Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học một số dẫn chất 4 amino 4h 1,2,4 triazol

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ, bên cạnh các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên và vi sinh, thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược ngày càng đóng một vai trò quan tr

NGUYỄN CÔNG TRƯỜNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 4-

AMINO-4H-1,2,4-TRIAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

NGUYỄN CÔNG TRƯỜNG

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 4-

AMINO-4H-1,2,4-TRIAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải

DS Ngô Xuân Hoàng

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa hữu cơ

HÀ NỘI-2013

thầy cô giáo, gia đình và bạn bè, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp“ Tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất 4-amino-4H-1,2,4-

triazol”

Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS TS Đinh Thị Thanh Hải

DS Ngô Xuân Hoàng

đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Đồng thời, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ Khoa Dược Lý - Viện Dược Liệu - Bộ Y tế, các cán bộ phòng phân tích cấu trúc, khối phổ, và phổ hồng ngoại ( Viện Hóa học – Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam ) đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện công trình này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, kỹ thuật viên bộ môn hóa hữu cơ, các thầy cô trong trường, các phòng ban, thư viện đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận!

Hà Nội, ngày 6/6/2013

Sinh viên

Nguyễn Công Trường

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1.Tác dụng sinh học của các dẫn chất Triazol 1

1.1.1.Tác dụng kháng khuẩn 1

1.1.2.Tác dụng kháng nấm 3

1.1.3.Tác dụng kháng tế bào ung thư 7

1.1.4.Tác dụng kháng virus và tác các dụng khác .11

1.2 Phương pháp tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol 12

1.3 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 13

1.3.1 Phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với amin bậc 1 13

1.3.2.Tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 15

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 18

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 18

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.1 Tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 19

2.2.2 Xác định cấu trúc hóa học 19

2.2.3 Thử tác dụng sinh học 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.3 Thử tác dụng sinh học 20

2.3.3.1 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư 20

2.3.3.2 Thử tác dụng kháng nấm 21

Chương 3 THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp hóa học 25

3.1.1 Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol (I) 25

3.1.1.1 Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp Horning.E.C 25

3.1.1.2 Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp Rubtsov M.V; Baichikov.A.G 27

3.1.2 Tổng các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol 28

3.1.2.1 Tổng hợp 4-(2’-cloro-benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (II) 29

3.1.2.2 Tổng hợp 4-(4’-fluoro-benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (III) 29

3.1.2.3 Tổng hợp 4-(4’-cloro-benzyliden amino) -4H-1,2,4-triazol (IV) 30

3.1.2.4 Tổng hợp 4-(3’-nitro-benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (V) 31

3.1.2.5 Tổng hợp 4-(2’-hydroxy-benzyliden amino) -4H-1,2,4-triazol (VI) 32

3.1.2.6 Tổng hợp 4-(4’-nitro-benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (VII) 32

3.1.2.7 Tổng hợp 4-(benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (VIII) 34

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc 35

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được 35

3.2.2 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 36

3.2.2.1 Phân tích phổ hồng ngoại IR 36

3.2.2.2 Phân tích phổ khối lượng MS 37

3.3 Thử tác dụng sinh học 39

3.3.1 Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người 39

3.3.2 Thử tác dụng kháng nấm 39

3.4 Bàn luận 40

3.4.1 Về tổng hợp hóa học 40

3.4.2 Về xác định cấu trúc 41

3.4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 42

3.4.2.2 Về phổ khối lượng (MS) 43

3.4.2.3 Về phổ cộng hưởng từ proton (1 H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (13C-NMR) của chất I, II, III 43

3.4.3 Về tác dụng sinh học 44

3.4.3.1 Tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư 44

3.4.3.2 Tác dụng kháng nấm 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

CTPT : Công thức phân tử

Et2O : ether

Hep-G2 : Tế bào ung thư gan

Hela : Tế bào ung thư tử cung

IR : phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

chăm sóc sức khỏe con người Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật

và công nghệ, bên cạnh các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên và vi sinh, thuốc

có nguồn gốc tổng hợp hóa dược ngày càng đóng một vai trò quan trọng và chiếm một lượng lớn trong tổng số các thuốc được sử dụng

Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tạo ra được các thuốc mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được sử dụng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng dược lý có và triển vọng cao để tạo

ra các chất mới dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị

Trong những năm gần đây, triazol và các dẫn chất là một dãy chất hữu cơ

đã được nghiên cứu một cách có hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã công bố cho thấy các dẫn chất triazol có các tác dụng đáng quan tâm như: kháng nấm, kháng khuẩn kháng virus và chống ung thư [2], [4], [7], [11], [14], [16-23], [25], [27-30], [33], [35-42], [45-47], [49] Trong số các dẫn chất triazol thì

các dẫn chất azomethin của 4-amino-4-H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm

đã được chú ý nghiên cứu, kết quả cho thấy các dẫn chất này có tác dụng sinh học đáng quan tâm

Tiếp tục hướng nghiên cứu về tổng hợp hóa học và tác dụng sinh học của

các dẫn chất triazol, chúng tôi thực hiện đề tài “ Tổng hợp và thử hoạt tính

sinh học một số dẫn chất 4-amino-4H-1,2,4-triazol” với các mục tiêu

nghiên cứu sau đây:

1 Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol và một số dẫn chất của chất này

2 Th ử sàng lọc tác dụng sinh học của một số chất tổng hợp được

dãy dẫn chất 4-amino-4H-1,2,4-triazol

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT TRIAZOL

Các dẫn chất triazol đã được nghiên cứu có hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng sinh học Rất nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của các dẫn chất triazol đã cho thấy các dẫn chất thuộc họ này có tác dụng sinh học phong phú, đa dạng và đã được sử dụng có hiệu quả trong điều trị Một số tác dụng sinh học chính có thể kể đến như sau: tác dụng kháng nấm, tác dụng khuẩn, tác dụng kháng ung thư, tác dụng kháng virus

1.1.1 Tác d ụng kháng khuẩn

Tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất triazol đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu

Đầu tiên, phải kể đến công bố của B.M Volynskii cùng các cộng sự [17]

vào năm 1971, đã phát hiện 2 dẫn chất của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với

5-nitro-furfural có tác dụng kháng khuẩn là furazonal và furacylin:

N N N

N CH

Furazonal

N N N

N CH CH HC Furacylin

Furazonal là hoạt chất có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng trên các chủng

vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, Salmonella

Typhi, Proteus vulgaris và streptococcus pneumonia kể cả những chủng đã kháng sulfamid và kháng kháng sinh Ở Liên Xô (cũ) furazonal đã được dùng điều trị lỵ trực trùng [42]

Tiếp theo đó, vào năm 1975, J R Bhuben [17] đã công bố

3-amino-1H-1,2,4-triazol có tác dụng kháng vi khuẩn gram (-):

Công thúc cấu tạo của

3-amino-1H-1,2,4-triazol:

N

NNH

NH2

Các dẫn chất của 4-amino-3H-1,2,3-triazol cũng có tác dụng sinh học

như kháng khuẩn, kháng nấm Kết quả này được P L Perrarinl [17] phát hiện năm 1975 và năm 1978 đó là các chất:

1-H-1,2,4-triazol acetamid có tác dụng kháng khuẩn khá mạnh đối với các

chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

Escherichia coli và một số vi nấm: C.albicans, C.parapsilosis,

C.pseudotro-picalis và C.stellatoided

Tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất

3-[4H-(1,2,4)-triazolyl]-2-aryl-1,3-thiazolidin-4-on cũng đã được H S Patel công bố trong nghiên cứu năm

2008 [37]

Theo đó các dẫn chất tổng hợp được thử nghiệm trên 2 chủng vi khuẩn

Gr(+) (B.subtilis, S.aureus ) và 3 chủng vi khuẩn Gram (-) (K.promioe, S.typhi

và E.coli) Kết quả cho thấy một số chất thử nghiệm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn chất đối chứng tetracyclin

N

N N C

S C N

H R O

Năm 2009, A Demirbas và các cộng sự [20] đã tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 1,3,4-thiadiazol-2-ylmethyl-1,2,4-triazol

Kết thúc công trình nghiên cứu này, các tác giả đã chỉ ra rằng các dẫn chất của 1,3,4-thiadiazol-2-ylmethyl-1,2,4-triazol có tác dụng rất tốt trên các

vi khuẩn như: Escherichia coli, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas

aeruginosa, Enterococcus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus

N N N N O N

O N

OCH3

CH2

R S

Thêm vào đó, cũng vào năm 2009, D Neslihan và cộng sự [21] đã tổng hợp 1,2,4-triazol base manich và base Schiff của chất này, thử hoạt tính sinh học của các chất tổng hợp được trên một số chủng vi khuẩn

N

N N

N

Kết quả của nghiên cứu này cho thấy các dẫn chất 1,2,4-triazol tổng hợp

được có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Yersinia

pseudotuberculosis, pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Candida tropicalis

Để góp phần tìm kiếm thêm các hoạt chất có tính kháng khuẩn cao và dược động học ưu việt, D Neslihan và cộng sự, năm 2010 [14], tiếp tục tổng hợp thêm một số dẫn 1,2,4-triazol và thử tác dụng sinh học của các chất này trên một số chủng vi sinh vật

Kết quả cho thấy rằng các chất tổng hợp được có tác dụng kháng E Coli,

Klebsiella pneumonia, Yersinia pseudotuberculosis, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeurogenosa, staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Candida tropicalis, Candida glabrata

1.1.2 Tác d ụng kháng nấm

Là tác dụng đáng chú ý của các dẫn chất triazol Các dẫn chất triazol và các dẫn chất imidazol đã tạo thành họ thuốc azol chống nấm Tác dụng chống nấm của các azol được phát hiện từ năm 1944 bởi Woolley [18], nhưng mãi

Với R: là các Aryl khác nhau

tới năm 1970 mới được công nhận và nghiên cứu sâu hơn về tổng hợp hóa học, dược động học, độc tính và thử lâm sàng

Trong những năm gần đây kết quả của các nghiên cứu này đã đưa ra các thuốc chống nấm mới thuộc họ triazol được áp dụng trong điều trị [2], [4] Các thuốc kháng nấm họ triazol được liệt kê trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số kháng sinh điều trị nấm chứa nhân 1,2,4-triazol

N N N

CH2O O

N

O CH

C

OH CH

CH3N N F

F

F

N N N

CH2

Nhiễm nấm do

Crypyococcus và Aspergillus

N N N

F F

Nhiễm nấm do

aspergillus, candida, cryptococcus

O O

H 2C F

F N

N N

CH2 O N N

N N N O

Năm 1979, 16 dẫn chất 1H-1,2,4-triazol được Ran Heeres và các cộng sự

[28] tổng hợp và thử tác dụng chống nấm

N N N

điều trị nhiễm nấm Cadida albican, Cryptococcus neoformans và Aspergilus

fumigatus

Các tác giả Narayanaswami và Richardson [35], năm 1983, đã nghiên cứu và công bố tác dụng kháng nấm của các dẫn chất triazol

N N N

N

CH2 C X

R

CH2

Trong đó R là các dẫn chất chứa vòng thơm như naphthyl, biphenylyl, chloro-pyrid-2-yl hoặc nhóm phenyl có các vị trí được thay thế bởi F, Cl, I,

5-CF3, hoặc C1-C4 alkoxy và X có thể là F, Br, Cl hoặc OH Kết quả cho thấy

hầu hết các chất các tác giả tổng hợp được đều có tác dụng ức chế Candida

albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergilus fumigatus, Coccidioides, Paracoccidioides, Histoplasma, Blastomyces

Kết quả của nghiên cứu trên đã góp phần tìm ra dẫn chất fluconazol, hoạt

chất này hiện nay đang được sử dụng trong điều trị nấm Crypyococcus và

Aspergillus

N N

R1 R2HO

N X

Y

R3

X: CH, N Y: F, Cl

N

H N N

K2CO3, DMF

Fluconazol

Năm 1991, 1994, 1998, Stephen J Ray và cộng sự [45], [46], [47] đã

tổng hợp và công bố tác dụng kháng nấm của một loạt dẫn chất

1H-1,2,4-triazol

Từ kết quả của những công bố này các tác giả đã tiếp tục sàng lọc, thử tác dụng sinh học và độc tính, cuối cùng đã lựa chọn được voriconazol đưa

vào sử dụng trong điều trị nấm Candida abicans, Crypotococcus neoformans,

Aspergillus furmigatus (công thức cấu tạo của voriconazol xem bảng 1.1) Năm 2001, Toshiyuki Konosu và cộng sự [30] đã tổng hợp các dẫn chất dioxin-triazol và tiến hành thử tác dụng chống nấm của các chất tổng hợp được Hầu hết các dẫn chất này có tác dụng kháng nấm cao với MIC ≤1µg/ml

CH O

OH

CH3

S ( )

A r n N

N N

F

F

n == 11,2,3

N N H

N

S CH2 CO HN R

Sau những nghiên cứu trên, vào năm 2008, S Emami và cộng sự [22] đã tổng hợp và thử tác dụng chống nấm của các dẫn chất 2-hydroxyphenacyl azol và 2-hydroxyphenacyl azolium Các chất này được xem như là một nhóm thuốc azol chống nấm mới Kết quả nghiên cứu cho thấy một số dẫn chất của triazol có tác dụng chống nấm hiệu quả với MIC < 32µg/ml

C OH

H3CO

O

CH2

N N N

NH2Br

R: CH3O , ClNăm 2009, R.R Soman và cộng sự [33] đã tiến hành thêm một nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng chống nấm của một số chất thuộc nhóm các dẫn chất 1,2,4-triazol

Với R là các aryl, các chất tổng hợp được đều có tác dụng chống nấm C

albicans và A.niger tại các nồng độ 50µg/ml và 100µg/ml

Có thể thấy rằng: các azol đã bổ sung một lượng lớn vào danh mục các thuốc chống nấm vì có độc tính thấp hơn amphotericin B, có tác dụng trên nhiều loại nấm khác nhau và có các tính chất dược động học ưu việt

Cơ chế tác dụng [2], [18], [24]: Các thuốc chống nấm azole đều hoạt động theo cơ chế tác dụng chung là ức chế enzym cytocrom P450 của nấm, các enzym này cần thiết để demethyl hóa các 14-α-methylsterol thành ergosterol Ergosterol là sterol chủ yếu của màng tế bào nấm, khi ergosterol không được tạo thành, màng tế bào nấm bị tổn thương nên thay đổi chức năng và độ thấm của màng, dấn đến làm mất các chất quan trọng trong tế bào nấm như ion K+

