Xác định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc

Hình 1.1: Sắc ký lớp mỏng phát hiện bufalin 1.2.4 Phương pháp LC-MS/MS Có nhiều nghiên cứu về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích bufalin.. Về cơ bản, đây là phương pháp sắc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN QUỐC LONG

XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN

QUAN ĐẾN CÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN QUỐC LONG

XÁC ĐỊNH BUFALIN TRONG MỘT SỐ SẢN PHẨM HỖ TRỢ SỨC KHỎE LIÊN

QUAN ĐẾN CÓC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

và viết khóa luận

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đặc biệt là TS Lê Thị Hồng Hảo đã tạo mọi điều kiện cho em được thực hiện đề tài tại đây

Em xin chân thành cảm ơn Ths Trần Cao Sơn, CN Đỗ Thị Thu Hằng cùng toàn thể các anh chị trong labo Hóa đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia

sẻ mọi khó khăn cùng em

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Trần Quốc Long

1.1 Các bufotoxin và bufalin 2

1.1.1 Giới thiệu chung về họ cóc và các bufotoxin 2

1.1.2 Bufalin 3

1.1.3 Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc 4

1.1.4 Các chế phẩm và bài thuốc dân gian có nguồn gốc từ cóc 4

1.2 Một số phương pháp xác định bufalin 5

1.2.2 Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) 5

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector PDA (HPLC-PDA) 6

1.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 7

1.2.4 Phương pháp LC-MS/MS 7

1.3 Kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ (LC-MS) 9

1.3.1 Sắc ký lỏng 9

1.3.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) 11

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên vật liệu- trang thiết bị 15

2.2.1 Nguyên vật liệu 15

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ 16

2.3 Nội dung, phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 17

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 17

3.1 Thiết lập điều kiện phân tích bufalin bằng LC-MS/MS 22

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS) 22

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 24

3.1.2.1 Pha tĩnh 24

3.2.3 Khảo sát thể tích chiết 32

3.2.4 Khảo sát cột chiết 33

3.2.5 Khảo sát dung dịch rửa giải 33

3.2.6 Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải 34

3.3 Thẩm định phương pháp 36

3.3.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 36

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 38

3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn 38

3.3.4 Độ lặp lại 39

3.3.5 Độ đúng 40

3.3.6 Bàn luận 41

3.4 Phân tích mẫu thực tế 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

Kết luận 43

Kiến nghị 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

GC-MS Gas chromatography mass spectrometry Sắc ký khí khối phổ

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSCCC High speed countercurrent

chromatography

Sắc kí phân bố ngược dòng tốc độ cao

LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass

spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

Bảng 1.2: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đề phân tích

bufalin 8

Bảng 2.1: Sản phẩm có thành phần làm từ cóc được nghiên cứu trong đề tài 15

Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 22

Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS 24

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu và diện tích pic bufalin 26

Bảng 3.4: Khảo sát các chương trình chạy gradient 27

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát chương trình chạy gradient 28

Bảng 3.6: Khảo sát tốc độ dòng pha động 29

Bảng 3.7: Chương trình gradient tối ưu 29

Bảng 3.8: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 31

Bảng 3.9: Khảo sát dung môi chiết 32

Bảng 3.10: Khảo sát thể tích dung môi chiết 32

Bảng 3.11: Khảo sát cột chiết pha rắn 33

Bảng 3.12: Khảo sát dung dịch rửa giải 34

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát thể tích dung dịch rửa giải 35

Bảng 3.14: Ion mẹ và 2 ion con của bufalin 37

Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của bufalin 39

Bảng 3.16: Kết quả đánh giá độ lặp lại 40

Bảng 3.17: Kết quả đánh giá độ đúng 41

Bảng 3.18: Kết quả phân tích bufalin trong mẫu sản phẩm dinh dưỡng có thành phần từ cóc 42

