Nghiên cứu phân lập một số hợp chất và độc tính của loài dây thìa canh lá to ( gymnema latifolium wall ex wight) thu hái ở hòa bình

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ KIM CHI NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI DÂY THÌA CANH LÁ TO GYMNEMA LATIFOLIUM WALL... TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUY

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI

DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA

LATIFOLIUM WALL EX WIGHT) THU

HÁI Ở HOÀ BÌNH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ KIM CHI

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ ĐỘC TÍNH CỦA LOÀI

DÂY THÌA CANH LÁ TO (GYMNEMA

LATIFOLIUM WALL EX WIGHT) THU

Bộ môn Thực Vật – Trường Đại học Dược Hà Nội

Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc nhất tới:

ThS Phạm Hà Thanh Tùng - Bộ môn Thực vật, Trường Đại học

Dược Hà Nội và DS Đoàn Thị Ái Nghĩa - Bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền, Trường Đại học Y Dược Huế Thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận

tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học

và hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Nguyệt Quế và ThS

Nguyễn Thu Hằng - Bộ môn dược lý, Trường Đại học Dược Hà Nội đã

hướng dẫn và giúp đỡ để em trong quá trình thực hiện khoá luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, các chị kĩ thuật viên

Bộ môn Thực vật đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn

Lời sau cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, các anh chị và bạn bè đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên Nguyễn Thị Kim Chi

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 2

1.1.1 Về thực vật 2

1.1.2 Về đa dạng di truyền 4

1.1.3 Về thành phần hoá học 5

1.1.4 Về tác dụng sinh học 6

1.1.5 Về độc tính 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

1.2.1 Về phân lập một số hợp chất 8

1.2.2 Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn 9

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…….12

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 12

2.1.1 Nguyên vật liệu 12

2.1.2 Động vật thí nghiệm 12

2.1.3 Dung môi, hoá chất 12

2.1.4 Máy móc - thiết bị 13

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13

2.2.1 Nghiên cứu phân lập một số chất tinh khiết 13

2.2.2 Xác định độc tính bán trường diễn 13

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu phân lập một số hợp chất 13

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu về độc tính bán trường diễn 15

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18

3.4 PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT 18

3.4.1 Quá trình chiết xuất 18

3.4.2 Quá trình phân lập 19

3.4.3 Xác định cấu trúc các chất phân lập được 20

3.5 ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN 24

3.5.1 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến sự tăng trưởng thể trọng của chuột cống trắng 24

3.5.2 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số huyết học của chuột cống trắng 25

3.5.3 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến các chỉ số sinh hoá của chuột cống trắng 26

3.5.4 Kết quả về mô bệnh học 27

3.6 BÀN LUẬN 29

3.3.1 Về phương pháp nghiên cứu 29

3.3.2 Về phân lập các chất 30

3.3.3 Về độc tính bán trường diễn 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

 Độ dịch chuyển hoá học

Magnetic Resonance Spectroscopy)

Resonance Spectroscopy)

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất GLHE9 và chất

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến

khối lượng cơ thể của chuột cống trắng

25

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến

các chỉ số huyết học của chuột cống trắng

25

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thìa canh lá to đến

các chỉ số sinh hóa của chuột cống trắng

26

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết lá Dây thì canh lá to đến

khối lượng tim, gan, thận, lách/100g chuột cống

trắng

27

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall

ex Wight

3

Hình 1.2 Đoạn nucleotide đặc trưng phân biệt hai loài

Gymnema latifolium và Gymnema sylvestre

5

Hình 1.3 Định tính gymnemagenin trong phân đoạn

ethylacetat trong mẫu Gymnema latifolium

Wall ex Wight

6

Hình 2.1 Quy trình thử độc tính bán trường diễn của

dịch chiết Dây thìa canh lá to (Gymnema

latifolium Wall ex Wight)

16

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ Dây thìa

canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex

Wight)

18

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập phân đoạn E1 từ Dây thìa canh

lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight)

