Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào pako vân kiều

Trước những yêu cầu và điều kiện như vậy, đề tài nghiên cứu “ Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc

KIỀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu và các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

Các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược

Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận

PGS.TS Nguyễn Thị Hoài, Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Huế

TS Phương Thiện Thương, Khoa Phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân - những người

đã ủng hộ, chia sẻ, động viên tôi những lúc khó khăn và giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, tháng 5, năm 2013 Sinh viên

Nguyễn Thị Huệ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về bệnh gút 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Mối liên quan giữa bệnh gút và sự tăng acid uric máu, vai trò của enzym xanthin oxidase 3

1.1.3 Thuốc ức chế xanthin oxidase 5

1.2 Tổng quan về xanthin oxidase 6

1.2.1 Nguồn gốc, phân bố 6

1.2.2 Cấu trúc, cơ chế hoạt động 7

1.2.3 Động học enzym 9

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzym 9

1.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro 11

1.3.1 Phương pháp đo quang 12

1.3.2 Phương pháp đo áp 13

1.3.3 Phương pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang 14

1.4 Các dược liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase 14

1.5 Thông tin về một số dược liệu của đồng bào Pako- Vân Kiều 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 17

2.1.2 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu 18

2.2 Phương tiện nghiên cứu 18

2.2.1 Thuốc và hóa chất 18

2.2.2 Thiết bị và dụng cụ 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng 20

2.4.2 Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều 24

2.4.3 Phương pháp thống kê 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Kết quả 26

3.1.1 Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng 26

3.1.2 Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều 31

3.2 Bàn luận 37

3.2.1 Về triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng 37

3.2.2 Về áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako – Vân Kiều 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO vii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ABTS : 2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)

AHP : 2-amino-4-hydroxypteridin

DMSO : dimethyl sulfoxid

HPLC : sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography)

IC50 : nồng độ ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration)

IXP : isoxanthopterin

NSAIDs : thuốc chống viêm không steroid (non steroidial anti inflammatory drugs)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thông tin về một số cây thuốc của đồng bào Pako –

Vân Kiều 16

Bảng 2.1 Danh sách các cây thuốc nghiên cứu 17

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase

của allopurinol ở các nồng độ khác nhau 28

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase

của Quercetin ở các nồng độ khác nhau 30

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase

của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 100µg/mL 32

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase

của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 50µg/mL 33

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase

của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 10µg/mL 34

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase

của cây mán đĩa theo từng nồng độ khác nhau 35

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa base purin 4

Hình 1.2 Cấu trúc xanthin oxidase 7

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động của xanthin oxidase 8

Hình 1.4 Đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S] trong sự có mặt

và vắng mặt chất ức chế 11

Hình 2.1 Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzym 21 Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm xây dựng đồ thị phương trình

Linewweaver – Burk 22

Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin

oxidase của một mẫu thử 23

Hình 2.4 Quy trình thí nghiệm xác định cơ chế ức chế xanthin

oxidase 24

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc theo thời gian của

lượng acid uric tạo thành (biểu diễn thông qua OD)

với các dung dịch enzym ở nồng độ khác nhau 26

Hình 3.2 Đồ thị Lineweaver – Burk của xanthin oxidase 27 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của

allopurinol theo nồng độ 29

Hinh 3.4 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của

quercetin theo nồng độ 30

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của

cao toàn phần Mán đĩa theo nồng độ 36

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn cơ chế ức chế xanthin oxidase của cao

phần mán đĩa 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gút là một bệnh chuyển hóa, có liên quan trực tiếp đến chế độ ăn uống giàu acid nucleic như thịt (đặc biệt là nội tạng), các loại đậu, một số loại hải sản và nấm men Bệnh xảy ra ở mọi dân tộc, mọi điều kiện địa dư và khí hậu, có chiều hướng phát triển ở thành thị và các tầng lớp có mức sống cao [1] Trên thế giới hiện nay, tỉ

lệ mắc gút ở người trưởng thành là 1%, đây cũng là bệnh viêm khớp phổ biến nhất

ở nam giới [14] Ở Việt Nam gần đây, đời sống người dân ngày càng cao lại được quan tâm chẩn đoán nên tỉ lệ phát hiện mắc gút ngày càng lớn [12]

Trước tình hình bệnh gút ngày càng phổ biến, các nghiên cứu phát triển thuốc điều trị gút ngày càng được quan tâm Bên cạnh việc phát triển các thuốc tổng hợp hóa học, thực vật và dược liệu cũng là một nguồn nguyên liệu to lớn để tìm ra các hướng đi cho quá trình điều trị bệnh gút Nhiều nghiên cứu sàng lọc và tìm kiếm

dược liệu có tiềm năng điều trị gút được tiến hành với cả thử nghiệm in vivo lẫn in vitro Trong đó, thử nghiệm in vitro thể hiện lợi thế với ưu điểm nhanh và đỡ tốn kém hơn Đặc biệt, đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro là hướng

nghiên cứu được nhiều tác giả lựa chọn nhằm tìm kiếm các dược liệu có tiềm năng điều trị gút [30] Có khá nhiều phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase, trong đó, phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric là phương pháp phổ biến, có thể thực hiện dễ dàng ở các điều kiện trong nước Bên cạnh đó, Việt Nam cũng là một đất nước có nhiều tài nguyên cây cỏ, cộng với nền y học cổ truyền phát triển với nguồn tri thức sử dụng thuốc dân gian của 54 dân tộc khác nhau Mỗi dân tộc đều có những kinh nghiệm sử dụng dược liệu khác nhau, đó là nguồn dữ liệu to lớn để nghiên cứu và phát triển các thuốc điều trị bệnh nói chung

và bệnh gút nói riêng

Trước những yêu cầu và điều kiện như vậy, đề tài nghiên cứu “ Triển khai

phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96

giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako – Vân Kiều” được thực hiện với hai mục tiêu sau:

1 Triển khai được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng

2 Đánh giá khả năng ức chế và xác định được IC50 của cây thuốc có tác

dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh nhất trong các cây thuốc có tiềm năng

khai thác của đồng bào Pako –Vân Kiều

1.1.2 Mối liên quan giữa bệnh gút và tăng acid uric máu, vai trò của xanthin oxidase

● Mối liên quan giữa bệnh gút và tăng acid uric máu

Acid uric là sản phẩm thoái giáng cuối cùng của nucleoprotein có chứa nhân purin [1],[3],[20] Khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa hòa tan urat trong dung dịch có cùng nồng độ natri như huyết tương – tức là tình trạng tăng acid máu, liên quan trực tiếp đến bệnh gút Trong mọi trường hợp, tăng acid uric máu dẫn đến tích lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi Sự lắng đọng urat tại các mô khác nhau gây ra các biểu hiện khác nhau Hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ sẽ khởi phát cơn gút cấp; sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt dịch,trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gút; sự có mặt vi tinh thể urat tại mô mềm, bao gân tạo hạt tophi; viêm thận kẽ (bệnh thận do gút) là do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận Acid uric niệu tăng và sự toan hóa nước tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu trong bệnh gút [7],[20]

Tăng acid uric máu được xác định là yếu tố nguy cơ của gút [20] Nồng độ acid uric máu càng cao thì nguy cơ mắc gút càng lớn [37] Bất kì yếu tố nào làm tăng quá trình tổng hợp hoặc giảm sự thải trừ acid uric đều có thể làm tăng nồng độ acid uric máu [20]

● Vai trò của xanthin oxidase trong sinh chuyển hóa acid uric

Xanthin oxidase là một enzym có vai trò quan trọng trong việc hình thành acid uric Enzym này có vai trò xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và

xanthin thành sản phẩm là acid uric ( hình 1.1) Bất kì tác động nào ảnh hưởng đến hoạt động của xanthin oxidase cũng ảnh hưởng đến sự tạo thành acid uric [3]

Hình 1.1

Sơ đồ chuyển hóa base purin

1.1.3 Thuốc ức chế xanthin oxidase trong điều trị gút

Hiện nay, chứng tăng acid uric máu và hậu quả của nó là bệnh gút đang ngày càng phổ biến Vì vậy, có khá nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra các loại thuốc mới được ứng dụng trong điều trị gút Một số thuốc điều trị gút cơ bản đang được sử dụng hiện nay là thuốc chống viêm và thuốc hạ acid uric máu Thuốc chống viêm như colchicin hay NSAIDs thường được dùng chủ yếu để điều trị các đợt cấp của gút với tác dụng giảm đau, chống viêm [4],[11] Gút là một bệnh mạn tính mà

nguyên nhân là chứng tăng acid uric máu Sử dụng thuốc nhằm mục đích giảm nồng

độ acid máu trong cơ thể sẽ góp phần cải thiện được gút và ngăn ngừa tái phát Có 2 con đường để thực hiện được điều này, một là tăng đào thải, hai là giảm tổng hợp acid uric Thuốc tăng đào thải acid uric cũng được sử dụng trong lâm sàng nhưng chúng có tác dụng hạ acid uric máu yếu và dễ gây ra sỏi tiết niệu [2] Trong khi đó,

cơ chế tổng hợp acid uric từ xanthin và hypoxanthin nhờ sự xúc tác của xanthin oxidase đã khá rõ ràng Ức chế xanthin oxidase sẽ ức chế quá trình tổng hợp acid uric và làm giảm nồng độ acid uric máu, cải thiện tình trạng bệnh gút [3] Hiện nay

đã có một số thuốc ức chế xanthin oxidase được sử dụng trong lâm sàng khá phổ biến trong điều trị gút

- Tác dụng không mong muốn:

- Gây kích ứng đường tiêu hóa, độc với gan và dị ứng với da

- Có thể gặp cơn gút cấp ở giai đoạn đầu điều trị [2]

● Febuxostat

Febuxostat là một thuốc có tác dụng ức chế chọn lọc xanthin oxidase được Liên minh châu Âu sử dụng gần đây để điều trị tình trạng tăng acid uric mạn có xuất hiện sự lắng đọng tinh thể urat Thuốc ức chế hoạt động của enzym thông qua việc khóa liên kết của enzym với cơ chất [22] So với allopurinol, febuxostat ức chế

xanthin oxidase và làm giảm nồng độ acid uric máu hiệu quả hơn trong cả thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng [15]

Thuốc có thể có một số tác dụng không mong muốn nhƣ gây rối loạn chức năng gan, đau đầu, buồn nôn, chóng mặt Ngoài ra, thuốc có thể gây các nguy cơ về bệnh tim mạch [22]

1.2 Tổng quan về xanthin oxidase

Xanthin oxidase là một enzym có cấu trúc phức tạp, đƣợc biết đến cách đây hơn 100 năm và đƣợc xem là enzym chìa khóa trong chuyển hóa purin Nó xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và xanthin thành urat Sự tăng xanthin oxidase liên quan đến nhiều cơ chế bệnh sinh nên hiểu biết về enzym, động học và kiểm soát enzym là thực sự cần thiết Tuy nhiên, do cấu trúc phức tạp và sự phân bố đặc biệt trong các mô, các chức năng của enzym này vẫn chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ [24]

1.2.1 Nguồn gốc, phân bố

Xanthin oxidase đƣợc tìm thấy trong các loài động vật có vú, gan bê và sữa

bò nhƣng cũng có trong chim, côn trùng và vi khuẩn [8] Trong các loài động vật có

vú, enzym đƣợc phân bố rộng rãi trong các mô nhƣng nồng độ cao nhất là ở gan và ruột Xanthin oxidase cũng đƣợc tìm thấy ở bề mặt các tế bào nội mô của bò và lợn nhà, và cả bề mặt của tế bào nội mô gan chuột Enzym này chiết xuất từ sữa bò là đặc trƣng nhất, tuy nhiên cũng có thể đƣợc chiết từ gan chuột, gà, gà tây và từ tuyến

Cơ chế hoạt động của enzym nhƣ sau: proton từ nhóm Mo-OH tấn công trung tâm ái nhân tại vị trí C-8 của cơ chất, đồng thời vận chuyển hydro giải phóng

ra từ vị trí C-8 tới nhóm Mo=S tạo ra LMoIVO(SH)(OR) (Giai đoạn 1) Sản phẩm trung gian này bị phá vỡ bởi sự vận chuyển electron các trung tâm oxi hóa khử khác trong enzym, giải phóng H+, tạo ra LMoVOS(OR) (Giai đoạn 2) Sau đó, hydro từ

dung môi thay thế nhóm R, quay về trạng thái ban đầu LMoVIOS(OH) của enzym (Giai đoạn 3) [18] (Hình 1.3)

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzym

● Nồng độ cơ chất

Xanthin oxidase xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric Khi nồng độ của xanthin trong cơ thể tăng thì tốc độ của phản ứng chuyển hóa sẽ tăng, acid uric tạo ra sẽ càng nhiều Tuy nhiên, đến một mức nào đó, enzym sẽ bão hòa cơ chất và tốc độ phản ứng không tăng lên nữa [3]

Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ xanthin thích hợp trong phản ứng để tốc độ phản ứng tối đa mà lại không lãng phí cơ chất

● Nồng độ enzym

Khi nồng độ enzym tăng lên, tốc độ phản ứng cũng tăng Tuy nhiên, khi nồng độ enzym tăng đến một mức nào đó, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động

vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không tăng lên nữa [3] Nồng độ enzym cũng là một yếu tố quan trọng khi xác định động học enzym, thời gian dừng phản ứng thích hợp

● Nhiệt độ

Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng enzym lên cực đại nhờ cơ chế tăng năng lượng cung cấp cho các phân tử cơ chất Mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10ºC thì tốc độ phản ứng sẽ tăng lên 2 lần Tuy nhiên, đến một nhiệt độ quá cao, enzym sẽ bị biến tính do bị phá vỡ các liên kết trong cấu trúc Mỗi enzym đều có một nhiệt độ thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác, ở nhiệt độ đó phản ứng enzym đạt tới tốc độ cao nhất [3] Nhiệt độ cũng là một yếu tố trong quá trình bảo quản enzym Xanthin oxidase bảo quản ở nhiệt độ 4ºC sẽ không bị giảm hoạt tính trong vòng sáu tháng Ở nhiệt độ -20ºC, enzym ổn định trong ít nhất một năm Có tác giả cho rằng, nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzym là 65ºC [33] Tuy nhiên, theo một nghiên cứu so sánh giữa xanthin oxidase từ sữa bò với xanthin oxidase từ sữa dê, nhiệt độ tối ưu cho xanthin oxidase từ sữa bò là 10ºC và từ sữa dê là 20ºC [21]

● pH

Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trường, vì vậy pH có tác dụng rất lớn đối với tốc độ phản ứng enzym Mỗi enzym có một giá trị pH phù hợp nhất cho hoạt động của mình Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ưu cũng dẫn đến sự giảm hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzym [3] Với xanthin oxidase, pH thích hợp là 4,7 [8] Tuy nhiên,

có tác giả cho rằng pH thích hợp cho xanthin oxidase là 7,5 - 8 [33] Cũng có nghiên cứu khác lại cho thấy, pH thích hợp cho xanthin oxidase từ sữa bò là 7,5 và

từ sữa dê là 7,2 - 7,4 [21]

● Ion kim loại

Các ion kim loại nặng có thể ức chế xanthin oxidase (Ví dụ: Hg2+, Ag+ ) Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hưởng tới cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [3]

● Các chất ức chế

Xanthin oxidase bị ức chế bởi ure, rất nhiều purin, pyrimidin và các hợp chất

dị vòng khác như purin-6-aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-aldehyd Xanthin oxidase còn bị ức chế bởi một số thuốc và một số dịch chiết từ các loài thực vật Xanthin oxidase bị bất hoạt không thuận nghịch bởi xyarit [8]

Hai cơ chế ức chế enzym là ức chế cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh Chất ức chế cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương tự cơ chất, kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, ngăn chặn enzym kết hợp với cơ chất Ức chế không cạnh tranh là sự ức chế thể hiện qua liên kết chất ức chế với enzym tự do hay phức hợp enzym cơ chất, mức độ ức chế không phụ thuộc nồng độ cơ chất [3]

Cơ chế ức chế được xác định thông qua việc xây dựng đồ thị phương trình Lineweaver – Burk, là đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S] với sự có mặt và vắng mặt chất ức chế [3] (Hình 1.4)

A B

Hình 1.4

Đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S] với sự có mặt và vắng mặt chất ức chế

A: ức chế không cạnh tranh B: ức chế cạnh tranh

1.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro

Để đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase, cần so sánh hoạt độ của enzym trong môi trường có và không có chất thử Có khá nhiều phương pháp xác định hoạt độ enzym [19]:

- Dựa vào sự giảm của các tác nhân oxi hóa thích hợp như oxy, xanh methylen, cytocrom

- Dựa vào độ giảm của cơ chất hay sự tạo thành của sản phẩm như acid uric Tương ứng với các nguyên tắc đó là các phép đo áp, đo nhiệt lượng, đo huỳnh quang, đo quang, đo bức xạ hay đo tích điện [32]

1.3.1 Phương pháp đo quang

● Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric

Được áp dụng phổ biến nhất là phương pháp của Noro [31], nguyên tắc dựa trên phản ứng :

Xanthin + H2O + O2 Acid uric + H2O2

Hoạt độ xanthin oxidase được xác định thông qua việc định lượng acid uric tạo thành được đo ở bước sóng 290nm ở 25ºC Một đơn vị enzym được định nghĩa

là tổng lượng enzym sản xuất ra 1 µmol acid uric trong mỗi phút ở nhiệt độ 25ºC

Phương pháp này được nhiều nhà nghiên cứu áp dụng và có sửa đổi cho phù hợp điều kiện, chủ yếu sử dụng máy quang phổ UV và một số ít dùng hệ thống ELISA [16],[30],[31],[35] Dung dịch đệm thường được sử dụng là đệm phosphat

có pH từ 7,5 - 8, vì đệm phosphat không ảnh hưởng đến hoạt động của xanthin oxidase [19], bước sóng đo cũng dao động từ 290-295nm

Quy trình đo thường được áp dụng với hỗn hợp thử bao gồm dung dịch đệm

và dung dịch enzym trong đệm được ủ trong 15 phút ở 25ºC Sau đó, thêm dung dịch cơ chất (xanthin) Tiếp tục ủ trong 30 phút ở nhiệt độ 25ºC Dừng phản ứng bằng acid HCl 1N Mẫu trắng chuẩn bị tương tự nhưng enzym cho vào sau khi đã cho HCl Tiến hành đo quang để xác định độ hấp thụ của từng mẫu [31]

Phương pháp này có ưu điểm là thuận tiện, nhanh và nhạy đối với enzym

tinh khiết ( thường dùng trong in vitro), tuy nhiên không thể áp dụng phương pháp

này để đo hoạt độ enzym trong tổ chức vì có sự có mặt của uricase [25] Có thể khắc phục hạn chế này bằng cách cho vào hỗn hợp thử kali oxonat 0,1 mM, acid uric tạo thành sẽ không bị ảnh hưởng bởi uricase [25]

● Phương pháp đo quang dựa trên chất ABTS 6-sulphonate)

(2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-Đây là một phương pháp mới sử dụng chất màu ABTS như một chất hấp thụ mật độ quang thông qua việc sử dụng 2 enzym uricase và peroxidase Phương pháp này có độ nhạy khá cao, có thể xác định được hoạt độ lên tới 20 U/mL và có thể áp dụng cho các bệnh lý huyết thanh khác [29]

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên chuỗi phản ứng:

Hypoxanthin + 2 H2O + 2 O2 uric acid + 2 H2O2

Acid uric + O2 allantoin + H2O2 + CO2

H2O2 + ABTSred ABTSox + 2 H2O

Hoạt độ của xanthin oxidase được xác định thông qua việc đo độ hấp thụ của ABTSox tạo thành sau 10 phút ở bước sóng 410nm [29]

1.3.2 Phương pháp đo áp

Trong phản ứng, xanthin oxidase đóng vai trò như một chất cho electron nên

có thể xác định hoạt độ enzym thông qua việc đánh giá sự khử của các chất nhận electron phù hợp như oxi, xanh methylen và cytochrom C

Phương pháp đo tỉ lệ tiêu thụ oxi cũng được một số tác giả áp dụng Tuy nhiên, ứng dụng của phương pháp này có một số hạn chế nếu trong gan có sự tiêu thụ oxi với tỉ lệ cao mà không có cơ chất [19]

Quy trình đo được áp dụng với hỗn hợp gồm một lượng gan đã được làm đồng nhất và ướp lạnh, đệm phosphat pH 8,6, dung dịch natri xanthat, dung dịch KOH Oxi tiêu thụ được đo áp ở 37ºC [19]

Để đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro, thường dùng enzym

tinh khiết phản ứng với cơ chất cùng sự có mặt của chất thử trong dung dịch đệm [30]

1.3.3 Phương pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang

Nguyên tắc dựa trên phản ứng oxi hóa 2-amino-4-hydroxypteridin (AHP) thành isoxanthopterin (IXP) dưới sự xúc tác của xanthin oxidase Lượng IXP tạo ra được đo bởi hệ thống HPLC sẽ tỉ lệ với hoạt độ xanthin oxidase [32]

Trên thực nghiệm, có thể tiến hành phương pháp này như sau: hỗn hợp phản ứng gồm đệm phosphat, dung dịch AHP, dung dịch 2,6-diclorophenonlindophenol natri, enzym và nước đủ thể tích; hỗn hợp được ủ trong 10 phút ở 37ºC; dừng phản ứng bằng HClO4 và làm lạnh trong 10 phút Phổ huỳnh quang kích thích và phát xạ của IXP được đo ở 343 nm và 410 nm [32]

Phương pháp này có ưu điểm đơn giản và nhạy (nhạy hơn phương pháp huỳnh quang thông thường khoảng 100 lần) Mặt khác, hỗn hợp phản ứng được phân tích trực tiếp bởi HPLC không cần phải tách IXP như trong phương pháp phóng xạ [32]

1.4 Các dược liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase

Các thuốc tổng hợp hóa học đang được sử dụng khá phổ biến trong điều trị gút Tuy nhiên, các thuốc tổng hợp hóa học có nhiều tác dụng phụ, trong khi đó, gút

là một bệnh mạn tính cần điều trị lâu dài Do đó, việc nghiên cứu tìm nhằm tìm ra thuốc điều trị gút từ dược liệu thiên nhiên ngày càng được ưu tiên vì có ít tác dụng không mong muốn Bên cạnh đó, hướng nghiên cứu dựa trên cơ chế ức chế xanthin oxidase đang được quan tâm gần đây Vì vậy, trên thế giới cũng như trong nước, ngày càng có nhiều nghiên cứu được tiến hành để tìm hiểu tác dụng ức chế xanthin oxidase của các dược liệu, từ đó tìm ra phương hướng cho việc phát triển thuốc điều trị gút từ dược liệu Có khá nhiều dược liệu đã được nghiên cứu và thể hiện tiềm năng ức chế xanthin oxidase

Ở các nước trên thế giới, đã có khá nhiều nghiên cứu sàng lọc các dược liệu

có tác dụng ức chế xanthin oxidase Trong một nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc ở

Ấn Độ, có 14 dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100 µg/mL trong 18 dịch chiết; trong đó có 10 dịch chiết ức chế hơn 50% với IC50 bé hơn 100 µg/mL; những cây thuốc có tiềm năng nhất tiếp tục được đánh giá tác dụng

hạ acid uric máu [34] Một nghiên cứu khác nghiên cứu trên 95 dịch chiết các cây từ New Caledonia và Vanuatu, 82 % trong số đó thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase; một số dịch chiết thể hiện tác dụng tốt với IC50 thấp [17] Một nghiên cứu trên 122 dịch chiết methanol của dược liệu ở Trung Quốc, có 69 dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100 µg/mL với 29 cây ức chế hơn 50%,

58 dịch chiết thể hiện tác dụng ở nồng độ 50 µg/mL với 15 dịch chiết ức chế hơn 50% Các cây tiềm năng nhất bao gồm Quế (IC50 = 18 µ/mL), Cúc hoa (IC50 = 22 µg/mL), Cỏ Gípxi (IC50 = 26 µg/mL) [27]

Trong nước cũng đã có một số nghiên cứu sàng lọc được thực hiện Một nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Mai và các đồng sự tiến hành đánh giá tác dụng của 288 dịch chiết được lấy từ 96 dược liệu chọn lọc, đã thu được một số kết quả khả quan Trong 288 dịch chiết, có 188 dịch chiết (65,3%) thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100 µg/mL, trong đó có 46 (24,5%) ức chế với tỉ lệ hơn 50% Ở nồng độ 50 µg/mL, có 168 (58,3%) dịch chiết thể hiện tác dụng với 21 (12,5%) ức chế hơn 50% Tại nồng độ 25 µg/mL, có 146 (50,7%) dịch chiết thể hiện tác dụng và 8 (5,5%) ức chế với tỉ lệ hơn 50% Trong khi đó, ở nồng độ 10 µg/mL, có 126 (43,8%) dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế với 2 (1,6%) dịch chiết

ức chế hơn 50% Tổng cộng có 49 dịch chiết có IC50 dưới 100 µg/mL [30]

1.5 Thông tin về một số dược liệu của đồng bào Pako- Vân Kiều

Việt Nam là quốc gia có 54 dân tộc sinh sống với nhiều ngôn ngữ khác nhau Mỗi dân tộc lại có một nhóm các cây thuốc chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh đặc thù của dân tộc mình Tộc người Pako và Vân Kiều là những cư dân có mặt sớm nhất ở vùng Trường Sơn trải dài từ Quảng Nam đến Quảng Bình, nhiều nhất là ở địa bàn miền núi Quảng Trị với hơn 70% người Pako - Vân Kiều sinh sống Qua thời gian họ đã tích lũy được những kinh nghiệm, tri thức về sử dụng các loài thực vật để làm thuốc chữa bệnh Trong thời gian qua, đã có một số công trình nghiên

cứu bảo tồn tài nguyên cây thuốc, tuy nhiên, những kết quả này mới chỉ dừng lại ở điều tra kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của cộng đồng, chứ chưa có những đánh giá kiểm chứng khoa học về tác dụng của các loài này [9],[10] Trong đề tài này, 10 cây thuốc của đồng bào Pako - Vân Kiều được lựa chọn từ các cây thuốc được sử dụng nhiều nhất trong dân gian ở vùng đồng bào sinh sống nhưng chưa có các nghiên cứu

cụ thể kiểm chứng thành phần hóa học và hoạt tính Các cây thuốc này chủ yếu có tác dụng chống viêm, giảm đau, lợi tiểu dùng trong các bệnh xương khớp hay các bệnh về đường tiết niệu Một số thông tin thu thập được từ những người dân bản xứ

về 10 cây thuốc được tổng hợp trong bảng 1.1

Bảng 1.1.Thông tin về một số cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều

1 Leea rubra Blume ex

Spreng Gối hạc Đau nhức xương khớp, chống viêm

2 Archidendron clyearia

(Jack.)I Niels

Mán đỉa Chống viêm tốt, viêm cầu

thận, viêm gan, viêm phần

phụ

scandens Blume

Dây hương Lợi tiểu, chống viêm

4 Ficus fulva Reinw ex

Blume Ngõa lông

Chữa đau nhức xương khớp, lợi tiểu, chữa phù

Các bệnh xương khớp, bệnh liên quan đến tiểu tiện

Roxb.ex Ait.f

Tóp mỡ thẳng Chữa sỏi thận

jamaicensis (L.) Vahl

Đuôi chuột Chữa đái buốt, đái ra sỏi và viêm đường tiết niệu

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu

Dược liệu nghiên cứu bao gồm 10 cây thuốc của đồng bào dân tộc Pako - Vân Kiều ở Quảng Trị đã và đang dùng để phòng và chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống viêm, chống oxy hoá và chống ung thư

Các mẫu cây nghiên cứu được PGS TS Ninh Khắc Bản, ThS Nguyễn Thế Cường – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học

Các mẫu được thu hái bởi PGS.TS Nguyễn Thị Hoài – Khoa Dược – Đại học

Y Dược Huế

Danh sách dược liệu nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.1

2.1.2 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu

Chiết xuất dược liệu: mẫu cây thuốc được phơi sấy khô, xay nhỏ thành bột

mịn, sau đó chiết với methanol tuyệt đối bằng pháp ngâm lạnh (48 giờ/lần x 3 lần) Gộp dịch chiết methanol và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cao Cao toàn phần được sấy chân không đến khối lượng không đổi

Chuẩn bị mẫu thử hoạt tính: hòa tan cao methanol trong dimethyl sulfoxid

(DMSO), pha loãng bằng đệm thành các nồng độ khác nhau sử dụng cho nghiên cứu

Bảng 2.1 Danh sách các cây thuốc nghiên cứu

1 AV08 Leea rubra Blume ex

Cành mang lá,

rễ

2 BM 87

Archidendron clyearia (Jack.) I

Phần trên mặt đất

Cành mang lá

Phần trên mặt đất

7 DK 56 Flemingia stricta

Roxb.ex Ait.f Fabaceae

Tóp mỡ thẳng

Cành mang lá

8 QT01

Stachytarpheta jamaicensis (L.)

Vahl

Verbenaceae Đuôi

chuột

Phần trên mặt đất

9 QT02 Phyllanthus

reticulatus Poir Euphorbiaceae Phèn đen Phần trên mặt đất

10 QT03

Caesalpinia pulcherrima (L.)

Sw

Fabaceae Phƣợng Kim mang lá Cành

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thuốc và hóa chất

- Allopurinol (Sigma Aldrich)

- Xanthin, ≥99% (Sigma Aldrich)

- Xanthin oxidase (9 đơn vị/mg protein, 8mg protein/ml; Sigma Aldrich)

- Dimethyl sulfoxid (Meck)

- Hóa chất pha đệm Na2HPO4, KH2PO4 (Vel, Bỉ)

- Một số dung môi, hóa chất, thuốc thử khác dùng trong chiết xuất và hóa chất đạt tiêu chuẩn dược dụng khác

2.2.2.Thiết bị và dụng cụ

- Máy đo pH (EUTECH)

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Hệ thống máy ELISA gồm máy dọc khay vi tinh thể (Biotek, Mỹ) và máy ủ lắc khay (Awareness, Mỹ)

- Máy cất nước 2 lần (Halminton, Mỹ)

- Máy khuấy từ ( Heidolph, Đức)

- Máy ly tâm (HERMILE Z300)

- Micro pipet một đầu kênh 2-20µl, 10-100µl, 100-1000µl (Eppendorf, Đức)

- Micro pipet đa kênh 30-100µl (Eppendorf, Đức)

- Đĩa Costar 96 giếng 3596 (Corning, Mỹ)

- Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: đầu côn, micro tube các loại, pipet, bình thủy tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được thiết kế với các bước tiến hành như sau:

● Thực hiện mục tiêu 1: Triển khai được phương pháp đánh giá khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng:

- Khảo sát động học enzym: nhằm mục đích

+ Lựa chọn hoạt độ enzym thích hợp cho khảo sát

+ Lựa chọn thời gian dừng phản ứng thích hợp

- Xây dựng đồ thị Lineweaver – Burk

- Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của allopurinol và quercetin

● Thực hiện mục tiêu 2: Xác định được IC50 của cây thuốc có tác dụng ức chế

xanthin oxidase in vitro lớn nhất trong các cây thuốc có tiềm năng khai thác của

đồng bào Pako – Vân Kiều

- Chiết xuất cao toàn phần của các cây thuốc

- Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của các cao toàn phần ở 3 nồng độ 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL

- Xác định IC50 của cây thuốc tiềm năng nhất

- Xác định sơ bộ cơ chế ức chế enzym của cây thuốc tiềm năng nhất

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase trên đĩa 96 giếng được triển khai theo phương pháp mô tả bởi Nguyễn Thị Thanh Mai [30] và được thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tạo thành acid uric từ xanthin nhờ

sự xúc tác của xanthin oxidase Lượng acid uric tạo ra tỉ lệ với hoạt độ enzym, được định lượng bởi việc đo quang ở 290nm Mẫu có chất thử được so sánh với mẫu không có chất thử để đánh giá tác dụng ức chế enzym của chất thử

2.4.1 Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng

● Chuẩn bị các hóa chất cần thiết