Hình 1.2: Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 9

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS 11

Hình 1.4: Bộ nguồn ion hóa 12

Hình 1.5: Mô hình bộ phân tích tứ cực chặp ba 14

Hình 2.1:Các bước của quá trình chiết pha rắn 18

Hình 3.1: Sắc ký đồ của dung dịch bufalin chuẩn với pha động ACN - HCOOH 0,1% 26 Hình 3.2: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 31

Hình 3.3: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 36

Hình 3.4: Sắc đồ mẫu trắng 37

Hình 3.5: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn 50 ng/ml 37

Hình 3.6: Sắc đồ mẫu bột đạm cóc phát hiện có bufalin 38

Hình 3.7: Sắc đồ bufalin tại LOD 38

Hình 3.8: Đường hồi quy tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chuẩn bufalin 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cóc nhà (Bufo melanostictus) thuộc họ Cóc-Bufonidae, được dùng trong đông y

và dân gian như một loại thực phẩm bổ dưỡng cho người già, một loại thuốc quý để hỗ trợ, tăng cường dinh dưỡng sau ốm dậy, dùng để chữa bệnh trẻ em suy dinh dưỡng, chán ăn, chậm lớn, gầy còm, còi xương, cam tích, lở ngứa trẻ em [2] Trong thịt cóc, có rất nhiều acid amin có giá trị (asparagin, histidin, tyrosin, methionin, leucin, isoleucin, phenylamin, tryptophan, cystein), hàm lượng một số nguyên tố vi lượng có ích như kẽm, mangan cao hơn rất nhiều so với các loài động vật khác [2] Như vậy giá trị dinh dưỡng của thịt cóc rất cao

Bên cạnh giá trị dinh dưỡng đã được chứng minh của thịt cóc, đã có nhiều trường hợp tử vong do ăn thịt cóc có nhiễm độc tố cóc, tính tới ngày 8/9/2010, toàn quốc ghi nhận 06 vụ ngộ độc do độc tố trong cóc (bufotoxin) xảy ra trên địa bàn 6 tỉnh/thành phố làm 17 người mắc, 13 người đi viện và 05 người chết [1] Các nghiên

cứu đã công bố xác định trong nhựa cóc Việt Nam – Bufo melanostictus có bufalin,

resibufogenin, bufotalin và nhiều bufadienolides khác, trong đó bufalin là thành phần

chính Đây là điểm khác biệt so với cóc Trung Quốc - Bufo gargarizans (trong nhựa có

chứa cinobufagin là thành phần chính) [21]

Hiện nay ở Việt Nam chưa có một phương pháp chính thức để phân tích phát hiện độc tố cóc trong các sản phẩm dinh dưỡng có thành phần từ cóc Vì vậy, để góp phần kiểm soát các nguy cơ tiềm ẩn ngộ độc độc tố cóc, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Xác định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe liên quan đến cóc” với

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Các bufotoxin và bufalin

1.1.1 Giới thiệu chung về họ cóc và các bufotoxin

Họ Cóc (Bufonidae) có 529 loài [11], trong đó 16 loài có các chất độc nhóm

bufotoxin (trong nội tạng (gan, trứng) và nhựa ở da, tuyến mang tai), bao gồm loài cóc

nhà Việt Nam B melanostictus Trong thịt cóc không có chất độc “Nhựa cóc” còn gọi

là thiềm tô (secretio bufonis) là nhựa tiết ở tuyến sau mang tai, tuyến trên mắt và các tuyến trên da của cóc Chất độc trong nhựa cóc, trong gan và buồng trứng cóc có độc tính rất cao [7]

Hợp chất bufotoxin là nhóm các chất độc thường thấy ở tuyến nhựa sau tai, da

và nội tạng của nhiều loài cóc, một số loài lưỡng cư khác và ở một số loài cây và nấm [12] Đây là một hỗn hợp gồm hơn 36 hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau: 5-MeO-DMT, bufalin, resibufogenin, cinobufagin, bufagin, bufotalin, bufogenin, bufothionin, epinephrin, norepinephrin và serotonin… trong đó có những chất được xếp vào nhóm không gây độc bao gồm cholesterol, provitamin D, ergosterol và gamma sitosteral Những chất gây độc được xếp thành 3 nhóm:

