Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất thiazolidin 2,4 dion

IC 50 : nồng độ mà tại đó 50% tế bào bị chết hoặc ức chế Từ kết quả nghiên cứu trên, nhận thấy hợp chất với nhóm thế là vòng benzen IIa và methylbenzen IId cho độc tính tế bào thấp với c

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUỐC THẮNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THIAZOLIDIN-2,4-DION

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN QUỐC THẮNG

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THIAZOLIDIN-2,4-DION

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy

giáo PGS TS Nguyễn Hải Nam và cô giáo TS Phan Thị Phương Dung, các

thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình giúp tôi hoàn thành khóa luận

này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến DS Lâm Thị Hòa cùng các thầy cô, các anh chị

kỹ thuật viên bộ môn Hóa Dược Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo

điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà

Nội đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt 5 năm học vừa qua

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các cán bộ phòng Phân tích hữu cơ – Viện

Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Phòng

Hóa vật liệu – Khoa Hóa – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia

Hà Nội

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đặc biệt là bố mẹ tôi, người

thân và bạn bè đã quan tâm, động viên tạo động lực cho trong cuộc sống và học tập

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Nguyễn Quốc Thắng

MỤC LỤC

CH NG T NG QU N 2

Tác dụng sinh học của thiazolidindion 2

Độc tính tế bào 2

1.1.2 Tác dụng ức chế enzym histon deacetylase 5

3 Một số tác dụng khác của thiazolidindion 12

2 Một số phản ứng sử dụng trong tổng hợp dẫn chất thiazolidindion 14

2 Phương pháp tổng hợp thiazolidin-2,4-dion 14

2 2 Phản ứng thế SN2 15

2 3 Phản ứng ngưng tụ 15

CH NG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2 2 Thiết bị, dụng cụ 17

2 3 Nội dung nghiên cứu 19

2 4 Phương pháp nghiên cứu 19

2 4 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 19

2 4 2 Xác định cấu trúc 20

2 4 3 Thử tác dụng độc tính tế bào in vitro 20

2 4 4 Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được 21

3 Hóa học 22

3 Tổng hợp hóa học 22

3 2 Kiểm tra độ tinh khiết 32

3 3 Xác định cấu trúc 33

3 2 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất được tổng hợp 38

3 3 Bàn luận 39

3 3 Tổng hợp hóa học 39

3 3 2 Tác dụng kháng tế bào ung thư 41

KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU TH M KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT:

HAT Histon acetyltranferase

HDAC Histon deacetylase

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

HepG2 Tế bào ung thư gan

MeOH Methanol

MS Phổ khối lượng (Mass spectroscopy)

PPAR-γ Peroxisom proliferator activated receptor gamma

MTT Thuốc nhuộm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium

bromid PTP 1B Protein tyrosin phosphat 1B

SAHA Acid suberoylanilid

STT Số thứ tự

SWL68 Tế bào gan bình thường

SW620 Tế bào ung thư đại tràng

TZD Thiazolidin-2,4-dion

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor)

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất sản phẩm

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các sản phẩm cuối 36 Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các sản phẩm cuối 37 Bảng 3.8 Tác dụng kháng tế bào ung thư đại tràng (SW62 ) 39 Bảng 3.9 Đánh giá độ giống thuốc của dãy chất được tổng hợp 42

trong protein

10

Hình 1.10 Kết quả ức chế HD C của các chất sau 8h 12

Hình 1.12 Một số TZD ức chế PTP1B mới được nghiên cứu 14

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thiazolidindion (TZD) và các dẫn chất đã được biết đến có tác dụng chống đái tháo đường nhờ hoạt hóa thụ thể peroxisom proliferator activated receptor gamma và ức chế protein tyrosin phosphat 1B [13,14] Một số thuốc điều trị đái tháo đường týp 2 dựa trên khung TZD vẫn đang được sử dụng trên thị trường như Pioglitazon [2, 17]

Bên cạnh đó, các hợp chất TZD còn được nghiên cứu khai thác các tác dụng khác như tác dụng kháng khuẩn [6], kháng nấm [7,8], chống oxi hóa tế bào [18] Đặc biệt trong thời gian gần đây, các nghiên cứu về dẫn chất của TZD thường hướng tới hoạt tính kháng trên các dòng tế bào ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan và một số dòng tế bào khác [12,26,28] Các tác giả đã thiết kế công thức mới của TZD, trong đó nhóm TZD đóng vai trò ức chế enzym histon deacetylase (một enzym quan trọng trong quá trình hình thành các tế bào ung thư) [26] Kết quả thu được rất khả quan khi so sánh với một số chất chống ung thư hiện hành

Từ các kết quả nghiên cứu trên, nhằm mục đích tìm kiếm thêm các dẫn chất

thiazolidindion triển vọng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất thiazolidin-2,4-dion” với các mục tiêu

sau:

1 Tổng hợp N-(2-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl) benzensulfonamid và một số dẫn chất

2 Thử độc tính tế bào của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tác dụng sinh học của thiazolidindion

Thiazolidindion còn được gọi là glitazon là nhóm các dẫn chất có chứa gốc thiazolidin-2,4-dion:

Các TZD đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như: tác dụng kháng khuẩn [6,7], chống nấm [7,8], chống oxy hóa [18], gây độc tế bào, chống ung thư [12,26,28], hoạt hóa thụ thể PPAR-γ, ức chế protein PTP1B [8,12,14]

Hiện nay, hướng nghiên cứu về hoạt tính của TZD đang được quan tâm nhiều là độc tính tế bào, ức chế HDAC, hoạt hóa PPAR-γ và ức chế PTP1B

1.1.1.Độc tính tế bào

Năm 2 , V Patil cùng cộng sự đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất

mang nhóm TZD (I) và thử độc tính in vitro trên 7 dòng tế bào ung thư bao gồm:

Hop62 (ung thư phổi), PC3 (ung thư tuyến tiền liệt), MCF7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan), K562 (ung thư bạch cầu), Gurav (ung thư miệng) và KB (ung thư vòm họng) Nồng độ các chất thử nghiệm trong khoảng từ 10-4

tới 10-7 M, tiến hành song song với 2 mẫu thử, một mẫu không sử dụng chất ức chế và một mẫu sử dụng chất ức chế là doxorubicin [29] Sau 48 giờ, đánh giá mức độ phát triển của mỗi dòng tế bào, xác định các nồng độ tại đó khả năng phát triển của tế bào bị ức chế 50% (GI50) Tính giá trị logarit nồng độ tại GI50, các giá trị âm thể hiện cho sự nhạy cảm của các dòng tế bào, các hợp chất có giá trị logGI50 < -4 được coi là có hoạt tính

Y=R-NH Ib,Ic,Ie Y=R Ia,Id

I

Bảng 1.1: Kết quả thử độc tính tế bào của các hợp chất TZD I

Hợp

logGI 50 K562 MCF7 HepG2 Hop62 PC3 Gurav KB

GI 50 : nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào

Nhận xét từ kết quả nghiên cứu cho thấy, hợp chất Ie có tác dụng ức chế tế

bào ung thư mạnh nhất trong các chất được tổng hợp Chất này ức chế 5 trong số 7

dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là K562, MCF7, PC3, Gurav và KB Chất Ic

cho thấy tác dụng yếu hơn, khi ức chế được 4 trong số 7 dòng tế bào: K562, Hop62,

PC3 và Gurav Hợp chất Ia và Id cùng cho thấy tác dụng trên 3 dòng tế bào ung thư

là MCF7, HOP62 và PC3 Riêng chất Ib chỉ ức chế được duy nhất dòng tế bào là

Hop62 Tất cả các chất trên đều không có tác dụng trên dòng tế bào ung thư gan (HepG2) Có thể là do các enzym amidase trong tế bào gan đã chuyển hóa nhanh chóng các hợp chất, khiến cho chúng không thể hiện được tác dụng [29]

Tiếp tục theo hướng nghiên cứu này, Shankar và cộng sự cũng đã tiến

hành tổng hợp nhóm hợp chất có chứa khung TZD (II) và đánh giá độc tính trên các

dòng tế bào ung thư ở người: HeLa (ung thư cổ tử cung), HT-29 (ung thư trực tràng), 549 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú) Sự ức chế phát triển của các tế bào ung thư sau 24 giờ được ghi nhận qua giá trị IC50 (µM) [7] Sử dụng phần mềm

để tính logP (thể hiện sự cân bằng giữa các nhóm thân dầu và thân nước) của các hợp chất tổng hợp được, từ đó có thể suy luận được khả năng thấm qua màng tế bào

Bảng 1.2: Giá trị IC 50 của các TZD (µM) và giá trị logP

IC 50 : nồng độ mà tại đó 50% tế bào bị chết hoặc ức chế

Từ kết quả nghiên cứu trên, nhận thấy hợp chất với nhóm thế là vòng benzen

(IIa) và methylbenzen (IId) cho độc tính tế bào thấp với các giá trị IC50 cao từ

60-100 µM Khi vòng benzen có thêm các nhóm thế halogen là brom (IIb) hoặc flo (IIc) hoạt tính tăng lên đáng kể với giá trị IC50 thu được trong khoảng 40-50 µM

Hợp chất có tác dụng mạnh nhất là 3,4,5-trimethoxylbenzen (IIe) với các giá trị

IC50 thấp nhất từ 30-36 μM Ngoài ra, các hợp chất dị vòng chứa Nitơ (IIg, IIh) và oxy (IIi) cho các giá trị IC50 ở mức cao từ 60-90 μM

Giá trị logP của các dẫn chất vòng benzen (IIa-IIf) cao hơn so với các dẫn chất mang nhóm dị vòng (IIg-IIi), chứng tỏ tính thân dầu của các hợp chất IIa-IIf cao hơn so với các hợp chất IIg-IIi Tính thân dầu thấp là một trong những nguyên

nhân chung khiến các chất khó thấm qua màng tế bào [7]

Các kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy các dẫn chất mang khung TZD có tác dụng trong việc ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư

1.1.2 Tác dụng ức chế enzym histon deacetylase

1.1.2.1 Khái niệm và cấu trúc enzym histon deacetylase

Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ ε-N-acetyl lysin amino acid của phần histon [16] Loại nhóm acetyl từ phần amin làm trung hòa điện tích dương của histon, dẫn đến giảm tương tác điện giữa histon với ADN Khi tương tác điện này yếu, nhiễm sắc thể tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính của gen được biểu hiện thông qua các tính

trạng Trong khi enzym histon acetyltranferase xúc tác quá trình acetyl hóa có tác dụng ngược lại Trong tế bào, H T và HD C là 2 enzym điều hòa quá trình acetyl hóa từ đó quyết định sự biểu hiện gen [4]

Hình 1.1: Vai trò cân bằng động giữa HDAC và HAT đối với sự phiên mã

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự ức chế phiên mã không thích hợp của

HD C là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thư Sự biến đổi trong cấu trúc chất nhiễm sắc có thể tác động lên quá trình biệt hóa tế bào bình thường, dẫn tới sự hình thành khối u Ức chế hoạt động của enzym HD C là đích tác dụng của nhiều thuốc chống ung thư đang được nghiên cứu trong giai đoạn hiện nay [16,22]

Về căn bản, các HD C có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau :

+ Ion Zn2+: là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí Thông thường các chất ức chế HD C liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HD C và độc tính tế bào càng mạnh [10]

+ Kênh enzym: là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất Kênh này được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl hóa [20]

Trạng thái bất hoạt Trạng thái hoạt động

Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 1.1.2.2 Một số chất ức chế HDAC đã được công bố

Từ những phát hiện đầu tiên về tác dụng ức chế HDAC của natri butyrat đã

có những đề tài lớn trong việc nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế HD C Đã có nhiều chất ức chế HD C được tìm ra, trong đó chất có tác dụng mạnh nhất được

biết đến hiện nay là TS - một sản phẩm lên men của Streptomyces, nhưng việc sản

xuất nó hiện nay là không khả thi [25] Cho đến thời điểm này, đã có hai chất ức chế HD C được FDA cấp phép lưu hành trên thị trường có tác dụng điều trị u lympho tế bào T dưới da: SAHA (Vorinostat, Zolina®) - chất có nguồn gốc tổng

hợp, Romidepsin (Istodax®) - chất được phân lập từ Chromobacterium violaceum

[32] Ngày nay có khoảng 15 chất ức chế HD C đang được nghiên cứu thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị ung thư (hình 3)

TSA Acid valproic

Hình 1.3: Cấu trúc một số hoạt chất ức chế HDAC

Nhóm tổng hợp của bộ môn Hóa Dược Trường Đại học Dược Hà Nội cũng

đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng ức chế HDAC dựa trên cấu trúc của SAHA Các kết quả thu được về khả năng ức chế HD C cũng như độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư là rất khả quan [5,27]

n1:1-3

Hình 1.4: Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố

Theo một số tài liệu tham khảo, hiệu quả tác dụng của các chất ức chế HDAC dựa trên sự có mặt của 3 yếu tố chính [10] (hình 5):

- Nhóm kết thúc có thể liên kết với Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các enzym HDAC như: acid hydroxamic, thiol, benzamid, mecaptoceton

- Cầu nối: thường là các mạch hydrocarbon, nằm trong lòng enzym

- Nhóm khoá hoạt động (capping group): thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt của enzym

Dựa trên các hiểu biết về cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC, R Mohan cùng cộng sự (2 ) đã nghiên cứu và thiết kế một số hợp chất của TZD

(IIIa và IIIb) nhằm ức chế HD C trên dòng tế bào ung thư gan Khác với các hợp

chất dựa trên cấu trúc của S H , tác giả sử dụng nhóm TZD là nhóm tạo phức với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của enzym (hình 6) [26]

Hình 1.5: Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC

Hình 1.6: Cấu trúc thiết ế và hợp chất ức chế HDAC

Các chất thiết kế được nghiên cứu đánh giá tính tương tác với HD C thông qua docking bằng mô hình trên phầm mềm MOE (Molecular Operating

Cầu nối Nhóm khóa hoạt động

Nhóm ức chế Nhóm hút điện

“túi” enzym

Chuỗi dài hẹp

Nhóm liên kết (acid hydroxamic)

Vùng bề mặt protein

Khoảng trống Vùng hoạt động

Environment) Kết quả docking cho thấy ái lực cao của hai chất được thiết kế đối với HDAC, thể hiện sự phù hợp về cấu trúc so với “túi” HD C

Hình 1 : Mô h nh phân tử I và II tạo iên ết che at với ion Zn trong protein

Tác dụng sinh học của 2 hợp chất mới tổng hợp được đánh giá qua độc tính

tế bào và tác dụng ức chế enzym HDAC

Đánh giá độc tính tế bào của hai hợp chất được tổng hợp tiến hành trên 2 dòng tế bào: tế bào ung thư gan (HepG2) và tế bào gan bình thường (WRL68) Hai tiêu chí đánh giá là tác dụng phụ thuộc vào liều và tác dụng phụ thuộc vào thời gian

Sử dụng dòng tế bào WRL68 nhằm theo dõi ảnh hường của các TZD trên tế bào gan bình thường Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 8 và 9

Biểu đồ kết quả cho thấy ở nồng độ µM sau 48 giờ, trên dòng tế bào

HepG2: chất IIIa làm 42,3 % tế bào chết và ở IIIb là 57,27% Trên dòng tế bào WRL68, độc tính của hai chất gần tương đương nhau: 34,66% (IIIa) và 37,5% (IIIb) Độc tính đã xuất hiện trên cả 2 dòng tế bào, tuy nhiên vẫn có sự chọn lọc

hơn trên dòng tế bào HepG2

Hình 1.8: Độc tính tế bào tại các nồng độ sau 48h

Thí nghiệm tiếp theo theo dõi sự ức chế tế bào của 2 chất tại các thời điểm

48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 2 giờ Tại thời điểm kết thúc 2 giờ, chất IIIa ức chế 82,98% tế bào HepG2 và 92,34% tế bào WRL68, trong khi đó chất IIIb tương ứng chỉ là 69,45% HepG2 và 55,6% WRL68 Chất IIIa cho thấy hoạt tính ức chế mạnh hơn theo thời gian so với chất IIIb Tuy nhiên lại có điểm hạn chế khi tác dụng trên

dòng tế bào WRL68 mạnh hơn trên dòng tế bào HepG2

Hình 1.9: Độc tính tế bào theo thời gian

Tiếp tục đánh giá khả năng ức chế HDAC in vitro của các chất được tổng

hợp trên dòng tế bào HepG2, đối chiếu và so sánh kết quả với hai chất ức chế

% tế bào chết theo liều của IIIa

HDAC mạnh là SB (sodium butyrat) và S H Kết quả được trình bày ở bảng 1.10

Hình 1.1 : ết quả ức chế HDAC của các chất sau h

Chất IIIb lúc này cho kết quả ức chế HDAC tốt hơn so với chất IIIa

(42,11%), chất so sánh SB (52,32%) và có hoạt tính gần tương đương với SAHA (57,89%) [26]

Từ kết quả nghiên cứu của tác giả trên đây, cho thấy các hợp chất của thiazolidin-2,4-dion có tiềm năng lớn trong việc ức chế enzym HD C Nhóm thiazolidin-2,4-dion đóng vai trò là nhóm tác dụng, ức chế trung tâm hoạt động của enzym

1.1.3 Một số tác dụng khác của thiazolidindion

1.1.3.1 Tác dụng hoạt hóa PPAR-γ

Thiazolidindion là nhóm chất chủ vận chọn lọc trên thụ thể PPAR-γ Thông qua hoạt hóa PP R-γ, TZD điều chỉnh sự biểu hiện của một số gen mục tiêu của PPAR-γ và tác động lên quá trình chuyển hóa lipid của tế bào Kích thích PP R-γ

sẽ kích thích dự trữ và sử dụng acid béo, triglycerid ở tế bào mỡ, kích thích sử dụng glucose và ức chế oxy hóa acid béo ở cơ, ức chế sự tổng hợp glucose ở gan, ngoài

ra còn tăng cường sự oxy hóa các LDL (low density lipoprotein) ở đại thực bào Từ

đó cải thiện sự nhạy cảm với insulin của tế bào, giảm nồng độ glucose trong máu, giảm acid béo trong máu, chống xơ vữa động mạch và cao huyết áp [13,7]

% HD C của HepG2 bị ức chế sau 8h

SB SAHA 3a 3b

Hình 1.11: Tác dụng của TZD trên PPAR-γ

Troglitazon (Rezulin) là loại thuốc đầu tiên trong nhóm được đưa vào sử dụng trong lâm sàng năm 997 nhưng do tác dụng phụ trên gan nên đã rút khỏi thị trường Một thuốc khác là Rosiglitazon cũng bị ngừng sử dụng do độc tính trên tim mạch, hiện tại chỉ Pioglitazon còn được sử dụng Nói chung nhóm thuốc TZD điều trị tiểu đường cho thấy nhiều tác dụng không mong muốn

1.1.3.2 Tác dụng ức chế PTP1B

PTP B là một phosphotyrosin phosphatase, enzym thủy phân nhóm phosphat gắn trên acid amin tyrosin PTP B tham gia phản ứng dephosphoryl hóa phosphotyrosin của enzym kinase hoạt hóa insulin và leptin Vì vậy, PTP B làm giảm thông tin dẫn truyền của thụ thể insulin và thụ thể leptin ở mô mỡ, gan, cơ Ức chế PTP B làm tăng độ nhạy, đáp ứng của insulin và leptin tại thụ thể, dẫn đến giảm nồng độ glucose, lipid trong máu [9,30] Vì vậy, PTP B đã được chứng minh

là một mục tiêu phân tử quan trọng cho nghiên cứu phát triển của các thuốc điều trị đái tháo đường Trong một số nghiên cứu gần đây, một số dẫn chất TZD đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzym PTP1B [9]

Hình 1.12: Một số TZD ức chế PTP1B mới được nghiên cứu

Tiền tế bào mỡ Tế bào mỡ nhạy cảm insulin Tế bào mỡ kháng insulin

kích thích sự

biệt hóa

Ngăn cản sự chuyển hóa

IVa-b

1.2 Một số phản ứng sử dụng trong tổng hợp dẫn chất thiazolidindion

1.2.1.Phương pháp tổng hợp thiazolidin-2,4-dion

1.2.1.1 Phản ứng đóng vòng của thioure với acid monocloacetic

Năm 954, E Mameli và cộng sự đã tổng hợp vòng thiazolidin-2,4-dion theo

sơ đồ [23]:

Phản ứng xảy ra qua hai giai đoạn:

- Giai đoạn 1: tạo pseudothiodohydantoin:

- Giai đoạn 2: thủy phân pseudothiohydantoin dưới tác dụng của HCl sinh ra trong giai đoạn một:

Phương pháp này được sử dụng nhiều vì có hiệu suất cao và tiến hành đơn giản

1.2.1.2 Phản ứng đóng vòng của ethyl cyanothioacetat có mặt acid hydrocloric

Phương pháp này do K C Joshi (1968) [20] tìm ra, tuy phản ứng đơn giản nhưng hiệu suất thấp nên ít được sử dụng

1.2.2 Phản ứng thế S N 2

1.2.2.1 Phản ứng tạo dẫn xuất sulfonamid

Phản ứng giữa dẫn xuất benzensulfoclorid và amin bậc 1 xảy ra theo cơ chế

SN2 [1]:

1.2.2.2 Phản ứng tạo ether từ dẫn xuất halogen và dẫn xuất phenol

Phản ứng thế giữa dẫn xuất halogen và một tác nhân base có cặp điện tử tự

do hay giàu electron như các alcol, phenol hay ester cũng theo cơ chế SN2 [1] Khi tác nhân nucleophin là nhóm OH phenol có thể sử dụng xúc tác là kiềm để chuyển phenol thành phenolat nhằm tăng khả năng và tốc độ phản ứng

1.2.3 Phản ứng ngưng tụ

Nhóm methylen trong nhân thiazolidin-2,4-dion có tính linh động cao, do đó

có khả năng tham gia phản ứng ngưng tụ với các aldehyd thơm theo sơ đồ phản ứng:

Trạng thái chuyển tiếp

Phản ứng có thể tiến hành trong các dung môi: ethanol, methanol hay acid acetic Xúc tác được sử dụng là piperazin hoặc có thể là natri acetat khan [3] Vì nhóm methylen của thiazolidin-2,4-dion linh động nên phản ứng ngưng tụ xảy ra dễ dàng, các tác nhân xúc tác có thể loại bỏ bằng dung dich acid hoặc lọc và rửa với nước

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.2 Dung môi và các hóa chất khác

2.2 Thiết bị, dụng cụ

2.2.1 Thiết bị, máy móc

STT Tên thiết bị, máy móc Nguồn gốc

4 Máy đo phổ khối lượng LTQ Obitrap XL (Phòng Hóa vật

liệu, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc Gia Hà Nội)

Mỹ

Máy đo phổ khối lượng Aligent 6310 (Phân tích hữu cơ –

Viện Hợp chất thiên nhiên - Viện Hóa học và Công nghệ

Việt Nam)

Mỹ

6 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR Brucker AV- 500MHz (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam)

Mỹ

2 Bình cầu đáy tròn 5 mL Đức

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học:

 N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)benzen

sulfonamid

 N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-4-methylbenzen sulfonamid

 N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-4-methoxy

benzensulfonamid

 4-chloro-N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)benzen sulfonamid

2.3.2 Thử độc tính tế bào in vitro và đánh giá sơ bộ tính giống thuốc của một số dẫn chất tổng hợp được

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

 Nghiên cứu tổng hợp 4 chất trong mục tiêu bằng phương pháp hóa học

 Dùng TLC để theo dõi tiến trình của phản ứng

 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy

2.4.2 Xác định cấu trúc

Các chất tổng hợp được xác định cấu trúc bằng các loại phổ sau: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ carbon (13

C-NMR)

 Phổ hồng ngoại (IR): phổ hồng ngoại được ghi tại Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (KHTN) Hà Nội – Đại học Quốc Gia Hà Nội, trên máy Perkin Elmer với kĩ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-600cm-1

Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với t lệ :2 rồi ép dưới dạng film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm [15]

 Phổ khối (MS): phổ khối lượng các chất được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học KHTN Hà Nội với chế độ đo EI và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chế độ đo ESI

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR, 13C-NMR) được ghi trên máy Bruker V-5 tại Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dùng DMSO làm dung môi, chất chuẩn nội là tetramethylsilan (TMS) [23]

2.4.3 Thử tác dụng độc tính tế bào in vitro

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (độc tính tế bào) in vitro được thực hiện

tại khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp MTT và giá trị IC50 được tính trên phần mềm GraphPad Prism

Dòng tế bào thử nghiệm: tế bào ung thư đại tràng (SW62 )

Dòng tế bào ung thư được sử dụng từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco s modified) hoặc RPMI bổ sung % FBS (huyết thanh bào thai bò)

Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp MTT theo các bước sau:

ước 1: Chu n bị

Các tế bào ở pha logarit được tripsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI bổ sung % FBS Điều chỉnh nồng độ

khoảng ,5x104 đến 3,5x104 tế bào, sau đó chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 2 µL, các đĩa sau đó được ủ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2

Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 2 µL môi trường DMEM/RPMI bổ sung % FBS từ dung dịch gốc mg mL trong dimethyl sulfoxid (DMSO) rồi thêm 2 µL mẫu thử vào các giếng ở nhiều nồng độ khác nhau Các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sau cho nồng

độ cuối cùng của DMSO không quá , %

ước 2: Tiến hành thử

Sau 48 giờ ủ, thêm vào mỗi giếng 2 µL thuốc nhuộm MTT (nồng độ MTT 5 mg/ mL trong muối đệm phosphat – PBS) Các đĩa được ủ thêm 3 giờ ở 37oC trong điều kiện 5% CO2 Tiếp theo mỗi giếng được cho µL dung dịch DMSO, để 5 phút cho MTT formazan được hòa tan Độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 5 nm

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó, độ hấp thụ giảm đi 5 % so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa trên phần mềm GraphPad Prism Trong phương pháp thử này, IC50 ≤ 2 µg mL được coi là có hoạt tính

2.4.4 Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được

Tính giá trị logP của các dẫn chất tổng hợp được bằng phần mềm EPIsuite Quy trình bao gồm vẽ cấu trúc 2D, tạo Smile notation bằng phần mềm Chemsketch

4 của CD labs sau đó đưa Smile notation vào phầm mềm EPIsuite để tính các giá trị logP

Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất dựa trên quy tắc Lipinsky [23]:

- Khối lượng phân tử của chất phải nhỏ hơn 5 g/mol

- Số trung tâm nhận liên kết hydro (N, O) phải nhỏ hơn

- Số trung tâm cho liên kết hydro (NH, OH) phải nhỏ hơn 5

- Cân bằng giữa tính thân nước dầu: logP <5

- Số liên kết linh động nhỏ hơn 15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Hóa học

Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận này được tiến hành theo sơ đồ 3.1

Sơ đồ 3.1: Quy tr nh tổng hợp các chất Ghi chú: i) 2-bromoethanamin hydrobromid, DMF, TEA, 25 o

C, 24 giờ; ii) hydroxybenzaldehyd, MeOH, Na 2 CO 3 , hồi ưu, 24 giờ; iii) thiazolidin-2,4-dion, EtOH, piperazin, 80 o C, 24 giờ; iv) HCl, H 2 O, hồi ưu, 2h

- Cho 9,45 g (0,1 mol) acid monocloroacetic; 7,6 g thioure (0, mol) vào bình cầu

500 mL Thêm tiếp 100 mL nước cất, lắp sinh hàn, đun hồi lưu bằng bếp điện có áo

bọc Sau khi dung dịch sôi khoảng 1 giờ, rót tiếp 10 mL HCl % qua sinh hàn vào bình cầu Tiếp tục hồi lưu thêm 2 giờ nữa Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM: MeOH: AcOH= 90:10:1

Xử lý hỗn hợp thu được:

- Rót hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ, làm lạnh, xuất hiện các tinh thể Để kết tinh lạnh trong 24 giờ Lọc tủa qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 50 mL nước cất lạnh

- Tẩy màu: chất rắn sau khi thu được, hòa tan trong 5 mL nước nóng, thêm 2 0

mg than hoạt, dùng đũa thủy tinh khấy nóng phút Lọc qua phễu lọc Buchner, rửa 2 lần với 10 mL nước nóng Dịch lọc thu được đổ vào cốc có mỏ, làm lạnh trong 24 giờ Sản phẩm kết tinh, màu trắng ánh vàng Lọc dung dịch qua phễu lọc Buchner, rửa tủa 3 lần với 10 mL nước lạnh

- Cho 0,3 mL (2 mmol) benzensulfonyl clorid (1a) (d= 1,184 g/mL), 2 mL DMF

vào bình cầu dung tích 5 mL, làm lạnh dung dịch bằng nước đá Thêm 45 mg (2,2 mmol) 2-bromoethanamin hydrobromid vào bình cầu Tiếp tục thêm từ từ 0,6 mL TEA (triethylamin), lắc đều hỗn hợp trong nước đá Phản ứng được tiến hành trong nhiệt độ phòng, kết hợp khuấy từ, thời gian 24 giờ Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM: MeOH = 40:1

Xử lý hỗn hợp phản ứng:

- Thêm dần 10 mL dung dịch nước lạnh, tiếp tục acid hóa bằng dung dịch HCl 5%

về pH 2-3 Chiết 3 lần bằng dung môi dicloromethan, mỗi lần 5-10 mL dung môi Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan Gộp dịch chiết của 3 lần Cất quay chân không ở 40o

C đến khi thu được sản phẩm Sấy sản phẩm ở 60o

Quy trình tiến hành tương tự với quy trình tổng hợp chất 2a, đi từ 0,40 g (2 mmol) chất 4-methylbenzen-1-sulfonyl clorid (1b)

Ghi chú: ii) MeOH, Na 2 CO 3 , hồi ưu, 24 giờ

Sơ đồ 3.4: Tổng hợp dãy chất 3a-d

- Cân hỗn hợp phản ứng gồm 120 mg (1 mmol) p-hydroxybenzaldehyd cùng 0

mg Na2CO3 vào trong bình cầu 50 mL Thêm tiếp 10 mL dung môi MeOH và hồi lưu Quá trình hoạt hóa diễn ra trong vòng 3 -6 phút Hòa tan 0,26 g (1 mmol) bột

kết tinh N-(2-bromoethyl)benzensulfonamid (2a) trong 10 mL dung môi MeOH,

dùng pipet hút và đưa từ từ vào dung dịch đã được hoạt hóa, hồi lưu trong khoảng

24 giờ Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM: MeOH= 40:1

Xử lý hỗn hợp phản ứng:

- Cất thu hồi bớt dung môi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ 40oC trong khoảng 2 phút Thêm từ từ dung dịch acid HCl 5% đã được làm lạnh vào hỗn hợp

phản ứng đến pH 2-3, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, xuất hiện tủa màu vàng nhạt Lọc tủa qua phễu thủy tinh, rửa nước bằng cất đến khi dịch lọc trung tính Tiếp tục rửa tủa lần 2 với 4 mL nước nóng Sấy khô tủa ở 60oC trong khoảng 4 giờ

hợp từ 0,28 g (1 mmol) N-(2-bromoethyl)-4-methylbenzensulfonamid (2b) với

p-hydroxybenzaldehyd theo phương pháp tương tự như tổng hợp chất 3a

Ghi chú: iii) EtOH, piperazin, hồi ưu, 24 giờ

Sơ đồ 3.5: Tổng hợp dãy chất 4a-d

- Cân 300 mg chất 3a (1 mmol) cùng với 120 mg thiazolidin-2,4-dion vào bình

cầu 50 mL Thêm tiếp 5 mL EtOH và 80 mg piperazin vào binh cầu, hồi lưu trong

24 giờ Kiểm tra phản ứng bằng TLC với pha động DCM: MeOH: AcOH= 90:5:1

Xử lý hỗn hợp phản ứng:

- Cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay ở nhiệt độ 40oC Đổ hỗn hợp phản ứng

ra cốc có mỏ đã có sẵn 10 mL HCl 5% được làm lạnh Khuấy nhẹ hỗn hợp bằng đũa thủy tinh và thêm từ từ 10 mL nước cất đã được làm lạnh Tráng rửa bình cầu bằng nước cất Tất cả dung dịch thu được làm lạnh trong 12 giờ để sản phẩm tủa hoàn toàn Lọc tủa bằng phễu thủy tinh, rửa bằng nước lạnh tới khi dịch lọc trung tính

- Sản phẩm được kết tinh lại trong dung môi EtOH Tinh thể thu được đem sấy khô ở 60o

C trong 4 giờ

Sơ đồ phản ứng:

Ghi chú: iii)EtOH, piperazin, hồi ưu, 24 giờ

Tiến hành:

- Chất N-(2-(3-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl)-4-methoxy

benzensulfonamid (4c) được tổng hợp từ 0,34 g (1mmol) chất formylphenoxy)ethyl)-4-methoxybenzen sulfonamid (3c) và thiazolidin-2,4-dion Quy trình tổng hợp tương tự như với chất 4a