Nghiên cứu tác dụng giải lo âu thực nghiệm của stephania sinica diels và stephania dielsiana y c wu, họ tiết dê menispermaceae

DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần Nguyễn Tiến Vững 3 1.2 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần Lã Đình Mỡi 4 3.1 Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và di

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

**********

KHỔNG TRỌNG QUÂN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU

THỰC NGHIỆM CỦA STEPHANIA SINICA

DIELS VÀ STEPHANIA DIELSIANA Y.C WU,

HỌ TIẾT DÊ MENISPERMACEAE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHỔNG TRỌNG QUÂN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU

THỰC NGHIỆM CỦA STEPHANIA SINICA

DIELS VÀ STEPHANIA DIELSIANA Y.C WU,

HỌ TIẾT DÊ MENISPERMACEAE

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

Bộ môn Dược lực

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới

TS Nguyễn Hoàng Anh, TS Đào Thị Vui, Ths Nguyễn Thu Hằng, Bộ môn

Dược lực, TS Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dược liệu, TS Nguyễn Quốc Huy,

Bộ môn Thực vật, trường ĐH Dược Hà Nội

Là những người thầy, người cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và

giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Đinh Đại Độ, kỹ thuật viên tại bộ môn Dược

lực trường ĐH Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và trực tiếp thực hiện nhiều công

việc xuyên suốt trong quá trình tiến hành đề tài

Nhân đây em cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

Các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược lực đã tạo mọi

điều kiện, giúp đỡ để em có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các bộ môn

trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong quá trình học tập

tại trường

Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia

đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình

học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên Khổng Trọng Quân

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Chi Stephania Lour.: Thành phần hóa học và các tác dụng dược lý tâm thần/thần kinh 3

1.1.1.Thành phần hóa học 3

1.1.2.Hàm lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong các loài bình vôi ở Việt Nam 3

1.1.2.1.Alcaloid toàn phần 3

1.1.2.2.Hàm lượng L-tetrahydropalmatin (Rotundin) 4

1.1.3.Tác dụng dược lý hướng thần kinh của các loài thuộc chi Stephania Lour. .6

1.2 Về hai loài Stephania dielsiana Y.C.Wu và Stephania sinica Diels 9

1.2.1.Đặc điểm thực vật 9

1.2.2.Thành phần hóa học 10

1.2.3.Các nghiên cứu về tác dụng dược lý hướng thần kinh và tâm thần 14

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1.Nguyên liệu 15

2.1.1.Dược liệu 15

2.1.2.Hóa chất và thiết bị 15

2.1.3.Động vật thực nghiệm 16

2.1.4.Chuẩn bị thuốc thử 16

2.2.Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1.Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 17

2.2.2.Nội dung nghiên cứu 17

2.2.3.Điều kiện tiến hành thí nghiệm 18

2.2.4.Liều sử dụng trong nghiên cứu 18

2.2.5.Mô hình gây stress cho chuột bằng phương pháp nuôi cô lập 19

2.2.6.Đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình EPM 19

2.2.7.Đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình ETM 21

2.2.8.Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental .22

2.3.Xử lý số liệu 23

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1.Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần S dielsiana và S sinica 24

3.1.1.Trên mô hình EPM ở chuột không chịu stress 24

3.1.2.Trên mô hình EPM ở chuột chịu stress do cô lập 26

3.1.3.Trên mô hình ETM 28

3.2 Đánh giá tác dụng an thần của dịch chiết nước toàn phần của S dielsiana và S sinica 29

3.2.1.Trên chuột không chịu stress 29

3.2.2.Trên chuột chịu stress do cô lập 30

3.3 Đánh giá tác dụng giải lo âu và an thần của alcaloid toàn phần từ S dielsiana và S sinica 31

3.3.1 Chiết xuất alcaloid từ củ 2 loài Stephania 31

3.3.2.Đánh giá tác dụng giải lo âu của alcaloid toàn phần từ S dielsiana và S sinica 32

3.3.3.Đánh giá tác dụng an thần của alcaloid toàn phần từ 2 loài Stephania 35

3.4.Bàn luận 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Akt Protein kinase B

BDNF Yếu tố kích thích thần kinh đến từ não (Brain-derived

neurotrophic factor) CREB Protein liên kết từng phần đáp ứng với AMP vòng (Cyclic-AMP

response element-binding protein) CRF Yếu tố giải phóng corticotropin (Corticotropin-releasing factor) DZP Diazepam

EPM Chữ thập nâng cao (Elevated plus maze)

ERK Protein chuyển gốc phosphat điều hòa tín hiệu ngoại bào

(Extracellular signal-regulated kinase) ETM Chữ T nâng cao (Elevated T maze)