- Nhóm 1: Các glycosis có tác dụng lên tim (hay bufadienolides) chủ yếu gồm bufalin, cinobufagin và resibufogenin có tác động trên hệ tim mạch của động vật và con người

- Nhóm 2: Phenethylamines và dẫn xuất Bao gồm các catecholamines như: dopamine, norepinephrine và epinephrine

- Nhóm 3: Tryptamines và dẫn xuất: serotonin, bufotenin, 5-methoxy-N,N- dimethyltryptamin (5-MeO-DMT) chúng có tác dụng tăng huyết áp và gây ảo giác và/hoặc hưng thần (psychoactive)

1.1.2 Bufalin [24]

 Tên thông thường: Bufalin

 Danh pháp quốc tế: (3β,5β)-3,14-Dihydroxybufa-20,22-dienolide, 5β,20(22)-Bufadienolide-3β,14-diol

Gần đây bufalin được nghiên cứu có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u LD50 của bufalin trên chuột là 2.35 mg/kg, rất độc đối với tim gây sung huyết tế bào cơ tim [25]

Tác giả Yasuharu H [29] đã nghiên cứu so sánh hoạt lực của bufalin tác dụng trên kênh Na+-K+-ATPase tại tế bào cơ tim của chuột với các glycosis tim khác, kết quả như sau: bufalin > digoxin > digitoxin > telocinobufagin > gamabufotalin > cinobufotalin > cinobufagin > g-strophanthin > digitoxingenin > resibufogenin [29]

1.1.3 Ngộ độc do ăn cóc và các sản phẩm chế biến từ cóc

Trong thời gian qua trong thực tế có rất nhiều vụ ngộ độc do độc tố cóc gây ra Triệu chứng ngộ độc độc tố cóc biểu hiện cấp tính, xuất hiện từ 1 - 2 giờ sau khi ăn (có thể sớm hơn nếu uống rượu, bia) với các biểu hiện sau:

+ Rối loạn tiêu hoá: Bệnh nhân bị chướng bụng, đau bụng trên rốn; kèm theo nôn mửa

dữ dội; có thể bị tiêu chảy

+Rối loạn tim mạch: Bệnh nhân hồi hộp, đánh trống ngực, tim đập nhanh; sau đó loạn nhịp tim (ngoại tâm thu thất, cơn nhịp nhanh thất), rung thất, block nhĩ - thất dẫn đến truỵ tim mạch; huyết áp lúc đầu cao sau đó tụt

+Rối loạn tâm thần kinh: Bệnh nhân rối loạn cảm giác (đau như kim chích ở đầu ngón tay, ngón chân, tê môi ), chóng mặt, ảo giác, vã mồ hôi lạnh, tăng tiết nước bọt; có thể

1.1.4 Các chế phẩm và bài thuốc dân gian có nguồn gốc từ cóc

- Dân gian [2]: Nhựa cóc là 1 trong 6 vị của đơn thuốc “Lục thần hoàn” Trong

nhân dân dùng nhựa cóc chữa giảm đau, tán thuỷ, dùng chữa phát bối, đinh độc, yết

hầu sưng đau, đau răng Thịt cóc khô dùng với liều 2 – 3 g tán bột uống hoặc làm thành thuốc viên, chữa gầy còm, chậm lớn, kém ăn, suy dinh dưỡng, Hiện nay có khá nhiều sản phẩm hỗ trợ sức khỏe trên thị trường có nguồn gốc làm từ cóc như: bột đạm cóc (Viện Dinh Dưỡng), bột cóc baby (Công ty CP Dược Hải Phòng), bột cóc royal baby (Công ty CP Công nghệ và Hóa sinh Hà Nội),…

