Nghiên cứu tác dụng hỗ trợ điều trị gút trên thực nghiệm của hạt cần tây (apium graveolens l , apiaceae)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ GÚT TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA HẠT CẦN TÂY APIUM GRAVEOLENS L., APIACEAE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ GÚT TRÊN THỰC NGHIỆM

CỦA HẠT CẦN TÂY

(APIUM GRAVEOLENS L., APIACEAE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ GÚT TRÊN THỰC NGHIỆM

CỦA HẠT CẦN TÂY

(APIUM GRAVEOLENS L., APIACEAE)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

thầy cô, bạn bè và người thân

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thùy Dương

và DS Vũ Thị Phương Thảo, những người thầy đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hướng

dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô và anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược lực, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng đào tạo, các bộ môn, phòng ban khác của trường Đại học Dược Hà Nội

Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, tháng 5, năm 2014 Sinh viên

Trần Thị Bích Ngọc

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ BỆNH GÚT 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp acid uric 2

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của gút 3

1.1.4 Cơ chế gây viêm cấp của tinh thể urat 3

1.1.5 Thuốc sử dụng trong điều trị gút và tăng acid uric máu 4

1.1.5.1 Thuốc chống viêm 4

1.1.5.2 Thuốc giảm tổng hợp acid uric……… 6

1.1.5.3 Thuốc gây tăng thải acid uric 7

1.1.5.4 Thuốc tiêu acid uric 8

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY CẦN TÂY 8

1.2.1 Tên gọi 8

1.2.2 Đặc điểm thực vật 9

1.2.3 Phân bố 10

1.2.4 Thành phần hóa học của hạt cần tây 10

1.2.5 Tác dụng sinh học của hạt cần tây 13

1.2.6 Công dụng của hạt cần tây 15

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 16

2.1.2 Chuẩn bị dịch chiết dược liệu 16

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Động vật thí nghiệm 17

2.2.2 Hóa chất, thuốc thử 17

2.2.3 Thiết bị 18

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm 20

2.4.2 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro và in vivo 21

2.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm thực nghiệm 24

2.4.3.1 Đánh giá tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 24

2.4.3.2.Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối 25

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 27

3.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY 27

3.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XO IN VITRO VÀ IN VIVO CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY 29

3.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vivo của cao toàn phần hạt cần tây……… 30

3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY 32

3.3.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 32 3.3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối… 34

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37 4.1 VỀ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY

……… 37 4.2 VỀ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY 38 4.3 VỀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CAO TOÀN PHẦN HẠT CẦN TÂY……… 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

STT Ký hiệu Tên bảng Trang

28

5 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro của

6 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vivo của

7 3.4 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô

hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 33

Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng tinh thể natri urat

35

1 1.1 Qúa trình hình thành acid uric trong cơ thể 2

3 1.3 Cơ chế chống viêm của NSAIDs và glucocorticoid 6

Khung cấu trúc của các hợp chất flavonoid có trong

6 2.1 Quy trình chiết xuất cao toàn phần hạt cần tây 17

8 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric

máu trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat 20

9 2.4 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế XO

10 2.5 Quy trình đánh giá tác dụng chống viêm trên mô

hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan 24

11 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng hạ acid uric của cao toàn

phần hạt cần tây trên mô hình gây tăng acid uric cấp 28

12 3.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế XO in vivo của

13 3.3 Kết quả đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình

XO : xanthin oxidase

NSAIDs : non steroidal anti – inflammatory drug

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gút là một bệnh rối loạn chuyển hóa với biểu hiện lâm sàng là tăng acid uric máu Tại Việt Nam, với sự phát triển của kinh tế xã hội cũng như chế độ dinh dưỡng thiếu hợp lý, bệnh gút ngày càng trở nên phổ biến hơn [3] Bệnh ở cả thể cấp

và mạn tính đều có những triệu chứng điển hình như viêm, đau dữ dội, khó vận động… làm ảnh hưởng không nhỏ tới chất lượng cuộc sống của bệnh nhân Việc sử dụng các thuốc hóa dược giảm đau, chống viêm, hạ acid uric máu mặc dù cho hiệu quả cao song vẫn còn hạn chế về tác dụng không mong muốn và giá thành, nhất là

khi bệnh nhân phải dùng thuốc lâu dài

Việt Nam với nguồn dược liệu đa dạng và phong phú đã có nhiều cây thuốc được sử dụng để điều trị bệnh gút Một số nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm kiếm những dược liệu mới có khả năng điều trị gút, đã phát hiện nhiều dược liệu có

khả năng ức chế hoạt động của enzym xanthin oxidase in vitro, trong đó có cây cần tây (Apium graveolens L., họ Cần, Apiaceae) [19], [25] Mặt khác, trong y học cổ

truyền, cần tây đã được dùng để điều trị bệnh thống phong (bệnh gút theo y học cổ truyền) và các bệnh liên quan về khớp như thấp khớp, đau khớp, viêm khớp [8], [13], [20] Để phát triển dược liệu này thành chế phẩm dùng trong điều trị gút, cần đánh giá tiếp tác dụng của cây cần tây trên động vật thực nghiệm Ở Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào được triển khai để đánh giá tác dụng điều trị gút của cây cần tây Với mong muốn góp phần điều trị và dự phòng tái phát bệnh gút bằng

thuốc có nguồn gốc dược liệu dựa trên cơ sở khoa học, đề tài “Nghiên cứu tác

dụng hỗ trợ điều trị gút trên thực nghiệm của hạt cần tây (Apium graveolens L., Apiaceae)” được thực hiện với ba mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng hạ acid uric của hạt cần tây trên thực nghiệm

2 Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro và in vivo của hạt

cần tây

3 Đánh giá tác dụng chống viêm của hạt cần tây trên thực nghiệm

1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp acid uric

cid uric là sản phẩm của quá trình thoái giáng các nucleo-protein có chứa nhân purin adenin, guanin trong cơ thể với sự tham gia của các enzym: phosphoribosyl pyrophosphatase (PRPP), nucleoside phosphorylase, xanthin

oxidase (XO) [15] hình1.1

Hình 1.1 Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [15]

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh của gút

Cơ chế bệnh sinh chính của gút là sự tăng acid uric máu Tăng acid uric được định nghĩa là khi nồng độ acid uric máu vượt quá giới hạn hòa tan tối đa của acid uric huyết tương: nam trên 7,0 mg/dL tức trên 420 μmol/L ; nữ trên 6,0 mg/dL (tức trên 360 μmol/L [12] Trong máu, lượng acid uric thường đạt đến mức độ hòa tan nhất định [50] Hàng ngày có khoảng 700mg acid uric được tạo ra bao gồm nội sinh (600mg) và ngoại sinh 100mg Trong đó, 30% bị phân hủy bởi vi khuẩn đường ruột, còn lại 70% được bài tiết qua thận [16] Khi nồng độ acid uric trong huyết thanh cao hơn nồng độ bão hòa, dẫn tới tích lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi Sự lắng đọng của các hạt này tại các vị trí khác nhau sẽ gây nên các tổn thương khác nhau Tại sụn khớp, khi các hạt này vỡ ra, sẽ khởi phát cơn gút cấp; sự lắng đọng của các vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt dịch, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương khớp mạn tính do gút; sự có mặt vi tinh thể urat tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi; và cuối cùng, lắng đọng tại tổ chức

kẽ của thận gây viêm thận kẽ [3]

Như vậy, việc tác động vào các yếu tố tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric sẽ là một trong các cách làm thay đổi nồng độ acid uric máu

1.1.4 Cơ chế gây viêm cấp của tinh thể urat

Trong bệnh gút, phản ứng viêm là nguyên nhân chính gây ra triệu chứng đau dữ dội ở bệnh nhân Các nghiên cứu gần đây đã xác định được cơ chế gây viêm do tinh

thể urat ở bệnh gút Phản ứng viêm chia làm 2 giai đoạn [29], [34]:

- Giai đoạn 1: Sản xuất ra IL-1β interleukin-1β Đầu tiên, bạch cầu đơn nhân trung tính thực bào các tinh thể urat, dẫn tới một loạt các quá trình truyền tín hiệu thông qua các chất truyền tin MyD88 (là protein đáp ứng tế bào tủy biệt hóa sơ cấp 88), NALPT (Nacht, Leucin rich repeat và PYD-containing protein 3) là một loại protein gây viêm, làm hoạt hóa dạng tiền IL-1β thành IL-1β hoạt hóa nhờ enzym caspase-1

- Giai đoạn 2: Khi có tín hiệu của IL-1β, IL-1R và TIR-MyD88 (TIR hay Toll/IL-1 có ở tế bào không nguồn gốc ở tủy xương , MyD88 được hoạt hóa

Do đó mà các chemokin và các chất trung gian gây viêm được giải phóng Đồng thời chính các chất này kích thích sản sinh ra IL-1β, TNF-α tiếp tục gây viêm trầm trọng hơn

Cơ chế gây viêm được mô tả ở hình 1.2

Hình 1.2 Cơ chế gây viêm của tinh thể urat [3]

1.1.5 Thuốc sử dụng trong điều trị gút và tăng acid uric máu

1.1.5.1 Thuốc chống viêm

 NSAIDs

Tác dụng: Giảm đau mức độ nhẹ và trung bình, có tác dụng tốt đối với các loại

đau do viêm Thuốc có tác dụng chống viêm trên hầu hết các loại viêm, không kể nguyên nhân

Cơ chế: Các thuốc này có tác dụng chống viêm do ức chế enzym

cyclooxygenase COX , ngăn cản tổng hợp prostagrandin là chất trung gian hóa học gây viêm, do đó làm giảm quá trình viêm Ngoài ra, thuốc còn ngăn cản quá trình biến đổi protein, do đó làm vững bền màng lysosom và đối kháng với tác dụng của các chất trung gian hóa học như: bradykinin, histamin, serotonin [2] cơ chế được thể hiện ở hình 1.3)

Chỉ định: Điều trị cơn gút cấp tính [2]

Tác dụng không mong muốn: trên tiêu hóa (loét dạ dày), trên máu (chảy máu),

trên thận (viêm thận kẽ) [2]

 Corticoid

Tác dụng: Thuốc có tác dụng chống viêm mạnh, do mọi nguyên nhân cơ học,

miễn dịch và nhiễm khuẩn) Do ức chế phospholipase C nên thuốc làm giảm giải phóng histamin và các chất trung gian hóa học gây dị ứng Đặc biệt, glucocorticoid

ức chế miễn dịch do giảm số lượng tế bào lympho, ức chế chức năng thực bào và sản xuất kháng thể Ngoài ra, thuốc còn có tác dụng trên chuyển hóa (glucid, lipid, protid, chuyển hóa muối nước) [2]

Cơ chế chống viêm: Glucocorticoid ức chế phospholipase A2 thông qua kích

thích tổng hợp lipocortin, làm giảm tổng hợp leukotrien và prostaglandin Ngoài ra thuốc còn có tác dụng ức chế dòng bạch cầu đơn nhân, đa nhân lympho bào đi vào

mô để gây khởi phát viêm [2] cơ chế được thể hiện ở hình 1.3)

Chỉ định: Điều trị gút đã chống chỉ định với NSAIDs và colchicin [17], [31] Tác dụng không mong muốn: Glucocorticoid thường gây loãng xương, loét dạ

dày tá tràng, phù, tăng huyết áp và các rối loạn khác [2]

 Colchicin

Cochicin là alkaloid của cây Cholchicum autumnale được sử dụng cho bệnh

đau khớp từ thế kỉ 16

Tác dụng: Thuốc có tác dụng tốt trong đau do gút, không có tác dụng trong

trường hợp không phải bệnh gút [2]

Cơ chế: Colchicin làm giảm sự di chuyển của bạch cầu, giảm sự tập trung của

bạch cầu hạt ở tổ chức viêm, ức chế thực bào các tinh thể urat và do đó kìm hãm sản xuất lactic, giữ cho pH tại chỗ được bình thường [2], [17]

Chỉ định: Điều trị gút cấp [3]

Tác dụng không mong muốn: Colchicin có tác dụng nhanh, mạnh nhưng

thường gặp buồn nôn, ỉa chảy và diệt tủy xương [31], [38]

Hình 1.3 Cơ chế chống viêm của NSAIDs và glucocorticoid

1.1.5.2 Thuốc giảm tổng hợp acid uric

 Allopurinol

Tác dụng: Thuốc làm giảm nồng độ acid uric máu Ngoài ra, thuốc làm tăng

bài xuất các tiền chất của acid uric qua nước tiểu [2]

Cơ chế: Allopurinol ức chế enzym xanthin oxidase, là enzym có vai trò

chuyển tiền chất hypoxanthin và xanthin thành acid uric, nhờ đó làm giảm nồng độ acid uric máu [2]

Tác dụng và cơ chế: Thuốc có tác dụng hạ nồng độ acid uric máu theo cơ chế

ức chế enzym xanthin oxidase, tương tự allopurinol [29]

Chỉ định: Điều trị gút khi có vùng da đỏ, tổn thương Đặc biệt là dự phòng khi

không có colchicin [38]

Tác dụng không mong muốn: Tác dụng không mong muốn thường gặp nhất

khi sử dụng febuxostat là làm bất thường chức năng gan, tiêu chảy, đau đầu, buồn nôn, phát ban, cơn gút cấp [38]

1.1.5.3 Thuốc gây tăng thải acid uric

 Probenecid

Tác dụng: Thuốc có tác dụng lên sự bài tiết acid uric qua nước tiểu theo cả hai

chiều Ở liều điều trị thuốc làm tăng thải acid uric, ở liều thấp thuốc có tác dụng ngược lại [33]

Cơ chế: Probenecid ức chế cạnh tranh hệ vận chuyển anion - urat gây ức chế

tái hấp thu acid uric, gây tăng thải trừ acid uric ở ống thận [2]

Chỉ định: Điều trị gút mạn [2]

Tác dụng không mong muốn: Probenecid có thể gây sỏi tiết niệu, Vì vậy

thường tránh dùng thuốc cho những bệnh nhân có tiền sử sỏi tiết niệu [21]

 Sulfinpyrazon

Tác dụng và cơ chế: Sulfinpyrazon có cơ chế và tác dụng thải trừ urat tương tự

nhưng hiệu quả cao hơn probenecid Tác dụng của thuốc phụ thuộc vào liều dùng

tương tự probenecid [50]

Chỉ định: Phối hợp với colchicin hoặc NS IDS để dự phòng cơn gút cấp Tác dụng không mong muốn: Có thể gặp đau bụng, buồn nôn, nôn, loét dạ dày

tá tràng hoặc tai biến trên máu giống như phenylbutazon [7]

Ngoài ra, trong nhóm thuốc này còn có: benzbromaron, fenofibrat và losartan

1.1.5.4 Thuốc tiêu acid uric

Trong cơ thể hầu hết các loài động vật có vú đều có enzym uricase, enzym này

có vai trò chuyển urat thành allantoin dễ tan và dễ bài tiết hơn, vì thế chúng có nồng

độ acid urat máu thấp và không bị gút Năm 1957, London và Hudson xác định rằng dùng uricase tinh khiết tiêm tĩnh mạch có tác dụng phân giải acid uric [6]

 Rasburicase

Tác dụng và cơ chế: Thuốc có tác dụng hạ nồng độ urat máu Rasburicase xúc

tác phản ứng oxi hóa của acid uric thành chất chuyển hóa allantoin không hoạt tính, sản phẩm chuyển hóa hòa tan nhiều trong nước hơn acid uric

Chỉ định: FDA gợi ý có thể dùng rasburicase trên người lớn (tuy nhiên có

khuyến cáo hạn chế) Thuốc có thời gian bán thải ngắn, dung nạp kém, tính kháng nguyên cao nên chưa được áp dụng để điều trị gút [7]

 Pegylat uricase

Pegylat uricase là một dạng uricase cải tiến, được gắn thêm chuỗi polyethylen glycol nhằm làm giảm tính kháng nguyên và kéo dài thời gian bán thải của uricase Các thử nghiệm lâm sàng ở giai đoạn I và II cho thấy thuốc có hiệu quả hạ acid uric máu, dung nạp tốt Hiện nay, thuốc vẫn đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng [7]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY CẦN TÂY

1.2.1 Tên gọi

- Tên khoa học: Apium graveolens L họ Cần (Apiaceae) [9], [11], [13]

- Tên nước ngoài: Celery ( nh ; ce’le’ri, prersildes marais, ache des marais

(Pháp) [13]

- Tên thường gọi: cây cần tây, cây cần tàu [9]

1.2.2 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, cao 15-150cm, toàn thân có mùi thơm, sống 1-2 năm Thân mọc thẳng đứng, nhẵn, có nhiều rãnh dọc, phân nhánh nhiều [11], [13] Lá hình thuôn hoặc hình trứng ngược, dài 7-18cm, rộng 3,5-8cm, chia làm 3 thùy hoặc xẻ 3, thùy cuối có hình thoi, kích thước 1,2-2,5 × 0,8-2,5cm, có răng cưa hoặc khía tai bèo Lá phía trên có cuống ngắn, phiến lá hình tam giác rộng, xẻ sâu 3 thùy, thùy cuối có hình trứng [32] Lá ở gốc có cuống, bẹ to rộng, có nhiều sóng, hình tam giác – thuôn hoặc dạng 5 cạnh có gốc cụt, xẻ 3-5 thùy hình tam giác, đầu tù, mép khía răng

to, không lông Cụm hoa dạng tán, rộng 1,5-4cm, mọc đối diện với lá, gồm nhiều tán dài, gắn không đều, các tán ở đầu có cuống dài hơn các tán bên trong và có kích thước 4-15mm [13], [32], tán kép mang 8-12 tán đơn [9], [13], mỗi tán hoa có 7-25 hoa, kích thước 6-9mm theo chiều ngang Hoa phía ngoài có 3-8(-16) cánh hoa mảnh, kích thước 0,5-2,5cm [32] Hoa nhỏ màu trắng hoặc lục nhạt, tràng có cánh khum, bầu nhỏ [13] Quả đôi dạng trứng, hơi dẹt, nhẵn, có cánh lồi chạy dọc thân [13], có 5 cạnh, 2n=22 [9], kích thước 1,3-1,5 × 1-2mm Cuống quả dài 1-1,5mm, quả có kích thước 1,3-1,5 ×1-2mm [32]

Mùa ra hoa và quả từ tháng 4 đến tháng 7 [32]

Hình 1.4 Cây cần tây ( Apium graveolens L.) [11]

1.2.3 Phân bố

Loài Apium graveolens L có nguồn gốc ở bờ biển Đại Tây Dương và Địa

Trung Hải, được trồng lâu đời ở các nước phương Tây [4], thích hợp và phân bố

nhiều ở vùng khí hậu ôn đới Loài Apium graveolens L có 3 thứ sau [13]:

- A.graveolens L var secalium Alef (cần tây cho lá): trồng nhiều ở Trung

Quốc, Việt Nam và các nước Đông Nam Á khác

- A.graveolens L var dulce (Miller) Pers (cần tây cho cuống): trồng nhiều ở

vùng ôn đới ấm của châu Âu hay châu Á (tây Liên bang Nga, Ucraina…

- A.graveolens L var rapaceum (Miller) Gaudin (cần tây cho củ): trồng ở

châu Âu

Nhìn chung, tất cả các loại cần tây đều ưa khí hậu ẩm mát, nhiệt độ trung bình

từ 15 đến 210C (ở Việt Nam và Đông Nam Á [13] Về mùa đông, cây chịu được nhiệt độ dưới 50C trong vài ngày, không chịu được nắng nóng Quần thể cần tây mọc hoang dại ở châu Âu và một vài giống cây trồng ở Trung Quốc có thể chịu được hạn Cây ra hoa, quả nhiều; tái sinh tự nhiên chủ yếu từ quả [5], [13]

Ở Việt Nam, loài A graveolens L thường gọi là cây cần tây Cây mới di

nhập vào nước ta và được trồng rộng rãi ở nhiều nơi để làm rau ăn

1.2.4 Thành phần hóa học của hạt cần tây

Các nghiên cứu về cần tây cho thấy có 89 chất đã được phát hiện có trong hạt cần tây, chủ yếu thuộc 3 nhóm chất flavonoid, tinh dầu và coumarin, ngoài ra còn

Hình 1.5 Khung cấu trúc của các hợp chất flavonoid có trong hạt cần tây

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid có trong hạt cần tây ST

Tác dụng sinh học (nếu có)

TL

TK

Giãn mạch, chống kết tập tiểu cầu,

ức chế men chuyển và chẹn kênh canxi

[36] [37]

1.2.4.2 Tinh dầu

Hạt cần tây chứa 2 - 3% tinh dầu [13] Kết quả định lượng tinh dầu trong hạt cần tây ở một số địa phương cho thấy hạt cần tây ở Hà Nội chứa 0,08% tinh dầu [1], hạt cần tây ở Nam Định chứa 0,88% tinh dầu [1]

Cho đến nay theo các tài liệu đã công bố, bằng phương pháp sắc kí khí và khối phổ đã phát hiện ra được 28 thành phần trong tinh dầu hạt cần tây, trong đó:

- 7 hợp chất phthalid, chiếm khoảng 37,4 - 42,3%

1.2.4.3 Coumarin

Các nghiên cứu về cần tây cho thấy có 22 chất thuộc nhóm coumarin, trong đó

11 chất thuộc nhóm fruocoumarin, 6 chất thuộc nhóm coumarin glycoside và 5 chất thuộc nhóm coumarin đơn giản

1.2.5 Tác dụng sinh học của hạt cần tây

1.2.5.1 Tác dụng chống viêm

Nhiều nghiên cứu gần đây trên động vật thực nghiệm đã chứng minh tác

dụng chống viêm tốt của dịch chiết cần tây Nghiên cứu của Mencherini T và cộng

sự đã chứng minh các flavonoid trong lá cần tây có tác dụng chống viêm trên thực nghiệm [25] Một nghiên cứu khác được công bố cho thấy tác dụng chống viêm tốt của luteolin - một flavonoid có trong cần tây trên thực nghiệm [49] Các nghiên cứu thực hiện trên mô hình gây viêm loét dạ dày cũng cho thấy cần tây cho tác dụng chống viêm tốt

1.2.5.2 Tác dụng hạ acid uric máu

Dịch chiết ether dầu hỏa và dịch chiết methanol từ hạt cần tây có tác dụng hạ acid uric máu Nghiên cứu được thực hiện trên chuột cống trắng mức liều 500 mg/kg Kết quả cho thấy nồng độ acid uric của lô uống dịch chiết ether dầu hỏa và lô uống dịch chiết methanol từ hạt cần tây giảm lần lượt 41% và 38% so với lô chứng tại thời điểm 3 giờ sau khi gây tăng cấp acid uric Tại thời điểm 6 giờ, nồng độ acid uric của lô uống dịch chiết ether dầu hỏa và lô uống dịch chiết methanol từ hạt cần

tây giảm lần lượt 44% và 31% so với lô chứng [14]

1.2.5.3 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2006, một nghiên cứu đã chứng minh rằng dịch chiết rễ và lá cần tây có tác dụng dọn dẹp các gốc tự do và làm giảm cường độ lipoperoxy hóa trong liposome Dịch chiết n-butanol của cần tây cho hiệu quả chống oxy hóa cao nhất [11] Một nghiên cứu công bố năm 2011 cho thấy hợp chất phenolic trong hạt cần tây có tác dụng khử gốc tự do, chống oxy hóa mạnh Đáng lưu ý, trong cần tây có 2 flavonoid là apigenin và kaempferol đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase [45]

1.2.5.4 Tác dụng chống ung thư

Năm polyacetylen trong dịch chiết cần tây được chứng minh có tác dụng gây độc tế bào gồm: falcarinol, falcarindiol, panaxydiol, 8-O-methylfalcarindiol Khả năng này đã được đánh giá bằng xét nghiệm V-PI annexin Falcarinol được chứng minh là hoạt chất có độc tính rõ rệt trên dòng tế bào bạch cầu lympho trong bệnh u lympho cấp Dịch chiết cần tây cũng chứng tỏ tác dụng diệt tế bào ung thư gan [35]

1.2.5.5 Tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết cần tây có tác dụng kháng khuẩn mạnh Theo nghiên cứu của

Magrinya và cộng sự , dịch chiết cần tây có tác dụng kháng Staphylococus carnosus

[24] Theo một nghiên cứu khác, carvacrol và cinnamaldehyd từ cần tây làm bất

hoạt vi khuẩn Salmonella enteric kháng kháng sinh [30] Dịch chiết hạt cần tây có tác dụng chống vi khuẩn Helicobacter pylori, một trong những nguyên nhân gây

loét dạ dày - tá tràng [47]

1.2.5.6 Tác dụng hạ huyết áp

Nghiên cứu in vitro cho thấy, dịch chiết methanol hạt cần tây có tác dụng ức

chế men chuyển angiotensin Tuy nhiên, tác dụng này còn kém xa so với lisinopril [41] Tác dụng hạ huyết áp của hạt cần tây là do hợp chất 3-n-butylphtalid (3nB) có trong tinh dầu hạt cần tây Cơ chế của tác dụng này có thể do sự phong tỏa kênh

Ca2+ thông qua điện áp hoạt động hoặc thụ thể trên kênh Ca2+ [40]

1.2.6 Công dụng của hạt cần tây

Hạt cần tây được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền để chữa thống

phong [8], viêm bàng quang, giúp khử trùng bàng quang và ống dẫn nước tiểu [8], [13]; kích thích tiêu hóa, gây trung tiện, bổ sung vitamin C và bồi bổ cơ thể [13]; chữa các bệnh suyễn, hen phế quản [8]; chữa các bệnh về khớp như thấp khớp, viêm khớp, đau khớp [13] Ngoài ra, trong y học cổ truyền, tinh dầu cần tây được sử dụng trong bệnh phù thũng, đau bàng quang, các trường hợp co thắt cơ trơn

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu

- Cây cần tây có hoa và hạt được thu hái tại xã Hải Nam - Hải Hậu - Nam Định vào tháng 11/2012

cứu đã được xác định tên khoa học là Apium graveolens L., họ Cần ( Apiaceae)

Hạt cần tây được đem phơi khô, bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát

2.1.2 Chuẩn bị dịch chiết dược liệu

Ngâm bột dược liệu đã xay thô với dung môi ethanol 96% ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ Lặp lại 3 lần

Dịch chiết sau 3 lần ngâm được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Loại

bỏ chất béo bằng cách lắc với ether dầu hỏa Sản phẩm thu được được sấy trong tủ sấy chân không đến khi trở thành cao khô

Quy trình chiết cao toàn phần hạt cần tây được thực hiện như hình 2.1

Hình 2.1 Quy trình chiết xuất cao toàn phần hạt cần tây

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, cân nặng từ 18-22g, khỏe mạnh

do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

- Chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, 8 tuần tuổi, cân nặng từ 150g, khỏe mạnh do Học viện Quân y cung cấp

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện

Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.2.2 Hóa chất, thuốc thử

- Allopurinol (Sigma Aldrich)

- cid uric, ≥ 99%, dạng tinh thể, dùng cho nghiên cứu và phát triển (Sigma Aldrich)

- Bộ hóa chất định lƣợng acid uric huyết thanh gồm hóa chất phản ứng và acid uric chuẩn (Teco Diagnostics)

- Carrageenan (Sigma Aldrich)

- Indomethacin, tiêu chuẩn phân tích (Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ƣơng -

Bộ Y tế)

- Hóa chất để pha mẫu dƣợc liệu: dimethyl sulfoxid (Merck)

- Kali oxonat, 97%, dùng cho nghiên cứu và phát triển (Sigma Aldrich)

- Xanthin, ≥ 99% Sigma ldrich

- Xanthine oxidase từ sữa bò (0,8 U/mg protein, 9 mg protein/ml, Sigma Aldrich)

- Các dung môi cho chiết xuất: ethanol, ether dầu hỏa đạt tiêu chuẩn công nghiệp

- Các dung môi, hệ đệm dùng cho phản ứng enzym đạt tiêu chuẩn phân tích

- Các hóa chất, dung môi khác đạt tiêu chuẩn dƣợc dụng

2.2.3 Thiết bị

- Máy sinh hóa TC 84 plus (Teco Diagnostics)

- Máy đo độ phù chân chuột LE 7500

- Máy ly tâm HERMLE Z300

- Máy ly tâm lạnh Sigma 3-18K (Sartorius)

- Thiết bị nghiền đồng thể

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể Biotek, Hoa Kì và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)

- Máy đo pH EUTECH)

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R210

- Cân phân tích AY 220 (SHIMADZU)

- Cân kĩ thuật Presica-BJ610C, TE412 (Sartorius)

- Tủ ấm điều nhiệt Memmert

- Các dụng cụ sử dụng lấy mẫu và xét nghiệm: micropipet và đầu côn tương ứng, dụng cụ thủy tinh, bơm kim tiêm các loại, mao quản, ống nghiệm các loại

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài được thiết kế với các nội dung tiến hành như sau:

- Đánh giá tác dụng hạ acid uric của cây cần tây trên thực nghiệm

- Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro và in vivo

- Đánh giá tác dụng chống viêm của cây cần tây trên thực nghiệm

Thiết kế nội dung nghiên cứu được mô tả ở hình 2.2

Hình 2.2 Thiết kế nghiên cứu

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm

 Thiết kế thí nghiệm

Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp

bằng kali oxonat [6], [48], [26]

Chuột nhắt trắng, đực, trưởng thành được chia ngẫu nhiên thành các lô:

- Lô chứng: uống dung môi

- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol

- Các lô thử: uống cao toàn phần hạt cần tây ở các mức liều thử nghiệm Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3

Tiêm kali oxonat

Uống thuốc

Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên mô

hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

 Thông số đánh giá

- Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm

- Tỷ lệ giảm nồng độ acid huyết thanh của lô thử so với lô chứng

I (%)=

Trong đó :

Cc, Ct: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử

I (%): tỷ lệ giảm acid uric huyết thanh của thử so với chứng trắng