GABA Gamma amino butyric acid

GAD Rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized anxiety disorder)

IL-1β Interleukin 1 beta

NF-ҡB Yếu tố nhân làm giàu chuỗi nhẹ kappa của tê bào B đã hoạt hóa

(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NMDA N-methyl-D-aspartat

PD Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder)

SPD Stepholidin

THP Tetrahydropalmatin

MeOH Methanol

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Nguyễn Tiến Vững) 3 1.2 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Lã Đình Mỡi) 4

3.1

Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên thời gian

lưu và số lần ra tay mở của chuột không chịu stress trên mô hình

EPM

24

3.2

Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên số lần

vào tay kín và tổng số lần lưu tại tay kín, tay mở của chuột không

chịu stress trên mô hình EPM

25

3.3 Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên số lần và

thời gian lưu tại tay mở của chuột chịu stress trên mô hình EPM 27

3.4

Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên số lần

vào tay kín và tổng số lần lưu tại tay kín, tay mở của chuột chịu

stress trên mô hình EPM

27

3.5

Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và clomipramin trên chuột

không chịu stress thể hiện qua các chỉ tiêu đánh giá trên mô hình

ETM

29

3.6

Tác dụng của alcaloid toàn phần, diazepam và tetrahydropalmatin

trên số lần và thời gian lưu tại tay mở của chuột không chịu stress

trên mô hình EPM

33

3.7

Tác dụng của alcaloid toàn phần, diazepam và tetrahydropalmatin

trên số lần vào tay kín và thời gian lưu tại tay kín, tay mở của chuột

không chịu stress trên mô hình EPM

34

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid toàn phần của 6 loài thuộc chi

Stephania Lour (UV 254 và 365 nm) 6

2.2 Hình ảnh củ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu 15

3.1

Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam (DZP) và

dịch chiết nước toàn phần (DC) của 2 loài Stephania trên chuột

bình thường

30

3.2

Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam (DZP) và

dịch chiết nước toàn phần (DC) của 2 loài Stephania trên chuột chịu

Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam (DZP),

tetrahydropalmatin (THP) và alcaloid toàn phần của 2 loài

Stephania trên chuột bình thường

35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn lo âu (anxiety disorders) là sự lo sợ quá mức trước một tình huống xảy ra, có tính chất vô lý, lặp lại và kéo dài gây ảnh hưởng đến sự thích nghi với cuộc sống của người bệnh Đây là một trong những rối loạn tâm lý có tính phổ biến cao, có xu hướng ngày càng gia tăng, thường kết hợp với nhiều rối loạn khác như mất ngủ, trầm cảm, rối loạn ăn uống, rối loạn hành vi [14] Hiện nay, phương pháp điều trị rối loạn lo âu chủ yếu là phối hợp liệu pháp tâm lý với thuốc giải lo âu (anxiolytics) Các thuốc giải lo âu có nguồn gốc hóa dược chính được sử dụng là các dẫn chất của benzodiazepin, buspiron và các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin hoặc chống trầm cảm 3 vòng [17] Hạn chế lớn nhất của các thuốc có nguồn gốc hóa dược là tác dụng phụ, khả năng lệ thuộc thuốc và phản ứng cai thuốc xảy ra khi dừng điều trị Thêm vào đó, giá thành cao của các thuốc này cũng là vấn đề cần quan tâm khi sử dụng thuốc hàng ngày trong một thời gian dài cho bệnh nhân Vì vậy, sử dụng các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dược liệu hiện được coi là hướng tiếp cận bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hóa dược trong điều trị rối loạn lo âu [47]

Chi Stephania Lour là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Tiết dê

(Menispermaceae) với khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á, châu Phi và châu Úc Trong lĩnh vực dược lý thần kinh và tâm thần, nghiên cứu về các loài trong chi chủ yếu tập trung trên tác dụng chống loạn tâm thần, hướng điều trị Alzheimer, an thần và giải lo âu Nhiều nghiên cứu hóa học

và dược lý đã được thực hiện để làm sáng tỏ các hướng tác dụng trên trong đó nhiều alkaloid có hoạt tính sinh học đã được phân lập và xác định cấu trúc [48]

Tại Việt nam, các loài của chi Stephania Lour được nghiên cứu khá đầy đủ

về hóa học và tác dụng sinh học hướng an thần trên cơ sở chiết tách tetrahydropalmatin và kinh nghiệm sử dụng của nhân dân [6], [16] Hướng nghiên cứu của đề tài tập trung vào đánh giá tác dụng dược lý thần kinh và tâm thần của hai

L-loài Stephania được phát hiện ở Ba vì (Hà nội) và Phong Nha (Quảng Bình) là

Stephania sinica Diels (bình vôi tán ngắn) và Stephania dielsiana Y.C Wu (củ

dòm) [6] Quan sát của Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Quốc Huy cho thấy dịch chiết S

dielsiana có tác dụng giảm hoạt động của chuột và kéo dài thời gian ngủ do

thiopental gấp 3 lần và 8 lần so với nhóm chứng khi dùng liều tương ứng 1,25g/kg

và 2,5g/kg [10] Nghiên cứu ban đầu về hóa học của Đỗ Quyên, Nguyễn Quốc Huy

và cộng sự cũng cho thấy có sự khác biệt về thành phần alcaloid giữa các loài

Stephania, trong khi tỷ lệ L-tetrahydropalmatin ở S sinica là khoảng 2,43% thì ở S dielsiana chỉ là 0,4% [6] Những kết quả này gợi ý cho hướng nghiên cứu sâu hơn

về tác dụng an thần và giải lo âu của S sinica và S dielsiana đồng thời tìm hiểu

xem liệu tác dụng này có phụ thuộc vào sự có mặt của L-tetrahydropalmatin trong dược liệu hay không

Xuất phát từ thực tế đó, đề tài được triển khai với mục tiêu đánh giá tác dụng giải lo âu và an thần thực nghiệm của dịch chiết nước và alcaloid toàn phần của

Stephania sinica Diels và Stephania dielsiana Y.C Wu trên chuột bình thường và

chuột chịu stress do cô lập

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Chi Stephania Lour.: Thành phần hóa học và các tác dụng dược lý tâm

thần/thần kinh

1.1.1 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của chi Stephania Lour gồm có alcaloid, flavonoid, tinh

bột, đường khử, acid malic, enzym oxydase Trong đó alcaloid là thành phần chính

và được quan tâm nhiều nhất [48] Các alcaloid đã phân lập từ các loài trong chi

Stephania Lour có thể xếp vào 9 nhóm: benzylisoquinolin, bisbenzylisoquinolin,

aporphin, proaporphin, protoberberin, morphinan, hasubanan, stephaoxocan và eribidin [6] Trong số này L-tetrahydropalmatin (THP) là alcaloid được nghiên cứu nhiều nhất để phát triển ứng dụng sản xuất thuốc an thần, gây ngủ

1.1.2 Hàm lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong các loài bình vôi ở Việt Nam

1.1.2.1 Alcaloid toàn phần

Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững đã công bố hàm lượng alcaloid toàn phần từ

3 loài bình vôi nghiên cứu như sau :

Bảng 1.1: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Nguyễn Tiến Vững)

Stt Loài Nơi thu hái Hàm lượng alcaloid toàn phần (%)

1 S glabra(Roxb.) Miers Ninh Bình 2,96

2 S kuinanensis H.S.Lo Lạng Sơn 4,41

3 Stephania sp3 Quảng Ninh 2,32

Năm 2000, Lã Đình Mỡi đã khảo sát hàm lượng alcaloid toàn phần trong 5 loài bình vôi nghiên cứu :

Bảng 1.2: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Lã Đình Mỡi)

Stt Loài Nơi thu hái Hàm lượng alcaloid

toàn phần (%)

1 S brachyandra Diels Sapa-Lào Cai 10,8

2 S glabra (Roxb.) Miers Mai Châu-Hòa Bình 3,4

3 S sinica Diels Tam Điệp-Ninh Bình 3,6

4 S kwangsiensis H.S.Lo Cẩm Phả-Quảng Ninh 3,5

5 S hainanensis H.S.Lo Hà Nam, Ninh Bình 2,6

Năm 2003, Vũ Xuân Giang đã định lượng alcaloid toàn phần loài

S.viridiflavens H.S Lo thu hái ở Sơn La là 2,92% (trích theo Nguyễn Quốc Huy

[6]) Năm 2004, Đỗ Phương Loan đã xác định hàm lượng alcaloid toàn phần trong

củ loài S brachyandra Diels là 10,38%

1.1.2.2 Hàm lượng L-tetrahydropalmatin (Rotundin)

Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững đã xác định hàm lượng THP từ 3 loài bình vôi nghiên cứu :

Bảng 1.3: Kết quả định lượng THP (Nguyễn Tiến Vững)

Bảng 1.4: Kết quả định lượng THP (Lã Đình Mỡi)

Stt Loài Hàm lượng

THP (%)

Hàm lượng THP/alcaloid toàn phần (%)

Vũ Xuân Giang đã xác định hàm lượng THP và palmatin trong loài S

viridiflavens H.S Lo thu hái ở Sơn La là: 0,63% và 0,32% Phạm Thị Duyên (2004)

đã nghiên cứu định lượng THP bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

cho thấy hàm lượng THP trong loài S dielsiana (thu hái ở Ba Vì-Hà Tây), loài S

viridaflavens (thu hái ở Sơn La) và Stephania sp (trong viên Balok) lần lượt là:

0,40%; 0,62% và 1,63% Đỗ Phương Loan đã xác định hàm lượng THP của loài S

brachyandra Diels ở củ là 3,7% và ở thân là 0,67%

Năm 2010, Nguyễn Quốc Huy tiến hành định lượng THP trong 3 loài nghiên cứu [6]:

Bảng 1.5: Kết quả định lượng THP (Nguyễn Quốc Huy)

Stt Loài Hàm lượng THP (%)

1 S brachyandra Diels 3,69

2 S dielsiana Y C Wu 0,40

3 S sinica Diels 2,43

Có thể thấy rõ có sự khác biệt rất lớn về hàm lượng alcaloid và THP giữa các

loài chi Stephania Lour phát hiện tại Việt Nam Kết quả khảo sát trên sắc ký lớp

mỏng của Đỗ Quyên và Nguyễn Quốc Huy cũng thể hiện rõ điều này

Hình1.1.Sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid toàn phần của 6 loài thuộc chi Stephania

Lour (UV 254 và 365 nm)

BR: S brachyandra, GL: S glabra, KW: S kwangsiensis, SI: S sinica; SP1: Stephania sp.1 (Mẫu Hòa Bình), DI: S dielsiana, R: L-tetrahydropalmatin

Dung môi triển khai sắc ký: Cloroform : Aceton : NH4OH [8 : 2 : 0,1]

1.1.3 Tác dụng dược lý hướng thần kinh của các loài thuộc chi Stephania Lour

Trong lĩnh vực dược lý thần kinh và tâm thần, nghiên cứu về các loài trong

chi Stephania chủ yếu tập trung trên tác dụng chống rối loạn tâm thần, tác dụng

hướng điều trị Alzheimer và tác dụng an thần và giải lo âu

(-)- Stepholidine (SPD) phân lập từ S intermedia H.S Lo đã được chứng

minh có hoạt tính đối kháng receptor D2 của dopamin ở vùng bụng mái (ventral tegmental area) và nhân vòng (nucleus accumbens), kích thích hoạt động của tyrosinhydroxylase, điều hòa giải phóng dopamin và có hiệu quả chống loạn thần trên mô hình gây tâm thần phân liệt ở động vật thực nghiệm [52] Trên lâm sàng, giúp cải thiện cả triệu chứng âm tính và dương tính ở bệnh nhân tâm thần phân liệt đồng thời ít gây tác dụng ngoại tháp [52] Bi-acetylated l-stepholidine, một dẫn chất

có sinh khả dụng tốt hơn SPD, với đặc tính chủ vận trên receptor D1 và receptor

5-HT1A,đối kháng trên receptor D2, làm giảm kích thích và cải thiện chức năng vận động, nhận thức ở chuột cống trong mô hình gây tâm thần phân liệt thực nghiệm bởi phencyclidin [25]

Tetrahydropalmatin (THP), một alcaloid được tìm thấy ở hầu hết các loài

thuộc chi Stephania, có ái lực gắn cao với receptor α1A và α2A-adrenergic, D1, D2 và

D3 của dopamin, receptor 5-HT1A, 5-HT1D, 5-HT4 và 5-HT7 của serotonin [34] Tác dụng đối kháng của THP trên receptor dopamin giảm dần theo thứ tự D1, D2, D3 THP có tác dụng đối kháng receptor α1-adrenergic, chủ vận trên receptor α2-adrenergic và là chất điều hòa dị lập thể dương tính của receptor GABAA [26], [51] THP đối kháng tác dụng hoạt hóa các receptor serotonin, noradrenalin và dopamin của cocain, đồng thời tác dụng trên receptor 5-HT1A và α-adrenergic giúp giảm nhẹ tác dụng ngoại tháp [37] THP có tác dụng giảm các triệu chứng trong quá trình cai nghiện cocain và heroin trên thực nghiệm ở chuột cống [53] THP ức chế sự phụ thuộc tâm thần gây ra bởi oxycodon thông qua ảnh hưởng tới sự phosphoryl hóa CREB (cyclic-AMP response element-binding protein) và ERK (Extracellular signal-regulated kinases) ở nhân vòng và hồi hải mã (hippocampus) ở chuột cống [35]

Theo hướng tiếp cận sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế acetylcholinesterase có tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer, dịch chiết củ loài

S suberosa Forman nồng độ 0,1 mg/ml ức chế trên 90% hoạt tính

actetylcholinesterase [29] Ba alkaloid protoberberin (stepharanine, cyclanoline và

N-methyl stepholidine) phân lập từ loài S venosa (Blume) Spreng có hoạt tính ức

chế mạnh acetylcholinesterase (tiềm năng trong điều trị sa sút trí tuệ và bệnh Alzheimer) với giá trị IC50 tương ứng là 14,1; 9, 23 và 31,3 M [28] Tetrandrin

được chiết xuất và phân lập từ loài S tetrandrae S Moore ức chế hoạt động của

NF-κB, giảm đáng kể sự tạo thành các yếu tố gây viêm IL-1β và TNF-α, bảo vệ tế bào thần kinh khỏi độc tính gây ra bởi amyloid-β protein, cải thiện tình trạng sa sút trí nhớ và giảm khả năng học nhớ trên chuột cống (mô hình mê cung nước Morris),

tạo tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer [27] Nhờ đặc tính chủ vận trên receptor D1 và đối kháng trên receptor D3, SPD làm giảm nhẹ rối loạn vận động ở bệnh nhân mắc bệnh Parkinson [52]

Dịch chiết nước của 3 loài S baicalensis, S tetrandra, S miltiorrhiza ức chế

receptor N-methyl-D-aspartat (NMDA), có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh tạo tiềm năng trong điều trị đột quỵ Nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng của một số alcaloid cho thấy stepholidin (SPD) thông qua con đường tín hiệu PI3-K/Akt làm tăng nồng Akt đã phosphoryl hóa (pAkt), ức chế apoptosis, bảo

vệ tế bào thần kinh khi phơi nhiễm với H2O2 [55]

Tetrandrin, một alkaloid nhóm bisbenzyllisoquinoline phân lập từ S

tetrandrae S Moore cũng đã được chứng minh có tác dụng an thần thể hiện trên

khả năng kéo dài thời gian ngủ do pentobarbital trên chuột nhắt với cơ chế thông qua ảnh hưởng trên dẫn truyền serotonin ở hệ thần kinh trung ương [58] Dịch chiết

S venosa liều 20mg/kg dùng đường uống tăng số lần ra tay mở, tăng thời gian lưu

tại tay mở trên chuột cống, thể hiện tác dụng giải lo âu Mức liều này không ảnh hưởng tới thời gian bất động trong thí nghiệm chuột bơi cưỡng bức liên quan đến tác dụng chống trầm cảm [40] Tetrandrin đảo ngược tác dụng làm giảm hàm lượng serotonin và noradrenalin ở hồi hải mã gây ra bởi reserpin, thể hiện hoạt tính chống trầm cảm thông qua ảnh hưởng trên dẫn truyền các amin giao cảm và tăng nồng độ BDNF (brain-derived neurotrophic factor) Hoạt tính chống trầm cảm của tetrandrin được thể hiện thông qua việc làm giảm thời gian bất động của chuột nhắt

ở 2 mô hình thí nghiệm chuột bơi cưỡng bức và test treo đuôi [23]

Tác dụng ức chế thần kinh trung ương của dl-tetrahydropalmatin (THP), một

alkaloid được phân lập từ nhiều loài trong chi Stephania đã được chứng minh trên

các mô hình dược lý thực nghiệm Ở liều thấp (0,5 – 10 mg/kg), THP có tác dụng giải lo âu rõ rệt, tác dụng an thần và giãn cơ chỉ thể hiện ở liều cao (50 mg/kg) Tác dụng giải lo âu của tetrahydropalmatin bị đối kháng bởi flumazenil, một chất cạnh tranh vị trí gắn của benzodiazepin trên GABAA receptor, chứng tỏ cơ chế giải lo âu

của THP thông qua, ít nhất một phần, tương tác với vị trí gắn của benzodiazepin trên receptor GABAA [26], [32] Nguyễn Tiến Vững đã tiến hành thăm dò tác dụng của l-THP trên điện não thỏ Tất cả các thỏ được tiến hành đặt điện cực vào vùng cảm giác, vận động và thể lưới thân não Sau khi cho thỏ uống l-THP với liều 100mg/kg thể trọng trong 7 ngày, thành phần các sóng điện não trong vỏ não vùng cảm giác-vận động và trong thể lưới thân vỏ não có những biến động rõ Sự tăng thành phần sóng chậm delta và giảm thành phần sóng nhanh beta chứng tỏ rằng l-THP có tác dụng tăng cường ức chế tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại não và thể lưới thân não [16] Phạm Duy Mai và cộng sự cũng đã nghiên cứu tác dụng an thần của THP, kết quả cho thấy gindarin hydroclorid (l-THP hydroclorid) mức liều 30mg/kg và 100mg/kg có tác dụng kéo dài thời gian ngủ gấp do thiopental gấp 1.5 lần so với nhóm chứng (trích theo Nguyễn Quốc Huy [6]) Cũng theo Nguyễn Tiến Vững, l-THP liều 40mg/kg kéo dài thời gian ngủ do pentobarbital gấp 8 lần so với nhóm chứng [16]

1.2 Về hai loài Stephania dielsiana Y.C.Wu và Stephania sinica Diels

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Stephania dielsiana Y.C.Wu.: Tên thường dùng: Củ dòm Tên khác: Bình

vôi nhựa tím, cà tòm (Tày, Tuyên Quang), củ gà ấp Phân bố: Lào Cai, Yên Bái,

Bắc Cạn, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Phú Thọ, Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh Dây leo nhỏ, sống nhiều năm Rễ củ to Thân leo cuốn dài khoảng 3m Thân non màu tím hồng nhạt Ngọn non, cuống lá và cuống cụm hoa có màu tím hồng Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực do 3-5 xim nhỏ hợp thành xim tán kép Hoa nhỏ, có cuống ngắn; đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, cánh hoa 3, hình quạt tròn, màu vàng cam Cột nhị ngắn, bao phấn 6, dính thành đĩa 6 ô Cụm hoa cái gồm 7-8 đầu nhỏ, cuống rất ngắn, xếp thành dạng đầu Hoa nhỏ; đài 1, màu tím hồng; cánh hoa 2, hình quạt tròn, màu vàng cam và có các vân tím; bầu hình trứng, đầu nhụy có 4-5 thùy dạng dùi Quả hình trứng đảo, hơi dẹt Hạt hình trứng ngược cụt đầu, có lỗ thủng ở giữa, trên lưng hạt có 4 hàng gai nhọn, cong [6]

Stephania sinica Diels.: Tên đồng nghĩa: Stephania rotunda Lour Tên thường dùng: Bình vôi, bình vôi Trung Quốc Tên khác: Củ một Trung Quốc, dây

lõi tiền bắc Phân bố: Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tây, Hòa Bình, Hà Nam, Ninh

Bình tới Bà Rịa- Vũng Tàu Dây leo cuốn, thân có rãnh dọc Rễ củ to, mọc đơn độc hoặc thành đám Lá có phiến hình lọng, không lông, mặt dưới màu nhạt, cuống dài đến 30cm Cụm hoa đực, xim tán kép Hoa đực: đài 6, cánh hoa 3 Cụm hoa cái dạng đầu Hoa cái: đài 1, cánh 2 Cụm quả hình cầu Hạt hình móng ngựa, dọc theo chiều lưng có 4 hàng gờ [6]

1.2.2 Thành phần hóa học

Theo Nguyễn Quốc Huy, trong củ 2 loài bình vôi nghiên cứu đều chứa alcaloid, tinh bột, đường khử tự do, acid hữu cơ, trong đó alcaloid là thành phần chính [6]

Hàm lượng alcaloid toàn phần là 3,6% [12] với S sinica và biến thiên từ 2,68% đến 4,85% với S dielsiana tùy thuộc vào tuổi của cây [7] Trong khi tỷ lệ L- tetrahydropalmatin ở S sinica là 2,43±0,04% thì ở S dielsiana chỉ là 0,40±0,01% [6]

Hiện đã phân lập được 5 alcaloid từ loài S.sinica, bao gồm:

l-tetrahydropalmatin (1) , runanin (2), cepharanthin (3), corydalmin (4) và sinomenin (5) [6], [9], [39]

H 3

H3CO

H3CO

CH3H

2 3

N-CH3

5

Với S.dielsiana hiện có 15 alcaloid đã được phân lập từ củ của loài này, bao

gồm : dehydrostesakin (6), oxocrebanin (7), 1,2 – methylen-dioxy- 8 – methoxy- 7 – oxodibenzoquinolin (8), l-tetrahydropalmatin, oxostephanin (9), dehydrocrebanin (10), ayuthianin (11), cephamorphinanin (12), aknadinin (13), liriodenin (14), (-) corydalmin, nor-canelillin (15), sinomenin, stephanin (16), dehydrostephanin (17), crebanin (18) [6], [11], [21], [56]

O O

CH3OCH3

CH3

O

O

10 11

O H

OCH3O

1.2.3 Các nghiên cứu về tác dụng dược lý hướng thần kinh và tâm thần

Tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Pubmed/Medline với các từ khóa Stephania

sinica Diels và Stephania dielsiana Y.C Wu chưa tìm thấy bất cứ công bố nào về

tác dụng sinh học liên quan đến tác dụng an thần và giải lo âu của hai loài công bố bởi các tác giả nước ngoài

Trong nước, Nguyễn Quốc Huy và cộng sự đã xác định được liều LD50 của

củ loài S dielsiana là 22,2 g/kg và thử tác dụng chống viêm và giảm đau thực

nghiệm của loài này [8] Theo đó, cả 2 mức liều 2,5 g/kg và 5 g/kg đều không có tác dụng giảm đau theo cơ chế trung ương theo phương pháp gây đau bằng mâm nóng Theo hướng tiếp cận sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế acetylcholinesterase có tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer, Đỗ Quyên và cộng sự đã phát hiện dịch

chiết methanol của Stephania sinica có tác dụng ức chế mạnh nhất enzym này (hoạt

độ ức chế 85% ở nồng độ 250 g/ml) đồng thời phân lập được 2 alkaloid là tetrahydropalmatin và sinomenin trong phân đoạn có tác dụng [13] Quan sát ban đầu của Phạm Thanh Kỳ và Nguyễn Quốc Huy cho thấy từ mức liều 2,5 g/kg dịch

l-chiết dược liệu S dielsiana đã quan sát thấy sự giảm hoạt động của chuột Dịch

chiết dược liệu có tác dụng kéo dài thời gian ngủ do thiopental gấp 3 lần và 8 lần so với nhóm chứng khi dùng liều tương ứng 1,25 g/kg và 2,5 g/kg [10]

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Dược liệu

Củ của loài bình vôi Stephania dielsiana Y.C.Wu., họ Tiết dê (Menispermaceae) thu hái tại Ba Vì, Hà Nội và củ của loài bình vôi Stephania

sinica Diels., họ Tiết dê (Menispermaceae) thu hái tại vườn quốc gia Phong Nha-Kẻ

Bàng, Quảng Bình Mẫu dược liệu được Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội định tên khoa học và lưu giữ tiêu bản tại phòng tiêu bản của Bộ môn Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi và sấy khô

Hình 2.1 Hình ảnh củ loài S sinica Hình 2.2 Hình ảnh củ loài S dielsiana

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Diazepam (biệt dược Seduxen của Gedeon Richter, Hungari), tetrahydropalmatin (Rotundin) chuẩn phân tích của công ty CP Tâm Hiếu Đức (98,4%), clomipramin (biệt dược Clomidep 25 mg của Công ty Sun Pharmaceutical Industries, Ấn độ), thiopental natri của Rotexmedica (Đức) do công ty cổ phần Dược phẩm TW2 phân phối

Dung dịch NaCl 0,9%, CMC 0,5%, NH4OH bão hòa, cloroform, thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendorf

Bình chiết Soxhlet, Bộ môn Dược liệu , trường ĐH Dược Hà Nội

Bơm, kim tiêm nhựa, đồng hồ bấm giây, cân phân tích, cân kỹ thuật

Cốc có mỏ 100, 250 ml, ống đong 50, 100 ml, chày, cối và một số dụng cụ dùng trong chăn nuôi và pha chế của bộ môn Dược lực, trường ĐH Dược Hà Nội

2.1.3 Động vật thực nghiệm

+ Chuột nhắt trắng giống đực, chủng Swiss albino khỏe mạnh, khối lượng

trung bình 18-22 g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương

+ Chuột cống trắng cả 2 giống, chủng Wistar, khối lượng 200-250 g do Học

viện Quân Y cung cấp Chuột được chia lô ngẫu nhiên 8-10 con/lô, nuôi trong điều

kiện nhiệt độ 24±1oC, ánh sáng tự nhiên, được nuôi bằng thức ăn chuẩn, uống nước

cô cách thủy tới cắn, hòa tan hoàn toàn cắn trong dung dịch acid sulfuric 5N (TT) Lọc qua giấy lọc vào bình gạn Kiềm hóa dịch lọc bằng amoniac đậm đặc (TT) đến

pH 10 Chiết bằng cloroform 4 lần Gộp dịch chiết cloroform, bốc hơi cách thủy đến cắn khô

+ Dịch chiết toàn phần trong nước thu được bằng phương pháp sắc với dung môi là nước, bay hơi dung môi đến dạng cao lỏng 1:1

+ Dạng hỗn dịch: phân tán diazepam, rotundin, cắn alcaloid trong CMC 0,5% theo tỷ lệ thích hợp rồi pha loãng bằng nước cất để đạt nồng độ mong muốn

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Thiết kế 4 đợt thí nghiệm với các nội dung sau: đánh giá tác dụng giải lo âu (mô hình chữ thập nâng cao, elevated plus maze, EPM) và an thần (tăng cường thời gian ngủ do thiopental) trên chuột bình thường của dịch chiết toàn phần với dung

môi là nước của 2 loài Stephania ở các mức liều khác nhau có đối chiếu với tác

dụng của diazepam (đợt 1) Tác dụng giải lo âu của dịch chiết toàn phần sau đó được đánh giá sâu hơn trên chuột chịu stress do cô lập (mô hình EPM) (đợt 2) và trên rối loạn lo âu lan tỏa và rối loạn hoảng sợ trên chuột bình thường (mô hình chữ

T nâng cao, elavated T maze, ETM) (đợt 3) Cuối cùng, đánh giá tác dụng an thần (tăng cường thời gian ngủ do thiopental) và giải lo âu (mô hình EPM) của alcaloid

toàn phần từ 2 loài Stephania có đối chiếu với tác dụng của tetrahydropalmatin trên

chuột bình thường (đợt 4)

Củ của 2 loài Stephania sinica và Stephania dielsiana

Dịch chiết nước toàn phần Alcaloid toàn phần

An thần, chuột không chịu stress

Giải lo âu, chuột

không chịu

stress, EPM

Giải lo âu, chuột chịu stress, EPM

Giải lo

âu, chuột không chịu stress, EPM

An thần, chuột không chịu stress

2.2.3 Điều kiện tiến hành thí nghiệm

Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 8h-17h Với mô hình EPM, chuột nhắt trắng được uống thuốc trong 5 ngày liên tục và tiến hành các thí nghiệm vào ngày thứ 5, sau khi cho chuột uống thuốc 60 phút Với mô hình ETM, chuột cống trắng được uống thuốc liên tục trong 21 ngày Vào ngày thứ 20, chuột được cho tiếp xúc trước với mô hình bằng cách cho di chuyển tự do trên tay mở trong 30 phút Tiến hành thí nghiệm vào ngày thứ 21 sau khi cho chuột uống thuốc 60 phút Cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng hai bóng đèn 60W

2.2.4 Liều sử dụng trong nghiên cứu

Trong thí nghiệm thăm dò liều (đợt 1), sử dụng 4 mức liều của dịch chiết

toàn phần của 2 loài Stephania là 30 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg và 1000 mg/kg

tính theo dược liệu khô Các thí nghiệm sau (đợt 2 và đợt 3) sử dụng mức liều có hiệu quả đã được xác định trong đợt 1 Liều của các alcaloid toàn phần (đợt 4) được qui đổi theo liều tương đương với liều của dịch chiết toàn phần trong nước có tác dụng Liều của chất đối chiếu diazepam được chọn ở mức 2 mg/kg thể trọng chuột theo nghiên cứu của Dương Phước An và cộng sự [1], mức liều này phù hợp với mức liều của diazepam dùng để điều trị lo âu trên người trưởng thành dùng đường uống (4 - 15 mg/ngày) [4], quy đổi ra liều của chuột nhắt trắng Mức liều của chứng dương clomipramin được sử dụng trong nghiên cứu là 25 mg/kg, sử dụng dài ngày (21 ngày) theo nghiên cứu của Poltronieri và cộng sự [44] Mức liều này phù hợp theo mức liều quy đổi từ mức liều dùng trên người để điều trị rối loạn hoảng sợ [4] sang liều trên chuột cống Mức liều 1 mg/kg của tetrahydropalmatin được lựa chọn

là mức liều thấp nhất thể hiện tác dụng giải lo âu rõ rệt trong nghiên cứu của Leung

WC và cộng sự [32] Các thuốc thử được phân tán trong CMC 0,5% để tạo hỗn dịch cho chuột uống

2.2.5 Mô hình gây stress cho chuột bằng phương pháp nuôi cô lập

Mô hình gây stress bằng phương pháp nuôi cô lập được triển khai theo mô tả

của Ojima và cộng sự [41] Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, giống đực chủng Swiss

albino 4 tuần tuổi nhận về được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 5

ngày, sau đó gây stress cô lập cho chuột bằng cách nuôi tách riêng 1con/lồng Lô bầy đàn được nuôi song song 10-15 con/lồng trong cùng thời gian với lô chuột được nuôi cô lập Chuột được cho ăn thức ăn chuẩn, uống nước tự do Các thí nghiệm được tiến hành sau 5 tuần gây stress

Hình 2.3 Hình ảnh chuột nuôi cô lập để gây stress

2.2.6 Đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình EPM

Mô hình chữ thập nâng cao theo mô tả của Lister [33]

Hình 2.4 Mô hình chữ thập nâng cao

Dụng cụ thí nghiệm

Dụng cụ bằng gỗ gồm 2 tay kín kích thước 30 x 5 x 15cm (dài x rộng x cao),

2 tay mở kích thước 30 x 5 x 0,2 cm, 2 tay kín và mở đặt vuông góc với nhau và đặt cách nền nhà 60 cm tạo thành hình chữ thập, cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng một bóng đèn 60W

5 phút Chuột được coi là ở trong 1 cánh tay khi cả 4 chân đều nằm trong cánh tay

đó Sau khi tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng khăn tẩm cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi Chỉ tiêu đánh giá: ghi nhận thời gian lưu lại ở tay mở, số lần ra vào các vùng cánh tay (đóng và/hoặc mở) của chuột