- Tại Trung Quốc thuốc Chansu (được biết đến với tên Senso tại Nhật Bản, tên Somsa tại Hàn Quốc) chế từ chất tiết trên da và tuyến mang tai cóc hiện được sử dụng khá rộng rãi [12] Thuốc có hoạt tính gây tê cục bộ, tăng huyết áp, cường hô hấp, kháng ung thư và ảnh hưởng trên tim mạch tuy nhiên giới hạn điều trị hẹp nên khá thận trọng khi sử dụng [11]

1.2 Một số phương pháp xác định bufalin

1.2.2 Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC)

Sắc ký phân bố ngược dòng là phương pháp sắc ký trong đó cả pha tĩnh và pha động ở trạng thái lỏng Do không sử dụng giá mang rắn nên sắc ký phân bố ngược dòng loại trừ được những khó khăn thường gặp trong các phương pháp sắc ký trên pha tĩnh rắn như mất mẫu hay phân hủy mẫu

Tác giả Li J và cộng sự [14] đã sử dụng phương pháp HSCCC kết hợp với sắc

ký điều chế HPLC để phân lập và tinh chế thành công tám bufadienolides (trong đó có bufalin) từ ChanSu Tác giả sử dụng chế độ rửa giải từng bước của HSCCC với hệ thống dung môi gồm petroleum ether-ethyl acetate-nước-methanol (4:6:4:6, 4:6:5:5, v / v) Sau đó sử dụng sắc ký điều chế HPLC để tách các bufadienolides, cấu trúc của chúng được xác nhận bởi ESI-MS và phổ 1

H-NMR

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với detector PDA (HPLC-PDA)

Bảng 1.1: Các nghiên cứu dùng phương pháp HPLC-PDA để phân tích bufalin

- Độ thu hồi trung bình của bufalin là 98,0%

[22]

- Nền mẫu: Gan người

- Chất nội chuẩn: Ethinyl estradiol (10 µg/ml)

- Dung môi chiết: Hỗn hợp acid photphoric đậm đặc

- LOD = 0,4 ng

- Độ thu hồi > 70%

1.2.3.Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Tác giả Hyo-Jae Lee và cộng sự [13] đã sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng

để phân biệt và phát hiện bufadienolides (bufalin, cinobufagin, resibufogenin, cinobufotalin) chiết từ nọc độc cóc Điều kiện phân tích: bản mỏng silica GF254, pha động: chloroform – aceton (10 : 3), hiện màu bằng dung dịch acid sulfuric 10%

Hình 1.1: Sắc ký lớp mỏng phát hiện bufalin

1.2.4 Phương pháp LC-MS/MS

Có nhiều nghiên cứu về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích bufalin Một số nghiên cứu được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 1.2: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đề phân tích bufalin

diethyl ether (4:1)

Acetonitrile - H 2 O (0,1% HCOOH), chế độ gradient/ 0,2 ml/phút

MS/MS 86.3±0.7

UPLC-ESI-1 ng/ml

[26] Chansu Ethyl

acetat

Acetonitrile - H 2 O (0,3 %

CH3COOH), chế độ gradient/ 0,7

ml/phút

Silicagel

HPLC/APCI-MS/MS 99.9

1 ng/g

Acetonitrile - H 2 O (0,1% HCOOH), chế độ gradient/ 0,3 ml/phút

MS/MS

LC/ESI- 106%

84-0.25 ng/ml

Oasis®HLB

HPLC/TOF-MS 85,28

0.15 ng/ml

Để phân tích hàm lượng các độc tố của cóc, hiện tại phương pháp chính được sử dụng là sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS) Về cơ bản, đây là phương pháp sắc

ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là thiết bị khối phổ Phương pháp có nhiều ưu điểm

như: giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau, có tính chọn lọc cao, với khả năng xác định các chất dựa vào khối lượng và cấu tạo của chất nên rất đặc trưng cho từng chất [18]…Với những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để nghiên cứu thiết lập phương pháp phân tích bufalin

1.3 Kỹ thuật sắc ký lỏng kết nối khối phổ (LC-MS)

Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng bộ phận phát hiện là detector khối phổ Mô hình đơn giản của hệ thống LC-MS như ở hình 1.2

Hình 1.2: Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS

1.3.1 Sắc ký lỏng [4]

Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động

là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 2 – 5 µm Trong phần tổng quan này, chúng tôi chỉ đi sâu trình bày về kỹ thuật sắc ký phân bố là loại kỹ thuật phổ biến nhất Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, pha động sử dụng, sắc ký lỏng phân bố được chia làm 2 loại: sắc ký pha thuận (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

tích khối

Detector/Lưu giữ số liệu

Chân không

 Sắc ký pha thuận: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica không xử

lý hóa học mang nhóm silanol hoặc các silica được gắn các nhóm chức phân cực:

-NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluene Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực

 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động phân cực: nước, methanol, acetonitril Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt

Có thể chia pha động làm hai loại:

 Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như MeOH, ACN Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược

 Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, triclomethan, toluen

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực

từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ

Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò tách các chất mà còn góp phần vào khả năng ion hoá của chất Chúng cũng có những yêu cầu cao hơn về độ tinh khiết, hàm lượng các tạp chất Có những loại pha động được sản xuất riêng cho LC-MS/MS

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp Một số loại detector dùng trong HPLC như: Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), detector huỳnh quang (RF), detector độ dẫn, detector mảng diot (PDA), detector khối phổ (MS)

1.3.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) [18]

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z

và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện (hình 1.3) Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Sau

khối

Detector

Xử lý và lưu giữ liệu Phổ khối

Chân không cao Tránh ion phân tích va chạm

với ion trong không khí

đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyển thành tín hiệu Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ

 Nguồn ion

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa đầu phun điện tử (ESI), ion hóa hóa học

ở áp suất khí quyển (APCI) Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion hoá phun điện tử (ESI)

Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:

+ Tạo thành các giọt mang điện tích

+ Làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt

+ Quá trình hình thành pha hơi các ion

Hình 1.4: Bộ nguồn ion hóa

Khi dung dịch mẫu ra khỏi cột sắc ký, được đưa vào ống mao quản bằng kim loại Đầu mao quản này được áp điện thế cao (4-6 kV) Khi điện tích dư trên đầu mao quản vượt qua sức căng bề mặt của dịch mẫu thì sẽ tạo thành các giọt mang điện tích Tiếp đó các giọt mang điện này được làm giảm kích thước nhờ hai quá trình liên tục xảy ra, đó là sự hóa hơi dung môi nhờ dòng khí N2 được liên tục thổi vào và sự bắn phá của các giọt tích điện cùng dấu Cuối cùng dẫn đến sự hình thành pha hơi của các ion

Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ phân tích khối phổ qua một cửa

sổ rất nhỏ Dung môi và khí trơ N2 được hút ra ngoài do một dòng khí (Curtain Gas)

Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm

 Loại hình thành ion dương

o Phù hợp nhất cho phân tích các loại chất phân tích có tính bazơ

o Thường hình thành nên ion [M+H]+

o Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+ , [M+Na+]+

 Loại hình thành ion âm

o Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại chất phân tích có tính acid

o Hình thành nên ion [M-H]-, [M-nH]

n-Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol, và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ

 Bộ phận phân tích khối: Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân

tích khối nhằm loại bỏ những ion không cần thiết, lựa chọn các ion phân tử, thực hiện bắn pha thêm để thu được các ion con Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay Bộ phân tích khối ba tứ cực được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật LC-MS/MS và đây chính là

kỹ thuật được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này

Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống

để các ion bay qua Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF) Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF Chỉ những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này

