Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây hồng

Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học .... Với mục đích cung cấp cái nhìn tổng quát về thực vật, hóa học và sinh học cho dược liệu lá Hồng, đặt cơ sở bước đầu cho

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

1 Bộ môn Dược học cổ truyền

2 Bộ môn Vi sinh – Sinh học

HÀ NỘI - 2014

nhiều sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ thầy cô, gia đình và bạn bè Những sự quan tâm giúp đỡ quý báu đó đã góp phần giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Văn Điền,

người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và cho tôi nhiều lời khuyên quý báu Thầy đã dành nhiều thời gian và công sức tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền đã luôn giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm tại Bộ môn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Cao Văn Thu (Bộ môn

Vi sinh – Sinh học) và TS Nguyễn Quốc Huy (Bộ môn Thực vật), những người đã

nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở bên tôi, giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong công việc, đồng thời cũng là nguồn động viên khích lệ tinh thần giúp tôi cố gắng hoàn thành tốt khóa luận của mình

Do hạn chế về thời gian và phạm vi đề tài, kết quả nghiên cứu của tôi mới chỉ là bước đầu, đồng thời trong quá trình thực hiện khó tránh khỏi thiếu sót, tôi rất mong nhận được những góp ý của thầy cô và bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Bạc Cầm My

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.2 Thành phần hóa học 5

1.3 Tác dụng sinh học của vị thuốc lá cây Hồng 8

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng 16

3.1.1 Đặc điểm hình thái 16

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 17

3.1.3 Đặc điểm bột lá 19

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng 20

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 20

3.2.2 Chiết xuất, định tính và định lượng các phân đoạn 28

3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng 42

3.3.1 Thử tác dụng kháng khuẩn của cao cồn toàn phần 42

3.3.2 Thử tác dụng kháng khuẩn của phân đoạn chloroform và ethyl acetat 45

3.4 Bàn luận 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kaempferol phân lập

từ lá Hồng đối với một số chủng vi sinh vật 9

2 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Hồng 27

3 Bảng 3.2 Hàm lượng cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 31

4 Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn các phân đoạn dịch chiết lá Hồng 32

5 Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của cao lỏng toàn phần

các nồng độ 1:1, 1:2, 1:4 44

6 Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của 2 phân đoạn

chloroform và ethyl acetat 45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Hình ảnh cây Hồng và một số bộ phận của cây 4

2 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 14 triterpenoid phân lập từ lá Hồng 6

3 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá Hồng 7

4 Hình 3.1 Cành mang lá cây Hồng 16

5 Hình 3.2 Hình thái lá cây Hồng 16

6 Hình 3.3 Ảnh chụp vi phẫu gân lá Hồng 17

7 Hình 3.4 Ảnh chụp vi phẫu phiến lá Hồng 18

8 Hình 3.5 Đặc điểm bột dược liệu lá Hồng 19

9 Hình 3.6 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ lá cây Hồng 30

10 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng với hệ

dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1) 34

11 Hình 3.8 Kết quả sắc ký đồ phân đoạn n-hexan dịch chiết lá Hồng

quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm 35

12 Hình 3.9 Sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá Hồng với hệ

dung môi khai triển Toluen: EtOAc: Acid formic (8:3:1) 37

13 Hình 3.10 Kết quả sắc ký đồ phân đoạn chloroform dịch chiết lá

Hồng quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm 38

14 Hình 3.11 Sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat với hệ dung môi khai

triển Toluen: EtOAc: Acid formic (9:6:1) 40

15 Hình 3.12 Kết quả sắc ký đồ phân đoạn ethyl acetat quan sát dưới

ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm 41

16 Hình 3.13 Sơ đồ sắp xếp khoanh giấy lọc các mẫu thử hoạt tính

17 Hình 3.15 Vòng vô khuẩn của mẫu thử phân đoạn chloroform và

ethyl acetat với vi khuẩn Bacillus pumilus và Shigella flexneri 46

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Hồng (Diospyros kaki L.f.) là một loài cây thuộc họ Thị (Ebenaceae), có

nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, sau đó du nhập vào Việt Nam [10] Hồng là một nguồn cung cấp phong phú các acid amin, carotenoid, flavonoid, protein, vitamin…[29] Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu chứng minh các chất phân lập

từ lá Hồng có nhiều tác dụng sinh học quan trọng như tác dụng hạ huyết áp [18], kháng khuẩn, chống ung thư [11], chống viêm, hạ lipid máu [29], chống oxy hóa [23]… Điều này cho thấy tiềm năng phát triển lớn của dược liệu này

Ở Việt Nam, cây Hồng được trồng chủ yếu để làm cây ăn quả Một số bộ phận của cây được dùng làm thuốc như tai Hồng (Thị đế), nước ép từ quả Hồng (Thị tất), chất đường từ quả Hồng (Thị sương) [6]… Lá Hồng cũng được sử dụng làm lá trà để chữa bệnh tăng huyết áp Tuy nhiên, việc sử dụng lá Hồng làm thuốc mới chỉ dừng lại ở kinh nghiệm dân gian, chưa có cơ sở khoa học chứng minh tác dụng và hướng dẫn sử dụng loại dược liệu này Các tài liệu của Việt Nam về lá Hồng còn rất hạn chế, chủ yếu là thông tin về đặc điểm hình thái thực vật Với mục đích cung cấp cái nhìn tổng quát về thực vật, hóa học và sinh học cho dược liệu lá Hồng, đặt cơ sở bước đầu cho những nghiên cứu chuyên sâu nhằm phát huy hết

tiềm năng của dược liệu này, chúng tôi tiến hành xây dựng đề tài “Nghiên cứu đặc

điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng”

với các mục tiêu:

1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng

2 Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng

3 Thử hoạt tính kháng khuẩn của lá cây Hồng

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật

1.1.1 Vị trí phân loại chi Diospyros

Cây Hồng có tên khoa học là Diospyros kaki L.f., tên đồng nghĩa: Diospyros

chinensis Blume, là một loài thuộc chi Diospyros Cây còn có các tên gọi khác như

thị đinh, mác pháp (Tày)… Tên nước ngoài: Kaki – persimmon, Japanese persimmon (Anh); kakier, plaqueminier kaki, plaqueminier du Japon, coing de Chine (Pháp) [10], Shi Zi (Trung Quốc) [19]

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 1987 [1],[6], [24], vị trí phân

loại của chi Diospyros được tóm tắt như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Diospyros

2 ô Đài hoa thường có 3-7 thùy Tràng hoa hình chum, hình chuông, hoặc hình ống, 3-7 thùy, rụng sớm Quả thịt, mang đài to không rụng Hạt 1-10 (hoặc hơn), thường hẹp theo bề ngang [22]

1.1.2.2 Phân bố

Chi Diospyros là chi lớn nhất trong họ Ebenaceae, có khoảng 500 loài, phân

bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới (ở châu Á có tới 200 loài) và một số nơi thuộc khu vực ôn đới, trong đó đa dạng nhất ở khu vực Đông và Đông Nam Á, chỉ có một số loài ở Tây Á, Nhật Bản và Đông Nam nước Mỹ [24] Trung Quốc có 60 loài, nhiều nhất ở Đông Nam và Tây Nam Trung Quốc [22] Ở nước ta, đã thống kê được 70

loài [7], 9 loài cho gỗ có giá trị sử dụng, 2 loài có quả ăn được là Hồng (D.kaki) và Cậy (D.lotus) [10]

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Diospyros kaki L.f

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật

Cây gỗ lớn cao tới 15m Lá mọc so le; có cuống ngắn, dài không quá 1 cm Phiến lá thuôn hình trứng hoặc trái xoan, dài 6 – 18 cm, rộng 3 – 9 cm, đầu có mũi lồi ngắn, gốc lá nhọn dần, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có lông tơ, mép nguyên hay hơi lượn sóng

Cụm hoa mọc ở kẽ lá, màu vàng nhạt Cây đực, cây cái riêng biệt hoặc có khi hoa đực, hoa cái có trên cùng một cây Hoa đực tụ họp thành xim 3 hoa ở nách lá,

có 2 lá bắc, 14-24 nhị thường là 16 Hoa cái mọc đơn độc, đài xẻ 5 thùy, bầu có 4 vòi nhụy và 4 ô, thường có vách giả chia làm 8 ngăn [8], [10], [22]

Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, nhẵn, phẳng hoặc có sống dọc, mang đài tồn tại cong lên, khi chín màu vàng hoặc đỏ Hạt dẹt, màu nâu vàng hoặc nâu đen (Hình 1.1)

Mùa hoa: tháng 3 – 7, mùa quả: tháng 8 – 10 [10]

1.1.3.2 Phân bố

Diospyros kaki L.f loài nguyên sản ở Nhật Bản và Trung Quốc, sau được du

nhập sang các nước Đông Nam Á khác như ở vùng Bắc Thái Lan, đảo Java, Sumatra (Indonesia); Malaysia Ở Italia, Israel, Brazil, Mỹ (California) cũng có trồng loài hồng này

Ở Việt Nam, D kaki là loài hồng được trồng phổ biến Đây là cây ăn quả lâu

đời ở các tỉnh phía Bắc từ Thanh Hóa trở ra Cây thường trồng ở vườn nhà, vườn

trang trại từ độ cao 500m trở xuống Ở miền Nam, hồng mới được phát triển ở Đà Lạt (Lâm Đồng) Các giống hồng đang được trồng hiện nay vô cùng phong phú như hồng Hạc, hồng Lạng, hồng vuông, hồng trứng… [10]

Hình 1.1 Hình ảnh cây Hồng và một số bộ phận của cây Chú thích:

1.2 Thành phần hóa học

Trên thế giới, nhiều hợp chất đã được phân lập từ các bộ phận khác nhau của cây Hồng, chủ yếu thuộc các nhóm chất glycoside, flavonoid, tanin, saponin, sterol

và triterpenoid [20], [21]

Quả hồng chứa 79,6% nước, 0,8% protein, 0,2% chất béo, 0,4% chất

khoáng, 19% carbonhydrat, calci, phosphor, sắt, caroten, vitamin A, thiamin, riboflavin, niacin và vitamin C Đã tìm thấy trong quả các hợp chất như citrulin, isodiospyrin, bisisodiospyrin, 2,3-butylen glycol, manitol, phytofluen, neodiospyrin, zeaxanthin và lyeopin Quả còn có tanin, pectin và polysaccharid Tanin khi thủy phân với kiềm thu được phloroglucinol và pyrocatechol [10] Tanin có trong quả hồng xanh khiến quả có vị rất chát, khi chín vị chát này hầu như mất đi, khi đó lượng đường khoảng 13 – 19% dưới dạng glucose, saccharose và fructose [8]

Hạt hồng chứa 0,8% acid citric, 4,76% đường khử và 5,9% đường tự do

[10]

Tai hồng chứa acid oleanolic, acid ursolic, acid betulic, acid syringic, acid

vanillic, β-sitosteryl- β-glucoside, trifolin, hyperin và kaempferol [6]

Lá Hồng có chứa nhiều hợp chất hữu cơ, chủ yếu thuộc các nhóm chất:

pectic polysaccharid, flavonoid, triterpenoid, đường, protein, các acid amin, vitamin… [12], [17], [29]

 Triterpenoid

Năm 2008, các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc (tại Hàn Quốc) đã phân lập và xác định cấu trúc của 14 triterpenoid từ lá cây Hồng (dịch chiết methanol, phân đoạn ethyl acetat) Trong đó có 2 triterpenoid mới và 12 triterpenoid đã biết Cấu trúc của 2 triterpenoid mới được xác định là 3R,19R-dihydroxyurs-12,20(30)-dien-24,28-dioic acid (1) và 3R,19R-dihydroxyurs-12-en-24,28-dioic acid (2)

12 triterpenoid đã biết được nhận diện là: coussaric acid (3), barbinervic acid (4), 24-hydroxy-3-epi-ursolic acid (5), rotungenic acid (6), pomolic acid (7), 24-hydroxyursolic acid (8), ursolic acid (9), 24-dihydroxyurs-12-en-3-on-28-oic acid

(10),oleanolic acid (13), 24-hydroxy-3-epi-oleanolic acid (11), và spathodic acid (14) [25]

Công thức hóa học của 14 triterpenoid được trình bày trong Hình 1.2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 14 triterpenoid phân lập từ lá Hồng

 Flavonoid

Năm 2010, một nghiên cứu tổng quan của các nhà khoa học Trung Quốc cho

thấy lá của loài Diospyros kaki L.f có các hợp chất flavonoid chính tương tự như lá của loài Ginkgo biloba, gồm các chất sau: myricetin, quercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, isoquercitrin, rutin [29]

Cấu trúc của các flavonoid này được trình bày trong Hình 1.3

Myricetin Quercetin Kaempferol

Astragalin Hyperin Isoquercitrin

Rutin Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số flavonoid chính trong lá cây Hồng

Ngoài ra, nhiều hợp chất khác cũng được phân lập từ lá Hồng: gamnamoside [4-(3-hydroxypropyl)-2-methoxyphenol β-D-apiofuranosyl (1→6) β-D-glucopyranoside] (2009) [26]; 8-C-[α-l-rhamnopyranosyl-(1→4)]-α-D-glucopyranosylapigenin (2009) [13]; một số pectic polysaccharid (2003, 2004, 2010) [15], [16], [14]; kaempferol 3-O-beta-D-galactopyranoside (TR),

isorhamnetin 3-O-beta-D-glucopyranoside (IS) (2011) [28]; hyperoside, trifolin, chrysontemin, quercetin-3-O-(200-O-β-alloyl-D-glucopyranoside) (QOG), kaempferol-3-O-(200-O-β-alloyl-D-glucopyranoside) (KOG) (2011); lupeol, β-sitosterol (2014) [11]

Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được công bố về thành phần hóa học của

Tại Nhật Bản, tác dụng ức chế men chuyển angiotensin đã được nghiên cứu

trên bốn flavonoid phân lập từ lá Hồng: astragalin (1), kaempferol -3 -O- (2" -O-

alloyl ) -glucoside (2), isoquercitrin (3) , và quercetin -3 -O- (2 " -O- alloyl glucoside (4) Thử nghiệm được tiến hành trên enzym chuyển angiotensin phân lập

)-từ phổi chuột Các hợp chất (1) – (4) có khả năng ức chế lần lượt là 67%, 53%, 33%, và 48% ở nồng độ 300 µg/ml Nồng độ ức chế 50% (IC50) của (1) và (2) đối với men chuyển tương ứng là 180 µg/ml và 280 µg/ml Mặt khác, (2) và (4) đã được chứng minh là có hoạt tính của tanin, nhưng (1) và (3) không có hoạt tính tanin Những kết quả này cho thấy không có mối quan hệ giữa sự ức chế men chuyển với hoạt tính của tanin trong bốn hợp chất [18]

1.3.2 Tác dụng ức chế vi sinh vật

Khả năng ức chế VSV của kaempferol phân lập từ dịch chiết EtOAc của lá

Hồng đã được khảo sát trên nhiều chủng VSV Các thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch Saboroud, mẫu chuẩn Amphotericin

B đối với nấm; môi trường thạch dinh dưỡng, mẫu chuẩn Penicillin G đối với vi khuẩn Gram (+) và Gentamycin đối với vi khuẩn Gram (-) Kết quả được ghi trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kaempferol phân lập từ lá Hồng

Amphotericin B 3,9 0,98 0,06 0,12 0,98 0,007

Penicillin G 0,015 0,12 0,06 0,007 0,98

Gentamycin 3,9 0,49 0,06 0,12 31,25

Nghiên cứu trên cho thấy, kaempferol phân lập từ lá hồng có hoạt tính kháng VSV đối với cả nấm và vi khuẩn, trong đó tác dụng mạnh trên nhiều vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

1.3.3 Tác dụng chống ung thư

Lupeol phân lập từ lá Hồng cho kết quả rõ ràng về khả năng chống ung thư

thử nghiệm trên tế bào MCF-7 và tế bào HeLa với nồng độ ức chế 50% (IC50) lần lượt là 20,7 và 23,4 μg/mL

Uvaol, α-amyrin và kampferol cũng cho thấy tác dụng kháng tế bào MCF-7

với IC50 tương ứng là 46,2, 47,1 và 43,4 μg/mL [11]

1.3.4 Tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu flavonoid toàn phần chiết xuất từ lá Hồng trên tế bào MC3T3-E1 với chất chống oxy hóa chuẩn rutin cho thấy dịch chiết flavonoid toàn phần có tác dụng chống oxy hóa mạnh, có khả năng dọn các superoxide anion và các gốc hydroxyl tự do ở mức độ vượt trội so với rutin, khả năng dọn các gốc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl kém hơn so với rutin [23]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là lá cây Hồng trơn được thu hái tại xã Yên Mỹ, huyện Thanh Trì, Hà Nội vào tháng 10 năm 2013 và tháng 5 năm 2014

Mẫu được thu hái và xử lý như sau:

 Mẫu cành mang lá và quả tươi dùng để giám định tên khoa học

 Mẫu lá tươi được rửa sạch, dùng để nghiên cứu đặc điểm hình thái và vi phẫu

 Mẫu lá khô: Lá được rửa sạch, phơi se, sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60oC đến khô

- Một phần mẫu được tán mịn, dùng để nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu

- Phần mẫu còn lại được xay thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát, dùng để chiết xuất nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng kháng khuẩn

Mẫu nghiên cứu được TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, trường Đại học

Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Diospyros kaki Thunb., họ Thị

(Ebenaceae) (Phụ lục 1)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Thuốc thử, dung môi, hóa chất

 Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật

 Thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu thành phần hóa

- Thuốc thử: các thuốc thử thường dùng để định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu như thuốc thử Mayer, Dragendorff, FeCl3 5%, Lugol…

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của hãng MERCK (Đức)

Các thuốc thử, dung môi, hóa chất đạt tiêu chuẩn hóa chất kiểm nghiệm, có xuất

Staphylococcus aureus ATCC 1128

Bacillus pumilus ATCC 10241

Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus cereus ATCC 9946 Sarcina lutea ATCC 9341

- Các mẫu chuẩn :

Streptomycin sulfat: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gram (-)

Benzathin penicillin: 20 IU/ml đối với vi khuẩn Gram (+)

- Môi trường thử nghiệm:

 Môi trường canh thang để nuôi cấy vi khuẩn kiểm định

Các chủng vi khuẩn, mẫu chuẩn và hóa chất thuộc bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội

Kính hiển vi LABOMED (Mỹ) Serial No 070918442

Máy ảnh kỹ thuật số Sony Cybershot W370

Tủ sấy Memmert (Đức)

Máy soi đèn tử ngoại VILBER LOURMAT CN-6.T (Pháp) Serial No.12 101537 Máy soi đèn tử ngoại CAMAG (Thụy Sỹ) Serial No.t 022.9120

Tủ hốt UNI-LAB

Máy cất quay BÜCHI Rotavapor R-200 (Thụy Sỹ) Serial 803894010002

Cân phân tích Sartorius TE214S (Đức) serial 23808521

Cân kỹ thuật Precisa XB 320C (Thụy Sỹ)

Máy ly tâm K Universal Centrifuge PLC-012E (Đài Loan) serial 717902

Bể cách thủy HHS4 (Trung Quốc) Serial No 211121618

Bếp điện Wisd Heating Mantle WHM12014 (Hàn Quốc) Serial No.0406452128 Máy đo độ ẩm Precisa XM120

Hệ thống máy chấm sắc ký CAMAG LINOMAT 5, máy chụp sắc ký CAMAG TLC VISUALIZE (Thụy Sỹ) được kết nối với máy vi tính có cài đặt phần mềm WinCATS, VideoScan

Các dụng cụ, thiết bị thuộc bộ môn Dược học cổ truyền và một số bộ môn khác, trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật lá cây Hồng

 Mô tả đặc điểm hình thái lá nghiên cứu

 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột lá Hồng

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây Hồng

 Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

 Chiết xuất, định tính và định lượng một số phân đoạn

2.2.3 Thử tác dụng kháng khuẩn của lá cây Hồng

 Thử tác dụng kháng khuẩn của cao cồn toàn phần đối với 5 chủng vi khuẩn Gram (-) và 5 chủng vi khuẩn Gram (+)

 Thử tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết các phân đoạn chloroform và ethyl acetat đối với các chủng vi khuẩn trên

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

 Mô tả hình thái thực vật

Quan sát trực tiếp mẫu nghiên cứu bằng mắt thường, mô tả các đặc điểm hình thái của lá theo phương pháp ghi trong các tài liệu [1], [4]

 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu

Cắt tiêu bản vi phẫu bằng lưỡi dao lam, tẩy nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép theo phương pháp vi phẫu thực vật thường quy [4] Làm nhiều tiêu bản, lựa chọn tiêu bản mỏng, nhìn rõ để quan sát và chụp ảnh qua kính hiển vi

Nhận biết các đặc điểm theo tài liệu [4]

 Nghiên cứu đặc điểm bột lá

Soi bột lá dưới kính hiển vi, quan sát các đặc điểm Làm nhiều tiêu bản bột, chụp ảnh ghi lại đầy đủ các đặc điểm của bột lá

Nhận biết các đặc điểm theo hướng dẫn trong tài liệu [2]

2.3.2 Nghiên cứu về hóa học

 Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

Tiến hành theo các phương pháp hóa thực vật thường quy [2], [3], [9]

Sử dụng dung môi thích hợp để chiết dịch chiết toàn phần của mỗi nhóm chất, dùng thuốc thử đặc hiệu của mỗi nhóm chất để định tính, có đối chiếu với mẫu trắng

để nhận xét kết quả

 Chiết xuất, định lượng các phân đoạn dịch chiết từ dược liệu

Sử dụng dung môi ethanol 70%, chiết theo phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng

cứ 24h rút dịch chiết 1 lần, chiết 3 lần, gộp các dịch chiết, thu hồi dung môi thu được cao lỏng nước Loại tạp Dùng cao lỏng này chiết lần lượt với các dung môi có

độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, sau đó bốc hơi dung môi thu được cắn các phân đoạn tương ứng Cân và tính hàm lượng các cắn

 Định tính các phân đoạn dịch chiết bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp

mỏng

Định tính cắn các phân đoạn theo định hướng các nhóm chất chính và phân tích bằng sắc ký lớp mỏng theo các phương pháp hóa thực vật thường quy [2], [3], [9], [27]

2.3.3 Thử tác dụng kháng khuẩn

Tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của cao lỏng cồn toàn phần, 2 phân đoạn dịch chiết chloroform và ethyl acetat đối với các chủng vi khuẩn Gram (+), Gram (-) theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch [5]

Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy VSV kiểm định Hoạt chất từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn

Đường kính vòng vô khuẩn được đo bằng thước Panmer có độ chính xác 0,02 mm, so sánh với mẫu chuẩn để đánh giá kết quả Mỗi mẫu là 6 lần để lấy kết quả trung bình

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của lá cây Hồng

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Lá Hồng mọc so le, đơn Cuống lá dài 0,5 – 1,5 cm Phiến lá hình bầu dục hoặc hình trứng, dài 6 – 20 cm, rộng 3 – 9 cm; ngọn lá có mũi lồi nhọn, gốc lá thuôn dần; mép lá nguyên hoặc hơi lượn sóng; mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới màu nhạt, có lông Gân lá hình lông chim

Hình 3.1 Cành mang lá cây Hồng

Hình 3.2 Hình thái lá cây Hồng

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu

Phần gân lá: Gân lá phía trên lồi ít, phía dưới lồi nhiều Biểu bì trên (1) và

biểu bì dưới (7) là một lớp tế bào hình tròn hay hình bầu dục, nhỏ, xếp đều đặn, mang lông che chở đơn bào (4), thỉnh thoảng có lông tiết (8) Sát lớp biểu bì là lớp

mô dày (5) cấu tạo bởi 3 – 4 lớp tế bào hình tròn hoặc hình trứng, thành dày Mô mềm (6) gồm các tế bào hình tròn hoặc hình trứng, thành mỏng, kích thước tương đối lớn, sắp xếp lộn xộn Một bó libe – gỗ xếp thành hình cung; libe (3) ở dưới, bắt màu đỏ; gỗ (2) ở trên, gồm nhiều mạch gỗ hình tròn, bắt màu xanh (Hình 3.3)

Hình 3.3 Ảnh chụp vi phẫu gân lá Hồng Chú thích:

Phần phiến lá: Phiến lá có cấu tạo dị thể bất đối xứng Biểu bì trên (1) và

biểu bì dưới (4) là một hàng tế bào hình chữ nhật, kích thước lớn hơn nhiều so với

tế bào biểu bì ở gân lá, mang lông che chở đơn bào (5) Dưới lớp biểu bì trên là mô giậu (2) gồm một lớp tế bào dài xếp sát nhau, thẳng đứng vuông góc với bề mặt lá

Mô khuyết (3) được cấu tạo bới các tế bào thành mỏng, kích thước không đều, sắp xếp lộn xộn tạo thành các khoảng trống (Hình 3.4)

3.1.3 Đặc điểm bột lá

Bột màu xanh nâu, mùi thơm nhẹ, không vị

Quan sát dưới kính hiển vi thấy các đặc điểm: Mảnh mô mềm phiến lá (1) gồm các tế bào hình đa giác Mảnh biểu bì mang nhiều lỗ khí (2) Lông che chở đơn bào thuôn dài (3) Sợi thường tập trung thành từng bó sợi lớn (4) Mảnh mạch gồm mạch xoắn (5) và mạch mạng (6) Lông tiết đầu đa bào có màu đỏ, chân đơn bào Nhiều tinh thể calci oxalat ở các hình dạng khác nhau: hình thoi, hình khối… (8) nằm độc lập hoặc nằm trong các đám sợi (9) (Hình 3.5)

Hình 3.5 Đặc điểm bột dược liệu lá Hồng Chú thích:

8 Tinh thể calci oxalat

9 Đám sợi mang tinh thể calci oxalat

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây Hồng

3.2.1 Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

3.2.1.1 Định tính glycosid tim

Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón, thêm 100 ml ethanol 25%, ngâm trong

24 giờ Gạn lấy dịch chiết, loại tạp bằng chì acetat dư, lọc qua giấy lọc gấp nếp Chuyển dịch chiết vào bình gạn, lắc với hỗn hợp chloroform - ethanol (4:1) 3 lần, mỗi lần 10 ml Gạn lấy lớp chloroform, gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng natri sulfat khan Chia đều dịch chiết vào 5 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô Bốc hơi dịch chiết trên bếp cách thủy đến cắn Dùng cắn này để tiến hành các phản ứng sau:

Phản ứng xác định khung steroid:

 Phản ứng Liebermann – Burchardt

Hòa tan cắn với 1 ml anhydrid acetic, 1 ml chloroform Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu đỏ tím (phản ứng dương tính)

Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng (phản ứng dương tính)

 Phản ứng Legal

Hòa tan cắn với 1 ml ethanol 90% Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều Quan sát màu ngay sau khi nhỏ thuốc thử So sánh màu sắc với ống chứng (ống không có cắn)

Kết quả: Ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng (phản ứng dương tính)

Phản ứng xác định phần đường 2-desoxy:

 Phản ứng Keller - Kiliani

Hòa tan cắn với 1 ml ethanol 90% Thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic Lắc đều Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống

Kết quả: Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện 1 vòng màu cam, lớp chất lỏng phía trên có màu vàng, không có màu xanh lá (phản ứng âm tính)

 Phản ứng với acid phosphoric đậm đặc

Hòa tan cắn với 1 ml aceton Thêm 5 ml acid phosphoric đậm đặc, lắc đều, đặt trên bếp cách thủy 15 phút, sau đó làm nguội

Kết quả: Dung dịch trong ống không chuyển màu (phản ứng âm tính)

Nhận xét: lá Hồng không chứa glycosid tim

3.2.1.2 Định tính flavonoid

Chiết 10 g bột dược liệu với ethanol 70% bằng cách đun hồi lưu trong 1 giờ Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp, bốc hơi trên bếp cách thủy đến khô Loại tạp bằng ether dầu hỏa Hòa tan lại cắn trong 10 ml ethanol 90% Chia đều dịch chiết vào 5 ống nghiệm nhỏ, đem tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng với dung dịch NaOH

Thêm vào ống nghiệm chứa dịch chiết vài giọt dung dịch NaOH 10%

Kết quả: Dung dịch chuyển sang màu đỏ cam (phản ứng dương tính)

 Phản ứng với hơi amoniac

Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Sấy khô rồi hơ trên miệng lọ amoniac đặc đã được mở nắp Quan sát màu của vết dịch chiết So sánh với mẫu chứng là một giọt dịch chiết khác không được hơ trên lọ amoniac

Kết quả: Màu vàng của vết dịch chiết thử đậm hơn so với mẫu chứng (phản ứng dương tính)

 Phản ứng với FeCl 3

Thêm vào ống nghiệm chứa dịch chiết vài giọt FeCl3 5%

Kết quả: Dung dịch xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính)

 Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước Lắc mạnh theo chiều dọc trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt

Kết quả: Bọt còn bền sau 15 phút (phản ứng dương tính)

 Các phản ứng màu

Chiết 10 g bột dược liệu với ethanol 70% bằng cách đun hồi lưu trong 30 phút Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp, bốc hơi trên bếp cách thủy đến khô Loại tạp bằng ether dầu hỏa Dùng cắn để làm các phản ứng sau:

 Phản ứng Liebermann – Burchardt

Hòa tan cắn với 1 ml anhydrid acetic, 1 ml chloroform Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 1 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Kết quả: Vòng ngăn cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu đỏ tím (phản ứng dương tính)

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết

Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%

Ống 2 để nguyên

Đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thủy trong vài phút Để nguội

Kết quả: Ống 1 có màu đỏ cam, ống 2 trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất Không có hiện tượng gì xảy ra (phản ứng âm tính)

 Phản ứng diazo hóa

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết Thêm 1 ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy trong 5 phút Làm lạnh dưới vòi nước rồi thêm từng giọt thuốc thử diazo Kết quả: Dung dịch xuất hiện màu đỏ (phản ứng dương tính)

 Quan sát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại

Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên 1 tờ giấy lọc, chờ khô dung môi và lặp lại như trên

4 lần Nhỏ chồng lên đó 1 giọt NaOH 5%, sấy khô Che ½ vết bằng 1 miếng kim loại rồi đem soi đèn UV trong vài phút Lấy miêng kim loại ra và quan sát vết dịch chiết dưới ánh sáng tử ngoại

Kết quả: Vết dịch chiết sáng đồng đều ở cả nửa bị che và không bị che (phản ứng âm tính)

Nhận xét: Lá Hồng không chứa coumarin

3.2.1.5 Định tính tanin

Chiết 10 g bột dược liệu bằng nước trên bếp cách thủy trong 15 phút Để nguội, lọc qua giấy lọc Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng với FeCl 3

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%

Kết quả: Dung dịch xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính)

 Phản ứng với chì acetat

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10%

Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện tủa bông (phản ứng dương tính)

 Phản ứng với dung dịch gelatin

Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% So sánh ống thử với ống chứng chỉ chứa thuốc thử và nước cất

Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện tủa bông trắng (phản ứng dương tính)

Nhận xét: Lá Hồng có chứa tanin

3.2.1.6 Định tính anthranoid

Chiết nóng 10 g bột dượcliệu bằng dung dịch H2SO4 20% trong 1 giờ Lọc dịch chiết còn nóng qua bông Làm nguội dịch lọc Lắc dịch lọc với ether (2 lần, mỗi lần 8 ml) Lớp ether thu được tiến hành các phản ứng như sau:

 Phản ứng Borntraeger

Lấy 1 ml dịch chiết, thêm 1 ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ

Kết quả: Lớp nước không có màu đỏ sim (phản ứng âm tính)

 Thử nghiệm vi thăng hoa

Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp nhôm, đốt nhẹ để loại nước Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 – 10 phút Lấy lam kính ra để nguội, soi kính hiển vi

Kết quả: Không quan sát thấy các tinh thể hình kim màu vàng (phản ứng âm tính)

Nhận xét: Lá Hồng không chứa anthranoid

3.2.1.7 Định tính alcaloid

Làm ẩm 10 g bột dược liệu bằng NH4OH 25% trong 20 phút Chiết dược liệu với chloroform bằng Soxhlet trong 2 giờ Dịch chiết thu được lắc với dung dịch acid sulfuric 2% Dich acid được dùng để định tính alcaloid bằng các phản ứng sau:

 Phản ứng với thuốc thử Mayer

Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Mayer

Kết quả: Trong ống nghiệm không xuất hiện tủa (phản ứng âm tính)

 Phản ứng với thuốc thử Bouchardat

Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat

Kết quả: Trong ống nghiệm không xuất hiện tủa (phản ứng âm tính)

 Phản ứng với thuốc thử Dragendorff

Lấy 2 ml dịch chiết, thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff

Kết quả: Trong ống nghiệm không xuất hiện tủa (phản ứng âm tính)

Nhận xét: Lá Hồng không chứa alcaloid

3.2.1.8 Định tính polysaccharid, đường khử, acid hữu cơ, acid amin

Chiết 10 g bột dược liệu với nước trên bếp cách thủy trong 15 phút Lọc dịch chiết qua giấy lọc gấp nếp Dùng dịch lọc để tiến hành các phản ứng sau:

 Định tính polysaccharid

Chuẩn bị 2 ống nghiệm:

Ống 1: 4 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Lugol

Ống 2: 4 ml nước cất + 5 giọt thuốc thử Lugol

Quan sát màu dung dịch trong 2 ống nghiệm

Kết quả: Màu dịch chiết trong 2 ống như nhau (phản ứng âm tính)

Nhận xét: Lá Hồng không chứa polysaccharid

 Định tính acid hữu cơ

Lấy 5 ml dịch chiết vào ống nghiệm Thêm vào dịch chiết một ít tinh thể

Na2CO3

Kết quả: Trong ống nghiệm xuất hiện bọt khí bay lên (phản ứng dương tính)

Nhận xét: Lá Hồng có chứa acid hữu cơ

 Định tính acid amin

Lấy 2 ml dịch chiết vào ống nghiệm Thêm vào dịch chiết vài giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy vài phút

Kết quả: Dung dịch trong ống chuyển sang màu tím (phản ứng dương tính)

Nhận xét: Lá Hồng có chứa acid amin

3.2.1.9 Định tính chất béo, caroten, sterol

Chiết 10 g bột dược liệu với ether dầu hỏa bằng cách ngâm qua đêm Lọc dịch chiết qua bông Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng sau:

Nhận xét: Lá Hồng có chứa sterol

Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu được tóm tắt ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá cây Hồng STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

1 Glycosid tim

Phản ứng Liebermann – Burchardt Phản ứng Baljet

Phản ứng Legal Phản ứng Keller – Killiani Phản ứng với H3PO4 đậm đặc

+ + +

Phản ứng diazo hóa

+ ++

+ ++

Có

4 Coumarin

Phản ứng mở đóng vòng lacton Phản ứng diazo hóa

Quan sát huỳnh quang

- +