,các acid amin và do đó nấm bị tiêu diệt

1.1.3 Tác d ụng kháng tế bào ung thư

STT Chất Công thức cấu tạo Chỉ định

CN

N N N

dương tính

Guanazol có CTCT như sau:

N N H

R1

N N N

Ung thư là một bệnh nan y và rất khó điều tri Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp hy vọng đạt kết quả trong việc điều trị căn bệnh này Vì vậy rất nhiều các chất kể cả các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên và các chất tổng hợp hóa học đã được thử tác dụng kháng tế bào ung thư Một số chất chứa hợp phần 1,2,4-triazol có mặt trong một số thuốc điều trị ung thư như anastrozol, letrozol, các thuốc này được liệt kê trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số thuốc chông ung thư có nhân triazol

Để chứng minh tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất triazol, đầu tiên phải kể đến công bố của M A Hahn, R H Adanson vào năm 1972

[17] về guanazol (3,5-diamino-1H-1,2,4-triazol) có tác dụng kháng tế bào ung

thư Hoạt chất này hiện nay đang được sử dụng trong điều trị bệnh tăng bạch cầu

Năm 1990, Phillip N Edward và Michael S Large [39] đã tổng hợp và thử tác dụng sinh học ức chế enzym acromastase ứng dụng trong điều trị ung thư

vú của một số dẫn chất 1H-1,2,4-triazol

Kết quả cho thấy các chất thử nghiệm có tác dụng ở nồng độ ≤ 10mg/ml Trong số các chất này đáng chú ý có hợp chất anastrozol, hiện nay đang được

sử dụng trong điều trị bệnh ung thư vú ở nữ giới

Anastrozol được tổng hợp theo sơ đồ sau:

Br Br

KCN , n-Bu4NBr CH2Cl2/H2O, 10:3, 3h NC CN

MeI, DMF NaH, 2h NC CN

Br (PhCO) 2 O2, NBS

CCl4, 2h

Na N

N N DMF, 18h

N NN

(Anastrozol)

Nối tiếp những thành quả nghiên cứu trên, cũng vào năm 1990, các nhà khoa học Robert M Bowman và cộng sự [41] đã tổng hợp và thử tác dụng kháng enzym acromastase của một số dẫn chất 1,2,4-triazol

N C

CN N

H N N Br

CN

N N N

NC

Letrozol

Công thức cấu tạo

Ar

IC50(µM)

N

N N N

S Ar O

F

HT29 K293 MDA231 4-F, 3-CF 3 C 6 H 3 10 20 9 2-F, 5-NO 2 C 6 H 3 13 25 13

N N

Ph N N N

Ph

SR

H3CO

R: CHCH2CH2OH CHCH2OCH3O

N N

Ph N N N

Ph

S Cl

R1

N H

R1:

Một nghiên cứu khác vào năm 2010 của Paul A.M Wood và cộng sự [38] đã tổng hợp và thử tác dụng ức chế acromatase- sulfatase của một số dẫn chất

4-amino-4H-1,2,4-triazol Kết quả một số chất thể hiện hoạt tính ức chế

acromatase và sulfatase ở mức độ nanomol Các dẫn chất

4-amino-4H-1,2,4-triazol này làm phong phú thêm số lượng các dẫn chất triazol có tác dụng chống ung thư

N N NN

CN

Mười sáu dẫn chất của triazol, năm 2012, đã được nhóm nghiên cứu của Eman M Flefel [23] và cộng sự tổng hợp thử tác dụng sinh học kháng vi sinh vật, kháng ung thư, kết quả cho thấy 5 dẫn chất được tổng hợp có tác dụng chống khối u tử cung và tế bào ung thư vú với IC50 (2,72-5,85µg/ml)

Một nghiên cứu khác năm 2012 của G.C Ramaprasad [40] đã thu được

kết quả đáng quan tâm khi thử hoạt tính của một số dẫn chất 1,2,4-triazol trên các dòng tế bào ung thư HT29, K293, MDA231 Kết quả thu được:

công thức cấu tạo như sau:

NH2N

N O

N O OH OH

H H H H

HO

Ribavirin là một nucleosid kháng virus phổ rộng, chống virus cúm B khá mạnh, kháng virus hợp bào đường hô hấp (RSV), nó cũng có một số tác dụng với các loại virus khác như: herpes, thủy đậu, viêm gan, sởi

• Tác dụng khác:

Ngoài các tác dụng đáng kể trên người ta còn thấy các dẫn chất triazol còn có một số tác dụng có thể ứng dụng trong điều trị như tác dụng chống sốt rét, chống trầm cảm Sau đây là một số chất đã được công bố công bố [11], [17]

HCOOH + NH2NH2 H2O HCONHNH2 + H2O

2 HCONHNH2

N N N

4-Amino-4H-1,2,4-triazol được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1899 do

S Ruhemann và cộng sự [43] thực hiện bằng cách đun nóng formyl hydrazin

ở nhiệt độ 150-2000C, đây là phương pháp khá đơn giản và thuận lợi Về sau nhiều nhà tổng hợp hữu cơ đã nghiên cứu sâu hơn về phương pháp tổng hợp

H2N

t0EtOH, t 0 c

M.V Rubtsov; A.G Baichikov [42] đã thực hiện phản ứng tổng hợp

4-amino-4H-1,2,4-triazol từ acid formic và hydrazin hydrat Phản ứng xảy ra theo hai giai đoạn nhưng thực hiện liên tiếp trong 1 quá trình:

Thông qua các phương pháp trên, chúng tôi nhận thấy để tổng hợp

4-amino-4H-1,2,4-triazol có thể tiến hành theo hai phương pháp bao gồm

N

N H

N

H2N CH2 O

O

N N N

CH3

C6H5Cl

phương pháp của M.V Rubtsov; A.G Baichikov [42] hoặc phương pháp của E.C Horning [26] Do đó, trong công trình nghiên cứu này chúng tôi tiến

hành tổng hợp hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol khảo sát theo 2 phương pháp của

M.V Rubtsov; A.G Baichikov [42] và E.C Horning [26]

Cơ chế phản ứng:[1], [5], [8]

Phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Tác nhân ái nhân tấn công vào nhóm carbonyl của aldehyd

theo cơ chế cộng hợp ái nhân AN:

Cơ chế như sau:

H

H H

O Ar H

N Ar1H

H

OH Ar H

N Ar1H

Giai đoạn 2: Phản ứng tách loại một phân tử nước theo cơ chế tách loại

N Ar1H

-H2O

C Ar H

N Ar1H

-H +

C

HNhư vậy khả năng và tốc độ của phản ứng phụ thuộc chủ yếu vào 2 yếu tố:

Οδ+ Oδ−

+ Sự phân cực của liên kết đôi carbonyl (C=O) của aldehyd (-CHO) Các nhóm thế hút điện tử (có hiệu ứng -M, -I) làm tăng tốc độ phản ứng vì làm tăng sự phân cực liên kết C=O

+ Tính ái nhân của phân tử amin Các amin có tính base càng lớn thì tốc

độ phản ứng càng tăng

• Phản ứng không cần xúc tác

Phản ứng của các hợp chất carbonyl rất hoạt động và các nucleophin cũng rất hoạt động thì phản ứng không cần xúc tác acid hay base Cơ chế phản ứng xảy ra như cơ chế chung

Để làm tăng điện tích dương trên nguyên tử carbon có thể dùng xúc tác acid để proton hóa nhóm carbonyl do đó làm tăng tính electrophin của carbon

Cơ chế phản ứng như sau:

N Ar1H H

C

OH Ar H

N Ar1H

H - H2O

C Ar H

N Ar1H

- H

C Ar H

N Ar1

Tốc độ đạt được cực đại khi tất cả các nhóm carbonyl được proton hóa Nhưng khi dùng tác nhân ái nhân có khả năng bị proton hóa như amin thì pH

để phản ứng có vận tốc cực đại phụ thuộc vào bản chất nhóm carbonyl và nucleophin Khi đó có thể tồn tại 2 cân bằng sau:

NH2

Ar1 + H Ar1 NH3

C Ar H

H

OH H

+

Sự proton hóa cặp điện tử tự do ở nguyên tử N của H2N-Ar1 làm giảm khả năng ái nhân của chất này, do đó làm giảm khả năng tấn công vào carbon của nhóm carbonyl Song nếu proton hóa nhóm carbonyl sẽ làm tăng khả năng phản ứng của nhóm này với tác nhân ái nhân Do dó ở một giá trị pH nào đó mà không phải tất cả lượng H2N-Ar1 chuyển thành H3N+-Ar1 và nồng

độ acid liên hợp của nhóm carbonyl có đủ để tốc độ phản ứng có giá trị lớn nhất, đó là giá trị pH tối ưu

• Phản ứng với xúc tác base

Các amin bậc 1 (tác nhân ái nhân) có tính base, có thể cộng hợp vào nhóm carbonyl mà không đòi hỏi deproton hóa, song phản ứng vẫn có thể xảy

ra tốt hơn với xúc tác base vì các ion imidua (được tạo thành từ các amin do

sự deproton hóa) là các base mạnh hơn do đó làm tăng khả năng phản ứng của tác nhân này

1.3.2 Tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

Nhiều nhà nghiên cứu trong nước và nước ngoài đã đi sâu nghiên cứu

phương pháp tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

• Nước ngoài

S Ruhemann [43] đã thực hiện phản ứng tổng hợp hợp các azomethin

của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm trong dung môi EtOH ở

nhiệt độ phòng với xúc tác piperidin:

CHO

N N N

H2N

N N N N

HC Ar Piperidin EtOH

Ar: , R: CH3

Với Ar-CHO là các aldehyd thơm như: benzaldehyd; nitrobenzaldehyd; 2-hydroxybenzaldehyd; p-dimethylamino benzaldehyd; furfural

3-Còn khi tạo các azomethin với các ceton thơm thì các tác giả thực hiện phản ứng trong dung môi EtOH, xúc tác piperidin, đun ở nhiệt độ sôi cách thủy:

Với:

M.V Rubtsov; A.G Baichikov [42] đã thực hiện phản ứng tổng hợp chế phẩm furazonal trong môi trường nước ở 15oC với sự có mặt của acid sulfuric Phản ứng xảy ra qua 2 giai đoạn sau:

- Thủy phân nitrofurfuraldiacetat với xúc tác acid sulfuric để tạo nitrofurfural

5 Ngưng tụ 5- nitrofurfural với 4-amino-4H-1,2,4-triazol trong môi trường

nước với xúc tác sulfuric, ở nhiệt độ 15o

C

• T ại

Vi ệt Nam

Năm 1983 Nguyễn Văn Yên, Nguyễn Quang Đạt [13] thực hiện phản

ứng tổng hợp các azomethin giữa 4-amino-4H-1,2,4-triazol và các aldehyd

thơm, Isatin trong dung môi EtOH, trong các điều kiện thử nghiệm ở nhiệt độ phòng và đun cách thủy với xúc tác là piperidin Kết quả cho thấy khi tiến

C

Ar

+

N N N

H2N

N N N N

C Ar

EtOH, t0piperidin

H2N +

O

N N N N

H2SO4

15 0 C

hành ngưng tụ trong điều kiện nhiệt độ sôi cách thủy phản ứng diễn ra thuận lợi hơn (ngắn hơn về thời gian, cao hơn về hiệu suất)

Năm 1993 Vũ Thị Hải Vân, Nguyễn Quang Đạt [12] đã thực hiện phản

ứng tổng hợp azomethin giữa 4-amino-4H-1,2,4-triazol và các aldehyd thơm

trong dung môi EtOH Hồi lưu cách thủy và xúc tác là các acid H2SO4 và HCl Năm 2004 Diệp Thị Minh Quyết, Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Ngọc

Anh [7] đã thực hiện phản ứng tổng hợp azomethin giữa

4-amino-4H-1,2,4-triazol và các aldehyd thơm trong dung môi EtOH sử dụng xúc tác là acid HCl

Trong công trình nghiên cứu này chúng tôi thực hiện các phản ứng tổng

hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm trong

dung môi EtOH, đun hồi lưu cách thủy, xúc tác acid HCl

CHƯƠNG 2

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Bình ba cổ với kích thước khác nhau, sinh hàn ngang, sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, cân kỹ thuật, máy hút chân không và tủ sấy Sắc kí lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng Silicagel Kieselgel 60F254(Merck)

Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Electro thermal digital tại Bộ môn Hóa Hữu cơ–Trường Đại học Dược Hà Nội

Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer tại Viện Hóa học (Viện

khoa học và công nghệ Việt Nam)

Phổ khối lượng (MS) ghi trên máy Varian MS tại phòng Khối phổ-Viện

hóa học (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

Bruker - AV500 tại phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hóa học (Viện khoa học

và công nghệ Việt Nam)

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

Khảo sát tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp M.V

Rubtsov; A.G Baichikov [42] và E.C Horning [26]

Thực hiện phản ứng tổng hợp azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

với các aldehyd thơm trong điều kiện đun cách thủy xúc tác HCl và khảo sát thời gian phản ứng

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.3.1 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư

Nguyên vật liệu thí nghiệm:

• Mẫu thử: 4 mẫu, bao gồm:

II, III, IV, VII

• Tế bào: gồm 4 dòng tế bào

- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

- Dòng tế bào Hela (tế bào ung thư tử cung)

- Dòng tế bào A549 (tế bào ung thư phổi)

- Dòng tế bào OVCAR-8 (tế bào ung thư buồng trứng)

• Hóa chất:

- MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide), môi trường nuôi cấy DMEM, huyết thanh thai bò (fetal bovine serum)

của hãng in vitrogen

- Adriamycin của hãng Sigma

- DMSO của hãng sigma

- Và các hóa chất khác

• Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính

hiển vi soi ngược, và các máy móc khác

Phương pháp:

Nguyên tắc:

- Áp dụng phương pháp MTT được biên soạn bởi tác giả Mosmann (1983) để đánh giá độc tính trên tế bào [34] Nguyên tắc của phương pháp

như sau: MTT là thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế

bào Tế bào được nuôi cấy trong một đĩa 96 giếng, đáy bằng Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37o

C, 5% CO2 Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tím trong ty thể của những tế bào sống Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600 nm Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzyme reductase trong ty thể là hoạt động, và do đó sự chuyển đổi có thể liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Chúng tôi sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của thuốc đối với tế bào

Cách tiến hành:

- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức

và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có

bổ sung huyết thanh bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L) Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm

- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/ml Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ 100, 50, 25, 12,5 và 6,25 μg/ml Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn

gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997 [15] Adriamycin được sử dụng làm chứng dương và dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm

- Quy trình nuôi cấy:

1 Pha loãng tế bào ở nồng độ khoảng 2X104 tế bào/ml môi trường nuôi cấy Thêm vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng 180μl huyền dịch tế bào Để 3 giếng trống chứa môi trường nuôi cấy làm chứng trắng (blank control)

2 Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37o

C và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Giữ tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định

3 Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường

4 Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ (37o

C, 5% CO2)cho phép thuốc phát huy tác dụng Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi

5 Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml

6 Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy

7 Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa

8 Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy

9 Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO Lắc

kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn

10 Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót

- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:

% tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý] / [OD540 của tế bào không được xử lý thuốc] x 100%

- Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell

2.3.3.2 Thử tác dụng kháng nấm

* Nguyên tắc

Thử sàng lọc hoạt tính kháng nấm được tiến hành theo phương pháp của Vander Berger và Vlietlinck [48], thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng, theo 2 bước sau đây:

- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính

- Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

• Kháng sinh đối chiếu

Nystatin hoặc Amphotericin B đối với nấm mốc và nấm men

• Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm

Nhỏ vào mỗi giếng đã có sẵn dung dịch VSV đã được hoạt hóa và được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn

vị McLand (khoảng 108

VSV/ml)

+ Chuẩn bị mẫu đối chứng dương:

Dãy 1: Môi trường

Dãy 2: Kháng sinh Nystatin + vi khuẩn kiểm định

+ Chuẩn bị mẫu đối chứng âm:

Chỉ có VSV kiểm định, không có kháng sinh hay chất thử

+ Đọc kết quả:

Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 370C/24 giờ cho

vi khuẩn và 300/ 48 giờ đối với nấm mốc và nấm men Kết quả dương tính là

ở nồng độ mà khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không thấy có vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các chứng giếng dương Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU

< 5

Mức dương ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử ở bước 2 để tính giá trị MIC

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chất có hoạt tính

Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần từ 5 – 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn

Mẫu chất tinh khiết có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

• Sơ đồ tổng hợp hóa học

Trong khóa luận này, chúng tôi đã tiến hành các phản ứng tổng hợp theo

sơ đồ phản ứng sau đây:

HCOOH + NH2NH2 H2O

N N N

H2N

HCl , t 0

N N N N

HC Ar

tổng hợp 4-Amino-4H-1,2,4-triazol theo các phương pháp của E.C Horning

[26] và M.V Rubtsov; A.G Baichikov [42]

3.1.1.1.Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp E.C Horning

• Giai đoạn 1: Tổng hợp formyl hydrazin

Phương trình phản ứng

HCOOC2H5 + NH2NH2 H2O 18h HCONHNH2 + C2H5OH + H2O

t 0

- Dụng cụ: bình cầu đáy tròn dung tích 250ml, sinh hàn, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cất quay chân không

- Tiến hành: cho 25ml EtOH vào bình cầu tiếp theo cho 25ml ethyl formiat 97% (0,3mol) và 21ml (0,36mol) dung dịch hydrazine hydrat 85%, lắp sinh hàn, đun sôi cách thủy duy trì trong 18h, để nguội ở nhiệt độ phòng, cất loại dung môi

• Giai đoạn 2: tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol

Phương trình phản ứng:

2 HCONHNH2

N N N

sản phẩm ra cốc, làm lạnh bằng nước đá, lọc hút qua phễu Buchner

Kết tinh lại: hòa tan hoàn toàn sản phẩm thô trong 15ml EtOH 95% nóng, lọc nóng, thêm 15ml ether và làm lạnh Sản phẩm kết tinh lại, lọc hút qua phễu Buchner, làm khô bằng bình hút ẩm, thu được 6,9g sản phẩm kết tinh, tinh thể màu trắng

- Sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3: EtOH (6:1), thu được một vết gọn,

rõ khi soi dưới ánh đèn tử ngoại, Rf= 0,47

●Kết luận:

- Đã tổng hợp được chất I theo phương pháp của E.C Horning [26], phản ứng

cho hiệu suất là: 55%

- Kết quả sắc kí lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy sản phẩm thu được tinh khiết và có nhiệt độ nóng chảy trùng với các số liệu đã công bố trong các tài liệu tham khảo được [26]

3.1.1.2.Tổng hợp 4-amino-4H-1,2,4-triazol theo phương pháp M.V Rubtsov; A.G Baichikov

Phương trình phản ứng:

2 HCOOH + 2 NH2NH2 H2O

N N N

H2N + 6 H2O 150-2000C

4h

PTL: 84.08

C2H4N4

- Dụng cụ: bình cầu đáy tròn dung tích 250ml, sinh hàn ngang, nhiệt kế, bình

hứng, máy khuấy từ gia nhiệt

- Tiến hành:

Cho vào bình cầu 30ml (0,6mol) acid formic 85%, làm lạnh bằng nước

đá đến 50C Thêm từ từ 71.4ml (0,72mol) hydrazin hydrat 50%, phản ứng tỏa nhiệt mãnh liệt Lắp sinh hàn, đun cách cát, nâng từ từ nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng lên đến 150-2000

C và duy trì ở nhiệt này trong 4h, nước từ hỗn hợp phản ứng được đều đặn cất ra Đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh bằng nước đá, sản phẩm kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner

Kết tinh lại: hòa tan hoàn toàn sản phẩm thô trong 25ml EtOH 95% nóng, lọc nóng, thêm 25ml ether Làm lạnh sản phẩm kết tinh lại, lọc hút qua phễu Buchner

Hút kiệt dung môi: làm khô bằng bình hút ẩm, thu được 19,5g sản phẩm kết tinh tinh thể màu trắng

- Đã tổng hợp được chất I theo phương pháp của M.V Rubtsov; A.G

Baichikov với hiệu suất là: 77,3%

- Kết quả sắc kí lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy sản phẩm thu được tinh khiết và có nhiệt độ nóng chảy trùng với các số liệu đã công bố trong các tài liệu tham khảo được [26], [42]

3.1.2 Tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol

Các dẫn chất của dị vòng triazol có ý nghĩa quan trọng và đã được nhiều tác giả nghiên cứu Trong công trình này chúng tôi đã tổng hợp thêm một số

dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm, phản

ứng xảy ra trong dung môi EtOH, ở nhiệt độ đun sôi cách thủy, sử dụng xúc tác acid HCl Về mặt lí thuyết, việc sử dụng xúc tác acid là hợp lý vì 4-amino-

4H-1,2,4-triazol là một base yếu nên cần dùng acid mạnh để proton hóa carbon của nhóm carbonyl(C=O) làm tăng khả năng cộng hợp ái nhân của nhóm carbonyl do đó sẽ tăng khả năng phản ứng ngưng tụ

Xuất phát từ 4-amino-4H-1,2,4-triazol (I) tổng hợp được và các aldehyd

thơm, chúng tôi tiến hành tổng hợp một số azomethin theo phương trình tổng quát sau:

N N N

N N N

HC Ar +

EtOH

Sau đây là kết quả thực nghiệm tổng hợp hóa học của các chất trong công trình này

3.1.2.1 Tổng hợp 4- (2’-clorobenzyliden )-amino-4H-1,2,4-triazol(II)

 Công thức

N N N N

HC Cl

PTL: 206.64 CTPT: C9H7ClN4

 Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt

 Tiến hành:

Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml

EtOH và 1,40g 2-clorobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3:MeOH (12:1), xác định được thời gian phản ứng thích hợp là 45 phút, sau đó đổ sản phẩm ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh Kết tinh lại trong EtOH, sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được 1,11g sản phẩm

 Kết quả:

- Hiệu suất: 53,72%

- Nhiệt độ nóng chảy: 187-188o

C

 Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng hơi vàng, xốp nhẹ

 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf =0,38

3.1.2.2 Tổng hợp 4-(4’-fluorobenzyliden )-amino-4H-1,2,4-triazol (III)

 Công thức

N N N N

HC

PTL:190.18

CTPT: C9H7FN4F

 Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt

 Tiến hành:

Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml

EtOH và 1,24g 4-fluorobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl, làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 45 phút, sau đó đổ sản phẩm

ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh Kết tinh lại trong EtOH, sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được 1,17g sản phẩm

HC

PTL: 206.64

CTPT: C9H7ClN4Cl

 Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt

 Tiến hành:

Cho vào bình cầu 3 cổ : 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml

EtOH và 1.40g 2-clorobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid, HCl làm xúc, tác lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 45 phút, sau đó đổ sản phẩm

ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng

EtOH lạnh Kết tinh lại trong EtOH, sấy khô ở nhiệt độ 600C, thu được 1,15g sản phẩm

 Kết quả:

- Hiệu suất: 55,65%

- Nhiệt độ nóng chảy: 190-191o

C

 Sản phẩm là bột kết tinh màu trắng hơi vàng, xốp nhẹ

 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc SKLM, hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), sản phẩm có Rf =0,60

3.1.2.4 Tổng hợp 4-(3’-nitrobenzyliden)-amino-4H-1,2,4-triazol(V)

 Công thức

N N N N

HC

PTL: 217.19 CTPT: C9H7N5O2

O2N

 Dụng cụ: Bình cầu 3 cổ 100ml, sinh hàn hồi lưu, máy khuấy từ gia nhiệt

 Tiến hành:

Cho vào bình cầu 3 cổ: 0,84g chất I (0,01mol) đã hòa tan trong 5ml

EtOH và 1,51g 3-nitrobenzaldehyd (0,01mol) đã hòa tan trong 10ml EtOH, thêm 2-3 giọt acid HCl làm xúc tác, lắp sinh hàn, đun hồi lưu cách thủy, theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CHCl3: MeOH (12:1), xác định thời gian phản ứng thích hợp là 30 phút, sau đó đổ sản phẩm

ra cốc, làm lạnh để kết tinh hoàn toàn, lọc hút qua phễu Buchner, rửa tủa bằng EtOH lạnh Kết tinh lại trong EtOH : DMF (2:1), sấy khô ở nhiệt độ 600

C, thu được 1.38g sản phẩm