Bộ phân tích khối ba tứ cực gồm ba tứ cực ghép nối với nhau (hình 1.5) Trong

đó, tứ cực thứ nhất (Q1) có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định

từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2 Ở tứ cực thứ hai (Q2) các ion phân tử bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions) Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến Sau

đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3 Bộ tứ cực thứ ba (Q3) làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện

Hình 1.5: Mô hình bộ phân tích tứ cực chặp ba

 Bộ phận phát hiện: Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối, các ion được đưa tới

phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận phát hiện cho phép khối phổ tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển Có hai loại bộ phận phát hiện

phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có

độ nhạy cao Các ion đập vào bề mặt diod làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các diod tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một diod tạo ra dòng các electron Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phospho và giải phóng

ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn

Q0

Bảng 2.1: Sản phẩm có thành phần làm từ cóc được nghiên cứu trong đề tài

4777/2012/ATTP-Bột cóc, lyzin, vitamin B1, kẽm gluconat, canxi lactat, bột đậu

Cóc sấy khô, đậu tương, đậu xanh, natri sorbat, hương vani

02/08/2013 02/08/2014

2.2 Nguyên vật liệu- trang thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

a Chất chuẩn

- Chất chuẩn Bufalin: Hãng Wako Pure, Ltd Độ tinh kiết > 98%

- Dung dịch chuẩn gốc bufalin nồng độ 1000 µg/ml: Cân 10 mg chất chuẩn pha vào 10 ml methanol, bảo quản trong bình tối tránh ánh sáng ở nhiệt độ 2-80C

- Dung dịch chuẩn trung gian 100 µg/ml: Hút 0,5 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 5 mL và định mức vừa đủ bằng Bảo quản ở 2-80C

- Dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 10 µg/ml, 5 µg/ml, 2 µg/ml, 1 µg/ml

Nồng độ dung dịch chuẩn trung gian (µg/ml) 100 100 100 100 Thể tích hút chuẩn trung gian (µl) 500 250 100 50

b.Hóa chất, dung môi

- Dung môi tinh khiết cho HPLC: methanol, acetonitril (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: acid formic, acid acetic băng, amoni acetat (Merck)

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ

 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS

- Cột sắc ký Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm) và tiền cột C18 (4

mm x 4,6 mm, cỡ hạt 5 µm)

- Máy lắc vortex IKA

- Máy li tâm (Heraus)

- Cân phân tích Metter Toledo (có thang đọc tới 0,1 mg và 0,01 mg)

- Máy cất quay chân không (Eyala)

- Bộ chiết pha rắn (Sulpelco) và máy hút chân không (New Askir 30)

- Bộ thổi khô (OA-Sys)

- Ống li tâm 50 ml

- Bình cô quay 100 ml

- Vial loại 1,8 ml

- Ống nghiệm thủy tinh

- Ống đong, phễu, giấy lọc

- Autopipet loại 100 µl ,200 µl, 1000 µl, 5000 µl và đầu côn tương ứng

2.3 Nội dung, phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

 Tối ưu hóa điều kiện xác định bufalin bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

 Khảo sát quy trình chiết bufalin từ nền mẫu

 Thầm định phương pháp:

 Độ đặc hiệu của phương pháp

 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

 Độ lặp lại của phương pháp

 Độ thu hồi của phương pháp

 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

 Ứng dụng phương pháp: Áp dụng phương pháp mới xây dựng để xác định bufalin trong một số sản phẩm hỗ trợ sức khỏe có chứa thành phần làm từ cóc hiện đang lưu hành

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

a Phương pháp tách chiết mẫu

Đối tượng mẫu phân tích trong luận văn này là sản phẩm dinh dưỡng có nền mẫu phức tạp Do đó cần có phương pháp tách chiết mẫu thích hợp để giảm ảnh hưởng của nền mẫu, tránh làm bẩn detector, tăng khả năng phát hiện

Trong đề tài này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để tách chiết mẫu [6][15][22]

Chiết pha rắn là một phương pháp chuẩn bị để làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn Sau đó chất phân tích được rửa giải bằng một lượng dung môi thích hợp, các chất ảnh hưởng được loại bỏ

Các bước của quá trình chiết pha rắn được mô tả như sau [3]:

Hình 2.1:Các bước của quá trình chiết pha rắn

1 Hoạt hóa chất hấp phụ và pha rắn

 Làm ướt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ

 Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp hấp phụ

 Không được để chất hấp phụ bị khô

2 Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột

 Chất phân tích được làm giàu trên chất hấp phụ

 Một vài thành phần ảnh hưởng khác cũng có thể bị giữ lại

 Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra

3 Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

 Loại bỏ chất gây ảnh hưởng và nền mẫu chỉ giữ lại chất phân tích

 Nếu mẫu là dung dịch nước, sử dụng hệ đệm hoặc hồn hợp nước-dung môi hữu cơ

 Chất hấp phụ chiết pha rắn thường sử dụng gồm các loại:

 Chất hấp phụ pha thường: Các silica trung tính, oxit nhôm

 Chất hấp phụ pha ngược: Các silica đã được ankyl hóa nhóm –OH

 Chất có khả năng trao đổi ion

 Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước

 Chất hấp phụ pha khí-rắn

Hiện nay, phương pháp chiết pha rắn ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến do những ưu điểm vượt trội sau:

 Hiệu suất thu hồi cao

 Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích dễ dàng

 Giảm lượng dung môi sử dụng

 Có khả năng kết hợp các phương pháp phân tích

 An toàn, đơn giản và có thể tiến hành hàng loạt

 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Giới hạn phát hiện LOD: là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có

thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được

Giới hạn định lượng LOQ: là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử

mà ta có thể định lượng và cho kết quả có độ chụm mong muốn

Xác định LOD, LOQ dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích (n=4) Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)

LOD là nồng độ mà tại đó S/N = 3

LOQ là nồng độ mà tại đó S/N = 10

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích

N là nhiễu đường nền

 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ

thuộc tuyến tính giữa đại lượng được đo và nồng độ các chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng được

đo và nồng độ các chất phân tích

Để xác định khoảng tuyến tính người ta thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong sự phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Có thể xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích

 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (đánh giá độ chụm) là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay hệ số biến thiên CV(%):

i i

Trong đó:

xi: Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i

x: Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

N: Số lần thử nghiệm

Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận Độ đúng là khái niệm định tính và được biểu diễn định lượng dưới dạng độ thu hồi (recovery) Độ thu hồi (đánh giá độ đúng) là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

R(%) = C

Cc x100%

Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

C (Ctt) : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/ml)

Cc (Clt) : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/ml)

d Phương pháp xử lý số liệu

Các kết quả được tính toán tự động theo phần mềm phân tích của thiết bị (phần mềm Analyst 1.5.1, ABSciex) Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsotf Excel

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thiết lập điều kiện phân tích bufalin bằng LC-MS/MS

3.1.1 Tối ưu các điều kiện của detector khối phổ (MS)

Qua tham khảo một số tài liệu [7][10][24][27], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định bufalin bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion dương

a.Tối ưu hóa điều kiện phân mảnh của bufalin (Compound Optimization)

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ

có dạng (M+H)+ Detector được sử dụng trong nghiên cứu này là khối phổ hai lần, do

đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc chọn được ion con là rất quan trọng Với

hệ thống Tripquad 5500, điều kiện phân mảnh của từng chất được tối ưu hóa tự động

Dùng xilanh 500 μL, bơm chuẩn bufalin 100 ng/ml trực tiếp vào detector khối phổ, lựa chọn 2 ion con có cường độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lượng bufalin

Bảng 3.1: Các thông số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh

Ion mẹ (m/z)

Ion con (m/z)

DP (V)

CE (V)

CXP (V)

