Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn lá cây hồng xiêm

Với mục đích nghiên cứu để tìm hiểu khả năng khai thác và sử dụng lá cây hồng xiêm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒNG XIÊM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài này, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Vũ Văn Điền –

Người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS Chử Thị Thanh Huyền đã tận tình hướng

dẫn tôi thực hiện khóa luận

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:

PGS.TS Cao Văn Thu đã giúp đỡ tôi thực hiện thử tác dụng kháng khuẩn

TS Nguyễn Quốc Huy đã giúp đỡ tôi xác định tên khoa học của mẫu cây

nghiên cứu

Các thầy cô giáo trong bộ môn Dược Cổ Truyền, Đại học Dược Hà Nội

Cảm ơn nhà trường đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài

Cảm ơn gia đình bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Bùi Hồng Tài

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Manilkara 2

1.1.2 Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae) 2

1.1.3 Đặc điểm chi Manilkara 2

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây hồng xiêm 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY HỒNG XIÊM 4

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC 5

1.4 TÍNH VỊ, CÔNG NĂNG 6

1.5 CÔNG DỤNG 7

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 8

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 8

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 8

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học 10

2.2.3 Thử tác dụng kháng khuẩn 10

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học 10

2.3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn 11

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA 12

3.1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 12

3.1.1 Đặc điểm dược liệu lá cây hồng xiêm 12

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá 12

3.1.3 Đặc điểm bột lá 13

3.2 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 14

3.2.1 Định tính các nhóm chất có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 14

3.2.2 Chiết xuất 21

3.2.3 Định tính các phân đoạn bằng SKLM 25

3.2.4 Phân lập chất từ cắn phân đoạn Ethyl acetat 31

3.3 THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN 39

3.3.1 Chuẩn bị 39

3.3.2 Tiến hành 40

3.4 BÀN LUẬN 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây hồng xiêm có nguồn gốc từ Nam Mỹ, chủ yếu ở Mêhicô Hiện nay được di thực vào nhiều nước nhiệt đới Ở châu Á, hồng xiêm được trồng nhiều nhất tại Thái Lan, Philippin, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Campuchia, Việt Nam [14] Ở Việt Nam, chủ yếu được trồng ở miền Nam, nhưng ở miền Bắc cũng được trồng ở nhiều nơi Cây trồng chủ yếu để lấy quả Nhựa chiết từ vỏ và quả hồng xiêm sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm, lá cây hầu như không được sử dụng [14], [11] Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về cây hồng xiêm rất hạn chế đặc biệt nghiên cứu về lá cây hầu như chưa có Tuy nhiên ở nước ngoài có khá nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của lá cây Với mục đích nghiên cứu để tìm hiểu khả năng khai thác và sử dụng lá cây hồng xiêm, chúng tôi

tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học

và tác dụng kháng khuẩn của lá cây hồng xiêm ” được thực hiện với một số mục

tiêu sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, vi phẫu và bột lá cây hồng xiêm

2 Nghiên cứu các nhóm chất và phân lập chất từ lá cây hồng xiêm

3 Thử hoạt tính kháng khuẩn lá cây hồng xiêm

Để thực hiện những mục tiêu đã đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật lá cây hồng xiêm thu hái ở Nghệ An: Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá, đặc điểm bột lá

2 Xác định các nhóm chất có trong lá cây và các phân đoạn dịch chiết bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

3 Định lượng sơ bộ khối lượng các phân đoạn

4 Định hướng phân lập chất sạch từ phân đoạn ethyl acetat

5 Thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết toàn phần

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Manilkara

Cây hồng xiêm có tên khoa học là Manilkara zapota (L.) P.Van Royen [5]

Tên đồng nghĩa: Achras zapota L [5]

Tên nước ngoài: Sapota, sapodilla plum (Anh), sapotier, sapotillier (Pháp) [14],[17] Chi Manilkara, họ Hồng xiêm (Sapotaceae), bộ Hồng xiêm (Sapotales), phân lớp

Sổ (Dilleniidae), lớp Ngọc lan (Magnolisida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

1.1.2 Đặc điểm chung của họ Hồng xiêm (Sapotaceae)

Họ Hồng xiêm hay còn gọi là họ Xabôchê [8], [1]

Cây gỗ, lá đơn, thường mọc cách, không có lá kèm hay lá kèm nhỏ rụng sớm Cây thường có mủ trắng, hoa lưỡng tính, cánh hoa thường có phần phụ ở bên hay ở lưng, vòng nhị ngoài thường là nhị lép Hoa thành bó, bộ nhị gồm 2-3 vòng, bộ nhụy gồm 4-12 lá noãn, quả mọng, hạt có nội nhũ dầu [1], [6]

Ở Việt Nam có 16 chi, trên 40 loài [1]

1.1.3 Đặc điểm chi Manilkara

Chi Manilkara gồm xấp xỉ 79 loài phân bố khắp các vùng nhiệt đới (30 loài ở Nam và Trung Mỹ, 35 loài ở châu Phi và 14 ở Đông Nam Á) [15]

Cây gỗ, lá đơn, thường mọc cách, không có lá kèm hay lá kèm nhỏ rụng sớm Cây thường có mủ trắng, hoa lưỡng tính, cánh hoa có phụ bộ ở lưng, tiểu nhụy bằng

số cánh hoa, có tiểu nhụy lép Hoa có 6 lá đài, 6 cánh hoa, hột dẹp, dài [8]

Chi Manilkara có chứa triterpenes, saponin và flavonoid Dịch chiết có hoạt tính kháng sinh, diệt ký sinh trùng, chống côn trùng có hại, kháng cholinesterase [18]

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố của cây hồng xiêm

Cây to, cao 10-15m, phân cành nhiều [14], mủ trắng, vỏ xám nâu, lỗ bì tròn [5]

Cành và lá khi còn non được phủ lông tơ Lá mọc gần nhau ở chót nhánh [5], mọc

so le, dày và dai, hình trứng hoặc trái xoan, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, mặt trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt, gân phụ nhiều, xếp song song, đều đặn [14], cách

nhau 4-6 mm [5]

Hoa mọc đơn độc ở kẽ lá, lưỡng tính màu vàng nhạt, đài 6 răng, xếp thành hai hàng, phủ lông màu vàng, tràng 6 cánh, nhị 6, nhị lép nhiều, bầu 10-12 ô [14], [5] Quả mọng hình trứng, vỏ mỏng màu nâu, rốn kéo dài màu nâu nhạt và nháp, hạt dẹt, màu đen, nhọn ở hai đầu [14], [11] Quả có đường kính 4-8 cm, chứa 2-5 hạt [30] Mùa hoa: Tháng 5-8, mùa quả: Tháng 9-11 [14]

1.1.4.2 Phân bố

Cây có nguồn gốc Trung Mỹ và Nam Mỹ, chủ yếu ở Mêhicô [14], [19], [24], [31] Hiện nay được di thực vào nhiều nước nhiệt đới Ở châu Á, hồng xiêm được trồng nhiều nhất tại Thái Lan, Philippin, Malaysia, Indonesia, Srilanca, Ấn Độ, Campuchia và Việt Nam [14], [17] Ở Việt Nam, cây được trồng ở hầu hết các tỉnh

từ Bắc vào Nam, trừ vùng núi cao trên 1000m Hồng xiêm là cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, với nhiệt độ thích hợp từ 24 đến 30˚C Cây trồng ở các tỉnh phía Bắc

có thể chịu được nhiệt độ dưới 10˚C về mùa đông Cây không mọc được ở vùng khô hạn [14]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY HỒNG XIÊM

Lá và vỏ thân chứa terpenoid, flavonoid, glycosid [21], [28]

 Lá cây hồng xiêm chứa steroid, triterpenoid, terpenoid, phenol, coumarin, tanin, glycosid tim, saponin, anthraquinon [26], flavonoid (apigenin-7-O-α-L-rhamnosid, myricetin-3-O-α-L-rhamnosid [24]), acid béo trong đó acid béo không

no chiếm 32,32% (thành phần chính là: acid oleic 13,95%, acid linoleidic 10,18%

và acid linoleic 5,96%) [17], [24], acid oleanolic, lupeol acetat [17]), acid béo no chiếm 59,95% (acid palmitic 48,01%, acid stearic 8,3%), hydrocarbon chiếm 89,303% các hợp chất không xà phòng hóa, thành phần chính n-Triacontan 49,50%

và n-octacosan 23,83%, 2 sterol (sitosterol 3,40%, stigmasterol 2,61%) [24]

 Vỏ cây chứa 11,8% chất tanin [14], [17], [20], saponin và một lượng nhỏ alkaloid kết tinh gọi là sapotin [5] và chất nhựa mủ Nhựa mủ khi cô đặc, khối lượng giảm còn 30-33%, có màu trắng sau chuyển thành màu đỏ hồng Nhựa mủ chứa 44,8% chất nhựa, 17,2% carbohydrat, 3,4% chất gôm và 9% đường Khi tinh chế chất nhựa mủ bằng cách rửa nhiều lần với kiềm mạnh, sau đó trung hòa và sấy khô, sẽ thu được một chất bột vô định hình, không tan trong nước [14]

 Quả chứa carbohydrat, protein, chất béo, canxi, phosphor, sắt, acid ascorbic, fructose 4,47-7,13%, sucrose 1,48-8,75%, tổng số đường 11,14-20,43%, tinh bột 2,98%, tanin 3,16-6,45% [17], [24], [29], polyphenols (methyl chlorogentat,

dihydromyricetin, quercitrin, myricitrin, catechin, epicatechin, gallocatechin, gallic acid) [22]

 Qủa hồng xiêm còn xanh và vỏ thân chứa chất dịch sữa, trong đó gôm chiếm 20-25% và nhiều tanin [14], [17] Quả chín chứa 14% đường mà thành phần chủ yếu là sacharose, dextrose và levulose [17]

 Hạt chứa 1% saponin và 0,08% sapotinin [14], [17], dầu béo và acid cyanhydric [14], alkaloid, phenol (Quercitol [20], [21]), flavonoid [27]

1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC

 Hoạt tính kháng khuẩn:

 Vỏ thân và lá: Dịch chiết ethanol, methanol và nước có hoạt tính kháng

khuẩn với 4 gram (+) (Bacillus subtilis BTCC19, Bacillus megaterium BTCC18,

Bacillus cereus ATCC258 and Sarcina lutea ATCC27803), 5 gram (-) (Escherichia coli ATCC25922, Shigella sonnei ATTC8992, Shigella shiga ATCC27853, Shigella dysenteriae ATCC561 and Salmonella typhi ATCC14228 và 5 chủng nấm (Aspergillus flavus ACCT10558, Aspergillus fumigatus ATTC10231, Candida albicans ATTC25889, Vasianfactum sp ATTC235561, Fusarium sp ACCT56390)

[21], [25], [28]

Dịch chiết methanol, ethanol có hoạt tính mạnh hơn dịch chiết nước [25], [28]

 Hạt: Dịch chiết aceton có hoạt tính kháng khuẩn với Vibrio cholerae MTCC

3906, Salmonella paratyphi A, Shigella flexneri MTCC 1457, Staphylococcus epidermidis MTCC 435 [25], [28]

 Hạ đường huyết:

Dịch chiết nước và cồn của lá cây hồng xiêm giảm đáng kể nồng độ đường trong máu so với tác dụng của metformin Tuy nhiên dịch chiết không thay đổi đáng

kể nồng độ đường trong máu của những con chuột bình thường Cơ chế hoạt động

có thể tương tự của biguanid (metformin) [24], [28]

 Hạ cholesterol:

Dịch chiết nước và dịch chiết cồn lá làm giảm đáng kể mức độ cholesterol trong

máu chuột gần với atorvastatin [24]

 Tác dụng chống oxy hóa:

 Dịch chiết ethanol, methanol, aceton và nước từ lá có tác dụng chống oxy hóa trên chuột Trong đó dịch chiết methanol tác dụng yếu, dịch chiết aceton có tác dụng chống oxy hóa mạnh [16]

 Dịch chiết methanol, aceton, ethanol, ethyl acetat, nước của hạt hồng xiêm

có tác dụng chống oxy hóa, trong đó dịch chiết cồn có tác dụng mạnh hơn ở cùng nồng độ [19] Tác dụng chống oxy hóa của cây hồng xiêm chủ yếu do polyphenolic

 Tác dụng diệt giun sán:

Dịch chiết ethanol và chloroform phôi hạt hồng xiêm có tác dụng làm tê liệt và diệt giun sán (sau 8 và 23 phút với dịch chiết chloroform, sau 3,3 và 7 phút với dịch chiết ethanol (12,5 mg/ml) [24]

 Tác dụng giảm đau :

Dịch chiết methanol và ether dầu hỏa lá cây hồng xiêm với liều 200mg/kg có tác dụng giảm đau 96,82% và 94,27% trên chuột [28], có ý nghĩa thống kê (p˂0,001) so với nhóm chứng [23]

 Độc tính

LD50 của dịch chiết nước và cồn lá hồng xiêm là 8g/kg [24]

Liều hiệu quả tối thiểu 8mg/kg cân nặng theo đường tiêm dưới da và 16mg/kg cân nặng theo đường uống [24]

ở Mỹ, Canada để chế tạo cao su [14], [17], dùng trong phẫu thuật nha khoa [28] Chất nhựa được dùng làm kẹo bạc hà, kẹo hồi [11] có khi được thêm chất pepsin với tên chewing gum, dùng làm thuốc chữa ho, giúp tiêu hóa hoặc làm thơm miệng [11], [28]

 Lá sắc uống hàng ngày để giảm huyết áp [17], chữa ho, cảm lạnh, tiêu chảy [16]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

 Mẫu nghiên cứu

Mẫu tươi: Lá cây tươi rửa sạch, dùng làm vi phẫu và nghiên cứu đặc điểm thực vật Mẫu khô: Lá cây hồng xiêm sau khi làm sạch, được sấy khô ở nhiệt độ dưới 60˚C:

- Tán thành bột mịn dùng để soi bột

- Xay thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo dùng để nghiên cứu hóa học và thử tác dụng kháng khuẩn

 Thời điểm thu hái: 11/2013

 Mẫu dược liệu được TS Nguyễn Quốc Huy – Bộ môn thực vật – Trường ĐH

Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Manilkara zapota (L.) P Royen, họ

Hồng xiêm (Sapotaceae)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

 Tủ sấy dược liệu SHELLAB

 Cân kỹ thuật Satorious

 Cân phân tích Precisa

 Kính hiển vi Labomed

 Hệ thống máy chấm sắc ký: thiết bị bơm mẫu tự động LIMONAT5), máy nén khí, phần mềm winCATS, videoSCAN

(CAMAG- Máy ảnh Sony 12.1

 Máy sấy Blustone

 Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI Rotavapor R-200

 Hóa chất và dụng cụ

 Hóa chất và thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu được mua tại Hà Nội, đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích theo Dược Điển Việt Nam IV [9]

 Hóa chất: Javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ carmin…

 Dung môi hữu cơ: Chloroform, methanol, ethanol, ethyl acetat, n-hexan, toluen, acid formic…

 Thuốc thử: Các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký

 Dụng cụ: Dụng cụ thủy tinh và các bộ dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm như: cốc có mỏ, bình nón, đũa thủy tinh, chày, cối, lam kính, ống nghiệm

…

 Môi trường dùng để thử hoạt tính kháng khuẩn

 MT canh thang nuôi cấy VSV kiểm định: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, nước vđ 100ml

 MT thạch thường: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt, thạch 1,6%, nước vđ 100ml

 Chủng vi sinh vật

10 chủng vi sinh vật (5 gram (+), 5 gram (-)) đạt tiêu chuẩn được lấy ở bộ môn Vi sinh-Sinh học trường đại học Dược Hà Nội

Nhóm gram (+):

- Staphylococcus aureus ATCC 1128 (Sta)

- Bacillus subtilis ACTT 6633 (Bs)

- Bacillus cereus ACTT 9341 (Bc)

- Bacillus pumilus ATCC 10241 (Bp)

- Sarcina lutea ATCC 9341 (SL)

Nhóm gram (-):

- Escherichia coli ATCC 25922 (EC)

- Pseudomonas aeruginosa VM 201 (Pseu)

- Salmonella typhi DT 220 (Sal)

- Shighella flexneri DT 112 (Shi)

- Proteus mirabilis BV 108 (Pro)

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

 Nghiên cứu đặc điểm bột và vi phẫu lá hồng xiêm

 Mô tả đặc điểm dược liệu lá hồng xiêm

2.2.2 Nghiên cứu về hóa học

 Định tính các nhóm chất chính trong lá cây hồng xiêm bằng phản ứng hóa học

 Chiết phân đoạn, xác định hàm lượng các phân đoạn và định tính các phân đoạn dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng

 Định hướng phân lập chất sạch bằng sắc ký cột

2.2.3 Thử tác dụng kháng khuẩn

 Thử tác dụng kháng khuẩn của 3 loại cao lỏng cồn ở 3 nồng độ 1:1, 1:2, 1:4

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

 Nghiên cứu đặc điểm hình thái:

Quan sát, chụp ảnh, mô tả đặc điểm lá

 Nghiên cứu đặc điểm vi học:

- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và bột lá theo tài liệu: [3], [4], [12]

- Quan sát cấu tạo vi phẫu lá và bột lá bằng kính hiển vi

- Chụp ảnh các đặc điểm vi học bằng máy ảnh

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu bằng các phản ứng

hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng theo tài liệu: [2], [3], [7], [10]

- Phân lập các chất bằng sắc ký cột theo tài liệu [3]

2.3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn

Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng cồn 1:1, 1:2, 1:4 với các chủng vi khuẩn Gram (+), Gram (-) theo phương pháp khuếch tán trong môi trường thạch (dùng khoanh giấy tẩm dd thử) [13]

 Nguyên tắc: Mẫu thử được tẩm vào khoanh giấy lọc vô trùng, đặt lên trên

lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp

của VSV kiểm định, tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh mẫu thử Đo đường kình vòng vô khuẩn (nếu có) để đánh giá kết quả

 Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh giá

theo công thức :

=

SD=

Trong đó: : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: Số thí nghiệm làm song song (n=3)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QỦA

3.1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT

3.1.1 Đặc điểm dược liệu lá cây hồng xiêm

Hình 3.1 Ảnh chụp lá cây hồng xiêm

Lá hình trái xoan, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài từ 5 cm đến 13 cm Phiến

lá nguyên, dày, mép nguyên Mặt trên màu lục bóng, mặt dưới nhạt Cuống lá nhẵn, dài 4-15 mm Gân phụ nhiều, xếp song song, đều đặn, cách nhau 4-5 mm Thể chất dai Không mùi, vị chát, hơi đắng

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá

- Phần gân lá: Gân lá hai mặt lồi, mặt trên lồi ít, mặt dưới lồi nhiều Biểu bì trên

(11) và biểu bì dưới (1) gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều đặn, hóa cutin Mô dày (2) gồm 5-6 hàng tế bào hình trứng, thành dày Mô mềm vỏ (3) gồm các tế bào

thành mỏng, hình gần tròn, kích thước không đều, xếp lộn xộn Vòng bó sợi chứa

các tinh thể canxi oxalat (4) hình khối, bao quanh bó libe-gỗ Libe-gỗ tạo thành bó hình cung, libe (5) ở ngoài, gỗ (6) ở trong, các mạch gỗ xếp thành hàng đều đặn

Mô mềm ruột (7) gồm các tế bào thành mỏng, không đều, xếp lộn xộn bên trong bó

libe-gỗ (Hình 3.2.b)

- Phần phiến lá: Biểu bì trên (11), biểu bì dưới (8) gồm các tế bào nhỏ xếp đều

đặn thành 1-2 hàng Mô dậu (10) gồm 1-2 hàng tế bào hình chữ nhật xếp vuông góc với các hàng tế bào biểu bì Mô khuyết nằm rải rác trong phiến lá (9) (Hình

3.2.a)

bào (7), mảnh mạch dẫn chứa tinh thể canxi oxalat (8)

Hình 3.2 Ảnh chụp vi phẫu lá cây hồng xiêm dưới KHV

Ghi chú : a Phiến lá: 8 Biểu bì dưới 10 Mô dậu

9 Mô khuyết 11 Biểu bì trên

b Gân lá: 1 Biểu bì dưới 5 Libe

2 Mô dày 6 Gỗ

3 Mô mềm vỏ 7 Mô mềm ruột

4 Bó sợi chứa tinh thể

Hình 3.3 Ảnh chụp một số đặc điểm bột lá cây hồng xiêm Ghi chú: 1 Tinh thể canxi oxalat hình khối 5 Mảnh mô mềm

2 Mảnh biểu bì 6 Mảnh mang màu

3 Mảnh mạch dẫn 7 Mảnh biểu bì mang lỗ khí

4 Bó sợi 8 Bó sợi chứa tinh thể canxi oxalat

3.2 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC

3.2.1 Định tính các nhóm chất có trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

3.2.1.1 Định tính flavonoid

Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 50ml ethanol 90˚ Đun

cách thủy 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc Cô dịch lọc tới cắn (1), hòa tan cắn vào

nước nóng, lọc nóng Cô dịch nước tới cắn (2), hòa tan cắn vào cồn 90˚ lấy dịch làm

các phản ứng sau:

 Phản ứng Cyanidin

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dung dịch thử Thêm một ít bột magnesi kim loại

(khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đặc (3-5 giọt) Để yên một vài phút Quan sát

thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ thẫm → Phản ứng dương tính

 Phản ứng với kiềm loãng

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dung dịch thử Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Quan sát thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng

của dung dịch sẽ được tăng thêm → Phản ứng dương tính

Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac lỏng đã được mở nút, quan sát thấy màu vàng của vết dịch chiết được tăng lên Nhỏ một

giọt khác làm chứng → Phản ứng dương tính

quan sát thấy xuất hiện tủa màu xanh đen → Phản ứng dương tính

 Phản ứng diazo hóa

Cho 1ml dung dịch thử vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%, thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng nhẹ Quan sát thấy xuất

hiện màu vàng cam → Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa flavonoid

3.2.1.2 Định tính coumarin

 Vi thăng hoa

Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng nhôm Đặt lên bếp điện có lưới amian, cho bay hơi hết nước trong dược liệu Đặt trên miệng nắp nhôm một phiến kính, trên đó có đặt ít bông tẩm nước lạnh Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy phiến kính ra, để nguội, đặt lam kính lên, soi dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim không màu Nhỏ thêm 1 giọt dd KI 10% lên phiến kính, soi dưới kính hiển vi thấy

tinh thể hình kim màu tím → Phản ứng dương tính

 Cho 10g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol 90% Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc thu được dùng để tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1-2 ml dịch chiết ethanol

+ Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

+ Ống 2: Để nguyên

Đun cả 2 ống nghiệm trên nồi cách thủy vài phút, quan sát thấy:

+ Ống 1: Xuất hiện tủa đục

+ Ống 2: Trong suốt

Thêm vào 2 ống nghiệm 2ml nước cất, lắc đều thấy:

+ Ống 1: Trở lại trong suốt

+ Ống 2: Thấy xuất hiện tủa đục

Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đặc thấy ống 1 đục trở lại → Phản ứng dương tính

 Phản ứng chuyển dạng đồng phân cis-trans:

Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, nhỏ tiếp 1 giọt dung dịch NaOH 10%, sấy nhẹ cho đến khô Che 1 nửa diện tích bằng một mảnh kim loại, soi dưới đèn tử ngoại trong vài phút, bỏ mảnh kim loại ra Quan sát thấy phần không bị che sáng

hơn phần bị che → Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa coumarin

3.2.1.3 Định tính Glycosid tim

Cho 10g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol 25%, lắc đều, ngâm qua đêm Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat nữa Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn

125 ml Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp chloroform - ethanol (4:1), mỗi lần 8ml Gạn lớp chloroform vào một cốc có mỏ dung tích 100ml đã được sấy khô Gộp dịch chiết chloroform lại Cho dịch chiết vào 3 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách thủy đến cắn Cắn thu được để làm các phản ứng:

 Phản ứng Liebermann – Burchard

Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn, để ống

chia thành 2 lớp

Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, chất

lỏng phía dưới màu hồng, phía trên màu xanh lá → Phản ứng dương tính

Cho vào ống nghiệm 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn, thêm vài giọt

Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ, lớp

chất lỏng trên có màu xanh lá → Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu chứa glycosid tim

3.2.1.4 Định tính Saponin

Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm

5ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước, lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm Để yên 15 phút, quan sát thấy bọt

bền vững sau hơn 15 phút → Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chứa saponin

3.2.1.5 Định tính Alcaloid

Cho khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu

(mỗi lần 5ml) Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết nước, cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml, để tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng với TT Mayer: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất

hiện tủa trắng → Phản ứng âm tính

 Phản ứng với TT Dragendroff: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendroff, không

thấy xuất hiện tủa da cam → Phản ứng âm tính

 Phản ứng với TT Bouchardat: Thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, không

thấy xuất hiện tủa nâu đỏ → Phản ứng âm tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có alcaloid

3.2.1.6 Định tính tanin

Chuẩn bị mẫu thử: Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 2g bột dược liệu,

thêm 20ml nước cất, đun sôi trên bếp qua lưới amian trong khoảng 10 phút Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp Lấy dịch lọc làm các phản ứng

Tiến hành phản ứng: Lấy 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml dịch lọc

tính

+ Ống 2: Thêm 2 giọt chì acetat 10%, không xuất hiện tủa bông → Phản ứng âm

tính

+ Ống 3: Thêm 5 giọt gelatin 1%, xuất hiện tủa trắng đục → Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu có tanin

3.2.1.7 Định tính đường khử

Chuẩn bị mẫu thử: Cho 2g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Lấy dịch lọc tiến hành phản ứng

Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch lọc, 3 ml dd Fehling A (TT) và 3 ml

dd Fehling B (TT), lắc kỹ, đun cách thủy vài phút thấy xuất hiện kết tủa đỏ gạch →

Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu chứa đường khử

3.2.1.8 Định tính anthranoid

 Phản ứng Borntrager:

Đun sôi cách thủy trong 15 phút Lọc nóng vào bình gạn Để nguội, lắc với 5ml chloroform, để yên phân lớp, gạn lấy lớp chloroform để tiến hành phản ứng

Lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1ml NaOH 10% vào lắc nhẹ,

không thấy lớp nước có màu hồng → Phản ứng âm tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có anthranoid

3.2.1.9 Định tính acid hữu cơ

Lấy 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống

Quan sát thấy hai ống có màu như nhau → Phản ứng âm tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có polysaccharid

3.2.1.11 Định tính acid amin

Lấy 2g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn, thêm 10ml nước cất Đun sôi trực

tiếp 10 phút trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lọc Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc

và 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 10 phút, xuất hiện màu tím →

Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu có acid amin

3.2.1.12 Định tính chất béo, caroten, sterol

Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50ml, đổ ngập ether dầu hỏa, đun cách thủy 15 phút Lọc lấy dịch lọc làm phản ứng

 Định tính chất béo

Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi, thấy để lại

vết mờ trên giấy lọc → Phản ứng dương tính

Sơ bộ kết luận: Dược liệu có chất béo

 Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết trên, bốc hơi dung môi đến khô, thêm vào

Cho vào ống nghiệm to 2ml dịch chiết trên, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn,

Sơ bộ kết luận: Dược liệu có caroten

Kết quả định tính các nhóm chất trong dịch chiết toàn phần lá cây hồng xiêm được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây hồng xiêm

Có

- PU chuyển dạng đồng phân cis - trans

+ +

Có

Có

- Phản ứng với chì acetat

- Phản ứng với gelatin 1%

+

- +

Có

3.2.2 Chiết xuất

 Chuẩn bị bột dược liệu

Lá được sấy khô ở 60˚C, tán thành bột thô đồng thời xác định độ ẩm dược liệu