Nghiên cứu phân loại các loài trong chi gymnema r BR thu ở việt nam sử dụng vân tay hóa học HPTLC

Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết một số loài trong chi Gymnema R.Br.. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt Bảng 1.2 Một số tá

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC TÚ

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI

TRONG CHI GYMNEMA R.BR THU Ở

VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA

HỌC HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC TÚ

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI CÁC LOÀI

TRONG CHI GYMNEMA R.BR THU Ở

VIỆT NAM SỬ DỤNG VÂN TAY HÓA

Lời cảm ơn

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS Phạm Hà Thanh Tùng Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và dìu dắt em trong quá trình làm Nghiên cứu khoa học và làm Khóa luận tốt nghiệp Nhờ có sự dìu dắt của Thầy mà

em đã trưởng thành lên từng ngày, học được nhiều điều bổ ích và hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Trần Văn Ơn và TS Hoàng Quỳnh Hoa Thầy cô đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình làm khóa luận và cho

em những lời khuyên bổ ích trong học tập và nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô trong bộ môn Thực vật Các Thầy Cô đã tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp này

và Thầy Cô luôn là tấm gương sáng để em noi theo và học tập

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Chu Thị Thoa và các chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn

Tôi cũng xin gửi tới các bạn cùng làm Nghiên cứu và Khóa luận tại Bộ môn lời cảm ơn chân thành vì những giúp đỡ chân tình trong quá trình làm thực nghiệm

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ông bà, bố mẹ và xin gửi lời cảm ơn tới em trai đã giúp đỡ và động viên tinh thần con trong suốt những năm tháng học Đại học

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Nguyễn Ngọc Tú

chromatography)

16

2.2.3 Tiến hành phân tích hóa học một số mẫu trong chi Gymnema

R.Br

20

2.3.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong các loài nghiên cứu 20

2.3.2 Xây dựng quy trình phân tích định tính bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng

27

2.3.3 Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết một số

loài trong chi Gymnema R.Br

3.3 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH CÁC DỊCH CHIẾT TOÀN PHẦN

VÀ PHÂN ĐOẠN THEO QUY TRÌNH ĐỀ XuẤT

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CHDCND Cộng hòa dân chủ nhân dân

HPTLC High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao)

TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages

UV Ultraviolet light (ánh sáng tử ngoại)

VIS Visible spectrum (ánh sáng trắng)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục các loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt

Bảng 1.2 Một số tác dụng sinh học đã được công bố của các

Bảng 1.4 Một số hệ dung môi dùng trong phân tích TLC 11 Bảng 2.1 Danh mục mẫu được phân tích và mã hiệu 18 Bảng 2.2 Tóm tắt các phản ứng định tính các nhóm chất trong

Bảng 3.1 Kết quả các phản ứng định tính thành phần hóa học

Bảng 3.2 Kết quả khối lượng cắn thu được khi chiết xuất bằng

Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả định tính saponin và flavonoid trong

Bảng 3.4 Giá trị Rf của các vạch đặc trưng chi Gymnema R.Br 37 Bảng 3.5 Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ

Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult 5

Hình 1.3 Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không

Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết NL, NK, HL với hệ dung môi

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu DM với hệ dung môi F.11 và S.2 hiện

Hình 3.3 Quy trình phân tích định tính các phân đoạn dịch

Hình 3.4 Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân

Hình 3.5 Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần và phân

Hình 3.6 Sự khác biệt giữa các mẫu của loài Gymnema

Hình 3.7 Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema

Hình 3.8 Sự khác nhau giữa các mẫu của loài Gymnema

Hình 3.9 Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) đã được sử dụng từ hơn 2.000 năm nay để điều

trị Đái tháo đường [41], [43] Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu

đã được tiến hành để chứng minh tác dụng sinh học của cây và xác định hoạt chất chính trong cây, đó là acid gymnemic [36], [38] Một hướng nghiên cứu mới đang được các nhà khoa học quan tâm áp dụng là tìm kiếm và sàng lọc tác dụng điều trị

đái tháo đường tương tự Dây thìa canh từ các loài khác trong cùng chi Gymnema

R.Br Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các loài cùng một bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau [3] Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh được tác

dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài Gymnema montanum Hook.f [15], Gymnema inodorum (Lour.) Decnc [34], [33], Gymnema yunnanense Tsiang [44]…

Cho đến nay, các nghiên cứu trong nước được tập trung thực hiện trên 2 loài là

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult [7] và Gymnema latifolium Wallich ex

Wight [3], [11] Trong các nghiên cứu này, tác dụng hạ đường huyết đã bước đầu được chứng minh trên các mẫu thu hái ở trong nước Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào được thực hiện một các hệ thống về sự tương đồng trong thành phần hóa học

của các loài trong chi Gymnema R.Br

Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu phân loại các loài trong chi

Gymnema R.Br thu ở Việt Nam sử dụng vân tay hóa học HPTLC” được thực hiện

với các mục tiêu sau:

- Xây dựng quy trình định tính các thành phần hóa học một số loài thuộc

chi Gymnema R.Br bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

- Xác định sự tương đồng về thành phần hóa học của một số loài trong chi

Gymnema R.Br và xây dựng cây phân loại thực vật chi dựa trên phân

tích định tính thành phần hóa học

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1.Đặc điểm thực vật

1.1.1.1.Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009, Chi Gymnema

R.Br thuộc Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) có vị trí phân loại như sau [39]:

Bảng 1.1 Danh mục các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam theo Pham

Hoàng Hộ (2000) [8]

1 Gymnema acuminatum (Roxb.) Wall Lõa ty nhọn

2 Gymnema albiflorum Cost Lõa ty hoa trắng

3 Gymnema inodora (Lour.) Decne Lõa ty không mùi

4 Gymnema latifolia Wall ex Wight Lõa ty lá rộng, Dây thìa canh lá

Dây thìa canh gân mạng

7 Gymnema tingens (Roxb.) Spreng Rau mỏ, Lõa ty nhuộm

Tuy nhiên, theo tài liệu được công bố mới nhất về họ Thiên lý ở Việt Nam

của Trần Thế Bách (2007), có 5 loài thuộc chi Gymnema R.Br phân bố ở Việt Nam

Đó là: Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst và Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult [2]

1.1.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố:

Đặc điểm thực vật của chi Gymnema R.Br: Cây leo, không có rễ phụ trên

thân Lá mọc đối, không nạc Cụm hoa xim, dạng tán đến chùm Hoa nhỏ Thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến Tràng hình bánh xe; thùy tràng không gập trong nụ, vặn, phủ nhau phải Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ dính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh; cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên; chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy Cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [4], [2], [8]

Phân bố ở Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonesia Ở Việt Nam, các

loài thuộc chi Gymnema R.Br phân bố ở nhiều vùng miền trên cả nước, từ Hải

Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Bắc Giang, Ninh Bình đến Thanh Hóa, Tây Nguyên, Tây Ninh [4]

1.1.2.Thành phần hóa học

Cho đến nay, các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học được tập trung vào

loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult với các nhóm chất triterpene

saponin thuộc 2 nhóm oleane và dammarane Saponin khung Oleane có các acid gymnemic và gymnemasaponins, trong khi đó saponin khung dammarane là các gymnemasides Trong lá còn xác định có resine, albumin, chlorophyll, carbonhydrates, acid tartric, acid formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid inositole, acid hữu cơ (5.5%), parabin, calci oxalate (7.3%), lignin (4.8%), cellulose (22%) [36], [35]

Lá Gymnema latifolium Wall ex Wight bằng các phản ứng định tính thường

quy được xác định là có chứa các nhóm chất sau: saponin, tanin, flavonoid, acid amin, đường khử và coumarin [7]

Thành phần tác dụng chính được xác định là acid gymnemic, là tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid [23], [20], [36] Các acid gymmenic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylroyl,…) của deacylgymnemic acid (DAGA) DAGA tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-betaglucoronide của gymemagenin [27] Cấu trúc của Gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được minh họa trong Hình 1.1 [36], [38]

Thành phần thứ hai được quan tâm nghiên cứu liên quan đến cơ chế hạ đường huyết là Gurmarin (Hình 1.2), một polypeptid có khả năng làm mất cảm giác

ngọt mà không ảnh hưởng tới các vị giác khác, được phân lập từ lá Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult [25], [32]

Hình 1.1a Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre

(Retz.) R Br ex Schult

Hình 1.2 Cấu trúc của Gurmarin Hình 1.1b.Cấu trúc của các acid gymnemic phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [37]

1.1.3.Tác dụng sinh học

Cho đến nay, các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh chủ yếu được thực

hiện trên loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult và đã được công bố Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cũng được tiến hành trên các loài khác như Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight và Gymnema yunnanense Tsiang (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số tác dụng sinh học đã được công bố của các loài trong chi

Gymnema inodorum (Lour.) Decne Ức chế hấp thu glucose [33], [34]

Gymnema latifolium Wall ex Wight Hạ đường huyết [7]

Gymnema yunnanense Tsiang Hạ đường huyết [44],

1.1.4. Một số kết quả nghiên cứu đã tiến hành ở Việt Nam

Năm 2007, Đỗ Anh Vũ công bố một số kết quả nghiên cứu sau [14]:

₋ Khẳng định tên khoa học của cây Dây thìa canh là Gymnema sylvestre (Retz.)

R Br ex Schult., Họ Thiên lý (Asclepidiaceae)

₋ Khẳng định cây Dây thìa canh ở Việt nam cũng có những tác dụng hạ đường huyết tương tự như những nghiên cứu trước đó đã được thực hiện trên thế giới

Năm 2008, Trương Thị Tâm đã công bố các kết quả nghiên cứu sau [12]:

₋ Xác định trong lá Dây thìa canh có saponin, flavonoid, đường khử, acid hữu

cơ và acid amin

₋ Dịch chiết toàn phần, dịch chiết nước và phân đoạn dịch chiết ethylacetat có tác dụng trên cả mô hình chuột bình thường và mô hình chuột gây tăng đường huyết bằng STZ Các phân đoạn dịch chiết n-hexan, chloroform không có tác dụng trên cả 2 mô hình thí nghiệm Phân đoạn n-buthanol chỉ

có tác dụng hạ glucose huyết trên mô hình chuột gây tăng đường huyết bằng STZ

Năm 2009, Lương Thúy An công bố các kết quả nghiên cứu sau [1]:

₋ Flavonoid tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-buthanol Saponin triterpenoid có trong 3 phân đoạn: chloroform, ethylacetat và n-buthanol, trong đó tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-buthanol

₋ Phân lập được 1 flavonoid tinh khiết kí hiệu là A1 từ phân đoạn ethylacetat

dự kiến là Kaempferol

Năm 2010, Nguyễn Hương Giang đã công bố các kết quả nghiên cứu sau [6]:

₋ Xây dựng và mô tả được quy trình chiết xuất dạng cao thuốc tinh chế từ dịch chiết Dây thìa canh (GS4) tối ưu với các điều kiện: kích thước của dược liệu, phương pháp chiết xuất, nồng độ cồn và pH trong phản ứng acid hóa

₋ Lựa chọn được 2 hệ dung môi định tính GS4 bằng sắc ký lớp mỏng:

 Hệ 1: Chloroform : Methanol : Acid formic (10 : 1.1 : 0,02) cho 10 vết với thuốc thử hiện màu là H2SO4 10%

 Hệ 2: Chloroform : Aceton : Acid formic (3.3 : 1 : 0,02) cho 9 vết với thuốc thử hiện màu là H2SO4 10%

₋ Đã phân lập được 2 chất tinh khiết từ GS4 kí hiệu là GS4A1 và GS5F2 Dự kiến GS4A1 là Myrtillogenic acid và GS5F2 là Glochioeriosides A

Năm 2013, Phạm Hà Thanh Tùng đã công bố kết quả nghiên cứu [13]:

- Mô tả đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của 26 mẫu trong chi

Gymnema R.Br được thu thập từ các địa phương khác nhau trong cả nước;

Xác định được hệ số tương đồng có giá trị 0,44 – 0,88 sử dụng chỉ thị RAPD

- Xác định sự có mặt của acid gymnemic trong dịch chiết methanol của 08 mẫu của 05 loài và gymnemagenin trong tất cả dịch chiết thủy phân

- Định lượng phân đoạn giàu saponin triterpenoid (GX4) trong 08 mẫu trong

đó mẫu của 2 loài cho tỷ lệ cao nhất là Gymnema latifolium Wallich ex Wight thu ở Thái Nguyên (2,25%) và Gymnema yunnanense Tsiang thu ở

Kon Tum (2,57%) Thành phần phân đoạn GX4 có tính tương đồng cao khi khai triển trên hệ dung môi chloroform: methanol (25:15) và so sánh

LIỆU

1.2.1.Phân tích hóa học bằng phương pháp dung môi phân đoạn:

Phương pháp dựa trên độ phân cực và độ tan khác nhau của các chất trong các dung môi khác nhau Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không đồng tan thường gặp được thể hiện ở Hình 1.3 [22]

1.2.2.Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

1.2.2.1 Định nghĩa

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc

độ khác nhau, tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau [22], [10], [5]

a Chất hấp phụ:

Hiện tượng hấp phụ là sự tích tụ một chất ở thể khí hoặc trong dung dịch trên

bề mặt một chất rắn Các chất hấp phụ được dùng trong sắc ký lớp mỏng hầu hết là các oxid không tan, các oxid hydrat hóa và các muối Các chất hấp phụ thường dùng

là silica, alumina, octadecasilica, cellulose, dextran gel, polyamid, hoặc các resin trao đổi ion khác Silicagel là chất hấp phụ thường gặp nhất Khả năng hấp phụ của silicagel là do các nhóm silanol có nhóm hydroxyl Khi bảo quản trong điều kiện thường, silicagel dễ dàng hấp phụ nước trong không khí, làm giảm khả năng hấp phụ của nó Do vậy, silicagel thường được sấy ở 100-120oC để loại nước hấp phụ

mà không làm mất đi nhóm hydroxyl của đơn vị silanol Khả năng hấp phụ của silicagel cao nhất khi được hoạt hóa ở 105oC trong 2 giờ [10]

Hình 1.3 Sơ đồ tách chiết phân đoạn sử dụng dung môi không đồng tan [22]

b Dung môi:

Tốc độ di chuyển của một chất trên bề mặt chất hấp phụ, phụ thuộc vào dung môi Tiêu chuẩn quan trọng nhất để lựa chọn một dung môi chính là độ phân cực của dung môi và pH của dung môi Chọn lựa dung môi cho sắc ký, cách tốt nhất

Dược liệu

Dịch chiết methanol

Phân đoạn n-hexan Lớp nước

Phân đoạn

Phân đoạn n-butanol

Phân đoạn nước

Chiết với n-butanol bão

là bằng thực nghiệm Để định hướng cho thực nghiệm này, có thể áp dụng quy tắc tam giác của Stahl (1960s’) (Bảng 1.3)

và vết gọn hơn Ngược lại, khi sắc ký các alcaloid base có tính kiềm, người ta thường thêm một ít kiềm (amoniac, triethylamin, diethylamin, dimethyl, fornamid ) vào dung môi khai triển Các chất này được gọi là chất điều chỉnh [22], [10],

Bảng 1.4 Một số hệ dung môi dùng trong phân tích TLC [22]

Silica gel Tách chất ít phân cực, ví dụ như

các dẫn xuất acid cinamic, coumarins

glycoside và polyphenol

Methanol:acetonitril:nước C18/C8 TLC pha đảo

Đối với các acid hoặc base, thêm lượng nhỏ acid hoặc base có thể cải thiện sắc kí

đường hoặc glycosid

1.2.2.2 Ý nghĩa - Ứng dụng

Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đơn giản, kinh tế và nhanh gọn có thể được dùng cho phân tích định tính và định lượng cũng như là tinh chế hợp chất từ thiên nhiên Thực tế, phương pháp này rất hữu ích trong nhận dạng một hợp chất đã biết và phát hiện sự có mặt của nhiều loại hợp chất khác trong cây cỏ, ví dụ như phenols, steroids, alkaloids, flavonoid, và coumarin TLC còn đóng vai trò như một công cụ bổ trợ tối ưu hóa điều kiện của sắc ký cột, bao gồm lựa chọn pha động và pha rắn, xác định chất phân lập từ sắc ký cột, cũng như là xác nhận sự tinh khiết của phân đoạn phân lập được [22]

1.2.2.3 Phương pháp tiến hành

a Chuẩn bị bản mỏng:

Bản mỏng nên được rửa sạch trước khi tiến hành khai triển do lớp hấp phụ silicagel có thể dễ dàng bị nhiễn bẩn bởi thời gian và điều kiện bảo quản kém Bản mỏng được nhúng vào một bể mở Dịch rửa có thể là methanol, methanol – dichloromethan (1:1) hoặc isopropanol, được chạy qua hết bản mỏng Bản mỏng đã rửa, sau đó được hoạt hóa lại trong tủ sấy [18]

b Chấm mẫu:

Chấm mẫu bằng phương pháp thủ công, bán tự động, hay tự động đều có thể được dùng Về mặt cơ bản, dịch thử và dịch chuẩn được chấm bằng ống mao quản Tuy nhiên, nên sử dụng phương pháp bán tự động hoặc tự động để phun mẫu Khoảng cách từ vị trí chấm mẫu đến rìa dưới của bản mỏng phụ thuộc vào kích

thước của bản mỏng Nhìn chung, khoảng cách nên là 10-15mm đối với bản tiện dùng (conventional plate) và 8-10mm đối với bản hiệu năng cao (high performance plate) Phần lớn sử dụng bản có kích thước 10mm Ngày nay, người ta thường chấm theo băng, độ dài băng khoảng từ 8-10mm đối với bản tiện dùng và 5-8mm đối với bản hiệu năng cao Khoảng cách giữa các điểm/băng thường là 5, 8, 10mm, tùy thuộc vào điều kiện làm việc thực tế Để có được kết quả tốt nhất, băng nên mỏng nhất có thể, thường nhỏ hơn 1mm Chú ý không làm hỏng bề mặt bản mỏng trong lúc phun mẫu [18]

c Khai triển:

Bản mỏng sau khi được phun mẫu được đặt vào bình khai triển đã bão hòa dung môi khai triển trong 15 phút Thể tích pha động khoảng 8 -10ml đối với bản 10cm x 10cm Thông thường, khoảng khai triển nên là 70-90mm đối với bản tiện dùng và khoảng khai triển hợp lí và lí tưởng nhất trên bản hiệu năng cao là 50-70mm [18]

d Hiện màu:

Nếu các vết chấm sắc kí có màu thì hình ảnh có thể được ghi lại dưới ánh sáng trắng Nếu vết chấm sắc kí có huỳnh quang UV thì quan sát dưới ánh đèn tử ngoại là cần thiết Đối với một số chất khác, cần phun hoặc nhúng vào thuốc thử đặc trưng để hiện màu và quan sát trực tiếp hoặc sau khi sấy Phương pháp nhúng

có ưu điểm là tạo một màu đồng nhất cho cả bản mỏng nhưng lại dễ hòa tan chất phân tích vào dung dịch thuốc thử hoặc làm cho vết bị kéo đuôi Việc giữ ổn định thời gian và nhiệt độ làm nóng đặc biệt quan trọng Tro hóa bản mỏng dễ dàng xảy

ra nếu nhiệt độ quá cao hoặc thời gian quá lâu Nếu acid sulfuric được dùng làm thuốc thử hiện màu thì bản mỏng rất dễ bị tro hóa Một số chất bị biến màu theo thời gian, đặc biệt là sau khi đã phun thuốc thử [18]

1.2.2.4 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình sắc ký

a Xử lý mẫu và chuẩn bị dung dịch thử

Thông thường, dược liệu thường chứa nhiều hợp phần phức tạp của các chất

đã được biết đến hoặc chưa được biết đến nên sắc ký bản mỏng thể hiện được càng

nhiều thông tin hóa học càng tốt Tuy nhiên, để có thể có một bản sắc ký rõ ràng và

“sạch sẽ” với độ phân giải cao các chất mục tiêu thì mẫu nên được tinh khiết hóa và

xử lý trước khi tiến hành TLC Dung môi lý tưởng sử dụng trong chuẩn bị dung dịch thử nên có độ hòa tan chọn lọc đối với chất phân lập và độ nhớt thấp hơn cũng như là điểm sôi thấp hơn Trong trường hợp này, methanol và ethanol thường được coi là một dung môi tối ưu cho chiết mẫu trong TLC Sau đó, tinh chế hoặc rửa dịch chiết toàn phần thường được tiến hành để tách hợp chất mong muốn ra khỏi nhiều tạp chất không mong muốn [18]

b Kỹ thuật chấm mẫu

Đây là một bước quan trọng trong phân tích sắc ký lớp mỏng để có được bản sắc ký có độ phân giải cao Độ chính xác của các phân tích định lượng cũng bị ảnh hưởng nhiều bởi bước này và chấm mẫu không đạt yêu cầu chính là một trong những nguyên nhân gây sai số Trong kỹ thuật chấm mẫu, cần chú ý một số điểm như sau:

Lượng mẫu chấm: Khả năng chứa mẫu của bản mỏng là có giới hạn Nếu lượng mẫu vượt quá khả năng này thì khả năng tách sẽ giảm đáng kể Đặc biệt là các bản mỏng thương mại hiện nay, được tráng sẵn bởi các tiểu phân silicagel mịn (11-12m và 5-7m), cải thiện được khả năng tách nhưng lại giới hạn khả năng chứa mẫu Do đó, cần thăm dò lượng mẫu chấm hợp lý để có được độ phân giải và

Hỏng cơ học trên bề mặt bản mỏng do thiết bị chấm mẫu cũng là một trong những nguyên nhân gây nên kết quả sắc ký không tốt trong phân tích định lượng Tuy nhiên, các bản mỏng thương mại có độ chắc cao và thiết bị phun mẫu bán tự

động hay tự động có thể hoàn toàn loại bỏ khả năng làm hỏng bề mặt bản mỏng [18]

c Ảnh hưởng của sự hấp phụ và độ ẩm tương đối đến sắc ký

Hoạt động của chất hấp phụ được quyết định bởi năng lượng bề mặt và diện tích bề mặt của nó Năng lượng bề mặt càng lớn, diện tích bề mặt càng rộng thì khả năng hấp phụ càng cao Khả năng hấp phụ ở silicagel là do nhiều nhóm silanol trên

bề mặt của nó, những nhóm hydroxyl hoạt hóa và hydroxyl tự do có thể tạo liên kết hydro với các chất phân cực hoặc chưa bão hòa Số lượng nhóm hydroxyl hoạt động

và hydroxyl tự do sẽ quyết định hoạt động của silicagel Silanol là nhóm thân nước

và nó có thể dễ dàng liên kết với nước để tạo thành nhóm silanol hydrat hóa và mất khả năng hấp phụ Do đó, bản mỏng cần được hoạt hóa ở nhiệt độ cao để chuyển hết các nhóm silanol hydrat hóa thành silanol tự do, tối ưu hóa khả năng hấp phụ của bạn mỏng Đây là quá trình thuận nghịch Nhiệt độ hoạt hóa thường là 105-

1100C, và bản mỏng sau khi hoạt hóa phải tránh tiếp xúc với môi trường thí nghiệm trước khi tiến hành chấm mẫu

Độ ẩm ảnh hưởng lớn tới quá trình sắc ký Một vài thành phần và hệ dung môi pha động sử dụng có thể có ảnh hưởng tới độ ẩm tương đối Điều kiện độ ẩm 30-70% sẽ đảm bảo sự ổn định của quá trình chạy sắc ký Để có được độ lặp lại cao giữa các phòng thí nghiệm khác nhau, trong các mùa khác nhau thì nên kiểm soát

độ ẩm trong quá trình thí nghiệm [18]

d Vai trò của bay hơi dung môi:

Không giống như sắc ký cột, trong sắc ký bản mỏng tồn tại một pha hơi hay còn gọi là “pha thứ ba” (third phase) Trong khoảng không gian của buồng khai triển, pha hơi đóng vai trò quan trọng và tham gia vào quá trình khai triển Do đó dung môi pha động cần được bão hòa trong khoảng thời gian nhất định, thông thường là 20 phút, để đảm bảo quá trình khai triển đạt kết quả tối ưu [18]

e Ảnh hưởng của nhiệt độ trong phân tích sắc ký lớp mỏng:

Trong một điều kiện độ ẩm tương đối nhất định, Rf có xu hướng cao hơn khi khai triển mẫu trong nhiệt độ cao Tuy nhiên, dao động giá trị Rf nói chung không

vượt quá ±0.02 nếu thay đổi trong nhiệt độ khai triển rơi vào trong khoảng ±50C Như vậy, ảnh hưởng của nhiệt độ trong sắc ký lớp mỏng không quá lớn Tuy vậy, nếu sự dao động nhiệt độ khai triển đạt tới mức cao thì kết quả sắc kí bản mỏng sẽ

bị ảnh hưởng lớn Thứ nhất, điểm sôi, áp suất hơi và khối lượng riêng của mỗi dung môi trong pha động thay đổi dẫn đến thay đổi trong tỷ lệ mỗi phần trong dung môi khai triển Thứ hai, nhiệt độ thay đổi chắc chắn sẽ thay đổi phần nước trong pha động hai pha dẫn đến thay đổi độ phân cực của pha động và thay đổi phân tích sắc

và được kiểm soát chặt chẽ, do đó, đảm bảo được độ lặp lại cao Đồng thời, các bước của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu và nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiểu tối đa các sai số có thể gặp phải Quá trình phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng Trong quá trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành ở những phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

Ngày nay, khi phân tích TLC được tiêu chuẩn hóa, ứng dụng của phương pháp này ngày càng lớn Nhiều nghiên cứu sử dụng HPTLC trong xây dựng

fingerprint xác định các marker hóa học đặc trưng của các loài thực vật cũng như phân loại các loài và dưới loài và xây dựng thành bộ cơ sở dữ liệu để tra cứu [42]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU

2.1.1. Nguyên vật liệu

Mẫu lá của loài thuộc chi Gymnema R.Br được trồng và thu hái ở những

vùng khác nhau trong phạm vi lãnh thổ Việt Nam Riêng mẫu được phát hiện và thu hái ở vùng Bolikhamxay – Cộng hòa dân chủ nhân dân Lào (CHDCND Lào) cũng được đưa vào nghiên cứu do chúng phân bố gần biên giới Việt Lào, có điều kiện khí hậu tương tự vùng Trung Bộ và Tây Nguyên Việt Nam Tên, địa điểm, thời gian thu hái được thể hiện trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục mẫu được phân tích và mã hiệu

Mục đích

nghiên cứu

Tên loài Địa điểm thu hái Thời

điểm thu hái

Mã hiệu mẫu Định tính

Gymnema inodorum (Lour.) Decne

CX2 CX3

Sàng lọc hệ Gymnema latifolium Thái Nguyên 3/2012 DM

dung môi Wall ex Wight

5/2013 GS3

Thái Nguyên (Hoa vàng)

GS4

Thái Nguyên (Hoa đỏ)

GS5

Gymnema yunnanense Tsiang

Gymnema inodorum (Lour.) Decne

Dương Nội, Hà Nội 5/2013 GI1 Vườn thực vật, Hà

₋ Máy xay dược liệu

₋ Bộ chiết hồi lưu 1000ml

₋ Phễu chiết 500ml

₋ Máy cất quay thu hồi dung môi Buchi

₋ Bể điều nhiệt Memmert

₋ Cân kỹ thuật Sartorius

₋ Máy li tâm Hettich Zentrifugen

₋ Hệ thống sắc ký bản mọng hiệu năng cao HPTLC CAMAG (hệ thống bao gồm: thiết bị chấm mẫu bán tự động Linomat 5, thiết bị phát triển tự động ADC2, buồng chụp ảnh TLC visualiser, được điều khiển thông qua phần mềm winCAT và phần mềm phân tích VideoScan trên máy tính)

₋ Cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống nghiệm, lam kính, v.v…

2.2.1. Định tính bột dược liệu

Định tính các nhóm chất chính trong bột dược liệu của tất cả các mẫu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng

2.2.2. Xây dựng quy trình phân tích HPTLC

- Tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các phương pháp chiết xuất đến hàm lượng cắn toàn phần và sắc ký đồ của dịch chiết tổng hợp

- Theo các tài liệu đã thu thập được, thành phần chủ yếu trong lá của GS chủ yếu là saponin và flavonoid, do đó, phân tích chủ yếu hai nhóm chất này

- Sàng lọc hệ dung môi chạy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao cho nhóm chất saponin và flavonoid

- Xây dựng và mô tả quy trình phân tích tối ưu từ các yếu tố đã nghiên cứu

2.2.3. Tiến hành phân tích hóa học một số mẫu trong chi Gymnema R Br

- Chiết xuất và tách phân đoạn theo quy trình đã mô tả từ kết quả sàng lọc

- Chạy sắc ký HPTLC trên hệ thống sắc ký bản mỏng hiệu năng cao HPTLC của CAMAG với điều kiện tiến như trong quy trình phân tích đã xây dựng ở mục trên

2.3.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong các loài nghiên cứu

Xác định các nhóm chất trong các loài: Gymnema sylvestre (Retz) R Br., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight và Gymnema yunnanense Tsiang bằng các phản ứng hóa học định tính thường quy

Trước khi tiến hành các phản ứng hóa học, các dịch chiết được chuẩn bị như sau [9]:

Dịch chiết ether: Chiết 10-25g bột dược liệu bằng diethyl ether bằng cách

lắc trong một bình nón trong vòng 10-20 phút cho tới khi dịch chiết ether khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ Gộp dịch lọc được dịch chiết ether

Dịch chiết cồn: Chiết tiếp bã dược liệu (đã được xử lý bằng n-hexan để loại

chlorophyll) bằng cồn cao độ (hoặc methanol) trong bình nón với sinh hàn hồi lưu

20-30 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 2-3 lần Gộp dịch chiết, lọc và cô lại (nếu cần) thu được dịch chiết cồn

Dịch chiết cồn thủy phân: Một phần dịch chiết cồn được thủy phân để định

tính các aglycon sau khi thủy phân Thêm 10ml acid hydrochloric 10% vào 15ml dịch chiết cồn và đun hồi lưu trên bếp cách thủy trong 30 phút, thêm 10ml nước Để nguội, cho hỗn hợp vào bình gạn và chiết bằng ether ethylic ( 15ml x 3 lần) Dịch ehter được dùng để định tính các aglycon

Dịch chiết nước: Bã dược liệu là tiếp tục được chiết nóng với nước trong

bình nón trên bếp cách thủy sôi Gộp các dịch chiết, để nguội, lọc và cô lại (nếu cần) thu được dịch chiết nước

Dịch chiết nước thủy phân: Một phần dịch chiết nước được thủy phân để

định tính các aglycon sau khi thủy phân 15ml dịch chiết nước được thủy phân bằng 10ml acid hydrochloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Để nguội, chiết hỗn hợp bằng ether ethylic (15ml x 3 lần) Dịch ether được dùng để định tính các aglycon

Các dịch chiết đã chuẩn bị được dùng để tiến hành các phản ứng định tính

Nhóm chất Phản ứng Mô tả Dương tính

Raymond – Marthoud – Định tính vòng lacton 5 cạnh

vào chén sứ bốc hơi tới cắn Hòa tan lại cắn với 2ml cồn, gạn dịch cồn vào ống nghiệm nhỏ

Thêm 2-3 giọt dung dịch m-dinitrobenzen 1%

trong cồn 96 (rồi thêm 3 giọt KOH 5%)

Định tính đường desoxy

2-Lấy 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ bốc hơi đến cắn Hòa tan cắn với 5ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn

Đậy ống nghiệm và đun cách thủy trong 5 phút

Xuất hiện màu hồng đến đỏ mận

Saponin

Phản ứng Salkowski

Nhỏ từng giọt dung dịch

H2SO4 đặc vào 1ml dịch chiết chloroform

Màu thay đổi từ vàng, đỏ, lơ xanh

3 giọt dịch lọc vào 2 ống sau:

- Ống 1chứa 5ml HCl 0,1N

- Ống 2chứa 5ml

Nếu cột bọt ở 2 ống cao bằng nhau

và bền như nhau

thì có Saponin triterpenoid

Nếu cột bọt ở ống kiềm cao hơn thì

có Saponin steroid

Nhóm chất Phản ứng Mô tả Dương tính

NaOH 0,1N

Sau đó, bịt miệng và lắc mạnh 2 ống trong 15 giây

Phản ứng Rosenthaler

Nhỏ vài giọt vanilin 1%

vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết, sau đó hơ nóng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn

Xuất hiện màu hoa

cà

Flavonoid

Phản ứng Cyanidin – Định tính các flavonoid có nhân γ-pyron và γ-dihydropyron

Lấy 5ml dịch chiết cồn, bốc hơi đến còn khoảng 2ml Thêm một ít bột Mg vào ống nghiệm Sau đó nhỏ 3 – 5 giọt acid hydrochlorid đặc vào rồi

để yên vài phút

Xuất hiện màu đỏ cam, đỏ thẫm, đỏ tươi

Định tính anthocyanosid

Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrochloric 10%

Kiềm hóa bằng dung dịch natri hydroxid 10%

Dung dịch cho màu hồng đỏ tới

đỏ, chuyển sang xanh khi kiềm hóa

Định tính proanthocyanidin

Thêm 2ml dung dịch acid hydrochloric 10% và đun trong bếp cách thủy 10 phút

Dung dịch có màu hồng tới đỏ

Alcaloid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cồn, bốc hơi tới cắn Hòa tan cắn trong

2-4ml dung dịch acid hydrochloric 5% Chia dung dịch acid vào 4

Nhóm chất Phản ứng Mô tả Dương tính

ống nghiệm và định tính bằng các thuốc thử sau

Thuốc thử Dragendorff

Hòa tan 8g Bitmut nitrat kiềm trong 20ml dd HNO3 Hòa tan 27,2 g KI trong 50ml nước Trộn hai dung dịch lại rồi thêm nước cho đủ 100ml

Tủa vàng cam đến

đỏ

Thuốc thử Mayer

Hòa tan 1,36g HgCl2trong 60ml nước Hòa tan 5g KI trong 10ml nước

Trộn 2 dung dịch lại rồi thêm nước cho đủ 100ml

Tủa trắng hay vàng nhạt

Thuốc thử Wagner

Hòa tan 1,27g Iod và 2g

KI trong 20ml nước.Thêm nước cho đủ 100ml

ml dịch chiết ether hoặc chloroform rồi lắc nhẹ

Định tính dạng toàn phần: thêm 1ml dung dịch NH3vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết chloroform rồi lắc nhẹ

Tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 10% và

Xuất hiện màu đỏ sim

Nhóm chất Phản ứng Mô tả Dương tính

lắc nhẹ

Coumarin

Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho 1ml dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm sau:

- Ống 1: chứa 0.5ml dung dịch KOH 10%

- Ống 2: chứa 0.5ml nước cất

Đun cách thủy cả 2 ống trong 2 phút Để nguội rồi quan sát Thêm vào cả

2 ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất Lắc đều rồi quan sát

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc

Ban đầu, ống 1 có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2 trong

Sau khi thêm nước cất, ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục

Sau khi acid hóa, ống 1 sẽ trở lại tủa đục như ống 2

Phản ứng Diazo

Thêm 2ml dung dịch NaOH 10% vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết rồi lắc kĩ, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha

Xuất hiện tủa đỏ gạch

Tanin

Phản ứng với FeCl3

Lấy 2ml dịch chiết nước vào ống nghiệm rồi thêm

2 giọt dung dịch FeCl3 5

%

Xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh rêu

Phản ứng với chì acetat

Lấy 2ml dịch chiết nước, thêm 2 giọt chì acetat

Xuất hiện kết tủa bông

Nhóm chất Phản ứng Mô tả Dương tính

10%

Phản ứng với dung dịch gelatin

Lấy 2ml dịch chiết nước, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%

Xuất hiện kết tủa bông trắng

Tinh dầu Cặn có mùi thơm

Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn Nếu cắn

có mùi thơm nhẹ, tiếp tục thêm cồn cao độ rồi lại bốc hơi đến cắn

Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng

Đường khử Phản ứng với

thuốc thử Fehling

Lấy 1ml dịch chiết nước vào ống nghiệm rồi thêm vài giọt thuốc thử

Fehling, sau đó đun sôi trong 2 phút

Xuất hiện tủa màu

Xuất hiện màu xanh tím

Nhóm chất Phản ứng Mô tả Dương tính

môi cho đến khô, rồi thêm 1ml anhydrid acetic, lắc kĩ Thêm 1ml acid sulfuric đặc bằng cách nhỏ theo thành ống nghiêng 45o.

màu từ hồng đến xanh lá

Chất béo Vết trên giấy lọc

Dịch chiết, lắc với ether dầu hỏa, nhỏ 1 giọt ether dầu hỏa lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi

Vết mờ trên giấy lọc

2.3.2. Xây dựng quy trình phân tích định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Các mẫu lá được tách chiết phân đoạn như trình bày trong Hình 1.3 Các phân đoạn thu được sẽ được phân tích định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Trong đó, một số yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình phân tích, bao gồm: phương pháp chiết xuất và hệ dung môi pha động, khoảng khai triển và thể tích phun Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố đó đến kết quả

phân tích Các thí nghiệm sàng lọc sau được tiến hành trên bột lá Gymnema latifolium Wall ex Wight thu được tại Thái Nguyên

2.3.2.1 Sàng lọc phương pháp chiết xuất:

Tiến hành chiết 10g bột dược liệu xay thô CX1, CX2, CX3 bằng 300ml methanol tuyệt đối bằng 3 phương pháp: Ngâm lạnh, Ngấm kiệt, Hồi lưu thu được các dịch chiết tương ứng: NL, NK, HL Một lượng nhỏ dịch chiết thu được theo 3 phương pháp được dùng để chấm sắc kí với:

₋ Bản mỏng tráng sẵn Silica Gel GF254 (Merck) hoạt hóa ở 1100C trong 1h

₋ Hệ dung môi khai triển: chloroform : methanol : acid formic (10:1,1:0,2)

₋ Hiện màu ở UV 365nm hoặc nhúng thuốc thử hiện màu dung dịch acid sulfuric 10%, hơ nóng đến khi hiện màu

Phần còn lại đem cô thành cắn và cân bằng cân kỹ thuật

2.3.2.2.Sàng lọc hệ dung môi pha động trong phân tích TLC

Tiến hành chiết tách phân đoạn dịch chiết Gymnema latifolium Wallich ex

Wight (mẫu DM) theo quy trình trình bày trong Hình 1.3 với phương pháp chiết xuất là phương pháp hồi lưu Định tính các phân đoạn dịch chiết bằng các phản ứng

thường quy trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 để xác định nhóm chất chính sẽ tập trung phân tích Tiến hành sàng lọc các hệ dung môi pha động thường dùng trong phân tích các nhóm chất đó và chọn ra hệ dung môi cho kết quả tách vết sắc ký tốt nhất

Sắc ký lớp mỏng (TLC): Được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn TLC Silica Gel 60 F254 (Merck); phát hiện vết ở UV 366nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10%, sấy ở 90oC đến khi hiện màu

Dựa vào kết quả định tính và sàng lọc thu được, đề xuất quy trình phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết các mẫu đã thu hái và mã hóa trong Bảng 2.1

2.3.3.Tiến hành phân tích định tính các phân đoạn dịch chiết một số loài trong

chi Gymnema R.Br theo quy trình đề xuất

Tiến hành phân tích định tính các mẫu theo quy trình đề xuất

Xác định các vạch đặc trưng chi và vạch đặc trưng loài:

- Vạch đặc trưng chi là vạch sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu

thuộc chi Gymnema R.Br khi tiến hành phân tích với cùng một hệ dung môi

pha động và quan sát, hiện màu với cùng một phương pháp

- Vạch đặc trưng loài là vạch sắc ký xuất hiện ở tất cả các mẫu nghien cứu thuộc cùng một loài nhưng không có ở loài khác trong cùng chi khi tiến hành phân tích với cùng một hệ dung môi pha động và quan sát, hiện màu với cùng một phương pháp

Đặc điểm về thành phần hóa học của các mẫu được thống kê qua kết quả sắc

ký đồ thu được Sự có mặt của các “vạch” trên sắc ký đồ được mã hóa nhị biến,

trong đó “1” là có vạch và “0” là không có vạch Hệ số đồng dạng Sij của các mẫu được tính theo công thức của Nei & Li [24]:

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling ++ ++ ++ ++ ++

Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - ++ - - + Acid amin Phản ứng với ninhydrin 3% ++ ++ ++ + -

Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính (+): Phản ứng dương tính

(++): Phản ứng rõ (+++): Phản ứng rất rõ

Kết luận:

Lá của cả 4 loài: Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang

Lá Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult và acid amin

Lá Gymnema sp có chứa saponin, flavonoid, coumarin, đường khử, sterol,

chất béo, acid hữu cơ

MỎNG

3.2.1. Sàng lọc phương pháp chiết xuất

Khối lượng cắn thu được từ các phương pháp chiết xuất được thể hiện trong Bảng 3.2

Bảng 3.2.Kết quả khối lượng cắn thu được khi chiết xuất bằng các phương

Chú thích: M: khối lượng cốc chứa cắn

M o : khối lượng cốc không chứa cắn

∆M: khối lượng cắn toàn phần

Như vậy, phương pháp hồi lưu cho khối lượng cắn lớn nhất là 0,62g và phương pháp ngâm lạnh cho khối lượng cắn thấp nhất là 0,52g

Sử dụng dịch chiết theo 3 phương pháp để tiến hành khai triển sắc ký lớp mỏng với hệ sung môi (S.2), hiện màu dưới UV 366nm thu Kết quả thu được cho thấy: không có sự khác biệt nhiều trong sắc ký đồ giữa các dịch chiết được chiết bằng 3 phương pháp khác nhau (Hình 1.3)

`

NL NK HL Hình 3.1 Sắc ký đồ dịch chiết NL, NK, HL với hệ dung môi (S.2), hiện màu

3.2.2. Định tính các phân đoạn dịch chiết

Các phân đoạn dịch chiết n-hexan, ethylacetat, n-butanol và nước của mẫu

Gymnema latifolium Wall ex Wight được định tính bằng các phản ứng hóa học

thường quy của saponin và flavonoid

Kết quả: Saponin và flavonoid tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat

và phân đoạn n-butanol Trong phân đoạn n-hexan không có saponin và flavonoid Trong phân đoạn nước, có saponin nhưng ít và không có flavonoid (Bảng 3.3)