+ CXP (collision cell exit potential): Thế áp giữa bộ tứ cực Q2 và Q3

+ CE (collision energy): Là năng lượng va chạm được tạo ra do thế áp vào bộ

tứ cực Q2, tạo ra năng lượng để phân mảnh ion mẹ

Mảnh ion con m/z=351 có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh con thứ hai m/z=255 có cường độ thấp hơn dùng để định tính bufalin

b.Tối ưu hóa các điều kiện của nguồn và khí (Source and gas Optimization)

Để tối ưu hóa điều kiện MS cho từng chất, chúng tôi sử dụng kỹ thuật FIA, nghĩa là hỗn hợp chuẩn được bơm trực tiếp váo máy MS mà không qua bộ HPLC

Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lượng và định tính của bufalin

Các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion

+ IS (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phận phân tích ion Thế này sẽ quyết định loại ion chuyển đến bộ phận phân tích khối Đối với loại ion dương 4000 – 5500V, ion âm (-)3000 – (-)4000V

+ GS1 (Ion Source Gas 1): Tạo áp suất khí hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho sự hình thành nên các giọt được dễ dàng hơn Tốc độ khí của Gas 1 thường cao hơn so với Gas 2

+ TEM ( Temperature): Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào (Gas2) Nó thúc đẩy quá trình hóa hơi các giọt chất phân tích khi đi ra khỏi đầu phun

+ GS2 (Ion Source Gas 2): Tạo áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay hơi dung môi, tăng hiệu quả của quá trình ion hóa

+ CUR (Curtain Gas): Luồng khí N2 tinh khiết được thổi vào khe giữa 2 màn chắn của bộ phận ion hóa và bộ phận phân tích phổ Nó có tác dụng đẩy các giọt dung môi và các phân tử trung hòa, để giữ cho Q0 (nguồn ion mẹ ) sạch hơn

Các thông số của bộ phận phân phân tích khối:

+ DP, CE, CXP như đã giải thích ở trên

+ EP (Entrance Potential): Thế áp vào nguồn ion mẹ Q0

+ CAD (Collisionally activated dissociation): Kiểm soát áp suất khí N2 trong

bộ tứ cực Q2, thúc đẩy quá trình phân mảnh thứ cấp, ngoài ra còn có tác dụng làm mát các ion con và hướng chúng đến bộ tứ cực Q3

Tự động khảo sát các thông số cho từng chất trên với các giá trị như sau:

GS1 (psi)

GS2 (psi)

CUR (psi)

DP (V)

EP (V)

CAD (psi)

CXP (V)

CE (V)

Giá trị

Kết luận: Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện MS và đưa ra được các

điều kiện tối ưu như trong bảng trên

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.1.2.1 Pha tĩnh

Trong nghiên cứu này, qua tham khảo các tài liệu [16][24] [26], chúng tôi chọn cột pha đảo C18 để phân tích Bufalin Đây là loại pha tĩnh phổ biến, phù hợp các điều kiện của phòng thí nghiệm Để bảo vệ cột, chúng tôi sử dụng thêm tiền cột Thông số cột tách và tiền cột:

 Cột: Symmetry C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm)

500 ng/ml để khảo sát dung môi pha động Hơn nữa để có thể vừa tách được bufalin, vừa tiết kiệm được thời gian phân tích và dung môi, chúng tôi tiến hành chạy pha động với chế độ gradient Các điều kiện chạy máy được cố định như sau:

 Cột: Symmetry water C18 (250 mm x 4,6 mm, 5µm)

 Tiền cột C18 (4 mm x 4,6 mm, 5 µm)

 Detector khối phổ với các thông số ở bảng 3.2

 Pha động: lần lượt sử dụng các hỗn hợp acetonitrile – acid formic 0,1 %; acetonitril – acid acetic 0,1% và acetonitril – amoni acetat 0,1 % theo chương trình gradient dưới đây: