Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất acid 3 (benzimidazol 2 yl) propanoic

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN NGUYỄN THÀNH ĐẠT NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA ACID 3-BENZIMIDAZOL-2-YLPROPANOIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN NGUYỄN THÀNH ĐẠT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ

DẪN CHẤT CỦA ACID 3-(BENZIMIDAZOL-2-YL)PROPANOIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI-2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐOÀN NGUYỄN THÀNH ĐẠT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ

DẪN CHẤT CỦA ACID 3-(BENZIMIDAZOL-2-YL)PROPANOIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến thầy PGS TS

u n n u n, người đã trực tiếp hướng dẫn, cho tôi những lời khuyên quý

báu, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược, đặc biệt là DS Nguyễn Văn Giang, DS Phạm Thị Hiền, DS Nguyễn Thị Thanh Phúc và CN Phan Tiến Thành của Tổ môn Tổng hợp Hóa dược đã nhiệt tình giúp

đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, cán bộ Phòng Phân tích phổ- Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Phân tích hữu cơ- Viện Hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng thư viện Trường Đại học Dược Hà Nôi, tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến bố mẹ và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập

Hà Nội, Ngày 21 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Đoàn Nguyễn Thành Đạt

MỤC LỤC

Trang Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát chung về benzimidazol và dẫn chất……… 2

1.2 Tổng quan về tác dụng sinh học của benzimidazol 3

1.2.1 Tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn 3

1.2.2 Tác dụng sinh học khác……… 9

1.3 Xác định hướng đề tài nghiên cứu……… 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 15

2.1 Nguyên liệu và thiết bị……… 15

2.1.1 Nguyên liệu, dung môi, hóa chất……… 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ ……… 16

2.2 Nội dung nghiên cứu……… 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 20

3.1 Tổng hợp hóa học……… 20

3.1.1 Tổng hợp acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic (1) 21

3.1.2 Tổng hợp ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2a)……… 22

3.1.3 Tổng hợp methyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2b)……… 22

3.1.4 Tổng hợp 3-(benzimidazol-2-yl)propanhydrazid (3a-1)……… 23

3.1.5 Tổng hợp ethyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (3a-2)……… 24

3.1.6 Tổng hợp ethyl 3-(1-benzyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (3a-3)……… 25

3.1.7 Tổng hợp methyl 3-(1-ethoxy carbonyl methyl-benzimidazol-2-yl)propanoat

(3b-1)……… 26

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được……… 27

3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được ……… 29

3.3.1 Kết quả phân tích phổ các chất trung gian (1, 2a, 2b) 29

3.3.2 Kết quả phân tích phổ các chất sản phẩm (3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1)……… 32

3.4 Thử tác dụng sinh học……… 35

3.4.1 Thử hoạt tính kháng khuẩn……… 35

3.4.2 Thử hoạt tính kháng nấm……… 38

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN……… 41

4.1 Về tổng hợp hóa học……… 41

4.2 Vế tác dụng sinh học……… 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……… 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

carcinoma cell line)

concentration)

pheochromocytoma cell line)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 MIC (μg/ml) của các chất trong nghiên cứu của T Z Taher 6

Bảng 1.3 IC50 (mM) của các hợp chất trên dòng tế bào HEPG2 và PC12 10

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H của 1, 2a, 2b 31

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1 32

Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ khối lượng của 3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1 32

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 3a-1, 3a-2,

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.4 Một số dẫn chất benzimidazol được sử dung trong điều trị 3

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của N1-alkyl-2-aryl-5(6)-R-1H-benzimidazol

Hình 1.7 Công thức cấu tạo các chất trong nghiên cứu của T Z Taher 6

Hình 1.8 Dẫn chất 3-(2-methylbenzimidazol-1-yl)propanhydrazid 7

Hình 1.10 Dẫn chất 2-methylaminobenzimidazol tổng hợp bởi K Achar 12

Hình 1.11 1H-pyrrolo[1,2-a]benzimidazol-1-on tổng hợp bởi A Chimirri 13

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic (1) từ

Sơ đồ 3.3 Tổng hợp ester ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2a) 22

Sơ đồ 3.4 Tổng hợp ester methyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2b) 22

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp 3-(benzimidazol-2-yl)propanhydrazid (3a-1) 23

Sơ đồ 3.6 Tổng hợp ethyl 3-(1-ethoxy carbonyl

Sơ đồ 3.7 Tổng hợp ethyl 3-(1-benzyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (3a-3) 25

Sơ đồ 3.8 Tổng hợp methyl 3-(1-ethoxy carbonyl

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sức khỏe luôn là một trong những vấn đề được chú trọng nhất trong mỗi quốc gia Việc sử dụng trực tiếp các sản phẩm tự nhiên để chữa trị đã có từ lâu và đạt được nhiều thành tựu, nhưng con đường tìm kiếm thuốc mới bằng phương pháp tổng hợp luôn là cần thiết khi mà mô hình bệnh tật ngày càng phức tạp Việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới là kết quả kết hợp của nhiều ngành khoa học như bào chế, hóa dược, vi sinh, dược lâm sàng…, trong đó tổng hợp hóa dược đóng vai trò rất quan trọng Ngày nay, các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa học ngày càng giữ vị trí quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe

Xu hướng nghiên cứu và phát triển thuốc mới thường dựa vào cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc có triển vọng sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể ứng dụng trong điều trị lâm sàng

Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy dẫn chất benzimidazol là nhóm hợp chất dị vòng có tác dụng sinh học rất đa dạng như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, chống co giật, giảm đau, chống viêm, hạ huyết áp…

Để góp phần làm phong phú thêm các nghiên cứu về tổng hợp và tác dụng

sinh học của dẫn chất benzimidazol, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của acid (benzimidazol-2-yl)propanoic” với các mục tiêu sau:

3-1 Tổng hợp và một số dẫn chất ester 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat với các nhóm thế khác nhau ở vị trí N1 và tổng hợp hydrazid

2 Thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của hydrazid và một số dẫn chất ester 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat tổng hợp được

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung về benzimidazol và dẫn chất

Năm 1944, Wooley suy đoán rằng benzimidazol có thể hoạt động tương tự như purin để thể hiện tác dụng sinh học [24] Năm năm sau, Brink xác định 5,6-dimethylbenzimidazol là sản phẩm phân hủy của vitamin B12 và sau đó tìm thấy một số các dẫn xuất của nó có hoạt động như vitamin B12 [7]

Hình 1.1 5,6-dimethyl-1-( -D-ribofiranosyl)benzimidazol

Cấu trúc benzimidazol là một hệ vòng bicyclic mà benzen kết hợp với

vị trí 4- và 5- của imidazol Các hợp chất benzimidazol nói chung, và benzimidazol carbamat nói riêng là những chất rắn kết tinh với điểm nóng chảy khá cao và tương đối khó tan trong nước [23]

Hình 1.2 Cấu trúc vòng benzimidazol

Bezimidazol có chứa một nguyên tử hydro được gắn với nitơ ở 1 vị trí

dễ dàng hỗ biến:

Hình 1.3 Hiện tượng hỗ biến ở benzimidazol

Hiện tượng này cũng được tìm thấy tương tự trong imidazol và amidin [15,25]

1.2 Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của benzimidazol

Hình 1.4 Một số dẫn chất benzimidazol đã được sử dụng trong điều trị

1.2.1 Tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn

Năm 2011, Yusuf Ozkay cùng cộng sự đã tổng hợp được một số

benzimidazol-hydrazon (1a÷ 1n); các dẫn chất này thể hiện tính kháng khuẩn

yếu nhưng hoạt tính kháng chủng Candida rất đáng chú ý ở nồng độ không

độc hại [20]

Hình 1.5 Các chất benzimidazol-hydrazid được tổng hợp

Các chất tổng hợp 1a÷ 1n được thử tác dụng ức chế in vitro vi sinh vật

theo kĩ thuật pha loãng liên tiếp Tác dụng kháng khuẩn được thử với dòng vi

khuẩn Gram(+) là: Staphylococcus aureus ATCC (American Type Culture Collection) 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus subtilis và

Listeria monocytogenes, đồng thời thử với vi khuẩn Gram(-) là: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Escherichia coli ATCC 35218, E coli ATCC

25922, Salmonella thyphimurium NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) B-4420; Proteus vulgaris NRRL B-123 và nấm men:

Candida albicans, Candida tropicalis và Candida glabrata ATCC 3658

Cloramphenicol và ketoconazol được sử dụng làm thuốc đối chiếu

Hầu hết các dẫn chất trên không có hoạt tính chống lại các chủng vi

khuẩn, tuy nhiên chúng vẫn có hoạt tính trung bình với E coli khi so sánh với

cloramphenicol Trái lại với hoạt tính kháng khuẩn yếu, các hợp chất 1a, 1k,

1l, 1m, 1n ức chế mạnh với C albicans, C glabrata và C tropicalis trong

khoảng MIC= 12,5÷ 400 µg/ml Chất 1k và 1m cho thấy hiệu lực gấp 2 lần

(MIC= 25 µg/ml) so với ketoconazol (MIC= 50 µg/ml) đối với tất cả các

chủng nấm Bên cạnh đó, hoạt tính kháng nấm với C tropicalis của 1a, 1l, 1n

cũng khá cao so với các tài liệu khác Các hợp chất khác 1b÷ 1j thể hiện hoạt

tính kháng nấm ngang bằng với ketoconazol Nghiên cứu về liên quan cấu trúc đến tác dụng sinh học (SAR- structure activity relationship) cho thấy mật

độ điện tử trên vòng benzen là yếu tố quan trọng liên quan đến tác dụng

kháng nấm tối ưu Các hợp chất 1k÷ 1n với nhóm thế hút điện tử (nitro,

triflomethyl, cyano và carboxyl) cho thấy tác dụng hoạt tính kháng nấm tốt nhất [20]

Năm 2009, Hakan Goeker cùng cộng sự đã tổng hợp và thử các hoạt

tính kháng nấm Candida in vitro của một số

N1-alkyl-2-aryl-5(6)-R-1H-benzimidazol, theo phương pháp pha loãng ống Các hợp chất được thử

nghiệm in vitro cho hoạt tính kháng nấm: C albicans (ATCC 10231), C

krusei (ATCC 6258), C parapsilosis (ATCC 22019), và C glabrata với các

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của N1-alkyl-2-aryl-5(6)-R-1H-benzimidazol trong

nghiên cứu của Hakan Goeker

Kết quả thử tác dụng sinh học cho thấy các benzimidazol này đều có

hoạt tính tốt trên một số loài Candida Trong đó

được thử tác dụng in vitro trên các vi khuẩn Gram(-): Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhi; vi khuẩn Gram(+): Staphylococcus aureus và nấm Candida albicans bằng phương pháp thạch

pha loãng (tobramycin và voriconazol được sử dụng là thuốc đối chiếu) Đánh giá các hợp chất thử nghiệm cho kết quả khả quan, đặc biệt với vi khuẩn

Gram(-) và Candida albicans với MIC rất thấp (< 0,016 μg/ml) Ngược lại, vi khuẩn Gram(+) (Staphylococcus aureus) lại có khả năng kháng tất cả các chất

thử nghiệm với MIC > 256 μg/ml [22]

Hình 1.7 Công thức cấu tạo các chất trong nghiên cứu của T Z Taher

Bảng 1.1 MIC (μg/ml) của các chất trong nghiên cứu của T Z Taher

Hợp chất Pseud E.c Sal St Ca

yl)propanhydrazid (năm 2000) trên chủng vi khuẩn Gram(+) (Bacillus

cereus), Gram(-) (Escherichia coli), nấm men (Saccharomyces cerevisae) và

nấm mốc (Aspergillus niger), thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa

(gentamycin, ampicillin được dùng là chất đối chiếu) [10]

Hình 1.8 Dẫn chất 3-(2-methylbenzimidazol-1-yl)propanhydrazid

Kết quả cho thấy 6a là chất có hoạt động rất mạnh chống lại vi khuẩn

Bacillus cereus, nhưng có tác dụng yếu trên Escherichia coli Các hợp chất

6c, 6d hoạt động tốt chống lại Bacillus cereus, trong khi hợp chất 6b, 6g chỉ

có tác dụng yếu trên Bacillus cereus Nhưng tất cả hợp chất đã được thử nghiệm cho thấy không có tác dụng chống lại Saccharomyces cerevisae và

Aspergillus niger [10]

Năm 2012, nhận thấy tỷ lệ đề kháng thuốc của các cầu khuẩn Gram(+)

bao gồm cả Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), tụ cầu

Coagulas kháng methicillin (MR-CNS), Pneumoniea kháng penicillin, và Enterococcus kháng vancomycin (VRE) tiếp tục tăng [21], trong đó đáng chú

ý là S aureus khi nhiều trường hợp chủng này đã kháng lại methicillin [12],

Hacer Karatas cùng cộng sự đã tổng hợp 1 dãy các chất

1H-benzimidazolcarboxamidin và đánh giá tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm in

vitro trên Staphylococcus aureus ATTC 25923, Candida albicans ATTC

10231, Candida krusei ATCC 6258, MRSA ATTC 43300 (Staphylococcus

aureus kháng methicillin) theo phương pháp pha loãng

Kết quả thử nghiệm cho thấy 8a, 8c, 8d, 8e, 9a, 9b có hoạt tính kháng

khuẩn tốt: chống MRSA (MIC < l µg/ml), hợp chất 9a, 9b có hoạt tính vừa

phải chống lại nấm Candida Các chất còn lại 7a÷ 7h, 8b cho thấy tác dụng

yếu hoặc không có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn

Thí nghiệm còn cho thấy nhóm amidin thơm (trong 9a, 9b) của

1H-benizimidazol đóng vai trò quan trọng trong hoạt động trong hoạt động kháng khuẩn [16]

1.2.2 Tác dụng khác của benzimidazol

Năm 2011, Z M Nofal cùng cộng sự đã tổng hợp được 1 dãy các dẫn chất của 1-(1H-benzimidazol-2-yl)-3-R-2-propen-1-on và thử hoạt tính chống ung thư trên HEPG2 (dòng tế bào ung thư biểu mô gan), PC12 (tế bào tủy thượng thận chuột) Dưới đây là một số dẫn chất thuộc nhóm này:

Hình 1.9 Các dẫn chất trong nghiên cứu của Z M Nofal

Kết quả nghiên cứu tác dụng in vitro của các hợp chất 10÷ 15 ức chế sự

phát triển của 2 dòng tế bào ung thư người được trình bày ở bảng 1.3 Nghiên cứu cho thấy, chất 11 có triển vọng tác dụng cao đối với cả PC12 (IC50= 2,4 mM) và HEPG2 (IC50= 0,268 mM), trong khi chất 10a, 10b, 14, 15a, 15b

chỉ hoạt động duy nhất trên tế bào PC12 và có hoạt tính in vitro yếu chống lại

HEPG2 ở nồng độ thấp Nghiên cứu cũng chỉ ra α,β-ceton không no ở 10a là

yếu tố tích cực nhất chống lại dòng tế bào PC12 (IC50= 0,103 mM), dẫn xuất

isoxazol 11 của nó cho hoạt động kép trên cả 2 dòng tế bào này Các dẫn xuất

acetohydrazid có hoạt tính rõ ràng trên dòng PC12 và hoạt tính yếu trên

HEPG2, trong đó 15a cho thấy hoạt tính rõ ràng nhất trên PC12 (IC50= 0,251 mM) do có sự hiện diện của lưu huỳnh trong chuỗi đính kèm bên [19]

Bảng 1.3 IC 50 (mM) của các hợp chất trên dòng tế bào HEPG2 và PC12

pyridinyl)benzimidazol (KB-1043) là hợp chất có hoạt động chống viêm,

giảm đau hạ sốt tốt hơn phenylbutazon và tiaramid Hơn nữa, hợp chất này có tác dụng kích thích tiêu hóa thấp hơn và chỉ số điều trị cao hơn 2÷ 3 lần so với nhóm hợp chất cùng nghiên cứu [14]

Năm 2010, một dãy các dẫn xuất 2-methylaminobenzimidazol được tổng hợp bởi Kavitha Achar và được sàng lọc tác dụng giảm đau, chống viêm

Hình 1.10 Dẫn chất 2-methylaminobenzimidazol được tổng hợp bởi K

Achar

Tác dụng giảm đau được đánh giá theo phương pháp gây đau bằng acid acetic Gần như tất cả các hợp chất thử nghiệm đều cho thấy tác dụng giảm

đau mạnh khi so sánh với thuốc chuẩn nimesulid Trong đó, chất 16-g cho

thấy tác dụng giảm đau rõ rệt (89%, 100 mg/kg thể trọng) Còn lại hợp chất

16-b, 16-d, 16-f, 16-g, 16-h, 16-i, 16-j và 16-k cũng cho thấy tác dụng tốt

Trong hệ thống vòng 2-methylaminobenzimidazol, người ta nhận thấy rằng sự

có mặt của -Br, -Cl trên vòng benzimidazol và -Br, -Cl, methyl, methoxy trên phần anilin tại các vị trí khác nhau làm tăng cường tác dụng giảm đau Ngoài

ra các dẫn chất trên cũng được nghiên cứu tác dụng chống viêm Kết quả cho

thấy hợp chất 16-a, 16-b có khả năng chống viêm tốt [6]

Năm 2001, Alba Chimirri cùng cộng sự đã tổng hợp một số dẫn chất

1H-pyrrolo[1,2-a]benzimidazol-1-on và thử đặc tính chống co giật trên chuột

DBA/2 [18] Số liệu được tính toán theo phương pháp của Litchfield và Wilcoxon

Hình 1.11 1H-pyrrolo[1,2-a]benzimidazol-1-on tổng hợp bởi A Chimirri

Bảng 1.4 Hoạt động chống động kinh trên chuột DBA/2

Trong các hợp chất được thay thế methyl ở vị trí R2 (18, 19, 21), sự có mặt của fluor ở vị trí C6 (chất 21) không làm ảnh hưởng đến tác dụng, nhưng nếu thay bằng clor (chất 19) thì lại làm giảm tác dụng Trong các hợp chất

thay thế bằng phenyl ở R2 (22, 23, 24) thì hoạt động mạnh nhất là dẫn chất thế 6-Cl (chất 23) Hiệu ứng co giật cũng tăng lên khi có mặt nhóm methyl ở C2

(25 và 26), đồng phân trans hoạt động mạnh hơn so với cis Cuối cùng, tác

dụng được tăng cường mạnh khi thay p-tolyl ở vị trí R2 (27, 28, 29), đặc biệt

sự kết hợp của nhóm thế 6-Cl và p-tolyl (chất 28) cho thấy hiệu quả chống co

giật mạnh nhất [9]

1.3 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho đề tài

Từ các tài liệu tham khảo được chúng tôi nhận thấy rằng các hợp chất của benzimidazol thế ở vị trí C2 và N1 đều có nhiều tác dụng sinh học như: kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, virus, chống co giật, giảm đau, chống viêm….[6,9,11,19] Các benzimidazol hydrazid cũng có các tác dụng sinh học đáng kể, đặc biệt là chống nấm [20] Vì thế hướng nghiên cứu của chúng tôi dự kiến là tổng hợp các dẫn chất của benzimidazol-2-propanoat, bao gồm: các hợp chất thế vị trí N1 và tổng hợp một số hydrazid, đồng thời thử tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn của chúng

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Thực hiện khóa luận này chúng tôi đã sử dụng một số hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược- Bộ môn Công nghiệp Dược

2.1.1 u ên li u, dun môi và óa c ất

Bảng 2.1 Danh mục nguyên liệu, dung môi và hóa chất

1 Acid acetic 99,8% Merck- Đức

17 N,N-dimethylformamid Trung Quốc

2.1.2 T iết bị dụn cụ

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, máy móc

Model UHP N0751E-SIN 9900774

Domnick Hunter Ltd- Anh

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer- USA tại bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa- Trường đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội và máy Impact- 410 Micolet tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy đo phổ khối 1100 series LC/MSD Trap Agilent của Viện Hóa học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-

500 tại Viện Hóa học- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp các hợp chất theo sơ đồ sau:

Bảng 2.3 Công thức của các chất dự kiến tổng hợp

Acid

3-(benzimidazol-2-yl)propanoic (1)

– Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

– Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của chất 2a, 2b, 3a-1, 3a-2, 3a-3,

3b-1

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổn ợp óa ọc và kiểm tra độ tin k iết

– Sử dụng phương pháp tổng hợp hóa học, dựa trên phản ứng:

 Phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất ester yl)propanoat

3-(benzimidazol-2- Phản ứng tổng hợp ester bằng tác nhân SOCl2

 Phản ứng hydrazid hóa ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat

 Phản ứng thế N1 của ester 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat

– Dùng TLC để theo dõi quá trình tiến triển của phản ứng

– Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy

* Phổ khối lượng (MS): phổ khối lượng các chất được ghi tại Viện Hóa học

và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, máy đo LC/MSD Trap Agilent hoặc Agilent 6310 với chế độ

đo ESI hoặc LC-MS [5,13]

Tất cả các chất tổng hợp được đem thử hoạt tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch và sau đó đo kích thước vòng vô khuẩn Chọn chất đối chiếu là penicillin và streptomycin với kháng khuẩn Chọn intraconazol là chất đối chiếu với phương pháp kháng nấm

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tổng hợp hóa học:

Sau khi tham khảo các tài liệu và dựa vào điều kiện phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất ester 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat và tổng hợp hydrazid theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung

Tác n ân và điều ki n: a) anhydrid succinic, xylen, 140 0

C, 3h; b) EtOH, SOCl 2 ,

80 0 C, 2h; c) MeOH, SOCl 2 , 80 0 C, 2h; d) hydrazin hydrat, EtOH, 90 0 C, 4h; e) ECA, DMF, K 2 CO 3 , 25 0 C, 12h; f) Benzyl clorid, DMF, K 2 CO 3 , 25 0 C, 2h; g) ECA, DMF,

K 2 CO 3 , 25 0 C, 4h

3.1.1 Tổng hợp acid 3-(benzoimidazol-2-yl)propanoic (1)

- Chất acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic được tổng hợp theo quy trình:

Sơ đồ 3.2 Tổng hợp 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic (1) từ o-phenylendiamin

 Hòa tan hỗn hợp gồm: 5,4g (0,05mol) 1,2-phenylen diamin và 30ml xylen trong bình cầu 250ml Thêm tiếp 10g (0,1mol) anhydrid succinic Lắp sinh hàn và đun hồi lưu, kết hợp khuấy từ trong 3h

 Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O = 9: 2: 2,5

 Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được làm lạnh, gạn lấy tủa Hòa tan tủa thu được trong 60ml HCl 1M (ở 600

C) Làm lạnh, lọc lấy dịch qua phễu lọc Buchner Dịch lọc được thêm 1g than hoạt, dùng đũa thủy tinh khuấy ở 600

C trong 10 phút Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 10ml nước nóng Dịch lọc được đổ vào cốc có mỏ, làm lạnh và trung hòa dịch lọc bằng natri acetat đến pH= 6 thì xuất hiện sản phẩm

(1) màu trắng Để trong 12h để tủa hết sản phẩm Lọc qua phễu lọc

Buchner, rửa tủa 3 lần với 10ml nước lạnh, thu được 6,65g sản phẩm thô Kết tinh lại sản phẩm trong EtOH 700, thu được tinh thể trắng, hình kim, nhẹ

3.1.2 Tổng hợp ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2a)

- Quy trình tổng hợp:

Sơ đồ 3.3 Tổng hợp ester ethyl 3-(benzimidazol-2-yl)propanoat (2a)

 Thêm 30ml EtOH tuyệt đối vào bình cầu 2 cổ 100ml, làm lạnh đến 50

C, vừa khuấy vừa thêm từ từ 0,36ml (4,9mmol) SOCl2, sau đó thêm tiếp 1g (4,9mmol) acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 2h Sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng

Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O

= 9: 2: 2,5

 Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Làm lạnh bằng đá, thêm 30ml nước lạnh và trung hòa bằng Na2CO3 đến pH= 6 thì sẽ xuất hiện sản phẩm (2a) màu vàng

nhạt Lọc thu tủa qua phễu Buchner Rửa tủa 2 lần với 10ml nước, hút kiệt và sấy khô

 Thêm 30ml MeOH vào bình cầu 2 cổ 100ml, làm lạnh đến 50C, vừa khuấy vừa thêm từ từ 0,36ml (4,9mmol) SOCl2, sau đó thêm tiếp 1g (4,9mmol) acid 3-(benzimidazol-2-yl)propanoic Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 2h Sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng

Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động n-BuOH: AcOH: H2O

= 9: 2: 2,5

 Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Làm lạnh bằng đá, thêm 30ml nước lạnh và trung hòa bằng Na2CO3 đến pH= 6 thì sẽ xuất hiện sản phẩm (2b) màu trắng

Lọc thu tủa qua phễu Buchner Rửa tủa 2 lần với 10ml nước, hút kiệt và sấy khô

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp 3-(benzimidazol-2-yl)propanhydrazid (3a-1)

 Hòa tan hỗn hợp gồm: 1g (4,58mmol) ethyl yl)propanoat và 17ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu 100ml Sau đó thêm 8ml (82,4mmol) hydrazin monohydrat 50% Lắp sinh hàn, đun hồi lưu và khuấy trong 4h

3-(benzimidazol-2-Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động CHCl3: MeOH = 9: 1

 Xử lý: để lạnh trong 15 phút sẽ xuất hiện tủa sản phẩm (3a-1) màu

trắng, lọc qua phễu Buchner, rửa tủa 2 lần với nước lạnh

3-(benzimidazol-2-Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động CHCl3: MeOH= 20: 1

 Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được lọc loại bỏ muối vô cơ, rửa bằng CH2Cl2, thêm 20ml nước lạnh rồi chiết 2 lần với CH2Cl2. Gộp dịch chiết và lắc dịch chiết với dung dịch NaOH để loại sản phẩm bị thủy phân Dịch CH2Cl2 được làm khan và cất thu hồi dung môi ở áp

suất giảm Chất rắn (3a-2) được kết tinh lại trong nước, để trong tủ lạnh

1 ngày Lọc thu tủa qua phễu Buchner

- Kết quả:

Sơ đồ 3.7 Tổng hợp ethyl-3-(1-benzyl-benzimidazol-2-yl)propanoat (3a-3)

 Hòa tan hỗn hợp gồm: 0,25g (1,15mmol) ethyl yl)propanoat và 7ml DMF khan trong bình cầu 2 cổ 50ml Thêm tiếp 0,16g (1,15mmol) K2CO3 khan, cuối cùng thêm từ từ 0,13ml (1,2mmol) benzyl clorid vào hỗn hợp trên Lắp dụng cụ làm khan (có gắn CaO), sục khí N2 trong suốt quá trình phản ứng, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 1h30 phút

3-(benzimidazol-2- Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động CHCl3: MeOH= 20: 1

 Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được lọc loại bỏ muối vô cơ, rửa bằng CH2Cl2, thêm 20ml nước lạnh rồi chiết 2 lần với CH2Cl2. Gộp dịch chiết dicloromethan, lắc dịch chiết với dung dịch NaOH 10% để loại sản phẩm bị thủy phân Dịch CH2Cl2 được làm khan bằng Na2SO4

khan và cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm Chất rắn (3a-3) được kết

tinh lại trong nước, để trong tủ lạnh 1 ngày Lọc thu tủa qua phễu Buchner

- Kết quả:

 Hiệu suất: 46,0% (0,16g)

 Cảm quan: chất rắn màu nâu

 T0nc= 85-880C

3-(benzimidazol-2- Phản ứng được theo dõi bằng TLC với pha động CHCl3: MeOH= 20: 1

 Xử lý: hỗn hợp phản ứng sau khi kết thúc được lọc loại bỏ muối vô cơ, rửa bằng CH2Cl2, thêm 20ml nước lạnh rồi chiết 2 lần với CH2Cl2 Gộp dịch chiết dicloromethan, lắc dịch chiết với dung dịch NaOH 10% để loại sản phẩm bị thủy phân Dịch CH2Cl2 được rửa, làm khan và cất thu

hồi dung môi ở áp suất giảm Chất rắn (3b-1) được kết tinh lại trong

nước, để trong tủ lạnh 4 ngày Lọc thu tủa qua phễu Buchner

Như vậy, chúng tôi đã tổng hợp được 7 chất Sau đây là bảng tóm tắt kết quả tổng hợp hóa học:

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học

Hiệu suất (%)

R f

Tinh thể màu trắng, hình kim

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng sắc kí lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy như sau:

- TLC được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel GF254 70-230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

- Dung môi hòa tan: EtOH 960

- Hệ dung môi: n-BuOH: AcOH: H2O (9: 2: 2,5); cloroform: methanol (20: 1)

Ghi chú: o-ph: o-phenylendiamin

Bảng 3.3 TLC của các chất sản phẩm (3a-1, 3a-2, 3a-3, 3b-1)

- Đo nhiệt độ nóng chảy các chất

Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (t0nc) của các chất được tóm tắt trong bảng

- Nhiệt độ nóng chảy của các chất dao động ở khoảng hẹp từ 2÷ 40C

 Sơ bộ kết luận các chất đã tổng hợp được là tinh khiết

 Tiến hành đo phổ để xác định cấu trúc các chất tổng hợp được

3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc

3.3.1 Kết quả phân tích phổ các chất trung gian (acid 1 và ester 2a, 2b)

a Phổ hồng ngoại (IR)

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 1, 2a, 2b

Nhận xét: Các chất đều có số sóng ứng với các dao động của các nhóm

liên kết, trong đó dao động của nhóm C=O là dao động mạnh Ở 2a, 2b nhóm C=O rõ và cao hơn ở acid 1

b Phổ khối lượng (MS)

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ khối lượng của 1, 2a, 2b

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H của 1,2a,2b

Chất Công thức cấu tạo Số liệu phân tích 1

H-NMR

1

1

H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 2,80 (2H, t, C2H2); 3,04 (2H, t, C3H2); 7,11 (2H, d, C5’H + C6’H); 7,46 (2H, d,

C4’H + C7’H)

2a

1

H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 1,21 (3H, t, CH3); 2,91 (2H, t, C2H2); 3,19 (2H, t, C3H2); 4,12 (2H, q,-CH2-); 7,20 (2H, dd, C5’H + C6’H); 7,50 (2H,

dd, C4’H + C7’H)

2b

1

H-NMR (500MHz, DMSO, ppm): δ 2,88 (2H, t, C2H2); 2,06 (2H, t, C3H2); 3,59 (3H, s, O-CH3); 7,07-7,13 (2H, m,

C5’H + C6’H); 7,41 (1H, d, C4’H); 7,51 (1H, d, C7’H); 12,21 (1H, s, NH)

Ghi chú: δ: Độ chuyển dịch hóa học (ppm); s: singlet; d: doublet; t: triplet; q: quartet;

- Kết hợp với kết quả phổ IR, phổ MS có thể khẳng định 3 chất 1, 2a, 2b

chúng tôi tổng hợp được có công thức cấu tạo như dự kiến