19

Hình 3.5 Hình ảnh vi thể gan, thận lô thử và lô chứng

của chuột thí nghiệm

28

Hình 3.6 Các định hướng nghiên cứu tác dụng của

lupeol

31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult.) đã được nền

y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda sử dụng từ hơn 2.000 năm để điều trị đái tháo đường [29], [32] Dựa trên kinh nghiệm này, nhiều nghiên cứu liên quan đến Dây thìa canh đã được thực hiện và một số sản phẩm từ dược liệu này đã được phát triển sử dụng trong hỗ trợ điều trị đái tháo đường

Dựa trên nguyên lý các loài thực vật ở cùng cấp phân loại bậc chi có khả năng có các hoạt chất và hoạt tính sinh học tương đồng, Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu hái ở huyện Cao Phong, tỉnh Hoà

Bình đã được các nhà khoa học nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu sàng lọc các dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường ở Việt Nam năm 2010 [7] Kết quả nghiên cứu đã cho thấy

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) có tác dụng hạ đường huyết cao hơn Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex

Schult.) [7] Do đó, nghiên cứu đã lựa chọn Dây thìa canh lá to là một trong

ba cây thuốc có triển vọng ứng dụng điều trị đái tháo đường ở Việt Nam Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt Nam cũng như trên thế giới chưa có một công bố nào về thành phần các chất hoá học và độc tính bán trường diễn của Dây thìa canh lá to Do vậy, nhằm góp phần đi sâu nghiên cứu về dược liệu tiềm năng này, đề tài “Nghiên cứu phân lập một số hợp chất và độc tính của

loài Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình” được thực

hiện với mục tiêu:

 Phân lập một số hợp chất trong thành phần hoá học của Dây thìa

canh lá to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình

 Xác định độc tính bán trường diễn của dịch chiết lá Dây thìa canh lá

to (Gymnema latifolium) thu hái ở Hoà Bình

TỔNG QUAN

1.1 LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT

1.1.1 Về thực vật

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [27], Dây thìa

canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) có vị trí phân loại như sau:

+ Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

+ Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

+ Phân Lớp Hoa Môi (Lamiidae) + Bộ Long Đởm (Gentianales) + Họ Trúc Đào (Apocynaceae)

+ Phân Họ Thiên lý (Asclepiadoideae)

+ Chi Gymnema R.Br

+ Loài Gymnema latifolium Wall ex Wight

Ở Ấn Độ, Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) còn được biết đến với các tên đồng nghĩa khác là Gymnema khandalense và

Gymnema kollimalayanum [20]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của loài

Thân leo tới 6 m Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ Cuống lá 1,5-4 cm, có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13×5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông dày đặc Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8 mm Đài hình trứng, phủ lông măng Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài Ống hoa có 5 cặp

gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng [12]

(b) Dạng sống; (c) Cụm hoa; (d) Mặt trên lá; (e) Mặt dưới lá; (f) Cụm hoa xim; (g) Lá bắc của cụm hoa; (h) Một hoa nguyên vẹn; (i) Đài; (j) Tràng;

(k) Trụ nhị nhụy; (l) Thể truyền phấn; (m) Bộ nhụy; (n) Quả

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall ex Wight [12]

Trụ nhị nhụy dạng hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy Khối phấn hình thuôn Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi Quả đại hình mác nhọn, mũi cong, 4,5-5,5×1,5-2 cm, có lông dày đặc Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng 1,1 cm×5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm [12]

Phân bố: Đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [20], Việt Nam (Cúc Phương, Hoà Bình, Thái Nguyên) [12]

1.1.2 Về đa dạng di truyền

Năm 2012, Phạm Hà Thanh Tùng [12] đã công bố nghiên cứu xác định

sự khác biệt di truyền sử dụng chỉ thị phân tử RAPD của 26 mẫu thuộc 5 loài

trong chi Gymnema R.Br., trong đó có 4 mẫu Gymnema latifolium Wall ex

Wight Kết quả cho thấy, 3 mẫu ở miền Bắc Việt Nam (Hoà Bình, Thái Nguyên và Tuyên Quang) cùng nằm trong cùng một nhóm di truyền, trong khi đó 1 mẫu ở gần khu vực miền Trung Việt Nam không cùng nhóm này Kết quả cho thấy sự khác biệt của các mẫu theo sự phân bố địa lý

Năm 2013, Vũ Thị Thanh Thuý [10] đã giải trình tự thành công đoạn

gen ITS của 8 mẫu trong chi Gymnema R.Br Kết quả đã xác định sự tương đồng di truyền của 2 mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight là 0.99 và đã

phát hiện đoạn trình tự CGGCCCAAA ở vị trí nucleotid 56 trên vùng khảo

sát ITS1+5.8S+ITS2 hoàn toàn khác biệt và là đặc trưng cho loài Gymnema

latifolium Wall ex Wight so với trình tự gen đã công bố trên ngân hàng gen

thế giới Genbank (Hình 1.2) Kết quả chứng minh khả năng nghiên cứu sự đa

dạng di truyền của các mẫu sử dụng đoạn trình tự gen ITS và là cơ sở của việc công bố trình tự gen của các mẫu nghiên cứu trên ngân hàng gen thế giới

Hình 1.2 Đoạn nuleotide đặc trưng phân biệt hai loài Gymnema latifolium

và Gymnema sylvestre [10]

1.1.3 Về thành phần hoá học

Thử nghiệm ban đầu đã xác định các nhóm chất có trong Dây thìa canh

lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) thu hái tại Hòa Bình có thành

phần chính gồm: saponin, flavonoid, tanin, sterol, chất béo acid amin, đường

khử và coumarin [3], [11]

Sản phẩm thuỷ phân phân đoạn ethyl acetat của Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) có pic sắc ký tương ứng với

gymnemagenin trên sắc ký đồ (Hình 1.3) [12]

Cho đến nay, chưa xác định được tài liệu nào trên thế giới và ở Việt Nam

công bố về các hợp chất được phân lập từ Dây thìa canh lá to (Gymnema

latifolium Wall ex Wight)

Hình 1.3: Định tính gymnemagenin trong các phân đoạn ethyl acetat trong

mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight [12]

1.1.4 Về tác dụng sinh học

Theo Trần Văn Ơn, Phùng Thanh Hương và cộng sự [7], dịch chiết lá

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) ở Việt Nam có tác

dụng hạ đường huyết trên cả chuột bình thường (24,07 %) tác dụng cao nhất

thể hiện sau 4 giờ, kéo dài đến 5 giờ và trên chuột gây tăng đường huyết bởi

Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngày cho uống dịch chiết Liều dùng thích

hợp lá dây thìa canh là cắn toàn phần được pha thành hỗn dịch trong nước cất

với tỉ lệ 1:1, với liều 0,5ml/25g, tương ứng với 10g lá khô/kg thể trọng

Kết quả thử nghiệm cho thấy tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết lá

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) mạnh hơn Dây thìa

canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) Kết quả này đã được

chuyển giao cho Công ty Dược Khoa (DK-Pharma) của Trường Đại học

Dược Hà Nội, là nơi duy nhất ở Việt Nam trồng trọt Dây thìa canh lá to theo

quy trình hướng dẫn “Thực hành tốt Trồng trọt cây thuốc” (GAP- WHO)

Công ty đã cho ra đời sản phẩm Trà tiểu đường DK-Betics, phần cốt lõi là

cây thuốc Dây thìa canh và Dây thìa canh lá to

Ngoài các công bố trên, hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có một công bố chính thức nào về tác dụng sinh học của Dây thìa canh

lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight)

1.1.5 Về độc tính

Độc tính cấp của Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex

Tham khảo một nghiên cứu [24] về độc tính bán trường diễn của dịch

chiết Dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R.Br ex Schult.) trong 52

tuần với liều tỷ lệ từ 0,01; 0,1; 1% cao chiết với tổng lượng thức ăn định mức

hàng ngày trên cả chuột đực và chuột cái Wista, so với lô chứng âm Trọng lượng cơ thể, lượng thức ăn tiêu thụ được theo dõi hàng tuần cho tới 12 tuần Sau đó chu kì được theo dõi dài hơn, nghiên cứu giữa kì vào tuần thứ 26 và lần cuối cùng vào tuần 52 Động vật thí nghiệm được xét nghiệm về huyết học, sinh hoá và bệnh học

Kết quả cho thấy, không có chuột chết trong khoảng thời gian 52 tuần, không có hiện tượng thay đổi về cân nặng, khả năng ăn uống, huyết học, sinh

hóa và bệnh học Kết luận: không có độc tính trên chuột dùng dịch chiết lá GS

đến mức liều 1% trong 52 tuần

Độc tính cấp của Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex

Nam, chưa có bất cứ nghiên cứu nào về độc tính bán trường diễn của các loài

trong chi Gymnema R.Br

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1.2.1 Về phân lập một số hợp chất

1.2.1.1 Chiết xuất

* Phương pháp ngâm lạnh

Sau khi chuẩn bị dược liệu, dung môi được đổ cho ngập dược liệu trong

bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (quy định riêng cho từng loại dược liệu), tại nhiệt dộ phòng, rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi) [5]

* Phương pháp ngấm kiệt đơn giản

Sau khi chuẩn bị dược liệu và dung môi trong bình ngấm kiệt Sau một khoảng thời gian xác định (tuỳ từng loại dược liệu), rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp dược liệu nằm yên (không được khuấy trộn) Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt dược liệu khoảng 3-4 cm [5]

1.2.1.2 Phân lập và xác định cấu trúc hoá học

Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế cột hấp phụ và cột lọc qua gel Sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn dung môi, theo dõi quá trình rửa giải

* Sắc ký cột hấp phụ:

Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất lỏng chảy qua, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh Nhờ vậy

mà có thể triển khai dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh [2], [17]

* Sắc ký lọc qua gel

Sắc ký lọc qua gel là phương pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ trong các lỗ xốp của gel Khoảng kích thước lỗ của gel xác định khoảng kích thước phân tử được phân tách qua quá trình sắc ký [2], [6], [17]

* Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển dịch với tốc độ khác nhau tuỳ theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại

ở những vị trí khác nhau [2], [6], [17]

* Xác định cấu trúc hoá học

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ: phổ hồng ngoại (UV), phổ tử ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng

chiều (NOESY, COSY, HMQC, HSQC, HMBC) Khoảng nửa thế kỉ trước,

chất hoá học từ dược liệu Tuy nhiên, sự phát triển của phổ cộng hưởng từ hai chiều đã cung cấp nhiều thông tin phổ hơn, chỉ ra sự tương tác lẫn nhau giữa các proton và carbon trong cấu trúc giúp xác định cấu trúc các chất chính xác

và đầy đủ hơn [17]

1.2.2 Về nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Nghiên cứu về độc tính của thuốc đóng vai trò vô cùng quan trọng để đảm bảo tính an toàn của thuốc, thuốc dù tác dụng mạnh đến mấy mà không

an toàn thì cũng sẽ không được sử dụng [1]

Độc tính bán trường diễn là một trong các nội dung về nghiên cứu độc tính gồm có: độc tính cấp; độc tính trường diễn (độc tính bán cấp, độc tính độc tính bán trường diễn, độc tính trường diễn); độc tính tại chỗ và độc tính chuyên biệt (độc tính sinh biến chủng, độc tính ung thư, độc tính trên sinh sản

và phát triển) [1]

Một số qui định về thử nghiệm độc tính bán trường diễn [1], [9]:

- Thời gian: phụ thuộc vào thời gian dùng thuốc cho người, thường gấp

4 lần thời gian dùng thuốc cho người

- Động vật thí nghiệm: thỏ, chuột cống trắng; giống đực hay cái tùy thí nghiệm; số lượng mỗi lô, thường với thỏ là 6 và với chuột là 10

- Đường dùng thuốc: đường dùng dự kiến dùng cho người, ngoài ra có thể thêm một đường dùng khác

- Liều dùng: thường tính từ liều thể hiện tác dụng trên động vật thí nghiệm hoặc có thể lấy liều dùng của người làm cơ sở, rồi dùng phép ngoại suy tính ra liều của động vật thí nghiệm

- Các thời điểm theo dõi: trước khi bắt đầu thí nghiệm; trong khi dùng thuốc, ngay sau khi dùng thuốc; sau khi ngừng thuốc một thời gian để theo dõi sự hồi phục; xét nghiệm đại thể và vi thể các cơ quan thì tiến hành lúc: ngay khi con vật chết, con vật còn hấp hối nhưng triển vọng

sẽ chết, sau khi kết thúc thí nghiệm

- Các thông số quan sát sẽ tuỳ thuộc đề tài Một số các chỉ tiêu :

o Biểu hiện chung: hành vi, lông, cân nặng, mức ăn uống…

o Các thông số huyết học: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, tỷ lệ huyết sắc tố, thời gian máu đông, máu chảy…

o Các thông số thuộc chức năng gan: ALT và AST, bilirubin, cholesterol…

o Các thông số thuộc chức năng thận: creatinin huyết, ure huyết…

o Xét nghiệm đại thể và vi thể: gan, thận, lách, tim…

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên vật liệu

Đối tượng nghiên cứu là lá của cây Dây thìa canh lá to (Gymnema

latifolium Wall ex Wight) thu hái ở Hòa Bình

Cây đã được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội (Mã hiệu tiêu bản HNIP/18068/14)

2.1.2 Động vật thí nghiệm

Chuột cống trắng chủng Wistar, cả 2 giống, khỏe mạnh, cân nặng từ 200-220g, do Học viện Quân y cung cấp Động vật được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 3 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu

Thức ăn: Thức ăn viên tổng hợp do Viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp chứa tỷ lệ thích hợp protein, carbonhydrat, mỡ, chất khoáng, vitamin, chất

xơ

Nước uống: Nước máy sinh hoạt

2.1.3 Dung môi, hoá chất

Dung môi: methanol, ethanol 70, n-butanol, n-hexan, ethyl acetat,

tuyệt đối

Chất nhồi cột sắc kí: silicagel pha thường (silicagel 60; 0,040 – 0,063

mm (230 – 400 mesh ASTM); Merck), pha đảo (YMC, 30 - 50m, Fuji Silysia Chemical Ltd.), Sephadex LH 20

Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV

2.1.4 Máy móc - thiết bị

Cân phân tích hiện số SARTORIUS TE3102S, độ chính xác 0,0001 g bếp điện, tủ sấy SHEELLAB, máy cô quay Buchi, bình chiết, máy lọc hút

chân không, máy xay dược liệu

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chuẩn nội là tetramethyl silan (TMS)

Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, cốc có mỏ nhiều thể tích, ống nghiệm,

đũa thủy tinh, ống sinh hàn, bình gạn, bình chạy sắc ký

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu phân lập một số chất tinh khiết

- Tiến hành chiết xuất và tách phân đoạn các chất theo độ phân cực

- Phân lập các chất dựa trên phương pháp sắc kí cột với các cơ chế cột hấp phụ, cột lọc qua gel SKLM được theo dõi trong quá trình rửa giải

2.2.2 Xác định độc tính bán trường diễn

- Tiến hành chiết xuất lấy dịch chiết toàn phần của cây Dây thìa canh lá

to (Gymnema latifolium Wall ex Wight), cô lấy cắn, phân tán trong

nước tạo hỗn dịch 1:2

- Thử độc tính bán trường diễn với liều nhắc lại trong 28 ngày trên chuột cống trắng

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu phân lập một số hợp chất

2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất

* Tạo dịch chiết toàn phần

Lá của cây Dây thìa canh lá to được rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy ở nhiệt độ 50ºC - 60ºC, sau đó xay thành bột thô Bột dược liệu được chiết bằng methanol tuyệt đối, phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, thời gian 7 ngày/đợt

x 3 đợt, thu được dịch chiết toàn phần Cất thu hồi dung môi methanol ở 50ºC thu được cắn toàn phần

* Chiết xuất các phân đoạn

Nguyên lý: Chiết xuất các chất được phân tán trong các dung môi khác

nhau dựa trên độ phân cực và độ tan khác nhau của các chất trong các dung môi đó [17]

Tiến hành: Phân tán cắn toàn phần trong nước, rồi tiến hành chiết phân

đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat, n-butanol Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm lần lượt thu được các cắn n- hexan, ethyl acetat, n-butanol Dịch nước còn lại đem cô cách thuỷ thu được cắn nước

* Chiết pha rắn

Nguyên lý: Chiết pha rắn được tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có

kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào lượng mẫu đem chiết (thường áp dụng với lượng cao chiết lớn trên 10g) Pha tĩnh hay sử dụng là silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 - 0,063 mm (230-400 mesh ASTM), Merck) Dịch chiết cao dược liệu được tẩm với lượng vừa đủ silicagel rồi thực hiện cất loại dung môi thu được bột khô tơi Lượng bột khô này được đưa lên cột sắc ký, sau đó rửa giải bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần

Tiến hành

- Cắn phân đoạn được hòa tan vào lượng methanol tối thiểu, sau đó tẩm với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1 Khối silicagel ẩm này được quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn Bột khô thu được dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo

- Chuẩn bị cột: cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự nhiên Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá Cho silicagel pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 30 cm, hoạt hoá

cột, sau đó đưa lượng chất đã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều

- Triển khai cột với hệ dung môi rửa giải lần lượt là hexan 100%, hexan: ethylacetat với các tỷ lệ 40:1, 20:1, 10:1 và ethylacetat 100% (1,5 lít cho mỗi hệ) Hứng các phân đoạn, cô quay cất thu hồi dung môi thu được các cắn dạng cao đặc

n-2.3.1.2 Phương pháp phân lập

Sắc kí cột hấp phụ: Sắc ký cột được tiến hành trên cột silicagel pha

FuJisilisa Chemical Ltd.)

Sắc kí lọc qua gel: sử dụng chất sắc kí là Sephadex LH-20

Sắc kí lớp mỏng: dùng để lựa chọn dung môi, định hướng các hợp chất

cần phân lập và theo dõi quá trình phân lập, được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC - Alufolien 60G F254 (Merck), RP18 (Merck) Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254nm và 366nm và

2.3.1.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Chất tinh khiết thu được đem đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR một

FT-NMR tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chuẩn nội là tetramethyl silan (TMS), sau đó so sánh với tài liệu tham

khảo để xác định tên, công thức hoá học của hợp chất

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu về độc tính bán trường diễn

2.3.2.1 Chuẩn bị cao lỏng

giờ

Chiết xuất dược liệu: lót một lớp bông thấm nước lên trên ống thoát

dịch chiết để bột dược liệu không gây tắc ống và lẫn vào dịch chiết Sau đó đặt giấy lọc đã cắt vừa vặn vào đáy bình Cho từ từ bột dược liệu đã được thấm ẩm vào bình, vừa cho vừa san đều và nén nhẹ Đổ dung môi vào bình chiết cho tới khi có vài giọt chảy ra thì đóng khóa lại Tiếp tục đổ dung môi đến khi cách mặt dược liệu 3-4cm, ngâm lạnh trong 48 giờ Hết thời gian ngâm lạnh, mở khóa cho dịch chiết chảy ra với tốc độ là 20 giọt/phút Chú ý cho thêm dung môi đảm bảo ngập mặt dược liệu từ 2-3cm

- Dịch chiết thu được đem cô đến cắn, phân tán trong nước tạo hỗn dịch 1:2

2.3.2.2 Thử độc tính bán trường diễn

Bố trí thí nghiệm: Chuột cống trắng cả 2 giống được chia ngẫu nhiên

thành 3 lô, cho uống thuốc thử hoặc nước vào một giờ nhất định liên tục trong

28 ngày, căn cứ vào liều tác dụng trên người 10g dược liệu khô/kg thể trọng:

- Lô chứng (n=10): uống nước với thể tích 1ml/100g chuột

- Lô thử liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa canh lá to với liều 1,4 g/kg chuột (tính theo dươc liệu khô)

- Lô thử liều 2: gấp 3 liều 1 (n=10): uống dịch chiết nước cao Dây thìa canh lá to với liều 4,2 g/kg chuột (tính theo dược liệu khô)

Hình 2.1 Quy trình thử độc tính bán trường diễn của dịch chiết

Dây thìa canh lá to (Gymnema latifolium Wall ex Wight)

Thông số đánh giá

- Tình trạng toàn thân: Biểu hiện của động vật thực nghiệm: tình trạng da, lông, mắt, sự tiết dịch, phân, nước tiểu…, hoạt động tự nhiên, hành vi, sự tiêu thụ thức ăn, nước uống (theo dõi hàng ngày) Sự thay đổi khối lượng cơ (cân hàng tuần)

- Huyết học: Các thông số: số lượng hồng cầu, nồng độ hemoglobin, tỷ lệ hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, lượng huyết sắc tố trung bình, nồng độ huyết sắc tố, số lượng tiểu cầu, số lượng bạch cầu và tỷ lệ % tế bào lympho

- Về sinh hoá: Các thông số: Hoạt độ AST, hoạt độ ALT, cholesterol toàn phần, protein toàn phần, creatinin huyết thanh

- Về mô bệnh học: Đại thể các cơ quan: quan sát cảm quan các cơ quan tim, gan, thận, lách Cân ngay khối lượng các cơ quan và tính

tỷ lệ so với khối lượng toàn bộ cơ thể

- Tiêu bản vi thể gan, thận (lấy ngẫu nhiên 30% động vật mỗi lô)

Xử lí số liệu: Phương pháp hậu kiểm ANOVA, số liệu được trình bày

dưới dạng M ± SD (M: giá trị trung bình của từng lô, SD: Độ lệch chuẩn)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT

3.1.1 Quá trình chiết xuất

Bột dược liệu (5 kg) được chiết xuất bằng phương pháp ngâm lạnh thu được 315g cắn toàn phần, sau đó tiến hành lắc phân đoạn thu được khối lượng cắn lần lượt là: n-hexan: 50g, ethylacetat: 60g, butanol: 80g, nước: 75g Cắn phân đoạn ethylacetat được đem chiết pha rắn thu được 5 phân đoạn từ E1 –

E5 (Hình 3.1)

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight)

3.1.2 Quá trình phân lập

Phân đoạn E1 được chọn để tiếp tục phân lập (Hình 3.2)

E1 được khai triển trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan : ethylacetat (40:1), thu được 2 phân đoạn E1A và E1B

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập phân đoạn E1 từ Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight)

Phân đoạn E1A được tiếp tục phân lập trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan : cloroform (20:1) thu được 7 phân đoạn E1A1 – E1A7

Phân đoạn E1A6 tiếp tục được triển khai bằng phương pháp sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi aceton : methanol : nước (1:1:0,2) thu được các phân đoạn được ký hiệu E1A6A – E1A6E

Phân đoạn E1A6E được đưa lên cột sắc kí pha thường với hệ dung môi n-hexan : cloroform (15:1) thu được E1A6E1 tương đối sạch E1A6E1 được triển khai trên sắc kí cột lọc qua gel Sephadex LH-20, rửa giải bằng methanol

tuyệt đối, thu được 1 hợp chất sạch số 1 (kí hiệu là GLHE9)

Phân đoạn E1A7 được triển khai trên sắc ký cột pha thường với hệ dung môi n-hexan : ethylacetat (10:1) thu được E1A7A E1A7A được triển khai trên sắc kí lọc qua gel Sephadex LH-20, rửa giải bằng methanol tuyệt đối, thu

được 1 hợp chất sạch số 2 (kí hiệu là GLHE7)

3.1.3 Xác định cấu trúc các chất phân lập được

3.1.3.1 Hợp chất 1 (GLHE9)

Hợp chất 1 (ký hiệu là GLHE9) được tách ra dưới dạng bột kết tinh

trắng hình kim; khi kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng pha thường với dung môi

Rf = 0,47

J suy ra proton của nhóm oxymethin phải có cấu hình  (chiếm vị trí axial

trong cấu dạng ghế của vòng A – khung dammaran)

cacbon bao gồm 7 nhóm methyl, 8 nhóm methylen, 5 nhóm methin và 6