Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 5 (4 bromobenzyliden) hydantoin và một số dẫn chất base mannich

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN TIẾN HIỆP TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-4’- BROMOBEZYLIDENHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN TIẾN HIỆP

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-(4’- BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN TIẾN HIỆP

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-(4’- BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS.Vũ

Trần Anh, PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải, PGS TS Nguyễn Quang Đạt là

người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của : Ths Đặng Vũ

Lương (phòng NMR-Viện Hóa Học và Công Nghệ Việt Nam), Nguyễn Thị Sơn (bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa –Trường Đại học Khoa học Tự nhiên),

TS Trần Thị Như Hằng (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên) và toàn thể

các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa hữu cơ, các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện-Trường Đại học Dược Hà Nội Cuối cùng tôi, xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, Ngày 13 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Tiến Hiệp

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN

1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN 2

1.1.1 Tác dụng chống co giật 2

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 3

1.1.3 Tác dụng chống ung thư 4

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP 5-(4'-BROMOBENZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ CÁC BASE MANNICH ….9 1.2.1 Phản ứng tổng hợp 5-arylidenhydantoin 10

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich……….13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI 15

2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.3.1 Phương pháp tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và dẫn chất base Mannich 16

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc 17

2.2.3 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 20

3.1.1 Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin (H 0 ) 21

3.1.2 Tổng hợp các dẫn chất base Mannich của 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin (H 1 -H 6 ) 22

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC 27

3.2.1 Phổ hồng ngoại 27

3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 27

3.2.3 Phổ khối lượng 27

3.3 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ 27

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 4.1 VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC 36

4.2 VỀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC 4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 36

4.2.2 Về phổ cộng hưởng tử hạt nhân 1H-NMR 37

4.2.3 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13

1

(thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô)

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

(Heteronuclear Single-Quantum coherence)

(H 1 -H 6 )

32

Bảng 3.5 Kết quả thử tác dụng của các chất tổng hợp được trên một số

dòng tế bào ung thư người (theo phương pháp SRB)

34

Bảng 3.6 Kết quả xác định giá trị IC50 (µg/ml) của một số chất tổng hợp

được trên dòng tế bào Hep G2 (theo phương pháp SRB)

35

Bảng 4.2 Các tương tác 1H-13C của

5-(4’-bromobenzylden)-3-pyrrolidinomethylhydantoin (H 6)

45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cuộc chiến chống lại bệnh tật, con người không ngừng tìm tòi, nghiên cứu để phát hiện ngày càng nhiều loại thuốc mới có hiệu quả trong phòng và điều trị bệnh Thuốc mới được tìm ra có nhiều nguồn gốc khác nhau, trong đó các thuốc được tạo ra bằng phương pháp tổng hợp và bán tổng hợp đóng vai trò quan trọng

Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tao ra các thuốc mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo ra các chất mới dự đóan có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị Các dẫn chất của hydantoin là dãy chất đã được quan tâm nghiên cứu về tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng rộng rãi làm thuốc Một số dẫn chất hydantoin đã được dùng rộng rãi trong lâm sàng như phenytoin (thuốc chống động kinh), nitrofurantoin (thuốc kháng khuẩn), dantrium (thuốc giãn

cơ vân), nilutamid (thuốc điều trị ung thư tuyến tiền liệt di căn) [19]

Trong những năm qua, đã tìm thấy nhiều dẫn chất 5-arylidenhydantoin thiên nhiên và tổng hợp có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, và có tác dụng chống ung thư rất đáng quan tâm [1], [5], [7], [8], [15], [20]

Để tiếp tục góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 5-arylidenhydantoin

có tiềm năng về hoạt tính chống ung thư, chúng tôi thực hiện khóa luận với các mục tiêu sau

1 Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và một số dẫn chất base

Mannich

2 Thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN

Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) là hợp chất hữu cơ được A.Bayer phát hiện năm 1861[29] bằng phản ứng hydro phân (hydrogenolysis) allantoin ( chất được phát hiện trong túi dịch niệu (the allantoin fluid) của bò cái), đó

là nguồn gốc tên hydantoin Sau đó, năm 1864, A.Bayer [30] tổng hơp được hydantoin với nguyên liệu đầu là bromoacetylure Tuy nhiên cấu trúc vòng của hydantoin chỉ được xác dịnh bởi Strecker vào năm 1873 [31]

N H

NH O

O

4

1 2

3 5

Hydantoin Bản thân hydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của hydantoin có tác dụng phong phú và đa dạng như thuốc chống động kinh, kháng khuẩn, chống ung thư [1], [3], [4], [8], [11], Các dẫn xuất thế ở vị trí

N1, N3, đặc biệt thế 2 lần ở vị trí C5 đã được nghiên cứu và cho thấy tác dụng sinh học đáng chú ý

1.1.1 Tác dụng chống co giật

Dẫn chất hydantoin được dùng nhiều nhất trong điều trị là

5,5-diphenylhydantoin (phenytoin) (1), biệt dược là Dilantin (biệt dược của

Parke-Davis), Epanutin (biệt dược của Pfizer) [3],[9]

NH

H N O

O

1

Phenytoin có tác dụng chống co giật, thường được sử dụng trong điều trị bệnh động kinh [3],[9] Tuy nhiên phenytoin còn có một số tác dụng phụ như giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, buồn nôn, phát ban, vì thế đã có nhiều nghiên cứu nhằm tổng hợp các dẫn chất của hydantoin có ít tác dụng phụ hơn nhưng vẫn duy trì được tác dụng chống co giật Ví dụ, các dẫn chất của phenytoin được tổng hợp gồm ethotoin (3-ethyl -5-phenylhydantoin), mephenytoin (5-ethyl-3-methyl-5-phenylhydantoin), 5-methyl-5-phenylhydantoin, và 5-pentyl-5-phenylhydantoin Các chất được tổng hợp đều chứa khung hydantoin, chứa các nhóm thế có khả năng tạo liên kết hydro (nhóm –C=O, nhóm –NH) và phần không kỵ nước như nhân thơm liên kết với C-5 [27]

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Nitrofurantoin (2) là dẫn chất hydantoin được dùng điều trị nhiễm khuẩn

đường tiết niệu từ năm 1959 và cho đến nay vẫn được sử dụng trong điều trị [12]

O

NH O O

Một số dẫn chất base Mannich ở N-3 của Nitrofurantoin (4) đã được tổng hợp

và thử nghiệm có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt, trong đó có chất đang được dùng làm thuốc tương tự như Nitrofurantoin nhưng bệnh nhân dễ

dung nạp hơn với biệt dược là Nifurfolin

(1-(5’nitro-2-furfurylidenamino)-3-morpholinomethylhydantoin) (5) [17]

O

O2N

N N N O

NH

CH3

CH3O O

7

Chất này được tổng hợp từ năm 1992, được ứng dụng trong điều trị ung thư tuyến tiền liệt di căn từ năm 1996 [9],[17]

Một số hợp chất thiên nhiên có cấu trúc 5-arylidenhydantoin được phân lập và tìm thấy có hoạt tính ức chế tế bào ung thư như các chất aplysinopsin

(8) và spongiacidin (9) từ bọt biển [16]

N H

N N

Br R

NH

H N O

O

9

Nhiều dãy chất 5-arylidenhydantoin đã được tổng hợp và thử nghiệm hoạt

tính chống ung thư ở nước ngoài cũng như ở Việt Nam

Năm 2003, các tác giả Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Lê Mai Hương [6] cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng hai dòng tế bào ung thư ở người (tế bào ung thư biểu mô (KB) và tế bào ung thư màng tử cung (FL)) của dãy chất 5-(5’-nitro-2’-furfurliden)hydantoin và các dẫn chất base Mannich của nó Kết quả là đã tìm được hai chất là 5-(5-nitro-2’-

furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (10) và furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (11) có hoạt tính kháng tế bào ung thư rất

3-piperidinomethyl-5-(5’-nitro-2’-mạnh (giá trị IC50 là 0,2-1,04 (µg/ml) đối với dòng tế bào FL và 0,6-1,15 (µg/ml) đối với dòng tế bào KB)

N H

H N O

O O

NO2

10

N

CH2N

N H O

hợp được có tác dụng ức chế quá trình phosphoryl hóa của EGFR, có tác dụng

ức chế sự phát triển và tăng sinh của tế bào ung thư biểu mô A431 khi thử ở nồng độ 20µM Chất có tác dụng mạnh nhất là (E)-5-p-hydroxybenzyliden-1-

phenethylhydantoin (12) với IC50=27µM trên invivo

Năm 2009, V.Zuliani và C.Carmi tiếp tục hướng nghiên cứu các dẫnchất 5-benzylidenhydantoin có hoạt tính ức chế EGFR và hoạt tính chống ung thư,

đã tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính chống tăng sinh dòng tế bào ung thư phổi A549 của một số chất [28] Kết quả cho thấy một số dẫn chất 5-benzyliden-1-phenethylhydantoin có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ở nồng

12

Các tác giả đã giả thiết cơ chế tác dụng kép của dãy chất này là do liên kết đôi liên hợp ở ngoài vòng đã tạo cho nhân hydantoin có khả năng tác dụng là tương tác với vị trí hoạt động của EGFR và alkyl hóa các chất ái nhân sinh học Giả thuyết này được ủng hộ bởi hoạt tính gây độc tế bào ung thư đã biết của nhiều hợp chất thiên nhiên và tổng hợp có chứa nhóm carbonyl α,β-không

no [14]

Năm 2009, M.Mudit, M.Khanfar đã công bố công trình nghiên cứu về phát minh, thiết kế và tổng hợp các dẫn chất 5-benzylidenhydantoin có hoạt tính chống ung thư di căn lấy cảm hứng từ hợp chất thiên nhiên ở biển [21]

Từ loài bọt biển Hemimycale Arabica (Mycalidae) ở biển Hồng Hải, các tác giả đã phân lập được 3 chất đã biết là (Z)-5-(4-hydroxybenzyliden)hydantoin

(13), 5-(4-hydroxybenzyl)hydantoin (14),

(Z)-5-(6-bromo-1H-indol-3-yl)methylenhydantoin (15)

NH HN O

O HO

13

NH HN O

O

HO

NH HN O

O HO

13

NH HN O

O HO

NH HN O

O HO

14

15

HN NH O

O

NH Br

Tiếp đó các tác giả đã tổng hợp 39 dẫn chất 5-benzylidenhydantoin, trong đó

có 8 chất mới Thử nghiệm hoạt tính chống ung thư cho thấy chất (13) tự nhiên và chất tổng hợp (Z)-5-(4-ethylthio)benzylidenhydantoin (16) có hoạt

tính mạnh ức chế sự tăng trưởng và sự xâm lấn của tế bào ung thư tuyến tiền

liệt trên invitro Về mối liên quan cấu trúc –tác dụng của dãy chất này, các tác

giả có nhận xét là yếu tố lập thể ảnh hưởng đến tác dụng nhiều hơn yếu tố điện tử và các chất có nhóm thế ở vị trí para của nhóm benzyliden mà có chứa các nguyên tử oxy, nitơ hoặc lưu huỳnh có hoạt tính cao Các hợp chất này có tính chất nhận hydro, vì thế có thể có tương tác liên kết hydro ở vị trí para

NH HN O

O S

16

Năm 2010, tác giả Vũ Trần Anh [1] đã nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt

tính của các dẫn xuất hydantoin 17→25, 17(a-d)-25(a-d) Kết quả đã tổng

hợp được 43 dẫn chất của hydantoin trong đó có 9 dẫn xuất của arylidenhydantoin và 34 dẫn chất base Mannich của các dẫn xuất 5-arylidenhydantoin Tác giả đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 43 chất tổng hợp được đối với 2 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư gan Hep-G2 và tế bào ung thư phổi LU Kết quả cho thấy trong số 43 chất tổng

5-hợp được có 4 dẫn chất 5-arylidenhydantoin và 9 dẫn chất base Mannich của chúng có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan người Hep-G2 (IC50=0,38÷5µg/ml) Các dẫn chất base Mannich đều có đặc điểm cấu tạo chung là chứa nhóm hút điện tử (-Cl, -NO2) trong hợp phần aryliden

CH N H

NH O

O

3 4 5 6 1' 2' 3' 4'

5' 6'

17 25

R= H; 2 ' -OH; 4'-N(CH 3 ) 2 ; 4'-OH; 4'-F 2' -Cl; 4'-Cl; 3'-NO 2 ; 4' -NO 2

CH N H

N O

O

3 4 5 6 1' 2' 3' 4'

Năm 2012, tác giả Đỗ Thị Thu Hằng [7] đã tổng hợp và thử họat tính kháng

tế bào ung thư của 15 dẫn chất 5-halogenoarylidenhydantoin và base Mannich

18(a-d)-20(a-d) Kết quả cho thấy 11 chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư

4 5

6

1' 2' 3' 4'

NH O

O R

132

4 5

6

1' 2' 3' 4'

5' 6'

CH

N H

N O

O

R

CH2NR1R2

Năm 2013, tác giả Trịnh Văn Ninh [8] đã tổng hợp và thử hoạt tính kháng

tế bào ung thư của 13 dẫn chất 3-aryl-5-arylidenhydantoin Kết quả cho thấy

có 2 chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư đại tràng HTC116 với IC50

=10,99 µg/ml và IC50=15,25 µ/ml, và có 2 chất có hoạt tính ức chế tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 với IC50=4,04 µg/ml và IC50=2,01 µg/ml

N H

5-(4’-BROMOBENZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ CÁC BASE MANNICH

Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) có công thức cấu tạo như sau:

N H

NH O

O

4

1 2

3 5

Từ cấu trúc phân tử hydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa

để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của hydantoin

1.2.1 Phản ứng tổng hợp 5-arylidenhydantoin

Sơ đồ phản ứng:

N H

NH O

O

N H

NH O

O

123 4 5

HC OH

R

N H

NH O

O

1 2

4 5

R

+

R = phenyl, phenyl thế, furyl, pyryl, pyridyl, quinolyl, hoặc indolyl

Năm 1911, Wheeler và Hoffman là những người đầu tiên nhận thấy hydantoin có thể ngưng tụ với aldehyd thơm tạo thành dẫn chất có nối đôi gắn

ở C-5 của hydantoin [26] Phản ứng được thực hiện trong acid acetic băng, với natri acetat khan, anhydrid acetic Các aldehyd thơm đã được sử dụng là benzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd, furfural, vanillin,…

N H

NH O

O

3 4 5

N H

NH O

O

1 3 4 5

Ar +

-H2O AcOH, AcONa

Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn chất thế ở C-5 của hydantoin [26] Một nhược điểm của phương pháp trên là phải sử dụng một lượng lớn acid acetic và natri acetat

Năm 1982, tác giả A.Kleeman và cộng sự [16] đã tiến hành phản ứng ngưng tụ hydantoin với một số aldehyd thơm với xúc tác muối amoni của các acid carboxylic trong acid acetic băng Kết quả thu được so sánh với phương pháp sử dụng xúc tác natri acetat của Wheeler và Hoffman cho hiệu suất tốt hơn hẳn Ví dụ: hiệu suất tổng hợp 5-benzylidenhydantoin từ benzaldehyd và

hydantoin theo phương pháp Kleeman là 95% so với 46% theo phương pháp Wheeler và Hoffman

Năm 1993, Marton, J [20] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin trong dung môi là hỗn hợp nước:ethanol (1:1), phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ Tác giả đã sử dụng một số aldehyd thơm (p-clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd,…), hiệu suất phản ứng 44-89% Năm 2004, tác giả Thenmozhiyal và cộng sự [24] đã sử dụng xúc tác này trong điều chế các phenylmethylenhydantoin và điều chế được 54 dẫn chất

Sơ đồ phản ứng:

Để rút ngắn thời gian phản ứng, hiện nay các nhà hóa học đã sử dụng vi sóng trong tổng hợp hữu cơ Năm 2006, tác giả Lamiri [17] đã sử dụng vi sóng trong tổng hợp 5-arylidenhydantoin Hỗn hợp natri acetat, oxyd nhôm được

hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, sau đó cất loại CH2Cl2, dùng vi sóng tần số 2405Hz, công suất 1250W tác động vào trong 2 phút

RCHO

N H

NH +

O H R

R

+

N H

NH O

R

R = Alkyl, alkoxy (-OR), -NR, -OH, -X, -CN, -CF3, -NO2

Phản ứng có hiệu suất tương đối cao (74-96%), với các aldehyd là

p-clorobenzaldehyd,

 Về cơ chế phản ứng ngƣng tụ

Phản ứng ngưng tụ giữa hydantoin và aldehyd thơm là phản ứng ngưng

tụ kiểu aldol xảy ra theo cơ chế sau [2]:

- Giai đoạn cộng hợp:

Nhóm methylen ở vị trí 5 của hydantoin rất hoạt động, nguyên tử H ở đây dễ dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành là một tác nhân ái nhân mạnh:

NH O

NH O

O

O H (+) (-)

H

NH O

O H CH Ar O

(III) (II) (IV)

Ion alcolat (IV) tạo thành lại lấy một proton của BH, trả lại xúc tác B(-) :

N H

HC Ar OH

(V)

+

- Giai đoạn ngưng tụ loại nước:

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich

a) Định nghĩa phản ứng Mannich

Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hóa các hợp chất hữu cơ có nguyên tử H linh động bằng tác dụng của formaldehyd (hoặc các aldehyd

thế aminomethyl gọi là base Mannich [2] Điều kiện cần thiết để xảy ra phản ứng là tính ái nhân của amin phải mạnh hơn tính ái nhân của hợp chất chứa hydro linh động Phản ứng thường được tiến hành trong môi trường acid [2], [25]

Phản ứng xảy ra dễ dàng trong dung môi alcol ở nhiệt độ không cao (<1000C)

và xúc tác là các acid hoặc nhiều trường hợp không cần xúc tác

b) Cơ chế phản ứng Mannich: phản ứng xảy ra qua hai giai đoạn:

-Giai đoạn 1: Amin phản ứng với fomaldehyd trong sự có mặt của acid, tạo thành một chất trung gian, chất này lọai nước tạo thành tác nhân ái điện tử: N

NH C

H Ar

O

O

OH2H

- Giai đoạn 2: Cation aminomethyl phản ứng với hợp chất có hydro linh động

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động không có khả năng tạo enol hóa (như trường hợp hydro linh động ở các liên kết N-H, S-H, Se-H, P-H hoặc ở liên kết C-H ở nhân indol, pyrol …) thì cation aminomethyl tấn công vào nguyên tử mang hydro linh động tạo sản phẩm base Mannich:

+Trường hợp hợp chất có hydro linh động có khả năng tạo enol (hydro linh

động nằm bên cạnh nhóm carbonyl của phân tử) thì cation aminomethyl là tác nhân ái điện tử tấn công vào liên kết đôi C=C của dạng enol tạo ra hợp chất chứa nhóm aminomethyl (base Mannich):

O C

Base Mannich

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI

2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 500ml, sinh hàn, phễu nhỏ giọt, ống đong, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner …)

- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, phòng Hóa Vật liệu, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia

Hà Nội

trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (MS) ghi theo phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy LC-MSD-Trap-SL, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và dẫn chất base Mannich

chất dự kiến

2.3.3 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo phương pháp: SRB [18], [22]

Nguyên tắc:

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế

bào Tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng

- Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin có màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều Các tế bào sống, sau đó được cố định Định lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 495-515 nm Từ đó tính được số lượng tế bào sống sót Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National

Cancer Institution - NCI)

Dòng tế bào thử nghiệm:

3 dòng tế bào:

Chất chuẩn dương tính

Sử dụng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine, Vinblastine hoặc

Taxol pha trong DMSO

Tiến hành thử hoạt tính

a/ Chuẩn bị tế bào

hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến

vi lượng 96 giếng đối với phương pháp SRB

ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển

huy tác dụng

b/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [18],[22]

- Tế bào sau khi được ủ từ 48 giờ-72 giờ được cố định bằng TCA ở 40C trong 1 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên

- Thêm 50 μl dung dịch sulphorhodanin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa sạch dung dịch sulphorhodanin B (SRB) dư bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần

0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức sau:

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên được đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình  độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau

0

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Trong khóa luận này, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp

5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và một số dẫn chất base Mannich của chúng, bao

gồm các công việc sau:

- Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin bằng phản ứng ngưng tụ

aldehyd thơm 4-bromobenzaldehyd với hydantoin theo phản ứng:

N H

NH O

O

N H

NH O

O

1 2 3 4 5 1'

5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin bằng cách cho 5-(4’-5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin

tác dụng với fomaldehyd và các amin bậc 1, bậc 2 theo sơ đồ phản ứng sau:

N H

NH O

O

1 23 4 5 1'

N O

O

1 23 4 5 1' 2' 3' 4'

3.1.1 Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin (H 0 )

Trên cơ sở lý thuyết về phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin

đã được trình bày ở phần tổng quan, chúng tôi tiến hành phản ứng theo phương pháp phản ứng được thực hiện trong acid acetic băng với natri acetat khan theo quy trình của tác giả Wheeler và Hoffman [26]

Công thức:

N H

NH O

O

1 23 4 5 1'

2' 3' 4'

ứng kết thúc sau 4 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi (A) dicloromethan:methanol (12:1), hệ dung môi (B) dicloromethan:methanol (14:1), hoặc hệ dung môi (D) cloroform:methanol (9:1).Để nguội, đổ hỗn hợp

ra cốc có mỏ, ngâm lạnh 5 phút sau đó để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Lọc hút kiệt,rửa tủa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi hết acid acetic (thử bằng giấy quỳ) Rửa tiếp vài lần bằng cồn lạnh Sấy khô tủa thu được Kết tinh trong dung môi EtOH/DMF (15:4)

Khối lượng sản phẩm 3,56g tinh thể màu trắng Hiệu suất: 26,7%

Nhiệt độ nóng chảy: 295-2970C

Rf = 0,74 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : CH3OH (12:1))

Rf = 0,66 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : CH3OH (14:1))

Rf = 0,65 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CHCl3 : CH3OH (9:1))

C với tỷ lệ số mol bromobenzyliden)hydantoin : formaldehyd : amin là 1:1:1 Chúng tôi đã tiến hành tổng hợp với các amin (morpholin, piperidin, pyrrolidin, N-

5-(4’-methylpyperazin, p-toluidin, p-anisidin)

Qui trình tổng hợp chung

nhiệt độ phòng cho phân tán đều trong 15 phút Cho tiếp 0,21ml formol

độ phòng trong vòng một giờ Sau đó đun cách thủy nâng dần nhiệt độ tới

850C thì thêm tiếp DMF vào từ từ để hỗn hợp tan hoàn toàn Sau đó, tiếp tục

mỏng với hệ dung môi A: CH2Cl2 : CH3OH (12:1) với các chất H 1 , H 4 Hệ

dung môi B: CH2Cl2 : CH3OH (14 :1) với các chất H 2 , H 3 Hệ dung môi C:

(9:1) với chất H 6, bản mỏng silicagel 60 F254, phát hiện vết ở đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm Sau 5 giờ phản ứng đạt tối ưu Đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ để nguội đến nhiệt độ phòng, để qua đêm Sau đó cạo thành cốc thật kỹ để tạo tủa tốt Lọc hút, rửa bằng ethanol lạnh thu được sản phẩm thô Kết tinh lại bằng dung môi thích hợp, sấy khô ở 600C trong tủ sấy chân không trong 3h thu được sản phẩm

Sau đây là các trường hợp cụ thể

1) 5-(4’-bromobenzyliden)-3-morpholinomethylhydantoin (H 1 )

N H

N O

O

1 23 4 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

6

CTPT: C15H16BrN3O3; KLPT: 366,21

0,22g (0,0025 mol) morpholin, thời gian phản ứng là 5 giờ Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (40:11)

Sản phẩm thu được là 0,71g tinh thể màu vàng , hiệu suất 77,8%

Nhiệt độ nóng chảy: 232-2330C, Rf = 0,78 (Hệ dung môi A )

O

1 2

3 4 5 1' 2' 3' 4' 5' 6'

CTPT: C16H18BrN3O2; KLPT: 363,24

Từ 0,67g (0,0025 mol) chất (H 0 ); 0,21 ml formol (0,0025 mol) HCHO và

0,21g (0,0025 mol) piperidin, thời gian phản ứng là 5 giờ Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (5 : 1)

Sản phẩm thu được là 0,74g tinh thể màu vàng, hiệu suất 81,5%

Nhiệt độ nóng chảy 220-2230C Rf = 0,6 (Hệ dung môi B )

N H

N O

O

1 2

3 4 5 1'

2' 3'

4' 6' 6

CH2 NH 1'' OCH3

2'' 3'' 4''

5'' 6'' 5'

CTPT: C18H16BrN3O3; KLPT: 401,24

0,31g (0,0025 mol) p-anisidin, thời gian phản ứng 5 giờ Sản phẩm được kết

tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (7:1)

Sản phẩm thu được là 0,62g tinh thể màu vàng, hiệu suất 61,8%

Nhiệt độ nóng chảy: 234-2370C, Rf = 0,85 (Hệ dung môi B)

Phổ IR (KBr, υ max (cm -1 )): xem phụ lục 4.1, bảng 3.2

Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6), δ(ppm): xem phụ lục 4.2, bảng 3.2

Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6), δ(ppm): xem phụ lục 4.3, bảng 3.3

CH2 N N CH3

1 23 4 5 6 1' 2' 3' 4'

5' 6'

1''

2'' 3'' 4''

5'' 6''

CTPT: C16H20BrN4O2 ; KLPT: 378,25

0,25g (0,0025 mol) N-methylpiperazin, thời gian phản ứng là 5 giờ Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (20:0,4)

Sản phẩm thu được có khối lượng là 0,605g tinh thể màu trắng, hiệu suất 64,0%

Nhiệt độ nóng chảy 238-2400C, Rf = 0,76 (Hệ dung môi A)

N O

O

1 2

3 4 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

6

2'' 3'' 4''

5'' 6''

CTPT: C18H16BrN3O2; KLPT: 385,24

0,27g (0,0025 mol) p-Toluidin, thời gian phản ứng là 5 giờ Sản phẩm được

kết tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (50 : 21)

Sản phẩm thu được là 0,84 tinh thể màu vàng chanh, hiệu suất 87,2%

Nhiệt độ nóng chảy: 243-2450C, Rf = 0,92 (hệ dung môi C)

N O

O

1 23 4 5 1'

2' 3' 4'

5' 6'

6

CH2 1''N

2'' 3'' 4'' 5''

CTPT: C15H16BrN3O2; KLPT: 349,21

0,18g (0,0025 mol) pyrrolidin, thời gian phản ứng 5 giờ Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH/DMF (20:3)

Sản phẩm thu được là 0,65g tinh thể màu vàng, hiệu suất 74,4%

Nhiệt độ nóng chảy: 224-2270C, Rf = 0,74 (hệ dung môi D)

Rf = 0,56 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CHCl3 : MeOH (9:0,5))

Phổ IR (KBr, υ max (cm -1 )): xem phụ lục 7.1, bảng 3.2

Phổ 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6), δ(ppm): xem phụ lục 7.2, bảng 3.2

Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6), δ(ppm): xem phụ lục 7.3, bảng 3.3

ESI-MS(m/z,%): xem phụ lục 7.4, bảng 3.4

3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC

3.2.1 Phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer tại phòng Hóa vật liệu,

Khoa hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội 7 phổ

đồ được ghi ở các phụ lục 1.1÷7.1 Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại

được ghi ở bảng 3.2

3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

(2D-NMR) được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER,

Đức) trong dung môi DMSO-d6, chất chuẩn nội TMS tại Viện Hóa học -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 7 phổ đồ được ghi ở các

phụ lục 1.2÷7.2 và 1.3÷7.3 Kết quả phân tích số liệu phổ cộng hưởng từ hạt

nhân proton và 13C được ghi ở bảng 3.2 và 3.3

3.2.3 Phổ khối lượng

Các chất tổng hợp được ghi phổ khối lượng theo phương pháp phun mù

điện tử (ESI-MS) trên máy LC-MSD-Trap-SL, tại Viện Hóa học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 7 phổ đồ được ghi ở các phụ lục

1.6÷7.6

3.2 THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ

Thử hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng tế bào ung thư người được

tiến hành tại Phòng Sinh học thực nghiệm-Viện Hóa học các hợp chất thiên

nhiên (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Tại Phòng sinh học thực nghiệm- Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam) 7 chất do chúng tôi tổng

hợp (H 0 -H 6) đã được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư

biểu mô vú MCF-7, dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 và dòng tế bào

ung thư gan người Hep-G2 Kết quả được trình bày ở bảng 3.5, bảng 3.6 Kết quả cho thấy có 5 chất là chất H 1 (IC50= 4,54 µg/ml), H 2 (IC50= 2,89 µg/ml ), H 3 (IC50= 3,73 µg/ml), H 4 (IC50= 2,84 µg/ml), H 6 (IC50= 1,59 µg/ml)

có hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 Các chất tổng hợp được không có tác dụng với dòng tế bào MCF7 và PC3 thử nghiệm

STT Công thức

Ký hiệu chất

M

Thời gian phản ứng (giờ)

Dung môi kết tinh lại R f

nóng chảy ( 0 C) Hiệu suất (%)

H

NH O

O

1 2

3 4 5 6 1'

2' 3' 4'

5' 6'

(15:4)

0,74A 0,66B0,65D

4 5 6 1' 2' 3' 4'

5' 6'

1'' 2'' 3'' 4''

5'' 6''

N O

O

CH 2

1'' 3'' 4'' 5'' 6''

O

CH2 NH 1'' OCH3

2'' 3'' 4''

O

CH2 N N CH 3

1 24 5 6 1' 2' 3'

4'

5' 6'

1'' 3''

4'

5' 6'

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' N

HN O

STT CTCT

Ký hiệ

1 24 5 6 1' 2' 3' 4'

5' 6'

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''

N

N O

3

1 24 5 6 1' 2' 3'

O

CH2

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''

N

7,578 (m;4H;H 2’,3’,5’,6’ ); 2,503 (m;4H;H 2’,6’’ ); 1,467 (m;4H; H 3’’,5’’ ); 1,312 (m;2H;H 4’’ )

4

1 24 5 6 1' 2'

O

CH 2 NH 1'' OCH3

2'' 3'' 4''

5''

10,829 (s;1H;N1H); 7,588 (m;4H;H 2’,3’,5’,6’ ); 6,793 (m;2H;H 3’’,5’’ ); 6,713 (m;2H;H 2’’,6’’ ); 6,160 (m;1H;NH); 3,660 (s;3H;OCH 3 )

N

N O

O

CH2 N N CH3

1 24 5 6 1' 2' 3'

4'

5' 6'

1'' 2'' 3''

5''

7,57(m, 4H, H 2’,3’,5’,6’ ); 2,507(m,8H,H 2’’,3’’,5’’,6’’ ); 2,126(s,3H,CH 3 )

3 5 6 1' 2' 3'

4'

5' 6'

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' N

HN O

(m;2H;H 3’’,5’’ );6,745(m;2H;H2’’,6’’);6,336(m;1 H;NH);2,174 (s;3H;CH3)

5' 6'

1'' 2'' 3'' 4''

5'' 6''

N O

O

CH2 N O

H 1 N O 108,113 164,06 155,762

132,066 (C 1’ ); 131,636 (C 3’,5’ ); 131,333 (C 2’,6’ ); 126,998 (C 5 ); 121,726 (C 4’ ); 65,972 (C 3’’,5’’ ); 59,878 (NCH 2 N); 50,313 (C 2’’,6’’ )

3

1 24 5 6 1' 2' 3'

O

CH 2

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6''

N

H 2 N 107,853 165,06 155,965

132,142 (C1’); 131,464 (C3’,5’); 131,196 (C2’,6’); 127,172 (C 5 ); 121,726 (C4’); 60,709 (NCH 2 N); 51,168 (C2’’,6’’); 25,41(C3’’,5’’); 23,323(C4’’)

4

1 24 5 6 1' 2' 3'

O

CH 2 NH 1'' OCH3

2'' 3'' 4''

5'' 6'' H 3 NH OCH3 108,303 164,072 155,125

151,081 (C 4’’ ); 139,765 (C 1’’ );131,982 (C 1’ ); 131,607 (C 3’,5’ ); 131,372 (C 2’,6’ ); 126,885 (C 5 ); 121,786(C 4’ ); 114,356 (C 3’’,5’’ ); 113,775 (C 2’’,6’’ ); 55,205 (OCH 3 ); 48,547 (NCH 2 N)

N

N O

O

CH2 N N CH 3

1 24 5 6 1' 2' 3'

4'

5' 6'

1'' 3''

5'' 6'' H 4 N N CH 3 106,43 165,369 155,693

135,139(C1’); 133,648(C4’); 129,017(C 5 ); 128,25(C2’,6’); 61,469(NCH 2 N); 54,205 (C3’’,5’’); 49,970 (C2’’,6’’); 40,090 (CH 3 )

3 5 6 1' 2' 3'

4'

5' 6'

1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' N

HN O

O

Br CH2 NH CH3 H 5 NH CH3 108,326 164,039 155,087

143,558 (C1’’); 131,985 (C1’); 131,615 (C3’,5’); 131,27 (C3’’,5’’); 129,34 (C2’,6’); 126,879 (C 5 ); 125,732 (C4’’); 121,794 (C4’); 112,72 (C2’’,6’’); 48,009 (NCH 2 N); 20,01 (CH 3 )

Bảng 3.4: Số liệu phổ ESI-MS của chất H 0 và các dẫn chất base Mannich

(H1-H6)

hiệu

Công thức phân tử

KLPT (M) Tính

[M-H] - m/z (%)

Ion khác m/z (%)