Phân lập tuyển chọn vi sinh vật xử lý loại bỏ nitơ trong nước thải chế biến thủy sản

Tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt tính vi khuẩn nitrate hóa Phần 2.. Tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt tính vi khuẩn phản nitrate hóa... Khảo sát hoạt tính các chủng NOB tuyển

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

MÃ NGÀNH: 60520320

HVCH: HUỲNH VĂN THÀNH HDKH: TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

Tp Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2013

1 TỔNG QUAN

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ

1 TỔNG QUAN

Nước thải chế biến thủy sản (CBTS)

Công nghệ xử lý nước thải CBTS ở VN Vấn đề tồn tại

Chiến lược xử lý nước thải CBTS

(Nguồn: Tổng cục Môi trường 2011)

(Tổng cục Môi trường, 2011)

Nước thải Mương tách dầu và mỡ Máy tách rác

Nitrate hóa

Phân hủy kị khí

•Giàu protein Nước thải CBTS

•Protein Amino acid

Khó tăng sinh hay

Nội dung nghiên cứu của luận văn

Tăng sinh, phân lập, khảo

cao

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Mẫu nước thải được lấy từ:

 Công ty CP Thủy sản số 4, 320 Hưng Phú, P.9, Q.8, TP.HCM

 Công ty cổ phần Trang - lô A 14b, KCN Hiệp Phước, Nhà Bè, tp.HCM

 Khu xử lý nước thải của Chợ đầu mối nông sản thực phẩm Bình Điền - Đl Nguyễn Văn Linh, khu phố 6, phường 7, quận 8, tp.HCM

 Luận văn được thực hiện tại Trung tâm thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh ( 475A, Điện Biên Phủ,Phường 25, Quận Bình Thạnh, Tp HCM)

PP tăng sinh, phân lập các vi khuẩn

nitrate hóa (AOB, NOB) và phản nitrate

PP định danh vi sinh vật (hình thái,

sinh lý, sinh hóa, phân tích gene)

PP định lượng vi sinh vật

3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

Phần 1 Tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt tính

vi khuẩn nitrate hóa

Phần 2 Tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt tính

vi khuẩn phản nitrate hóa

Vd: Nitrobacter spp

AOB = ammonium

oxidizing bacteria

Vd: Nitrosomonas spp

Phân lập AOB

Không thành công

AOB là vi khuẩn tự dưỡng (autotrophic),

dễ bị vi khuẩn dị dưỡng (heterotrophic)

lấn át, khó phận lập

Quan trọng là tăng sinh để chuyển hóa,

không cần phải phân lập

N– NH4+ giảm gần hết từ 583mg/l xuống < 10mg/l đồng thời

N-NO2- tăng đến 186.9mg/l, trong khi N-NO3- sinh ra không đáng kể (<

23mg/l)

Khảo sát hoạt tính quần thể AOB

Hiệu quả nitrate hóa (%) =

(N-NO2- Cuối + N-NO3- Cuối)/N-NH4+Đầu*100

Tăng sinh NOB (nitrate oxidizing bacteria)

Phân lập NOB

NOB là vi khuẩn dinh dưỡng hỗn hợp (mixotrophic) (Spieck E và Lipski A, 2011)

Khảo sát hoạt tính các chủng NOB phân lập

chủng phân lập sau 6 ngày (Môi trường W2)

Chọn chủng 2, 3 và MV1

Khảo sát hoạt tính các chủng NOB tuyển chọn

Hiệu quả chuyển hóa nitrite 47-55%,

Hiệu quả nitrate hóa cao nhất 5% sau

12 ngày khảo sát

Thảo luận phần 1

AOB là vi khuẩn tự dưỡng rất khó phân lập

NOB là vi khuẩn hỗn hợp có thể phân lập tuyển chọn

Với nồng độ vi khuẩn đủ lớn có thể xử lý gần 100% NH4+ ở nồng độ cao (583 mg/L), trong đó 50% được oxy hóa chủ yếu thành NO2-

Chuyển hóa NO2- thành NO3- diễn ra chậm, do tăng sinh rất chậm, phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Spieck E và Lipski A, 2011).

Cần tiếp tục nghiên cứu này

Cần trang bị máy lắc, máy đo DO, pH,

hóa chất đầy đủ

Cần phối hợp với vi khuẩn khử

(VK phản nitrate hóa)

Phần 2 Phân lập, sàng lọc, tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate hóa và khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng lên hoạt tính của chúng

Hô hấp kị khí Khử nitrate dị hóa

Tăng sinh vi khuẩn phản nitrate

Không sục khí

Khảo sát hoạt tính phản nitrate

Phân lập VSV thuần khiết trên

MT Giltay nitrate

Tăng sinh trên MT Giltay

nitrite (thay nitrate bằng

Kết quả sàng lọc chủng phản nitrate

theo hoạt tính

Từ 20 chủng sàng lọc được

7 chủng có hoạt tính phản

nitrate mạnh nhất, đều phân lập từ nước thải chợ đầu mối

thủy sản

Sàng lọc – Loại bỏ vi khuẩn gây

bệnh qua test sinh hóa

Loại bỏ 1 chủng, giữ 6 chủng

Nước thải CBTS có thể chứa VK đường ruột, Vibrio spp

Các VK này khử nitrate, khử nitrite sinh NH4+

Có thể phân biệt chúng với VK phản nitrate qua test sinh hóa

Chọn VK không lên men đường (F), oxidase +

Bỏ: VK lên men đường (F+, MR+, VP+), oxidase-

QCVN 11:2008/BTNMT- NTCBTS:

Hiệu quả xử lý E%= [1 -

-đầu]*100

Khảo sát các thông số ảnh hưởng lên quá trình

phản nitrate của chủng A xylosoxidans III-8

Oxy

Nguồn C

Tỉ lệ C/N

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Ảnh hưởng của giá thể bám dính

Ảnh hưởng của mật độ VK

Ảnh hưởng của oxy lên tăng trưởng của

A xylosoxidans III-8

Tăng sinh khối trong quá trình hiếu khí

Phản nitrate trong qúa trình thiếu khí

Ảnh hưởng của nguồn C lên hoạt tính

phản nitrate của A xylosoxidans III-8

(Handbook of water treatment, 2002)

Nguồn C nội sinh (từ nước thải)

Nguồn C bổ sung (từ bên ngoài)

ra môi trường

Ảnh hưởng của nguồn C lên hoạt tính phản

nitrate của A xylosoxidans III-8

MT 1: 5 g acid citric ; 1 g asparagine (MT Giltay)

MT2 : 5,86 g acetate natri, 1 g asparagine

MT3: 5,86 g acetate natri, 1 g peptone

Điều kiện thiếu khí, không giá thể

hơn, tuy không nhiều

96 giờ cao nhất ở MT3 100%

Ảnh hưởng của tỉ lệ C/N lên hoạt tính

phản nitrate của A xylosoxidans III-8

Tính toán COD lý thuyết:

(Handbook of water treatment, 2002)

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên hoạt tính

phản nitrate của A xylosoxidans III-8

Nước thải CBTS chứa hàm lượng NaCl cao khoảng 3% (Dan Nguyen

Ảnh hưởng của giá thể lên hoạt tính

phản nitrate của A xylosoxidans III-8

TN phản nitrate

không giá thể

TN phản nitrate có giá thể (plastic)

Giá thể làm tăng bề mặt tiếp xúc VSV với môi trường, tăng hiệu

quả chuyển hóa ngay cả khi có mặt 3% NaCl

Ảnh hưởng của mật độ vi sinh lên hoạt tính

phản nitrate của A xylosoxidans III-8

MT3 (acetate natri, peptone) C/N = 12, có giá thể, điều kiện thiếu khí

Mật độ VS ảnh hưởng mạnh đến tốc độ khử nitrate và hiệu quả xử lý

Mật độ >108 cfu/ml: không kinh tế

108 cfu/ml đạt hiệu quả xử lý 100% sau 36 giờ, tốc độ chuyển hóa

tương đương kết quả thực tế (Weiss WEFTEC 2005)

Đề nghị mô hình MBBR phản nitrate thí

nghiệm sử dụng A xylosoxidans III-8

Mô hình thí nghiệm khảo sát

Đề nghị mô hình MBBR phản nitrate thí

nghiệm sử dụng A xylosoxidans III-8

4 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ

 Nguồn C thích hợp cho chủng A xylosoxidans III-8 trong quá trình phản nitrate

là acetate natri để chuyển hóa 100% N-NO3-, tích lũy nitrite và ammonium không đáng kể sau 96 giờ trong môi trường không giá thể

 Tỷ lệ C/N-NO3- = 4, 12 hay 18 đều không cho sự khác biệt đáng kể về hiệu quả

xử lý

 Khả năng chịu muối của chủng A xylosoxidans III-8 là 3%, hiệu quả xử lý nitrate

trong môi trường 3% NaCl, khi không có giá thể bám dính là 55% và khi có giá thể bám dính là 88%

 Mật độ VSV thích hợp để chuyển hóa nitrate 100% là 108cfu/ml sau 48 giờ trên môi trường có giá thể bám dính với vận tốc chuyển hóa là 0,09 kg N-NO3-/m3/ngày

 Mô hình thiết bị dạng MBBR thí nghiệm được đề nghị dựa trên bề mặt bám dính giá thể là 19,23 m2/kg giá thể và mật độ giá thể là 1177 m2/m3

 Xác định điều kiện hoạt động tối ưu của chủng vi khuẩn nitrate hóa: khả năng chịu muối của AOB và NOB, động học nitrate hóa trong điều kiện nước thải thực và mô hình MBBR cho quá trình nitrate hóa

 Khảo sát ảnh hưởng của các chất ức chế VSV trong nước thải và phương pháp thích ứng VSV trong nước thải có chứa chất ức chế

 Thiết kế hệ thống thu khí hoàn chỉnh, phân tích thành phần và thể tích khí thu được

 Khảo sát điều kiện kết hợp vi khuẩn nitrate hóa và phản nitrate, thử nghiệm mô hình MBBR để xử lý nước thải giàu nitơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

-

HUỲNH VĂN THÀNH

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ

LÝ LOẠI BỎ NITƠ TRONG NƯỚC THẢI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

-

HUỲNH VĂN THÀNH

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ

LÝ LOẠI BỎ NITƠ TRONG NƯỚC THẢI

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS Nguyễn Hoài Hương

Thành phần Hội đồng đánh giá Luận văn Thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ Luận văn Thạc sĩ)

1 PGS TS Lê Mạnh Tân Chủ tịch hội đồng

2 TS Nguyễn Thị Hai Thư ký hội đồng

3 GS TSKH Nguyễn Công Hào Phản biện 1

4 TS Nguyễn Quang Cầu Phản biện 2

5 TS Thái Văn Nam Ủy viên hội đồng

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Huỳnh Văn Thành Giới tính:Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 04/06/1983 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Kỹ Thuật Môi Trường MSHV: 1141810031

I- TÊN ĐỀ TÀI:

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT XỬ LÝ LOẠI BỎ NITƠ TRONG

NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN THUỶ SẢN

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Tăng sinh và phân lập vi khuẩn nitrate hóa và khảo sát chuyển hóa NH4

+

trong môi trường nước thải nhân tạo

- Phân lập tuyển chọn vi khuẩn phản nitrate và khảo sát chuyển hóa NO2-,

NO3 –

trong môi trường nước thải nhân tạo và nước thải thực

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/2012

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 03/2013

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYẾN HOÀI HƯƠNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Học viên thực hiện Luận văn

(Ký và ghi rõ họ tên)

Huỳnh Văn Thành

ii

LỜI CÁM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi những lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn thể các Thầy/Cô đã giảng dạy trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại Học Kỹ Thuật Tp.HCM

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Hướng dẫn Khoa học cho đề tài của tôi, Cô

TS Nguyễn Hoài Hương, người đã hướng dẫn tận tình và giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình tôi thực hiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy/Cô trong Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này

Xin cảm ơn các Anh/chị đồng nghiệp đã tạo điều giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Cảm ơn các bạn sinh viên đã giúp đỡ nhiệt tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Xin được gửi lời cảm ơn đến các công ty: Công ty CP Thủy Sản 4, Công ty (Phường 9, Quận 8, Tp.HCM)

Và cuối cùng, xin được cảm ơn Ba, Mẹ, Vợ, Con và gia đình tôi đã động viên tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn này

Xin được cảm ơn tất cả

Huỳnh Văn Thành

iii

TÓM TẮT

Từ nuôi trồng thủy sản nước thải chế biến, vi khuẩn nitrat bao gồm vi khuẩn oxy hóa amoni (AOB) và vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB) đã được làm giàu và phân lập Hiệu quả loại bỏ ammonium của chúng đối với nước thải tổng hợp với tải trọng N-

NH4

+

là 583 mg / L đã được khảo sát Tương tự như vậy, vi khuẩn khử nitrate và nitrite được phân lập và sàng lọc các vi khuẩn phản nitrate thật sự dựa trên khả năng của chúng để giảm nitrate và nitrite mà không sinh ammonium Các chủng tiềm năng nhất của vi khuẩn đã được tìm thấy có thể giảm hoàn toàn 200 mg / L N-NO3

-, trong khi tích lũy chỉ có 0,05 mg / L N-NO2

và sinh ra <10 mg / L N-NH4+ Giải trình tự gen 16S rRNA của chủng chọn lọc khảo sát và so sánh với GenBank cho

thấy rằng nó thuộc về loài Achromobacter xylosoxidans Các nghiên cứu động học

của N-NO3

-, N-NO2-, N-NH4+ chuyển đổi trong các điều kiện khác nhau cũng đã được thực hiện

iv

ABSTRACT

From aquaculture processing wastewater, nitrifying bacteria including ammonium oxidizing bacteria (AOB) and nitrite oxidizing bacteria (NOB) were enriched and isolated Their ammonium removal efficiency for synthetic wastewater with N-

NH4

+

loading of 583 mg/L was investigated Similarly, nitrate and nitrite reducing bacteria were isolated and screened for true denitrifiers based on their ability to reduce nitrate and nitrite without the ammonification The most potential bacterial strain was found to be able to reduce completely 200 mg/L N-NO3

-, while accumulate only 0,05 mg/L N-NO2- and gerenate <10 mg/L N-NH4+ Its 16S rRNA gene sequencing and comparison with genbank shows that it belongs to the speciesAchromobacter xylosoxidans The kinetic studies of N-NO3-, N-NO2- and N-NH4+ conversion under different conditions were also carried out

v

MỤC LỤC Trang

LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii TÓM TẮT iii ABSTRACT iv MỤC LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH BẢNG x DANH SÁCH HÌNH xii CHƯƠNG: MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Phương pháp nghiên cứu 4

5 Ý nghĩa của đề tài 4 5.1 Ý nghĩa khoa học 4 5.2 Ý nghĩa thực tiễn 5 5.3 Dự kiến các kết quả đạt được của luận văn 5 5.4 Giới hạn của luận văn 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6 1.1 TỔNG QUAN VỀ NGÀNH CHẾ BIẾN THỦY SẢN VÀ NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN THỦY SẢN 6 1.1.1 Giới thiệu chung về ngành chế biến thủy sản 6 1.1.2 Lưu lượng và thành phần nước thải chế biến thỷ sản 7 1.1.3 Nồng độ muối 8 1.1.4 Hiện trạng xử lý nước thải của ngành chế biến thủy sản 9 1.2 TỔNG QUAN MỘT SỐ QUÁ TRÌNH XỬ LÝ NITƠ BẰNG PHƯƠNG

PHÁP SINH HỌC 11 1.2.1 Quá trình nitrate hóa 11

vi

1.2.2 Khử nitrate sinh học 14 1.2.3 Tăng cường sinh học (Bioaugmentaion) 15 1.3 MỘT SỐ QUÁ TRÌNH KHỬ NITƠ 17 1.3.1 Quá trình anammox 17 1.3.2 Quá trình Sharon 21 1.3.3 Quá trình Canon 23 1.4 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN NITRATE HÓA 25 1.4.1 Những vi khuẩn oxi hóa nitơ hay vi khuẩn nitrate hóa (Nitrifying Bacteria) 25 1.4.2 Những yếu tố hay điều kiện môi trường ảnh hưởng đến vi khuẩn nitrate hóa

và quá trình nitrate hóa 31 1.4.2.1 Sự tích lũy NO2

31 1.4.2.2 Oxi hòa tan (DO) 31 1.4.2.3 Tính kiềm và pH 33 1.4.2.4 Nhiệt độ (Temperature) 34 1.4.2.5 Sự ức chế và độc tính (Inhibition and Toxicity) 35 1.5.TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA 37 1.5.1 Cơ sở di truyền của vi khuẩn phản nitrate 37 1.5.2 Con đường sinh hóa và hô hấp của vi khuẩn phản nitrate hóa 37 1.5.3 Quá trình phản nitrate thông thường 40 1.5.4 Phản nitrate tự dưỡng vô cơ 41 1.5.5 Sản phẩm khí tạo thành 41 1.5.6 Một số vi khuẩn phản nitrate hóa điển hình 42

1.5.6.1 Pseudomonas stutzeri 43

1.5.6.2 Paracoccus denitrificans 44 1.5.6.3 Bacillus azotoformans 45 1.5.6.4 Thiobacillus denitrificans 45

1.5.6.5 Achromobacter xylosoxidans 46

1.5.7 Cơ chế quá trình phản nitrate 47 1.5.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phản nitrate 50

vii

1.5.8.1 Nguồn cung cấp carbon và năng lượng (Cơ chất) 50 1.5.8.2 Điều kiện môi trường kỵ khí 51 1.5.8.3 Điều kiện thích hợp cho vi khuẩn phát triển 52 1.5.9 Một số nghiên cứu trước đây 52 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 54 2.1 Thời gian và địa điểm 54 2.2 Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ & thiết bị 54 2.2.1 Vật liệu 54 2.2.2 Hóa chất 54 2.2.3 Dụng cụ và thiết bị 55 2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 56 2.3.1 Phương pháp luận và mục tiêu nghiên cứu 56 2.3.2 Nội dung và phương pháp tiến hành 56 2.3.2.1 Tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt tính vi khuẩn nitrate hóa 57 2.3.2.2 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn phản nitrate hóa 60 2.3.3 Phương pháp phân tích 66 2.3.3.1 Phương pháp phân tích vi sinh 66 2.3.3.2.Phương pháp định tính NH4

+

, NO3-, NO2- 70 2.3.3.3 Các phương pháp phân tích hóa học (định lượng) 71 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 74 3.1 Tăng sinh, phân lập và khảo sát hoạt tính vi khuẩn nitrate hóa 74 3.1.1 Tăng sinh và phân lập vi khuẩn nitrite hóa và khảo sát chuyển hóa NH4+ trong môi trường nước thải nhân tạo 74 3.1.1.1.Tăng sinh AOB và phát hiện hoạt tính 74 3.1.1.2 Phân lập AOB 74 3.1.1.3 Khảo sát hoạt tính chuyển hóa NH4+ trong môi trường nhân tạo 74

3.1.2.Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrate hóa của các chủng NOB có nguồn gốc từ nhà máy chế biến thủy sản (CBTS) 78 3.1.2.1.Tăng sinh NOB 78