Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 1,3,4 thiadiazol

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [40,41]..

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám

ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Hải Nam, DS Nguyễn Xuân Phong - Bộ môn

Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn

và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè

đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Đỗ Thị Mai Dung

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2

1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase 2

1.1.2 Phân loại các HDAC 3

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC 4

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 6

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 6

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 8

1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 9

1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC 9

1.3.2 Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới 10

1.4 PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC 13

1.4.1 Tổng hợp amid với tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 13

1.4.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 14

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 15

2.1.1 Hóa chất 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Tổng hợp hóa học 16

2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.3.1 Tổng hợp hóa học 16

2.3.2 Thử tác dụng sinh học 17

2.3.3 Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được 19

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 HÓA HỌC 20

3.1.1 Nghiên cứu Docking 20

3.1.2 Tổng hợp hóa học 21

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết 34

3.1.4 Xác định cấu trúc 34

3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 40

3.2.1 Thử hoạt tính sinh học 40

3.2.2 Đánh giá mức độ giống thuốc 40

3.3 BÀN LUẬN 41

3.3.1 Tổng hợp hóa học 41

3.3.2 Tác dụng sinh học 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALL : Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính

AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính

Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính Carbonyldiimidazol

Bệnh lympho mãn tính (Chronic lymphocytic leukemia)

Tế bào lymphoT dưới da (Cutaneous T cell lymphoma) 13

HAT : Histon acetyltranferase

HDAC : Histon deacetylase

Phương pháp phổ tử ngoại 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid

MS

NSCLC

: :

Phổ khối lượng Ung thư phổi tế bào không nhỏ (Non-smali lung cell)

3 Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất 5a-f với HDAC8 20

4 Bảng 3.2: Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid

5 Bảng 3.3: Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các chất 5a-f 34

6 Bảng 3.4: Kết quả phân tích phổ MS của các chất 4a-f 35

7 Bảng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất 5a-f 36

8 Bảng 3.6: Kết quả phân tích phổ MS của các chất 5a-f 37

9 Bảng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 5a-f 37

10 Bảng 3.8: Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các chất 5a-f 39

11 Bảng 3.8: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 5a-f theo

12 Bảng 3.10: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1 Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom 2

2 Hình 1.2: Mô tả đặc điểm của các loại HDAC 4

3 Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào

7 Hình 1.7: Các dẫn chất amid ngược của SAHA 11

8 Hình 1.8: Các dẫn chất -alkoxy của SAHA 11

9 Hình 1.9: Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA 11

10 Hình 1.10: Các dẫn chất aicd biphenyl-hydroxamic 12

11 Hình 1.11: Công thức cấu tạo của WR301849 12

12 Hình 3.1: Mô hình tương tác của 6 dẫn chất 5a-f với HDAC8 21

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

1 Sơ đồ 1.1: Cơ chế xúc tác của CDI 14

2 Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 21

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006) là chất ức chế histon deacetylase đầu tiên được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T Sau đó, năm 2009 depsipeptid (Romidepsin®) một chất ức chế HDAC khác cũng được cấp phép trong điều trị ung thư tại Mỹ Như vậy có thể thấy, HDAC là một mục tiêu phân tử quan trọng trong điều trị ung thư và các chất ức chế HDAC là các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết

kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [40,41] Các nghiên cứu gần đây tại bộ môn về các acid hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC cho thấy có thế thay thế nhóm nhận diện bề mặt của SAHA là nhân phenyl bằng vòng thơm khác như benzothiazol cho hoạt tính

in vitro rất khả quan [3] Tiếp theo đó, trong luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Ánh Tuyết

[4] khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol đã được sử dụng làm nhóm nhận diện bề mặt thay cho benzothiazol Tuy nhiên nghiên cứu trên mới chỉ tổng hợp được 5 dẫn chất, chưa đủ để đánh giá khả năng tương tác của nhóm nhận diện bề mặt mới với

HDAC, cũng như chưa tìm được chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro tốt

để tiến hành các thử nghiệm sâu hơn Trên cơ sở thay đổi các nhóm thế ở vòng thơm sẽ làm thay đổi tương tác của chất với mục tiêu phân tử, chúng tôi thiết kế các

nhóm thế mới trên khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol và tiến hành đề tài “Tổng hợp

và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung thiadiazol” với hai mục tiêu:

1,3,4-1 Tổng hợp N1-hydroxy-N8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid và 5 dẫn chất

2 Thử độc tính tế bào và tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được

2

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)

Tất cả bộ gen của người được gói trong nhiễm sắc thể (NST), một phức hợp đại phân tử protein-ADN Nhiễm sắc thể có cấu trúc động, được tổ chức cao, bao gồm: ADN, các protein histon và protein không phải histon Đơn vị cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom Một nucleosom điển hình bao gồm một octamer hình đĩa của 4 cặp histon (2 cặp của H2A với H2B và 2 cặp của H3 với H4) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid [1,48] (hình 1.1):

Hình 1.1: Cấu trúc của histon trong nucleosom

Khi đầu amin của histon tích điện dương sẽ tương tác với phần phosphat mang điện âm trên phân tử ADN làm đóng xoắn NST gây ức chế dịch mã và tổng hợp protein, làm ức chế sự biển hiện gen Ngược lại khi tương tác điện tích này yếu NST tháo xoắn , quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính của gen được biểu hiện thông qua các tính trạng Việc tích điện dương của histon mạnh hay yếu thông qua quá trình acetyl hóa đầu amin ở phần đuôi của histon liên quan đến hoạt động của 2 emzym histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT)

1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase

3

Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm

acetyl từ -N acetyl lysine amino acid của histon HDAC có tác dụng đối lập với

histon acetyltransferase (HAT) - enzym xúc tác chuyển nhóm acetyl từ acetyl coenzym A đến -amino của lysin ở đầu N của histon [49]

1.1.2 Phân loại các HDAC

Có 18 HDAC ở người được chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu trúc của chúng lần lượt với Rpd3, Hdal và Sir2 trong nấm men [22,43] (hình 1.2):

Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8

Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10

Nhóm III: Các protein điều hòa chuỗi thông tin bao gồm:

- Chất đồng đẳng của Sir2 trong nấm men Saccharomyces cerevisiae

- Sirtuin trong động vật có vú (SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4,

SIRT5, SIRT6, SIRT7)

Nhóm IV: HDAC11

Các HDAC nhóm I, II, IV được coi là các HDAC “kinh điển” gồm 11 thành viên, trong khi các thành viên nhóm III được gọi là các sirtuin [22] Các HDAC kinh điển và sirtuin có cơ chế xúc tác khác nhau Các HDAC kinh điển là những enzym phụ thuộc Zn2+, chúng có chứa 1 túi xúc tác với 1 ion Zn2+ ở đáy túi Do đó những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo phức với Zn2+ như các acid hydroxamic, các thiol… Ngược lại các sirtuin không bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ vì cơ chế hoạt động của chúng phụ thuộc vào NAD+ như 1 cofactor thiết yếu [43] Thuật ngữ các chất ức chế HDAC thường được sử dụng cho những hợp chất nhằm mục tiêu vào các HDAC kinh điển và những hợp chất này đang được đánh giá dựa trên các thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau

HATs HDACs

4

Ghi chú: Vùng xúc tác

Vùng tín hiệu nhận diện nhân tế bào

Hình 1.2: Mô tả đặc điểm của các loại HDAC

1.1.3 Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC

HDAC xúc tác loại bỏ nhóm acetyl từ histon và protein không phải histon, làm

tăng sự tích điện dương trên đầu N của histon và đóng xoắn NST, kết quả là ức chế

quá trình phiên mã do ngăn cản các nhân tố sao mã tiến đến đích của chúng trên ADN Ngược lại, HAT acetyl hóa histon làm trung hòa cực dương trên lysin và giúp tháo xoắn cấu trúc của nucleosom, do đó giúp cho các yếu tố sao mã dễ dàng tiếp cận ADN Như vậy sự acetyl hóa và deacetyl hóa NST đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình biểu hiện gen Việc mất cân bằng hoạt động giữa HAT và HDAC có thể dẫn đến những bất thường biểu hiện gen và do đó dẫn đến ung thư [18,27,30,35,39]

5

HDAC đã được xác định bị rối loạn điều hòa trong ung thư Sự huy động bất thường của các HDAC vào chuỗi điều hòa của gen đích có thể xảy ra thông qua tương tác biến đổi của chúng với việc tăng cường vai trò của các protein gắn kết ADN gây ung thư Ví dụ như receptor α-RAR gắn kết gen PML (promyelocytic leukemia gen) hoặc PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger) trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL) Trong điều kiện sinh lý, α-RAR là nhân tố sao mã hoạt hóa acid retinoic giúp giải phóng phức hợp đồng ức chế chứa HDAC và làm gia tăng các chất đồng hoạt hóa sao mã (bao gồm cả HAT) Điều này dẫn đến sự acetyl hóa histon và ức chế gen đẩy mạnh sự biệt hóa tế bào Trong bệnh bạch cầu tiền tủy bào cấp (APL), protein gắn kết α-RAR/PML hoặc α-RAR/PLZF giữ HDAC và phối hợp với phức hợp đồng ức chế Do đó tăng methyl transferase histon và ADN dẫn đến ngăn cản sự phiên mã [18,21,27] Vì vậy, tế bào ung thư không trải qua giai đoạn biệt hóa và phát triển quá mức Sự gia tăng bất thường của HDAC còn được quan sát khi gen đột biến gây ung thư Bcl6 được biểu thị quá mức trong bệnh u lympho tế bào B [7] Tương tự, protein gắn kết AML1-ETO tìm thấy trong bệnh bạch cầu tủy bào cấp (AML) có chức năng như chất ức chế sao mã chủ yếu thông qua ETO, nên có vai trò như vị trí gắn kết cho phức hợp đồng ức chế N-Cor/Sin3/HDAC1 Việc chuyển đổi AML1 từ chất hoạt hóa phiên mã thành chất ức chế được điều khiển bởi protein gắn kết CBFb-SMMHC thông qua sự gia tăng phức hợp đồng ức chế mSin3A/HDAC Cuối cùng, biểu thị quá mức nhân tố sao mã SCL/Tal1 trong bệnh u lympho tế bào T cấp có nguyên nhân là do gia tăng bất thường HDAC1 nằm trong phức hợp đồng ức chế, dẫn đến ngăn cản gen đích điều hòa E47/HEB [14] Biểu thị quá mức HDAC1 và/hoặc HDAC2 và/hoặc HDAC6 còn gặp trong một số bệnh ung thư tạng đặc như ung thư tiền liệt tuyến, ung thư dạ dày, trực tràng, ung thư vú và ung thư não [23,45,47] cũng như trong các bệnh lý ác tính về máu (bệnh bạch cầu tủy bào cấp, bạch cầu tế bào B, bệnh u lympho tế bào T ngoại vi, bệnh u lympho tế bào B và bệnh u lympho da tế bào T) [37] Hơn nữa, việc tìm ra các cơ chất của HDAC là các protein như p53, E2F, Rb, Bcl6, Gli1 liên quan đến xu hướng gây ung thư và tiến triển bệnh ung thư đã khẳng định vai trò của

6

HDAC trong ung thư [12,36] Tóm lại, các biến đổi sau phiên mã của HDAC có thể làm thay đổi tương tác của chúng với phức hợp đồng ức chế mà các phức hợp này liên quan đến quá trình phiên mã của các gen gây ung thư

Các nghiên cứu có tính thống kê còn chỉ ra rằng các HDAC liên quan đến nhiều giai đoạn điều hòa cơ bản của quá trình sinh học trong tế bào ung thư như chu trình tế bào, sự biệt hóa, sự chết tế bào theo chương trình kể cả sự xâm lấn, sự di chuyển và sự tạo mạch Vai trò chức năng của các HDAC trong quá trình sinh học của tế bào ung thư được tóm tắt trong hình 1.3 [9,20,28,44]

Như vậy ức phiên mã được điều hòa bởi sự ra tăng HDAC và có thế kiểm soát ung thư bằng cách ức chế hoạt động của HDAC Các chất ức chế HDAC đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu nhằm tìm ra chất có tác dụng ức chế chọn lọc từng loại HDAC để ứng dụng trong điều trị ung thư

Hình 1.3: Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

7

Từ những phát hiện đầu tiên về tác dụng ức chế HDAC của natri butyrat, cho tới nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra rất nhiều hợp chất mới có tác dụng ức chế

HDAC Trong đó trichostatin A (TSA), một sản phẩm lên men của Streptomyces, là

chất có tác dụng ức chế mạnh nhất tuy nhiên việc sản xuất nó lại không khả thi [38] Hiện nay, đã có 2 chất có tác dụng ức chế HDAC được FDA cấp phép lưu hành trên thị trường để điều trị u lympho tế bào T dưới da là SAHA (vorinostat, Zolinza®) và Romidepsin (Istodax®) Ngoài ra, còn khoảng 15 chất ức chế HDAC khác cũng đang được thử nghiệm tác dụng điều trị ung thư trên lâm sàng ở các giai đoạn khác nhau (hình 1.4) và được chia làm 4 nhóm dựa theo cấu trúc (bảng 1.1)

Hình 1.4: Một số chất ức chế HDAC đang được thử nghiệm lâm sàng

Mỗi nhóm dẫn chất này đều có những hạn chế riêng như: các acid hydroxamic

bị chuyển hóa nhanh, ức chế không chọn lọc trên các loại enzym HDAC; các benzamid và các acid béo có hiệu lực kém; các peptid vòng khó tạo thành về mặt hóa học Các nhóm khác nhau có tác dụng ức chế các loại HDAC khác nhau: các acid hydroxamic ức chế mạnh HDAC nhóm I và II, các acid carboxylic và peptid vòng ức chế mạnh HDAC nhóm I

8

Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng

Acid

carboxylic

Butyrat AN-9 (tiền thuốc) Acid valproic Phenyl butyrat

Acid

hydroxamic

SAHA PXD101 NVP-LAQ824 LBH-589 ITF-2357 SB-939 CRA 024781 JNJ-16241199

Các

benzamid

SNDX-275 CI-994 MGCD-0103

I, II

I, II

II

Tạng đặc, u lympho, AML Tạng đặc, NSCLC, tế bào thận,tụy Tạng đặc, ung thư bạch cầu, MDS

Peptid vòng Depsipeptid

(FK228)

I, II Tạng đặc, CLL, AML, u đa tủy

xương, NHL tế bào T ngoại vi, RAI kháng thyroid, ung thư đại tràng tiến triển

Ghi chú: NSCLC: carcinom tế bào phổi không nhỏ; AML: ung thư bạch cầu tủy bào cấp; MDS:

hội chứng loạn sản tủy; CTCL: u lympho da tế bào T; ALL: ung thư bạch cầu cấp; CLL: ung thư bạch cầu mãn

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC

Cấu trúc của các chất ức chế HDAC rất đa dạng nhưng nhìn chung đều gồm 3 phần chính:

- Nhóm khóa hoạt động (capping group) hay vùng nhận diện bề mặt (surface recognition group): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt

enzym

- Vùng cầu nối sơ nước: thường là những hydrocacbon thân dầu mạch thẳng hay vòng, có thể no hoặc không no để tạo các liên kết Van der Waals với kênh

enzym

9

- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): tương tác với ion

Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC như acid hydroxamic, các thiol, nhóm

o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton

Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy nhóm kết thúc, cầu nối và một phần của nhóm khóa hoạt động nằm trong túi enzym làm lấp đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động tương tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Nhóm nhận diện bề mặt có thể liên kết với phần cầu nối thông qua một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dược động học cho các chất ức chế HDAC Việc nghiên cứu thiết kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này

1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID

HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI

1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl-acid hydroxamic đã được biết đến nhiều, ví dụ như SAHA (hình 1.5)

Hình 1.5: Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC

Cấu trúc của nhóm chất này cũng gồm 3 phần chính có liên quan đến tác dụng như sau [38]:

- Nhóm khóa hoạt động: liên quan đến tính đặc hiệu và hiệu lực ức chế enzym HDAC, thường là các aryl, các nghiên cứu về các chất tổng hợp được cho thấy kích thước vòng nhân thơm lớn sẽ cho tác dụng tốt hơn vòng nhỏ

10

- Cầu nối sơ nước: liên quan đến khả năng ức chế enzym, quyết định sự phù hợp về cấu trúc của các chất với chiều dài của kênh enzym Phần này thường có cấu trúc amid - alkyl, là các hydrocarbon mạch hở hoặc các vòng thơm có kích thước nhỏ Trong cầu nối liên kết amid là quan trọng nhưng không phải là then chốt, độ dài mạch carbon tối ưu là 5 - 6C

- Nhóm liên kết với Zn2+: acid hydroxamic, là phần không thể thiếu để có tác dụng ức chế HDAC

1.3.2 Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới

1.3.2.1 Thay đổi cầu nối

- Các N-hydroxy-2-propenamid, các acid hydroxamic tương tự TSA

Nhóm các N-hydroxy-2-propenamid (hình 1.6) được thiết kế và tổng hợp dựa

trên cơ sở nghiên cứu cấu trúc của TSA và oxamflatin (hình 1.6) Các chất này có tác dụng ức chế HDAC yếu hơn TSA song tương tự oxamflatin [29]

Hình 1.6: Cấu trúc của TSA, oxamflatin và các dẫn chất N-hydroxy-2-propenamid

- Các amid ngược của SAHA

Nhóm nghiên cứu thuộc công ty Topo Target (Anh) đã thiết kế và tổng hợp gần 40 dẫn chất amid ngược của SAHA (hình 1.7) [6] Nhiều chất trong số này có hoạt tính ức chế HDAC tương đương thậm chí mạnh hơn SAHA Trong đó có 2

chất đã được thử nghiệm mô hình ung thư in vivo trên chuột cho kết quả khả quan,

định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

11

Hình 1.7: Các dẫn chất amid ngược của SAHA

- Các dẫn chất ω-alkoxy của SAHA

Nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm nghiên cứu Sigma-Tau (Pomezia, Ý) đã thiết kế và tổng hợp dãy dẫn chất ω-alkoxy của SAHA (hình 1.8) [24]:

Hình 1.8: Các dẫn chất ω-alkoxy của SAHA

Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế HDAC2 cho thấy tất cả các dẫn xuất alkoxy của SAHA đều cho giá trị IC50 ở mức rất thấp (0,05 - 0,5 µM) Độc tính của các chất với tế bào ung thư thể hiện mạnh hơn so với SAHA trên cả 3 dòng tế bào NB4 (ung thư bạch cầu tiền tủy bào cấp), H460 (ung thư phổi người), HCT-116 (ung thư đại tràng)

ω-1.3.2.2 Thay đổi nhóm khóa hoạt động

- Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA

Viện nghiên cứu Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí phenyl của SAHA (hình 1.9) Trong đó có nhiều chất có tác dụng ức chế HDAC tương đương hoặc mạnh hơn SAHA [19]

Hình 1.9: Các acid phenylthiazol - hydroxamic tương tự SAHA

- Các acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA

Nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski đã thiết kế và tổng hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic tương tự SAHA (hình 1.10) [31] Kết quả

12

các dẫn chất này ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3,

6, 8, 10) Một số acid biphenyl-hydroxamic cũng có độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư tụy thử nghiệm nhưng tác dụng không tốt bằng các acid phenylthiazol-hydroxamic

Hình 1.10: Các dẫn chất acid biphenyl-hydroxamic

- Các acid isoxazol-hydroxamic tương tự SAHA

Trong quá trình nghiên cứu các dẫn chất của acid phenylthiazol-hydroxamic, nhóm nghiên cứu của Alan P Kozikowski thuộc đại học Illinois (Chicago, Mỹ) đã tổng hợp dẫn chất acid phenylisoxazol-hydroxamic WR301849 (hình 1.11) [32] Dẫn chất isoxazol này có tác dụng ức chế HDAC1, 3 và 6 rất mạnh với IC50 thấp đến nồng độ nanomol (0,002 nM)

Hình 1.11: Công thức cấu tạo của WR301849

Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazol được đưa vào vị trí ngay sát nhóm acid hydroxamic đã được thiết kế và tổng hợp Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy 4 dẫn chất I-IV ức chế cả 5 loại HDAC1,

2, 3, 6 và 10 với IC50 trung bình khoảng 150 nM, thấp nhất là 25 nM (bảng 1.2)

Ghi chú: # : Không thử hoạt tính

Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy acid hydroxamic là nhóm chất có khả năng ức chế HDAC tốt, một số chất có tác dụng độc tính với tế bào ung thư ở

nồng độ rất thấp Tổng hợp các acid hydroxamic hướng ức chế HDAC đang là một

hướng nghiên cứu mới và có nhiều triển vọng trong việc tìm kiếm các hợp chất có tác dụng kháng tế bào ung thư chọn lọc, có hiệu quả điều trị cao và ít gây tác dụng

không mong muốn

1.4 PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC

Các chất tổng hợp trong đề tài này đều qua 4 bước phản ứng Trong đó, có 2 phản ứng quan trọng là phản ứng tạo liên kết amid và phản ứng tổng hợp acid hydroxamic Qua tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn các phương pháp tổng hợp phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm như sau:

1.4.1 Tổng hợp amid với tác nhân acyl hóa là acid carboxylic

Acid carboxylic là tác nhân acyl hóa yếu, để acyl hóa amin cần có chất xúc tác Các tác nhân hoạt hóa acid carboxylic là imidazolium tỏ ra khá hữu hiệu trong việc tạo thành liên kết amid, trong đó carbonyldiimidazol (CDI) là chất hay được sử

14

dụng nhất trong nhóm Victor Andrianov và cộng sự đã dùng CDI để xúc tác phản ứng tạo amid cho hiệu suất cao [6], phương trình phản ứng tổng quát như sau:

RCOOH + R1NH2 RCONHR1

Cơ chế xúc tác của CDI được biểu diễn trong sơ đồ 1.1:

Sơ đồ 1.1: Cơ chế xúc tác của CDI 1.4.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester

Có nhiều cách khác nhau để tổng hợp acid hydroxamic từ ester nhưng hay dùng nhất là sử dụng KCN hoặc NaOH làm xúc tác Các phản ứng có phương trình như sau [5,13,16,24]:

Với điều kiện hóa chất, dung môi tại phòng thí nghiệm và tham khảo tài liệu, chúng tôi lựa chọn xúc tác NaOH và dung môi MeOH để tiến hành phản ứng này

15

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

- Máy khuấy từ gia nhiệt

- Máy cất quay chân không Buchi R-210

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh, tủ sấy, máy siêu âm

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital) để xác định nhiệt độ nóng chảy

- Máy Perkin Elmer để xác định phổ IR

- Máy khối phổ HP 5989B-MS để ghi phổ MS

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR

- Thử độc tính trên tế bào ung thư đại tràng (SW620)

- Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

2.3.1.1 Nghiên cứu Docking

- Việc nghiên cứu sơ bộ tính tương tác của các chất với HDAC (docking) được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc Đại học Quốc gia Seul, Hàn Quốc

- Để tìm hiểu sơ bộ tương tác của các chất với HDAC, chúng tôi đã tiến hành docking cho các chất tổng hợp được dựa trên cơ sở mạng lưới của HDAC8 tương tác với SAHA [26] Cấu trúc của HDAC8 có điểm tương đồng cao với HDAC4 với điểm DALI Z (Z-score điểm đánh giá độ giống) = 40,4 và điểm r.m.s.d (root-mean-square deviation, độ lệch) = 2,1Å, thứ tự acid amin giống nhau (46%) và là HDAC của động vật có vú đầu tiên có cấu trúc không gian được nghiên cứu kỹ nhất Chúng tôi thực hiện kiểm soát thử nghiệm lắp ghép của các chất vào HDAC8 bằng chương

- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng chạy sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro được thực

hiện tại Khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism [8,34] Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng)

Các tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:

Chuẩn bị: Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch

đơn tế bào trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS và điều chỉnh đến nồng độ khoảng 1,5.104 đến 3,5.104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 200 l Các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2 Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 l môi trường RPMI bổ sung 10% FBS

từ dung dịch gốc 10 mg/mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 l mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO không quá 0,1%

Tiến hành thử: Sau khi ủ 48 giờ, thêm vào mỗi giếng 20 l thuốc nhuộm MTT

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) với nồng độ MTT là

5 mg/mL trong muối đệm phosphat - PBS Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 37oCtrong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo, mỗi giếng được cho 100 l dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 510 nm

* Tính kết quả

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy): kết quả cuối

19

cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism Trong

phương pháp thử này, IC 50  20 g/mL được coi là có hoạt tính

2.3.3 Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được

Tính giá trị logP của các chất tổng hợp bằng phần mền EPTsuite cung cấp bởi

US Environmental Protection Agency's Office of Pollution Prevention and Toxics and Syracuse Research Corporation (SRC) Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm ChemSketch 4.0 của ACD labs sau đó đưa Smile notation vào phần mềm EPIsuite để tính các giá trị logP

Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất dựa trên quy tắc Lipinsky [33]:

+ Khối lượng phân tử của chất không lớn hơn 500 g/mol

+ Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) không lớn hơn 10

+ Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) không lớn hơn 5

+ Giá trị logP của chất không lớn hơn 5

+ Số liên kết linh động không lớn hơn 15

20

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Nghiên cứu Docking

Để tìm hiểu sơ bộ về khả năng tương tác của các chất với mục tiêu phân tử là các HDAC, chúng tôi nghiên cứu và dự đoán năng lượng liên kết các chất trong thiết kế với trung tâm hoạt động của HDAC8 Kết quả được minh họa bằng mô hình tương tác của các chất với HDAC8 (hình 3.1), năng lượng liên kết dự đoán được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả docking của các chất 5a-f với HDAC8

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

Tác nhân và điều kiện: i) Thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, hồi lưu, 4 h; ii)

FeCl 3 6H 2 O, ethanol, hồi lưu, 3 h; iii) Acid monomethyl suberic, carbonyldiimidazol, DMF, 60 o C, 24 h; iv) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol, -10 o C, 1 h

22

3.1.2.1 Tổng hợp “N 1 -hydroxy-N 8 -(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid” (5a)

a Tổng hợp chất 2a

Chất 2-benzylidenhydrazincarbothioamid (2a) được tổng hợp từ benzaldehyd

(1a) qua phản ứng ngưng tụ với thiosemicarbazid có xúc tác là acid hữu cơ theo sơ

đồ 3.2:

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất 2a

 Tiến hành phản ứng:

+ Lấy 0,2 ml (2 mmol) benzaldehyd cho vào bình cầu đáy tròn dung tích 50

ml, thêm 20 ml ethanol khan

+ Thêm 0,218 g (2,4 mmol) thiosemicarbazid và 3-4 giọt acid acetic băng vào bình phản ứng

+ Đun hồi lưu kết hợp khuấy từ 300 vòng/phút, tiến hành phản ứng trong 4 h

 Xử lý phản ứng:

+ Cất loại dung môi bằng máy cất quay chân không trong 5 phút ở nhiệt độ

40oC

+ Thêm 20 ml nước cất để tủa sản phẩm

+ Lọc, rửa tủa 3 lần bằng 15 ml nước cất lạnh

+ Sấy khô tủa ở 60oC và thu được 0,32 g sản phẩm

+ Cất loại dung môi bằng máy cất quay trong 5 phút ở nhiệt độ 40oC

+ Thêm 20 ml nước cất lạnh vào hỗn hợp phản ứng

+ Kiềm hóa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 30% đến pH = 8-9

+ Chiết thu sản phẩm bằng DCM (chiết 3 lần mỗi lần 20 ml DCM), gộp các dịch chiết và lắc với nước muối bão hòa, thu và làm khan dịch chiết bằng Na2SO4khan, cất quay chân không ở 40oC đến khi hết dung môi và sản phẩm kết tinh ở dạng rắn

+ Sấy sản phẩm ở 60oC trong 4 h, thu được 0,19 g

24

Chất methyl 8-oxo-8-(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-ylamino)octanoat (4a) được

tổng hợp bằng phản ứng acyl hóa hợp chất 3a với acid monomethyl suberic theo sơ

+ Tiếp tục cho 0,177 g (1 mmol) chất 3a vào bình phản ứng

+ Duy trì nhiệt độ phản ứng ở 60oC kết hợp khuấy từ 300 vòng/phút, tiến hành phản ứng trong 24 h

 Xử lý phản ứng:

+ Làm lạnh bình phản ứng, thêm từ từ 20 ml dung dịch HCl 5% lạnh vào bình, vừa thêm vừa lắc đều Để lạnh 30 phút để tủa sản phẩm

+ Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất đến khi dịch lọc trung tính

+ Sấy khô tủa ở 60oC, thu được 0,22 g sản phẩm

25

Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất 5a

 Tiến hành phản ứng:

+ Cho 0,174 g (0,5 mmol) chất 4a và 0,35 g (5 mmol) hydroxylamin

hydroclorid vào bình cầu dung tích 50 ml, thêm 5 ml methanol, đem siêu âm 5 phút

để tạo hỗn dịch đồng nhất

+ Hòa tan 0,8 g (20 mmol) NaOH vào 3 ml nước cất trong ống nghiệm

+ Đồng thời làm lạnh bình phản ứng và dung dịch NaOH xuống dưới 0oC bằng hỗn hợp nước đá muối Thêm từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng Duy trì nhiệt độ phản ứng ở -10oC kết hợp khuấy từ 300 vòng/ phút, phản ứng kết thúc sau 1 h Theo dõi tiến trình phản ứng và xác định thời điểm kết thúc bằng cách dùng dung dịch FeCl3 5% và TLC, cụ thể làm như sau:

- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl loãng trên khay sứ, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch FeCl3 5%, nếu xuất hiện màu đỏ vang chứng

tỏ đã có acid hydroxamic được tạo ra

- Acid hóa khoảng 0,1 ml hỗn hợp phản ứng trong vial, thêm methanol để hòa tan tủa, kiểm tra bằng TLC với pha động DCM/MeOH/CH3COOH = 90/10/1

Kết thúc phản ứng khi kết quả cho thấy đã phản ứng hết ester ban đầu

 Xử lý phản ứng:

+ Acid hóa hỗn hợp phản ứng bằng dung dịch HCl 5% lạnh đến pH = 6-7, để lạnh 15 phút để tủa sản phẩm

+ Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh

+ Sấy khô tủa ở 60oC, thu được 0,09 g sản phẩm

 Kết quả

+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng

+ Hiệu suất: 52%

-Chất 5b được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.6:

Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp 5b

Tác nhân và điều kiện: i) Thiosemicarbazid, ethanol, acid acetic băng, hồi lưu, 4 h; ii)

FeCl 3 6H 2 O, HCl 5%, ethanol, hồi lưu, 3 h; iii) Acid monomethyl suberic, carbonyldiimidazol, DMF, 60 o C, 24 h; iv) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, methanol, -10 o C, 1 h

a Tổng hợp chất 2b

Để tổng hợp chất 5b cần tổng hợp chất 2-[4-(dimethylamino)benzyliden]

hydrazincarbothioamid (2b) Quá trình tổng hợp chất 2b từ 0,298 g (2 mmol) chất

4-dimethylaminobenzaldehyd (1b) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a

Kết quả như sau:

+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng hơi vàng

+ Cất loại dung môi bằng máy cất quay trong 1 phút ở nhiệt độ 40oC

+ Thêm 10 ml nước cất lạnh vào hỗn hợp phản ứng

+ Kiềm hóa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 30% đến pH = 8-9

+ Chiết thu sản phẩm bằng DCM, chiết 3 lần mỗi lần 20 ml DCM, gộp các dịch chiết và lắc với nước muối bão hòa, thu và làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan, cất quay chân không ở 40oC đến khi hết dung môi và sản phẩm kết tinh ở dạng rắn

+ Sấy sản phẩm ở 60oC trong 4 h, thu được 0,23 g

a Tổng hợp chất 2c

Để tổng hợp chất 5c cần tổng hợp chất 2-(4-fluorobenzyliden)

hydrazincarbothioamid (2c) Quá trình tổng hợp chất 2c từ 0,21 ml (2 mmol) chất

4-fluorobenzaldehyd (1c) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a Kết quả

+ Cảm quan: bột kết tinh màu xanh đen

+ Cảm quan: bột kết tinh màu vàng nhạt

31

3.1.2.5 Tổng hợp “N 1 -hydroxy-N 8 -[5-(4-methylphenyl)-1,3,4-thiadiazol-2-yl] octandiamid” (5e)

a Tổng hợp chất 2e

Để tổng hợp chất 5e cần tổng hợp chất 2-(4-methylbenzyliden)

hydrazincarbothioamid (2e) Quá trình tổng hợp chất 2e từ 0,24 ml (2 mmol) chất

4-methylbenzaldehyd (1e) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 2a Kết quả

+ Cảm quan: bột kết tinh màu trắng