Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 5 aryl 1,3,4 thiadiazol

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất định hướng ức chế HDAC cho kết quả hoạt tính sinh học rất khả quan, đặ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-  -

LƯƠNG XUÂN HUY

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG

KHUNG 5-ARYL-1,3,4-THIADIAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

-  -

LƯƠNG XUÂN HUY

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG

Lời cảm ơn

Đầu tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến người

thầy và người cô đáng kính của tôi: PGS.TS Nguyễn Hải Nam và TS Đào

Thị Kim Oanh, giảng viên bộ môn Hóa Dược, trường đại học Dược Hà Nội

Thầy cô đã không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã luôn có những chỉ dẫn chính xác, kịp thời và động viên tôi những lúc khó khăn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến DS Trần Thị Bích Lan và DS Đỗ Thị Mai

Dung đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn

Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Hóa Dược trường đại học Dược Hà Nội trong suốt thời gian qua đã tạo điều kiện để tôi thực hiện khóa luận tại bộ môn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, các anh chị, các bạn và các em trong nhóm thực nghiệm tại bộ môn Hóa Dược đã đồng hành cùng tôi chia sẻ vui buồn trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 1 tháng 5 năm 2014

Người viết

Lương Xuân Huy

1.1.1 Định nghĩa histon deacetylase (HDAC) 3

1.2 Chất ức chế HDAC trong điều trị ung thư 4 1.2.1 Histon deacetylase (HDAC) và ung thư 4 1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 5 1.2.3 Phân loại các chất ức chế HDAC 6 1.2.4 Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC 8 1.3 Một số nghiên cứu trên thế giới và trong nước về các acid

hydroxamic hướng ức chế HDAC công bố gần đây 9

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

2.3.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 17

2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 18

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Acid deoxyribonucleic

AsPC-1 : Tế bào ung thư tụy

DCM : Dicloromethan

DMF : Dimethylformamid

DMSO : Dimethylsulfoxid

EtOH : Ethanol

HAT : Histon acetyltranferase

HDAC : Histon deacetylase

HDACi : Chất ức chế histon deacetylase

IC50 : Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào

IR : Phương pháp phổ hồng ngoại

MCF-7 : Tế bào ung thư vú

MeOH : Methanol

MS : Phổ khối lượng

NCI-H460 : Tế bào ung thư phổi

NMR : Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân PC3 : Tế bào ung thư tiền liệt tuyến

SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic

SW620 : Tế bào ung thư đại tràng

TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng

TSA : Trichostatin A

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.2 Mô tả hoạt động của HDAC 3 Hình 1.3 Phân loại các HDAC phụ thuộc Zn2+ 4 Hình 1.4 Mô tả hoạt động của các HDAC và các chất ức chế

HDAC

6

Hình 1.5 Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC 8 Hình 1.6 Dẫn xuất acid 1,3,4-oxadiazol/thiadiazol hydroxamic 9 Hình 1.7 Dẫn xuất acid 1,3,4-thiadiazol hydroxamic 10

Hình 1.8 Công thức acid aryl ether/aryl sulfon hydroxamic 11 Hình 1.9 Công thức chung các 4-alkyl piperidin và 4-alkyl

Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp chung Va-d 18

Đặt vấn đề

Các histon deacetylase (HDAC) là một nhóm các enzym có vai trò quan trọng trong quá trình phiên mã gen Nhiều bằng chứng cho thấy những enzym này không chỉ liên quan đến cấu trúc của chromatin và sự biểu hiện của gen mà còn tác động đến chu trình phát triển của tế bào và tiến trình ung thư bao gồm sự hình thành của các khối u ác tính [12,16] Chính vì vậy, các enzym này đang là một trong những đích quan trọng trong việc nghiên cứu phát triển các thuốc điều trị ung thư mới [7,22]

Các nhà nghiên cứu đã đạt được nhiều thành quả trong việc tìm ra nhiều chất ức chế HDAC, như là Trichosatin A, SAHA (Vorinostat), MS-27-

275 (Entinostat), LBH-589 (Panobinostat), PDX-101 và Oxamflatin Trong số này, acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza) đã được phê duyệt bởi Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) vào năm 2006 trong điều trị

u lympho tế bào T dưới da Tới nay, ít nhất 24 chất ức chế HDAC đang trong quá trình thử nghiệm lâm sàng ở các cấp độ khác nhau [10]

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất định hướng ức chế HDAC cho kết quả hoạt tính sinh học rất khả quan, đặc biệt là khi thay nhân phenyl của SAHA bằng vòng thơm khác như benzothiazol, 5-phenyl-1,3,4-

thiadiazol Tiếp tục hướng nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng

hợp và thử tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mang khung aryl-1,3,4-thiadiazol” với hai mục tiêu:

5-1 Tổng hợp 4 acid hydroxamic mang khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol

2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế HDAC

của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Histon deacetylase

Tất cả bộ gen của người được gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức hợp đại phân tử protein-ADN Đơn vị cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom

Hình 1.1 Cấu tạo nucleosom

Mỗi nucleosom điển hình bao gồm một octamer hình đĩa của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với H2B và 2 cặp của H3 với H4) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid Đầu amin của histon mang nhiều điện tích dương nên tương tác mạnh với đầu phosphat mang điện âm của ADN tạo nên cấu trúc của nucleosom và cấu trúc bậc cao của NST quy định quá trình biểu hiện gen Khi đầu amin của histon tích điện dương càng lớn tương tác này càng mạnh, NST đóng xoắn càng chặt ức chế quá trình phiên mã Ngược lại thì quá trình phiên mã diễn ra và gen được biểu hiện Mức độ tích điện dương của histon phụ thuộc vào quá trình acetyl hóa ở đầu amin của histon Sự acetyl hóa làm trung hòa bớt điện tích dương ở đầu amin của histon Trong tế bào có 2 enzym đóng vai trò chính trong quá trình acetyl hóa là HDAC và HAT Hai enzym này có vai trò trái ngược nhau Sự cân bằng trong hoạt động của chúng đảm bảo mức độ tháo xoắn của nhiễm sắc thể diễn ra bình thường

1.1.1 Định nghĩa histon deacetylase (HDAC)

Histon deacetylase (HDAC) là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ -N acetyl lysine amino acid của histon Nó có tác dụng đối lập với histon acetyltransferase (HAT) [23]

Hình 1.2 Mô tả hoạt động của HDAC

1.1.2 Phân loại HDAC

Có 18 HDAC ở người được chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu trúc và chức năng của chúng [16]:

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8

Nhóm IIa: HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9

Nhóm IIb: HDAC6, HDAC10

Nhóm III: Các protein điều hòa chuỗi thông tin bao gồm:

- Chất đồng đẳng của sir2 trong men Saccharomyces cerevisiae

- Sirtuin trong động vật có vú (SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7)

Nhóm IV: HDAC11

Nhóm I, II và IV được coi như những HDAC “cổ điển” và gồm 11 thành viên là những enzym phụ thuộc Zn2+, chúng có chứa một túi xúc tác với

một ion Zn2+ ở đáy của túi Những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic, thiol,…Trong khi đó, các thành viên nhóm III được gọi là những sirtuin có cơ chế phụ thuộc vào NAD+như một cofactor thiết yếu [20] Thuật ngữ “các chất ức chế HDAC” thường được sử dụng cho những hợp chất ức chế các HDAC thuộc nhóm I, II và IV

và những hợp chất này hiện nay đang được tiến hành các thử nghiệm lâm sàng

Hình 1.3 Phân loại các HDAC phụ thuộc Zn2+

1.2 Chất ức chế HDAC trong điều trị ung thư

1.2.1 Histon deacetylase (HDAC) và ung thư

Ung thư xảy ra do đột biến trong ADN, dẫn đến tế bào tăng sinh vô hạn

độ, vô tổ chức và không tuân theo các cơ chế kiểm soát về phát triển của cơ thể Quá trình deacetyl hóa histon của HDAC ảnh hưởng lên sự biểu hiện của

gen qua đó tác động tới sự khởi đầu và tiến triển của ung thư

Các HDAC gây ra sự khởi đầu của ung thư bằng cách [15]:

- Giảm ức chế chu trình tế bào

- Ức chế biệt hóa tế bào

- Tránh sự chết tế bào theo chương trình (apoptosis)

Các HDAC thúc đẩy sự tiến triển của ung thư bằng cách [15]:

- Thúc đẩy sự hình thành mạch (angiogenesis)

- Tăng cường xâm lấn (invastion)

- Giảm bám dính (adhesion)

- Tăng di chuyển (migration)

1.2.2 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Khả năng chống ung thư của các chất ức chế HDAC (HDACi) bắt nguồn từ khả năng tác động lên nhiều giai đoạn chu trình tế bào đã bị biến đổi

ở các tế bào ung thư

Các chất ức chế HDAC tác động tới tế bào ung thư theo ba cơ chế chủ yếu [15]:

- Giúp hoạt hóa các CDKI (chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin) gây ức chế sự sinh sôi của tế bào

- Hoạt hóa các yếu tố biệt hóa (differentiation factors) làm tăng biệt hóa thay vì tăng số lượng tế bào

- HDACi hoạt hóa các yếu tố chết tế bào theo chương trình

Hình 1.4 dưới đây mô tả hoạt động của HDAC và chất ức chế HDAC

Hoạt động của HDAC Hoạt động của chất ức chế HDAC (HDACi)

Hình 1.4 Mô tả hoạt động của các HDAC và các chất ức chế HDAC

1.2.3 Phân loại các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng để sử dụng trong điều trị ung thư có thể được chia làm 4 nhóm dựa trên cấu trúc [6]:

- Các hydroxamat: TSA, SAHA, CBHA,

- Các peptid vòng: depsipeptid, CHAPs,…

- Các acid béo mạch ngắn: butyrat, phenylbutyrat, valproic acid,…

- Các benzamid: N-acetyldinalin, MS-275,

Mỗi nhóm trên đều có những hạn chế nhất định như: các acid hydroxamic bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc lên các loại enzym HDAC; các benzamid và acid béo có hiệu lực kém; các peptid vòng khó tạo thành về mặt hóa học Các nhóm khác nhau có tác dụng ức chế các loại HDAC khác nhau: các hydroxamic acid ức chế mạnh HDAC nhóm I và II, các acid carboxylic và peptid vòng ức chế mạnh HDAC nhóm I Hiện nay có khoảng 24 chất ức chế HDAC thuộc 4 nhóm đang được thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị ung thư (cụ thể trình bày trong bảng 1.1) [10]

Bảng 1.1 Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng

Acid béo

mạch ngắn

Butyrat mM Nhóm I, IIa121 Pha I, II Valproic acid (VPA) mM Nhóm I, IIa121 Pha I, II AN-9 (tiền thuốc) µM N/A* Pha I, II

Hydroxamat

Trichostatin A (TSA) nM Nhóm I, IIa121 N/A SAHA, Vorinostat µM Nhóm I, IIa121 Pha I, II, III

m-carboxycinamic acid

Cyclic

tetrapeptid

Depsipeptid nM Nhóm IIb36 Pha I, II

Apicidin nM HDAC1, 3, không

1.2.4 Liên quan cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc acid amid-alkyl-hydroxamic

đã được biết đến nhiều, ví dụ như SAHA Cấu trúc của chúng bao giờ cũng bao gồm 3 phần chính A - B - C: Phần nhóm nhận diện bề mặt, phần cầu nối

và nhóm gắn kết với ion Zn2+

Hình 1.5 Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC

Nói chung hiệu quả tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi) dựa

trên sự có mặt của 3 yếu tố chính [14]:

- Nhóm kết thúc có thể gắn kết với Zn 2+ trên vị trí tác dụng của các enzym HDAC (zinc-binding group-ZBG): acid hydroxamic, các thiol,

benzamid, mercaptoceton, Đây là phần không thể thiếu để có tác dụng ức chế HDAC

- Cầu nối sơ nước (hydrophobic linker): thường có cấu trúc amid-alkyl,

nằm trong lòng enzym Cầu nối này liên quan đến khả năng ức chế, quyết định sự phù hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài của kênh enzym Liên kết amid quan trọng nhưng không phải then chốt, độ dài mạch tối ưu là 5-6C

- Nhóm khóa hoạt động (capping group): thường là vòng thơm hoặc

peptid vòng và thường nằm trên bề mặt enzym Nhóm này liên quan đến tính đặc hiệu và hiệu lực ức chế HDAC

Cho đến nay phần lớn các nghiên cứu liên quan cấu trúc – tác dụng đều tập trung tìm hiểu vai trò của nhóm gắn với ion Zn2+, cố gắng nghiên cứu thay thế acid hydroxamic và một vài cầu nối

1.3 Một số nghiên cứu trên thế giới và trong nước về các acid

hydroxamic hướng ức chế HDAC công bố gần đây

 Thiết kế acid 1,3,4-oxadiazol/thiadiazol hydroxamic

Hai dãy 1,3,4-oxadiazol/thiadiazol đã được tổng hợp với nhóm gắn kết ion Zn2+ (C), cầu nối (B), và nhóm nhận diện bề mặt (A) Các đánh giá khả năng ức chế ung thư, TT, ức chế tế bào Ehrlich ung thư cổ trướng ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ cho kết quả đầy hứa hẹn [9]

Hình 1.6 Dẫn xuất acid 1,3,4-oxadiazol/thiadiazol hydroxamic

Kết quả nghiên cứu in vitro cho thấy trong dãy oxadiazol, chất 1a (R =

H, X = O) ức chế HDAC-1 mạnh nhất với IC50 = 0,006 µM và HCT-116 với

IC50 = 0,09 µM Trong dãy thiadiazol, chất 2a (R = H, X = S) ức chế

HDAC-1 mạnh nhất với IC50 = 0,008 µM và HCT-116 với IC50 = 0,08 µM

 Các dẫn xuất acid 1,3,4-thiadiazol hydroxamic

Một nhóm các nhà khoa học Trung Quốc đã thiết kế và tổng hợp một dãy các acid 1,3,4-thiadiazol hydroxamic ức chế HDAC với các cầu nối và

nhóm thế trên vòng 1,3,4-thiadiazol khác nhau Khả năng ức chế enzym của

các chất 3a-g cho thấy cầu nối 5-6 cacbon ở giữa nhóm gắn Zn2+ và vòng 1,3,4-thiadiazol là tối ưu cho hoạt tính

Hình 1.7 Dẫn xuất acid 1,3,4- thiadiazol hydroxamic

Một trong số các dẫn chất này 3b (n=5, R = -C6H5) cho IC50 = 0,089

μ có khả năng ức chế tốt hơn SAHA (IC50 = 0,15 μ ) [18]

Bảng 1.2 Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn xuất 1,3,4-thiadiazol

 Thiết kế acid aryl ether/aryl sulfone hydroxamic tương tự TSA

Lần đầu tiên các dẫn chất acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động là aryl ether và aryl sulfon cùng cầu nối có 5C không bão hòa đã được tổng hợp

và đánh giá Một số hợp chất chứa nhóm thế meta và para trên vòng aryl cho

thấy khả năng ức chế mạnh HDAC ở nồng độ nanomol [4]

Hình 1.8 Công thức acid aryl ether/aryl sulfon hydroxamic

Hầu hết các dẫn xuất acid aryl ether hydroxamic cho thấy kết quả hứa

hẹn Trong đó chất đầu tiên nghiên cứu 4a cho thấy khả năng ức chế HDAC ở

mức trung bình (IC50 = 188 n ), đặc biệt 4d cho khả năng ức chế mạnh nhất

với IC50 = 18 nM Kết quả thu được chỉ ra rằng nhóm thế tại vị trí meta và/hoặc para trên vòng aryl cho tác dụng ức chế tốt Ngoài ra khả năng ức chế HDAC cũng phụ thuộc chủ yếu vào nhóm thế trên vòng aryl và rất ít phụ thuộc vào việc có hay không nhóm -CH3 ở vị trí R

Đối với dẫn xuất acid aryl sulfon hydroxamic, kết quả không như mong đợi, tất cả đều ức chế HDAC với IC50 > 1 µM

Bảng 1.3 Tác dụng của acid aryl ether/aryl sulfon hydroxamic

 Các alkyl piperidin và piperazin

Các nhà khoa học Italia đã công bố kết quả nghiên cứu một dãy các acid 4-alkyl piperidin và 4-alkyl piperazin hydroxamic hướng ức chế HDAC dựa trên cấu trúc của SAHA Các chất này đã được thay đổi nhóm khóa hoạt động và cầu nối so với SAHA [19]

Hình 1.9 Công thức chung các 4-alkyl piperidin và 4-alkyl piperazin

Sau khi tiến hành thử khả năng ức chế HDAC và dòng tế bào ung thư

HTC-116, họ đã xác định được một nhóm các chất 5a-f có hoạt tính Tất cả đều là dẫn chất 4-alkyl piperidin với n=3, trong đó 5f cho hoạt tính mạnh nhất

và cả hai chất 5e, 5f đều có thể so sánh được với SAHA

Các dẫn chất alkyl piperazin cho kết quả không như mong đợi

Bảng 1.4 Hoạt tính sinh học của một số dẫn chất alkyl piperidin

 Kết hợp chất ức chế kép HDAC và HMGR

Một dãy các chất ức chế HDAC và 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A reductase (HMGR) được tạo ra bằng cách sử dụng nhóm hydroxamat và cấu trúc cơ bản của statin để kết nối hai protein Những chất này cho thấy tiềm năng ức chế HDAC và HMGR với giá trị IC50 ở mức nM Những chất này cũng có hiệu quả ức chế H G cũng như thúc đẩy acetyl hóa histon và tubulin trong tế bào ung thư, nhưng không gây độc cho tế bào lành [11]

Hình 1.10 Thiết kế chất ức chế kép dựa trên cấu trúc SAHA và Lovastatin

 Các chất ức chế HDAC do nhóm nghiên cứu bộ môn Hóa Dược,

trường Đại học Dược Hà Nội thiết kế và nghiên cứu

Tiếp nối các nghiên cứu phát triển thuốc mới theo hướng tác dụng lên đích là các enzym HDAC, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế và phát triển các dẫn chất hydroxamic acid mang khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol mới Kết quả công bố trên tạp chí Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry tháng 10/2013 cho

thấy một số chất trong dãy, ví dụ 7b-d cho kết quả khả quan về khả năng ức

chế HDAC cũng như độc tính trên nhiều dòng tế bào [17]

Bảng 1.5 Độc tính của các chất ức chế HDAC tổng hợp được

Chất R Độc tính trên các dòng tế bào (IC 50 ,* µM) Log

pǂ SW620 MCF-7 PC3 AsPC-1 NCI-H460

*Nồng độ của chất gây ra sự giảm 50% số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình ba kết quả với độ lệch dưới 10%

ǂ Ước lượng bằng phần mềm Kowin v1.67 US EPA

SAHA: acid suberoylanilid hydroxamic

Dữ liệu từ bảng trên cho thấy chất 7a có độc tính mạnh trên cả năm dòng tế bào Đặc biệt trên hai dòng SW620 và PC3, hiệu lực của 7a gấp gần 5

lần SAHA Điều này cho thấy các chất có cấu trúc chứa dị vòng thiadiazol ở giữa vòng phenyl và nhóm amid cho kết quả tốt hơn SAHA

1,3,4-Sự có mặt của nhóm halogen trên vòng phenyl tại một trong ba vị trí

2,3,4 có thể giữ lại được hoặc tăng nhẹ tác dụng (7b-d, 7f) Kết quả cho thấy

vị trí số 2 dường như cho tác dụng mạnh nhất Tuy nhiên khi thêm một nhóm

–Cl vào vị trí số 6 (chất 7l) thì tác dụng giảm rõ rệt

Ngoài ra, hai chất có chứa nhóm –NO2 (7j và 7k) là những chất có hoạt

tính thấp nhất trong số các chất khảo sát

Các chất 7m-o cho độc tính thấp hơn 7a nhiều lần nhưng so với SAHA

thì tương đương hoặc thậm chí mạnh hơn trên cả 5 dòng tế bào

Các kết quả trên đã tạo nền tảng cho tác giả phát triển hướng nghiên cứu trong thiết kế công thức, tổng hợp Bằng việc giữ nguyên cấu trúc acid hydroxamic với dị vòng 5 cạnh 1,3,4-thiadiazol ở giữa vòng thơm và nhóm amid, và thay vòng phenyl bằng dị vòng chứa O hoặc S, các chất thu được đã cho những kết quả khả quan về cả độc tính trên các dòng tế bào và tác dụng

ức chế HDAC Kết quả cụ thể sẽ được trình bày trong các chương tiếp theo của khóa luận này

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.2 Dung môi và hóa chất khác

DMF Aceton MeOH Acid acetic băng n-Hexan

HCl EtOH NaOH Dicloromethan Nước cất

2.2 Thiết bị, dụng cụ

- Bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt, sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm, pipet, bình chiết, phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp mỏng (TLC)

- TLC tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh

- Nhiệt độ nóng chảy (Tonc) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital)

- Phổ hồng ngoại (I ) được ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ

thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-600 cm-1 tại phòng thí nghiệm bộ môn hóa vật liệu Đại học Khoa học tự nhiên

- Phổ khối lượng ( S) được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap MS của viện Hóa học các hợp chất tự nhiên Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-N được ghi bằng máy Bruker AV-500, dùng DMSO-d6 làm dung môi Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (parts per million - ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

2.3 Nội dung nghiên cứu

1

-hydroxy-N8 thiadiazol-2-yl]octanediamid

-[5-(3-methylfuran-2-yl)-1,3,4-2.3.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được

- Thử tác dụng ức chế HDAC bằng phương pháp Western blot

- Thử tác dụng kháng tế bào ung thư đại tràng (SW620) in vitro

- Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp được

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

 Nghiên cứu tổng hợp 4 chất mục tiêu bằng phương pháp hóa học

 Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng

chảy

Tổng hợp 4 chất trong khóa luận này được tiến hành theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.1 Quy trình tổng hợp chung Va-d

Tác nhân và điều kiện: i) thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng; ii)

hydroxylamin, NaOH, methanol

so sánh với mẫu trắng

2.4.4 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư in vitro

a) Nguyên tắc thử

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được

thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học uốc gia Chungbuk, Cheong u, Hàn Quốc theo phương pháp TT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm

GraphPad Prism

Dòng tế bào thử nghiệm: tế bào ung thư đại tràng (SW620)

Dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (K IBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10 BS (huyết thanh bào thai bò)

Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp TT theo các bước sau:

Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào

hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường RPMI bổ sung 10 BS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104

đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 L Các đĩa sau đó được ủ ở 370Ctrong điều kiện 5% CO2 Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 L môi trường RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 L mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1 Tiến hành thử: Sau khi ủ 4 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 L thuốc nhuộm TT (nồng độ TT 5

mg mL trong muối đệm phosphat - PBS) Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 370

C trong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 L dung dịch

D S , để 5 phút cho TT formazan được hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

b) Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 50

so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5

Giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism Trong

phương pháp thử này, IC 50  20 g/mL được coi là có hoạt tính

2.4.5 Giá trị LogP và đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được

Tính các giá trị logP bằng phần mềm EPIsuite cung cấp bởi US Environmental Protection Agency’s office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC)

Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất dựa vào quy tắc Lipinsky [13]:

- Khối lượng mol phân tử của chất < 500 g/mol

- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) phải <10

- Số trung tâm liên kết hidro (NH, OH) < 5

- Cân bằng hệ số thân dầu nước: logP <5

- Số liên kết hydro linh động <15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ

furan-2-carbaldehyd (Ia) được thực hiện bằng phản ứng ngưng tụ với xúc tác

là acid hữu cơ, tiến hành theo sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp chất IIa

Tiến hành phản ứng:

Cho 0,20 ml (2 mmol) furan-2-carbaldehyd (Ia) và 0,2180g (2,4 mmol)

thiosemicarbazid vào bình cầu 50 mL Thêm 20 ml dung môi EtOH tuyệt đối

và 2 giọt acid acetic băng làm xúc tác Đun hồi lưu và khuấy 300 vòng/phút trong 4h

Thu sản phẩm:

Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C sau đó thêm

15 mL nước cất để tủa sản phẩm Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL nước cất Sấy khô tủa ở 600C (trong khoảng 24h)

Kết quả:

 Cảm quan: Bột tinh thể màu trắng

 Hiệu suất: 91% (0,3070g)

 T0nc: 165-1660C

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,66

Toàn bộ sản phẩm IIa được dùng để thực hiện bước tiếp theo của quá trình tổng hợp chất Va

3.1.1.2 Tổng hợp chất IIIa

Chúng tôi thực hiện việc tổng hợp chất

5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-amin (IIIa) từ IIa bằng phản ứng đóng vòng nội phân tử Quá trình tổng

hợp được thực hiện theo sơ đồ 3.3

Sơ đồ 3.3 Tổng hợp chất IIIa

Tiến hành phản ứng:

Cân 0,81g (3 mmol) muối sắt FeCl3.12H2O, hòa tan bằng 3 mL dung môi EtOH trong bình cầu 50 mL, gia nhiệt đến hồi lưu Đồng thời cân

0,1690g (1 mmol) chất IIa, hòa tan bằng 20 mL dung môi EtOH tuyệt đối

trong cốc có mỏ, đun nóng khoảng 70ºC

Đổ dung dịch chất IIa từ cốc có mỏ vào bình phản ứng, tiếp tục đun hồi

lưu và khuấy 300 vòng/phút Kết thúc phản ứng sau 3 giờ

Thu sản phẩm:

Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ khoảng 400C trong 2 phút sau đó pha loãng hỗn hợp phản ứng bằng nước cất Kiềm hóa hỗn hợp bằng khoảng 10 mL dung dịch NaOH 30% (kiểm tra bằng giấy quỳ)

Chiết 3 lần bằng cloroform (mỗi lần 5-10 mL), thu lớp dưới Gộp dịch chiết của 3 lần chiết lại với nước muối bão hòa Cất thu hồi dung môi của dịch chiết bằng máy cất quay ở nhiệt độ 400C đến khi hết dung môi, thu sản phẩm

IIIa Sấy sản phẩm ở 600C trong 4h

8-{[5-(furan-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}-8-oxooctanoat (IVa) được tổng hợp từ chất IIIa bằng phản ứng acyl hóa của

chất IIIa với acid monomethyl suberic Quy trình tổng hợp được thực hiện

phản ứng đã hoạt hóa đủ thời gian, cho 0,1670g (1 mmol) chất IIIa vào bình

phản ứng, gia nhiệt lên 600C, khuấy 300 vòng/phút trong vòng 24h

Thu sản phẩm:

Làm lạnh bình phản ứng bằng nước đá Đổ từ từ 15 mL dung dịch HCl loãng, lạnh vào bình phản ứng, vừa đổ vừa lắc Để yên 15 phút

Lọc và rửa tủa 3 lần bằng 15 mL dung dịch acid HCl loãng, lạnh Sấy tủa ở 600C trong 24h

Cho 0,1690g (0,5 mmol) chất IVa và 0,33g (5 mmol) hydroxylamin

hydroclorid vào bình cầu 50 mL, thêm 20 mL dung môi MeOH, dùng siêu âm

để tạo hỗn dịch đồng nhất Đặt bình phản ứng trong hỗn hợp nước đá và muối

ăn, duy trì nhiệt độ dưới 00

C, khuấy 300 vòng/phút

Hòa tan 0,40g (10mmol) NaOH trong 5 ml nước cất trong ống nghiệm

và làm lạnh xuống dưới 00C trong hỗn hợp nước đá muối Đổ dung dịch NaOH vào bình phản ứng, giữ nhiệt độ dưới 00C, phản ứng kết thúc sau 1,5 giờ Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 và TLC, cụ thể làm như sau:

- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng bằng 1 giọt dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, xuất hiện màu đỏ

vang chứng tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra

- Acid hóa khoảng 0,1 mL hỗn hợp phản ứng, kiểm tra TLC với pha

động DCM : MeOH (9:1) Kết thúc phản ứng khi ester ban đầu đã hết

3.1.2.1 Tổng hợp chất IIb

Tổng hợp chất IIb từ 0,24mL (2mmol) chất thiophen-2-carbaldehyd

(Ib) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất IIa Kết quả như sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng

0,185g (1 mmol) chất IIb được tiến hành tương tự như tổng hợp chất IIIa

Kết quả như sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu vàng nâu

8-oxo-8-{[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]amino}octanoat (IVb) được tiến hành tương tự như tổng hợp chất IVa

Kết quả của quá trình như sau:

 Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng

 Hiệu suất: 60% (0,2130g)

 T0nc: 196-1980C

 Kiểm tra bằng TLC với pha động DCM : MeOH (9:1) cho Rf = 0,8

3.1.2.4 Tổng hợp chất Vb

Tổng hợp chất đích thứ hai N 1 -hydroxy-N 8

-[5-(thiophen-2-yl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl]octanediamid (Vb) từ 0,1775g ( 0,5 mmol) chất IVb được

tiến hành tương tự như tổng hợp chất Va Kết quả như sau: