phần pha động 26 3.4 Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động 26 3.5 Kết quả tính thích hợp của hệ thống 29 3.7 Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính 31 3.8 Kết quả độlặp lại của phương pháp 32 3.9 Kết quả độ chính xác khác ngày của phương pháp 33 3.10 Kết quả độ thu hồi của phương pháp 34 3.11 Bảng định lượng gentiopicrin trong mẫu thử 34

1.1 Công thức cấu tạo của Gentiopicrin 2

1.2 Bao bì chế phẩm kem Viemda AD 5 1.3 Cấu tạo hạt silica đã silan hóa 11

1.5 Cấu trúc cột có gốc isopropyl 13 3.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc A/m vào thời gian chiết 24

3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc A/m vào thời gian đun cách

thủy

25

3.3 Sắc ký đồ của chất phân tích ở tốc độ dòng đã chọn 28 3.4 Phổ hấp thụ cực đại của chất phân tích 28 3.5 Sắc ký đồ mẫu placebo 30 3.6 Sắc ký đồ mẫu gentiopicrin chất chuẩn 30 3.7 Đồ thị mẫu Gentiopicrin trong kem Viemda AD 31 3.8 Đồ thị đường chuẩn gentiopicrin 32 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chế phẩm kem Viemda AD 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm da cơ địa (còn gọi là chàm thể tạng - Atopic dermatitis - AD), là một bệnh viêm da mạn tính, bệnh thường xuất hiện ở trẻ em và có thể kéo dài đến tuổi trưởng thành, ngoài ra bệnh có thể gặp ở người lớn [10] Chàm thể tạng là bệnh liên quan đến yếu tố di truyền, miễn dịch và môi trường Ngày nay, sự phát triển của xã hội, ô nhiễm của môi trường đã làm cho bệnh chàm thể tạng có xu hướng tăng [6] Điều trị chàm thể tạng chưa có thuốc đặc hiệu, chủ yếu sử dụng corticosteroid với tác dụng chống viêm và giảm các phản ứng dị ứng Tuy nhiên, nhóm thuốc này gây rất nhiều tác dụng phụ như: lệ thuộc thuốc, dị ứng thuốc, viêm nhiễm mắc kèm, Do vậycần phát triển thuốc có khả năng điều trị chàm thể tạng nhưng ít hoặc không có tác dụng phụ

Một trong các biện pháp đang được nghiên cứu hiện nay là các chế phẩm từ dược liệu Trong đó, Long đởm đã được biết đến trong y học cổ truyền có tác dụng điều trị vàng da, viêm gan, viêm miệng, và các bệnh viên nhiễm khác [2], [4] Chế phẩm kem Viemda AD được điều chế từ cao đặc long đởm có thành phần chính là gentiopicrin đang được nghiên cứu để có thể dùng trong điều trị chàm thể tạng Để đưa thuốc vào sản xuất và sử dụng cần đảm bảo yêu cầu chất lượng theo quy định

Để góp phần vào công tác kiểm tra chất lượng thuốc nói chung và tiêu chuẩn hóa một chế phẩm sản xuất từ dược liệu nói riêng chúng tôi thực hiện

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Long đởm

Long đởm thuộc họ long đởm (gentianaceae) Trong đó hay dùng trong

đông y là loài Gentiana lutea Tại Việt Nam, có hai loài được sử dụng làm

thuốc là G Loureirii phân bố ở cao nguyên Lang Biang - Đà Lạt - Lâm Đồng

và G Rigescens có ở Tây Nguyên [2]

Vị thuốc Long đởm sử dụng thân rễ và rễ, thu hái vào mùa thu và mùa xuân, mùa thu là tốt nhất Đào lấy thân rễ và rễ, rửa sạch, phơi âm can, cắt đoạn 2-3cm phơi hoặc sấy khô Theo Muscre’,[3] hàm lượng gentiopicrin trong rễ tươi đạt 2,48%, sấy bằng tủ sấy tỉ lệ này giảm còn 2,10%, rễ sấy trên gác bếp còn 1,61%, rễ đã lên men chỉ còn lại vết Do đó, thu hái rễ long đởm cần rửa và sấy khô sớm (dưới 3 ngày)

Thành phần hóa học trong rễ long đởm:

- Dược liệu họ gentianaceae thường chứa những iridoid glucosid và monoterpen alcaloid Iridoid chính (chiếm khoảng 85% iridoid) được xác định

là gentiopicrosid (gentiopicrin - C16H20O9), hàm lượng trong rễ khoảng 0,35% [5]

- Ngoài ra còn có: gentioflavin, gentisin, scabrosid, triflorosid

Hàm lượng gentiocrosid phụ thuộc vào tuổi cây và thời gian thu hái, cao nhất đạt 7,8% (lúc cây 3 tuổi), phần trên mặt đất đạt khoảng 1% [2] Gentiopicrin có công thức hóa học như sau:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo Gentiopicrin

Tên khoa học: dihydro-1H,3H-pyrano[3,4-c]pyran-1-one

(5R-trans)-5-Ethenyl-6-(-D-glucopyranosyloxy)-5,6-Trọng lượng phân tử: 356.32

Tính chất:

Phân tử có màu trắng hoặc vàng nhạt thậm chí có kết tinh màu đỏ; dễ tan trong nước, methanol hoặc ethanol; dễ biến sắc dưới ánh sáng mặt trời Độ tan trong nước: 43g/l (250C), điểm chảy: 1910C, điểm sôi: 6680C.Kết tinh từ ethyl acetat hoặc alcohol tuyệt đối Điểm chảy 191°C []D20 là 199° (ethanol) uv max (c = 0,0285 g/l methanol): 270 nm (log  3.96) [17]

Công dụng của Long đởm đã được biết trong y học cổ truyền là thanh nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thực, tiêu viêm, sưng mù [2], [4] Trong y học hiện đại, long đởm được biết đến là vị thuốc có tác dụng phòng sự lên men (uống ít, nửa giờ trước bữa ăn), tác dụng kích thích sự bài tiết dịch tiêu hóa, khỏe dạ dày [4], [1] Các iridoid có tác dụng ức chế và thu gom các gốc tự do như peroxyd, superoxyd, do đó có tác dụng bảo vệ tế bào gan, giảm oxy hóa

tế bào, đẩy nhanh quá trình nhu mô hóa tế bào, đồng thời giảm nồng độ men gan Ngoài ra, các alcaloid trong long đởm có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm do tác dụng hạ thấp men chuyển hóa amin, trên thực tế có thể dùng trong dự phòng viêm màng não truyền nhiễm, nước sắc long đởm có tác dụng

ức chế trực khuẩn mủ xanh, tụ cầu vàng, trực khuẩn lị [4], [1], [12]

Gentiopicrin trong dược liệu cũng như trong chế phẩm được một số nhà khoa học nghiên cứu và xác định bằng phương pháp sắc ký

Yin H, Zhao Q, Sun FM, An T [16] đã xác định gentiopicrin trong

Gentianamacrophylla bằng sắc ký lớp mỏng sau đó hiện màu bằng thuốc thử

Dragendorff và HPLC

Huang Z, Lin S [15] đã xác định gentiopicrin trong biyanqingdugranulae

bằng SPE-HPLC Quá trình tách dùng cột Hypersil ODS 2 (250 mm x 4,6

mm, 5 µm) Pha động gồm methanol - nước (30:70, tt/tt) Lưu lượng dòng 1 ml/phút Bước sóng phát hiện 275 nm Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ gentiopicrin trong khoảng 0,02235 – 0,1676 mg/ml, độ thu hồi trung bình 98,1% với RSD 1,7%

Dược điển Trung Quốc 2010 [13], phân tích gentiopicrin bằng cột C18 (250 x 4,6 cm, 5 µm), pha động gồm methanol – nước (25:75), bước sóng phát hiện 270 nm Yêu cầu số đĩa lý thuyết phải lớn hơn 3000 tính theo pic gentiopicrin

1 Cao đặc Long Đởm (Hàm lượng gentiopicrin

không dưới 2% cao khô tuyệt đối)

TRƯỜNG CAO ĐẲNG Y TẾ HÀ NỘI

VIEMDA AD CREAM

Kem bôi ngoài da 20gam

(Sản phẩm nghiên cứu, không bán)

Chống chỉ định:

Mẫn cảm với thành phần của thuốc

khác nhau của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động Pha tĩnh được cố định trên cột hay trên bề mặt chất rắn Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác pha tĩnh-pha động và chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính, định lượng

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatoghraphy - HPLC) là một nhóm các phương pháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc

và không đồng tan với nhau Pha động là một chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc một chất mang rắn đã được liên kết hóa học

1.3.2 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.2.1 Hệ thống cấp pha động [12]

Pha động trong sắc ký lỏng thường là hai hay nhiều dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp Trước khi chạy mẫu, pha động cần lọc (màng lọc 0,45µm) và đuổi khí hòa tan trong pha động Khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, nhiễu đường nền

Có hai cách dùng để rửa giải pha động:

- Đẳng dòng: Thành phần pha động không thay đổi trong quá trình sắc ký

- Gradient: Pha động là hỗn hợp nhiều dung môi, thường 2-4 loại được đựng trong các bình khác nhau Tỷ lệ các thành phần dung môi, lưu lượng dòng hoặc cả tỷ lệ các thành phần và lưu lượng dòng thay đổi trong quá trình sắc ký theo chương trình đã định

1.3.2.2 Bơm cao áp [12]

Hệ thống bơm có chức năng tạo áp suất cao đẩy pha động từ bình dung môi qua hệ thống sắc ký Hệ thống bơm hiện nay được điều khiển bằng máy tính có thể lập chương trình để thay đổi tỉ lệ các thành phần pha động theo yêu cầu (sắc ký gradient)

Bơm HPLC cần đáp ứng các yêu cầu sau:

- Tạo được áp suất cao từ 3000-6000 psi (250-500 atm)

- Lưu lượng bơm khoảng 0,1-10 ml/phút

- Không bị ăn mòn bởi các thành phần pha động

- Có tốc độ bơm không đổi

Các máy sắc ký hiện đại có cấu hình hoàn thiện hơn

1.3.2.3 Bộ phận tiêm mẫu [12]

Để đưa mẫu vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hoặc tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay trong hệ tiêm mẫu tự động Sai số tiêm mẫu dùng van khoảng 0,5%

Cột bảo vệ được lắp trước cột sắc ký để loại các tạp chất có trong mẫu phân tích có thể làm giảm tuổi thọ của cột Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại.

Máy tính kết nối trực tiếp với hệ thống sắc ký, có phần mềm điều khiển

xử lý các số liệu về thời gian lưu, diện tích pic, hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết

1.3.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh

hưởng:

 Thời gian lưu tR [12]

Thời gian lưu của một chất là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, đến detector và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm mẫu đến lúc xuất hiện đỉnh của pic Thời gian lưu là thông tin về mặt

định tính của quá trình sắc ký, nó có giá trị xác định đối với một chất khi tiến hành sắc ký trong điều kiện xác định Ngoài ra trong một phép phân tích còn thời gian lưu hiệu chỉnh, được tính bằng công thức sau: tR’= tR – t0

Trong đó: t0 là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, nếu tR quá lớn thì pic doãng, thời gian phân tích kéo dài

 Hệ số phân bố K [12]

Là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng, xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột:

= CC

Trong đó:

Cs là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động

VS: Thể tích mẫu trong pha tĩnh

VM: Thể tích mẫu trong pha động

k’: tối ưu trong khoảng 1 ≤ k’ ≤ 8 k' nhỏ thì tR nhỏ, k' lớn thì pic doãng

 Hệ số chọn lọc α [9]

Đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của hai chất A và B,

người ta dùng hệ số chọn lọc α:

α = = ′ ′= ( )

( )Quy ước: Chất B là chất lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1

Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0

Yêu cầu: trong định lượng yêu cầu hệ số bất đối xứng pic nằm trong khoảng 0,8 - 2

 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột

WA; WB: là chiều rộng của pic đo ở đáy pic

W1/2A; W1/2B: độ rộng của pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu: Rs > 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 trong định tính Trong định lượng yêu cầu RS 2,0

1.3.4 Lựa chọn điều kiện sắc ký trong sắc ký phân bố

1.3.4.1 Pha tĩnh

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi trong cột, là yếu tố quan trọng quyết định

sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động sắc ký phân bố được chia làm 2 loại:

 Sắc ký phân bố pha thuận: pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc dẫn chất các chất phân cực

 Sắc ký phân bố pha đảo: pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất không phân cực hoặc ít phân cực

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose hay trên mạch carbon) Trong sắc ký phân

bố pha đảo, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt được sử dụng nhiều nhất

Hình 1.3: cấu tạo hạt silica đã silan hóa

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan

- R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc alkylamin –CH2NH2, alkyl nitril –CH2CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân bố pha thuận để

phân tích các chất phân cực

- R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl-R của mạch carbon (C2;C8;C18) hay các gốc carbon vòng phenyl Do các nhóm

OH thân nước được thay thế bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt pha tĩnh trở nên ít phân cực Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký phân bố pha đảo để phân tích các chất không phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn

có những nhóm –OH tự do gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích

Trong môi trường quá acid (pH <2), thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột

Trong môi trường base (pH >7), các nhóm OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base Trong tương tác này, khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –SiC18 dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có các đỉnh ra khác nhau hay là hiện tượng kéo đuôi Kết quả giảm đi độ chính xác

Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyl disizan (ít

sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này Cấu trúc liên kết được trình bày như sau:

Hình 1.4: cấu trúc cột LC-DB

Có cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương tác với nó là thay những nhóm methyl của –Si(CH3)2C18 bằng các nhóm thế lớn hơn như isopropyl để những nhóm này sẽ che chắn đi những nhóm –OH, được trình bày như hình dưới đây:

Hình 1.5: cấu trúc cột có gốc isopropyl Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên mạch C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của mạch C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh

1.3.4.2 Lựa chọn pha động

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu tố thứ 2 quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: nước, methanol, acetonitril hoặc hỗn hợp của chúng Các dung môi này có thể hòa tan thêm một lượng nhỏ acid, muối, kiềm hoặc dung môi hữu cơ không phân cực

Pha động trong HPLC ảnh hưởng đến rất nhiều thông số của quá trình

sắc ký như: độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs, độ rộng pic nên việc phân tích và lựa chọn pha động là rất quan trọng

Yêu cầu của pha động:

 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian

 Hòa tan chất cần phân tích

 Có độ tinh khiết cao

 Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

 Có tính kinh tế và ít gây ô nhiễm môi trường

Các yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả:

 Bản chất của dung môi để pha pha động

 Thành phần các chất trong pha động

 pH của pha động

 Tốc độ dòng của pha động

Chọn đệm-pH:

Trong sắc ký phân bố mà chất tan có tính acid hoặc base thường phải

sử dụng đệm ở pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký

Tốc độ dòng của pha động:

Để tăng hiệu lực tách của quá trình sắc ký, phải chọn tốc độ dòng pha động phù hợp, đảm bảo việc tách các chất phân tích được tốt nhất mà đạt hiệu quả cao về thời gian và kinh tế Khi tốc độ dòng quá nhỏ có thể tách tốt hơn nhưng thời gian phân tích kéo dài và doãng pic

1.3.4.3 Lựa chọn detector

Khi pha động rửa giải các chất ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bởi detector chuyển thành tín hiệu và ghi trên sắc ký đồ Detector phổ biến nhất là detector UV-VIS, sử dụng để phát hiện các chất trong công thức có nhóm mang màu (nối đôi liên hợp, vòng thơm, ) Tùy theo chất cần phân tích mà

người ta đặt các bước sóng phát hiện khác nhau dựa vào bước sóng cực đại của chất phân tích trong điều kiện tiến hành sắc ký đã khảo sát

1.3.5.2 Phương pháp định lượng và cách tính kết quả trong HPLC

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao và diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký:

 Phương pháp chuẩn ngoại

 Phương pháp chuẩn nội

 Phương pháp thêm chuẩn

 Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Dựa trên việc so sánh đáp ứng pic của mẫu thử với mẫu chuẩn được phân tích trong cùng một điều kiện Nồng độ (hàm lượng) của chất chưa biết được tính toán dựa trên nồng độ (hàm lượng) chất chuẩn đã biết hoặc suy ra

từ đường chuẩn hoặc so sánh với chuẩn có nồng độ tương đương

Trong phạm vi khóa luận này, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn hóa một điểm và đường chuẩn:

- Chuẩn hóa một điểm: chuẩn bị một mẫu chất chuẩn và một mẫu chất thử Tiến hành song song với nhau Căn cứ vào diện tích pic của chất chuẩn, chất thử và nồng độ chất chuẩn, tìm được nồng độ chất thử

- Phương pháp đường chuẩn: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần, thường từ 5 - 7 điểm Tiến hành sắc ký Thiết lập mối

tương quan giữa đáp ứng phân tích và nồng độ chuẩn

Điều kiện áp dụng phương pháp đường chuẩn là trong khoảng nồng độ khảo sát, chứng minh luôn có tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân

tích với diện tích pic của chất phân tích

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG - HÓA CHẤT - THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Chế phẩm Kem VIEMDA AD của Trường Cao Đẳng Y Hà Nội (tuyp 20g, sản xuất ngày 25/04/2013, hạn dùng 2 năm kể từ ngày sản xuất) thuộc đề tài cấp thành phố Hà Nội

2.2 THIẾT BỊ - HÓA CHẤT

2.2.1 Thiết bị:

- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent của Mỹ

- Máy lắc xoáy tốc độ caoVortex mixer VM 300 của Đài Loan

- Máy lắc siêu âm: Bandelin Sonorex super RK 106 của Đức

- Nồi đun cách thủy Wisecircu của Tây Ban Nha

- Cân phân tích Metller Toledo (d = 0,01 mg) của Thụy sĩvà Sartorius (d

1 Gentiopicrin chuẩn của Trung Quốc (hàm lượng 100%)

2 MeOH loại dùng cho máy HPLC của Meck Damstaat, Đức

3 Nước cất hai lần

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU