Nghiên cứu bán tổng hợp carbocistein quy mô 1,0 KG mẻ

Mặt khác, Carbocistein có thể tổng hợp được từ nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước là L-cystin và L-cystein sản phẩm thủy phân từ các nguồn keratin.. SCMC là thuốc điều hòa chất nhầy, có

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG VĂN KHOA

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CARBOCISTEIN QUY MÔ 1,0KG/MẺ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG VĂN KHOA

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP

CARBOCISTEIN QUY MÔ 1,0KG/MẺ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn

Đình Luyện, người đã trước tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện

giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Hân, thầy TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang, CN Phạm Tiến Thành của Tổ môn Tổng hợp Hóa dược - Bộ môn Công nghiệp dược đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận vừa qua Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thày cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dược, cũng như các thày cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt năm năm học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố mẹ, anh chị tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện

đề tài Khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Dương Văn Khoa

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về Carbocistein (SCMC) 3

1.1.1 Cấu trúc hóa học và tính chất lý hóa 3

1.1.2 Tác dụng dược lý 5

1.1.2.1 Dược động học 5

1.1.2.2 Dược lực học 6

1.2 Tổng quan về các phương pháp tổng hợp SCMC 8

1.2.1 Các phương pháp tổng hợp SCMC đi từ L-cystein 8

1.2.2 Các phương pháp tổng hợp Carbocistein đi từ L-cystin 10

1.2.3 Các phương pháp tổng hợp Carbocistein đi từ nguyên liệu khác 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu 14

2.1.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Tổng hợp hóa học 16

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 16

2.3.3 Xác định cấu trúc sản phẩm 16

2.3.4 Phương pháp kiểm nghiệm hàm lượng carbocistein 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 18

3.1 Tổng hợp carbocistein từ L-cystin và L-cystein hydroclorid monohydrat 18

3.1.1 Tổng hợp carbocistein từ L-cystin 18

3.1.2 Tổng hợp carbocistein từ L-cystein hydroclorid monohydrat 18

3.1.3 Lựa chọn nguyên liệu để nâng cấp quy mô mẻ, khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất quá trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm 19

3.1.3.1 Tỷ lệ mol acid monocloracetic (MCA) và L-cystein.HCl.H2O 19

3.1.3.2 Nhiệt độ phản ứng: 21

3.1.3.3 Nồng độ NaOH 22

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc sản phẩm 23

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm 23

3.2.2 Khẳng định cấu trúc sản phẩm 24

3.2.2.1 Phổ hồng ngoại 24

3.2.2.2 Phổ khối lượng 24

3.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) 25

3.3 Nâng cấp quy trình tổng hợp quy mô 1kg/mẻ 25

3.4 Kiểm nghiệm carbocistein theo một số tiêu chuẩn dược điển Anh 2007 27

3.4.1 Định tính 27

3.4.2 Định lượng carbocistein theo BP2007 28

3.5 Bàn luận 29

3.5.1 Về tổng hợp carbocistein từ L-cystin 30

3.5.2 Về tổng hợp carbocistein từ L-cystein hydroclorid monohydrat 31

3.5.3 Về quá trình tinh chế sản phẩm 32

3.5.4 Về khẳng định cấu trúc 32

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

L-CHM L-cystein hydroclorid monohydrat

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu 14

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng tỷ lệ mol MCA: L-CHM

tới hiệu suất phản ứng

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết SCMC tổng hợp được 23

Bảng 3.6 Số liệu phân tích phổ khối lượng của các chất tổng hợp

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình tổng hợp

Carbocistein quy mô 100g/mẻ

26

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình tổng hợp

Carbocistein quy mô 500g/mẻ

26

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình tổng hợp

Carbocistein quy mô 1Kg/mẻ

27

Bảng 3.11 Kết quả định tính carbocistein theo BP 2007 27

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol L-cystin

và MCA

20

Hình 3.2 Đồ thì biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất phản ứng 21

Hình 3.3 Đồ thị biểu thị sự ảnh hưởng của NaOH tới hiệu suất phản ứng 22

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh lý liên quan tới đường hô hấp là một trong các bệnh rất phổ biến hiện nay Các bệnh hô hấp thường gặp bao gồm: viêm phế quản cấp, viêm phổi do các loại vi khuẩn, virus; hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, ung thư phổi, tràn dịch màng phổi, lao phổi Các bệnh này chiếm khoảng 80% số các bệnh lý hô hấp, bên cạnh đó, còn nhiều bệnh hô hấp khác, tuy nhiên chỉ chiếm tỷ lệ ít hơn, như: giãn phế quản, viêm phổi kẽ, bụi phổi, các biểu hiện phổi trong các bệnh hệ thống, nội tiết, cơ xương khớp, thận…[8]

Có rất nhiều thuốc có cơ chế tác dụng khác nhau được dùng để điều trị các bệnh đường hô hấp Trong đó, nhóm thuốc làm tiêu nhày, giúp thông thoáng đường thở được dùng khá phổ biến….[3,9] Carbocistein là một thuốc như vậy, carbocistein có tác dụng làm lỏng dịch nhày đường hô hấp dựa trên cơ chế cắt đứt các cầu nối disulfid trong chuỗi peptit của mucin, được dùng trong các trường hợp rối loạn hô hấp, đặc biệt liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ nhầy nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mạn tính, giãn phế quản, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng Điều trị hỗ trợ trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai

và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật [7,28,29,30]

Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng carbocistein còn có tác dụng trong điều trị bệnh viêm phổi mãn mãn tính (chronic obstructive pulmonary disease- (COPD)) [17,19] và trong việc ức chế sự lây nhiễm virus cúm A [34]

Tuy nhiên, trong nước chưa có doanh nghiệp nào tự sản xuất nguyên liệu cũng như thuốc thành phẩm chứa thành phầm carbocistein bán trên thị trường, mà nguồn thuốc chủ yếu là nhập khẩu Mặt khác, Carbocistein có thể tổng hợp được từ nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước là L-cystin và L-cystein (sản phẩm thủy phân

từ các nguồn keratin) Dựa trên những thành công bước đầu trong việc khảo sát tổng hợp carbocistein trong nước ở quy mô phòng thí nghiệm [4] và để chủ động tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc, phát triển công nghiệp hóa dược nước nhà, chúng tôi

thực hiện đề tài “Nghiên cứu bán tổng hợp carbocistein quy mô 1,0kg/mẻ”

Với mục tiêu:

“Xây dựng được quy trình bán tổng hợp carbocistein quy mô 1kg/mẻ đạt hàm lượng theo tiêu chuẩn BP2007”

 Danh pháp quốc tế (International Nonproprietary Name- INN): Carbocisteine

 Danh pháp IUPAC: Acid (R)-2-Amino-3-(carboxymethylsulfanyl) propanoic

 Tên khác: S-Carboxymethy-L-cystein, acid (R)-2-amino-4-thia-adipic,

3-(Carboxymethylthio)-L-alanin, L-3-((Carboxymethylthio) alanin, acid g[(carboxymethyl)sulfanyl] propanoic, aicd (2R)-2-amino-3-[(carboxymethyl)sulfanyl] propanoic, S-Carboxymethyl-L-cystein, ( R )-Carbocistein, Carbocystein [31,33]

(2R)-2-b Tính chất lý hóa

 Tính chất vật lý :

+ Bột kết tinh hay tinh thể hình đĩa, không màu

+ Tan trong nước sôi, không tan trong nước lạnh và không tan trong các các chất hữu cơ thông thường (ethanol, methanol, aceton…)

+ Độ quay cực riêng: [α]D20= + 0,5 trong dung dịch HCl 1N

+ Nhiệt độ nóng chảy: 204- 207oC [33]

 Tính chất hóa học :

SCMC có cấu trúc của một α-amino acid nên có các phản ứng đặc trưng cho các nhóm amin và carboxyl như phản ứng acetyl hóa, phản ứng formyl hóa hay ester hóa

+ Phản ứng với ninhydrin:

Các α-amino acid khi phản ứng với ninhydrin sẽ bị dezamin hoá, oxy hoá và

decarboxy hoá tạo CO2, NH3 và aldehyd tương ứng (ninhydrin dạng khử) Sau đó ninhydrin và ninhydrin dạng khử lại phản ứng tiếp với NH3 tự do tạo thành phức hợp màu tím, có độ hấp thụ cực đại ở λ= 570nm Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin

+ Phản ứng Biure:

Trong môi trường kiềm, acid amin tạo phức nội phân tử với ion Cu2+ tạo phức hợp màu tím ở dạng anion Phản ứng này tạo phức có màu bền vững và ổn định được dùng để định lượng acid amin

+ Phản ứng với Fluorescamin:

Phản ứng cho sản phẩm huỳnh quang với α-amin của acid amin, đây là phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng ngàn nano gram

+ Phản ứng Sanger:

Phản ứng dùng để xác định acid amin-N tận cùng dựa trên phản ứng của acid amin phản ứng với clorid dabsyl và 1- fluoro-2,4 dinitrobezen cho các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân protein

+ Trong phân tử SCMC có chứa lưu huỳnh, nên có phản ứng Folh xác định acid amin chứa lưu huỳnh

+ Phân tử SCMC có chứa nhóm chức acid (diacid), nên có phản ứng đặc trưng của acid: phản ứng ester hóa, phản ứng acyl hóa [2,10,14,20,23]

1.1.2 Tác dụng dược lý

1.1.2.1 Dược động học

Sau khi uống, thuốc được hấp thu nhanh và đạt nồng độ tối đa trong huyết tương sau 2 giờ [7,15] Carbocistein thấm qua tốt các tế bào mô phổi, niêm mạc đường hô hấp và có tác động tại chỗ [12,17] Đỉnh nồng độ trong huyết tương đạt được sau 1-2h Thời gian bán thải 2h Sinh khả dụng kém, dưới 10% liều dùng do được chuyển hóa mạnh và chịu ảnh hưởng khi qua gan lần đầu Chuyển hóa của carbocistein rất phức tạp, thông qua phản ứng decarboxyl hóa, N-acyl hóa và phản ứng sulfo hóa, deamin hóa và ester hoá với acid glucoronic tạo thành chất không có tác dụng Thải trừ 30-60% qua thận ở dạng không đổi Chất chuyển hóa chính của SCMC được thải trừ qua thận là hợp chất disulfid S-(carboxymethylthio)-L-cystein [17,35] Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng sự chuyển hóa của carbocistein dao động trên cùng 1 cá thể, vài chất chuyển hóa dạng sulfoxid được tạo thành sau khi dùng thuốc

về đêm Do vậy việc lựa chọn đúng thời điểm uống thuốc của SCMC có tác động lớn đến sự đồng nhất của các chất chuyển hóa S-oxid qua thận [1]

Ngoài ra, trên động vật có bằng chứng chứng minh: carbocistein làm tăng sự vận chuyển clorid qua hệ thống biểu mô và điều này góp phần vào tác dụng điều hòa dịch tiết [16]

Thuốc và các chất chuyển hóa SCMC được đào thải qua nước tiểu

1.1.2.2 Dược lực học

Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy các thành phần đường (fucos và acid sialic) trên glycoprotein nhầy (mucin) thông qua việc ức chế kinin- tác nhân có vai trò quan trọng trong phản ứng viêm (gây giãn mạch, tăng tính thấm mao mạch,

và gây đau), từ đó làm giảm hay ngăn chặn phản ứng viêm và co thắt phế quản) có liên quan đến độ nhớt của dịch nhầy đường hô hấp SCMC là thuốc điều hòa chất nhầy, có tác dụng điều chỉnh fucos và acid sialic trong chất nhầy đường hô hấp thông qua cơ chế ức chế yếu tố TNF-α (tumor nucrosis factor alpha- TNF α) yếu tố làm tăng độ nhớt của chất nhầy và ức chế sialyl Lewis X trên protein dung hợp MUC5AC (Mucin 5 kiểu phụ A và C) do đó làm giảm độ nhớt của chất nhầy [1,17,19,28,29,31]

Trong một nghiên cứu khác, các tác giả chỉ ra rằng SCMC có tác dụng làm lỏng dịch nhầy đường hô hấp theo cơ chế làm gãy cầu nối disulfid của các glycoprotein (còn gọi là mucoprotein) làm cho tan chất nhày nhớt đặc quánh [17,19]

Tác dụng chống oxy hóa: trên invitro, carbocistein có tác dụng chống oxy

hóa Nhóm thioester của carbocistein có thể bị oxy hóa bởi các mẩu oxy hoạt động

và hình thành dạng sulfoxid, chúng có thể phản ứng với gốc oxy hoạt động, oxy hóa chúng tạo thành sulfoxid hoặc các dẫn chất sulfon Đặc biệt là chúng rất chọn lọc với nhóm -HClO và –OH Đó chính là khả năng oxy hóa nội sinh Tác dụng oxy hóa cũng đã được chứng minh khi kích hoạt các tế bào máu đơn nhân ở ngoại vi, nhờ đó mà chúng cũng có tác dụng chống viêm Tuy nhiên, cơ chế oxy hóa vẫn chưa được biết đến đầy đủ [17]

Theo một nghiên cứu khác cho thấy rằng, tác dụng chống oxy hoá của carbocistein bằng cách ức chế quá trình chuyển đổi xanthine dehydrogenase thành superoxide sản xuất xanthine oxidase- một enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa purin Vì vậy, SCMC còn có tác dụng tromg điều trị gout và các bệnh lý liên quan tới tăng acid uric máu [38]

Tác dụng chống viêm: Đối với những thuốc có chứa nhóm cystein, khả năng chống oxy hóa cùng với tiền chất khác là glutathion đã được chứng minh là làm tăng khả năng sản xuất cytokin tiền viêm (TNF-α; IL-6; IL-8) [24]

Ngoài ra, SCMC còn có tác dụng trong ngăn ngừa lây nhiễm cúm tuýp A: SCMC có tác dụng ức chế yếu tố nhân kappa B (Nuclear factor- kappa B: NF-κB)

và tăng pH trong endosomes làm giảm các thụ thể virus cúm người trong tế bào biểu mô đường hô hấp, do vậy, ức chế sự lây nhiễm virus cúm A [34]

Carbocistein còn được sử dụng hiệu quả trong bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính nhờ tác dụng long đờm, chống viêm và chống oxy hóa [17,19,34] Có bằng chứng chứng minh rằng carbocistein có tác dụng tốt ở những bệnh nhân có sử dụng corticosteroid dạng hít thường xuyên, bệnh nhân hen suyễn [26]

Carbocistein được sử dụng trong hội chứng suy nhược liên quan đến ung thư Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, những bệnh nhân ung thư với nồng độ cao các mẩu chất oxy hóa hoạt động trong máu và giảm nồng độ các men erythrocyt glutathion peroxidase và superoxid dimutase Sự có mặt của các chất này có liên quan mật thiết đến nồng độ các cytokin tiền viêm IL-6; TNF-α và CRP (C-reactive protein) và nồng độ thấp leptin [1,32]

Cũng theo một nghiên cứu khác chỉ ra, các dẫn chất cystein còn được dùng điều trị trong các bệnh tim mạch và rối loạn thần kinh Các bệnh này chủ yếu liên quan đến sự có mặt của các gốc oxy hóa tự do Trong những năm gần đây, một số lượng lớn các dẫn chất thiol được sử dụng để ức chế sự oxy hóa các gốc oxy tự do

và giảm căng thẳng thần kinh [27,40]

Chỉ định: Rối loạn hô hấp đặc biệt liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ nhầy

nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mãn, giãn phế quản, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính Ðiều trị hỗ trợ trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật [1,17,19]

Chống chỉ định:

Dị ứng với carbocistein

Phụ nữ có thai hoặc đang thời kỳ cho con bú

+ Từ L-cystin tiến hành khử hóa trong môi trường kiềm với sự có mặt của kẽm

và acid monocloroacetic ta cũng thu được SCMC

1.2.1 Các phương pháp tổng hợp SCMC đi từ L-cystein

a Phương pháp của L Michaelis và Maxwell P Schubert (1934)

SCMC (I) được tổng hợp từ L-cystein hydroclorid monohydrat (II) và acid monocloroacetic (III) trong môi trường kiềm (dung dịch KOH 6,7M) Dung dịch

sau phản ứng được điều chỉnh về pH 5 bằng acid acetic băng, làm lạnh bằng nước

đá trong 2h, cystin sẽ tủa lại Lọc loại tủa cystin, thu lấy dịch lọc Điều chỉnh pH dịch lọc về 2 bằng acid hydroclorid 6M, làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h SCMC sẽ kết tinh Lọc thu lấy tinh thể Kết tinh lại sản phẩm trong nước Hiệu suất phản ứng khoảng 70%, nhiệt độ nóng chảy 175- 176oC [36]

O

OH

NH2

O Cl

OH O

KOH

II

I III

a Phương pháp của M.D Amstrong và cộng sự (1951)

Tổng hợp SCMC từ L-cystein bằng cách hồi lưu hỗn hợp của L-cystein và acid monocloroacetic trong HCl đặc trong 24h Sau đó hoà tan hỗn hợp phản ứng vào nước, chỉnh pH bằng 4 Sản phẩm sẽ kết tủa, lọc, rửa tủa nhiều lần bằng nước

và ethanol Kết quả thu được dạng racemic của SCMC, hiệu suất quá trình đạt 73% [11] Năm 1958, L Goodmans và cộng sự đã cải tiến quy trình này bằng cách đun hồi lưu L-cystein và acid monocloroacetic trong môi trường kiềm loãng cũng thu được L-SCMC, phản ứng đạt hiệu suất 72%, sản phẩm thu được có nhiệt độ nóng chảy 197-203oC [24]

b Phương pháp của Maurice Joullie và cộng sự (1962)

SCMC được tổng hợp từ L-cystein hydroclorid monohydrat và ClCH2COONa trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 5N) dưới bầu khí nitơ và nhiệt độ thấp

Tinh chế SCMC: Đun nóng hỗn hợp gồm: SCMC, HCl 3N ở 70oC trong 30 phút Sau đó thêm than hoạt, rồi đun sôi khối phản ứng trong 15 phút Lọc nóng để loại bã than Dịch lọc được làm nguội đến 40oC Sau đó được trung hòa bằng cách thêm từ từ dung dịch NaOH, khuấy mạnh Duy trì nhiệt độ khối phản ứng 50oC trong 16h, SCMC sẽ kết tinh lại Lọc thu tinh thể, rửa tủa bằng nước cất cho tới khi

có phản ứng âm tính với dung dich AgNO3 Hiệu suất quá trình tinh chế đạt 89- 93%, SCMC thu được có nhiệt độ nóng chảy 208oC [45]

c Phương pháp của Maurice Joullie và cộng sự (1967)

SCMC được tổng hợp từ L-CHM và MCA trong môi trường pH 8 (điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 5N) dưới bầu khí nitơ ở nhiệt độ 50oC Khi phản ứng kết thúc, ngừng cung cấp N2, sau đó điều chỉnh pH về 6 bằng HCl đặc Tẩy màu bằng than hoạt, lọc nóng, thu dịch lọc Dịch lọc được đưa về nhiệt độ phòng Điều chỉnh pH dịch lọc về 2,8 bằng HCl đặc, SCMC (I) sẽ kết tủa Ly tâm thu lấy tủa và rửa tủa cho đến khi hết ion Cl-

Tinh chế: Tạo hỗn dịch của SCMC thô với HCl 2N (HCl dư khoảng 25%) Đun sôi hỗn dịch trong 5 phút, rồi làm lạnh về 30oC Điều chỉnh pH dung dịch đến

2,8 bằng NaOH 2N Sản phẩm I sẽ kết tủa Lọc rửa tủa sản phẩm tới khi hết ion Cl- Sản phẩm đạt độ tinh khiết 99,5% Hiệu suất phản ứng đạt 90- 95% Nhiệt độ nóng chảy: 249- 250oC [32]

d Phương pháp của Bethge và các cộng sự (1984)

Hòa tan hoàn toàn 140g cystein hydroclorid monohydrat, trong 1000ml dung dịch NaOH 4N Khuấy và cho thêm vào dung dịch 3g NaHS trong nước Khuấy thêm 45 phút Sau đó cho vào khối phản ứng 95g acid monocloroacetic Luôn giữ nhiệt độ 20oC trong suốt các quá trình đó Để khối phản ứng 3h ở nhiệt độ 20- 30oC Sau đó điều chỉnh pH về 3 bằng dung dịch HCl Hạ nhiệt độ xuống 10oC, hỗn hợp racemic của SCMC kết tinh Lọc lạnh, rửa với nước loại ion clorid Sấy tinh thể ở

105oC Hiệu suất phản ứng đạt 97%, hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy 188- 192oC [44]

Từ hỗn hợp racemic (RS) SCMC tách lấy (R) SCMC bằng (R)-1-phenyl ethylamin và tách lấy (S) SCMC bằng (S)-1-phenyl ethylamin

1.2.2 Các phương pháp tổng hợp Carbocistein đi từ L-cystin

a Phương pháp của Earl Pierson và các cộng sự (1946)

SCMC được tổng hợp từ L-cystin (IV) bằng cách thực hiện phản ứng khử trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 30%) có mặt acid monocloroacetic (III)

và kẽm, ở nhiệt độ 30oC Dịch phản ứng sau khi loại bỏ kẽm dư sẽ được điều chỉnh

về pH 2 bằng acid sulfuric đặc Hạ nhiệt độ phản ứng xuống 15- 20oC, khuấy liên

tục trong 1-2h, SCMC (I) sẽ kết tinh Lọc, rửa tinh thể bằng nước lạnh, sấy thu được sản phẩm I Hiệu suất phản ứng đạt 90%, nhiệt độ nóng chảy 188- 191oC [22]

Phương trình phản ứng:

b Phương pháp Maierhop và cộng sự (1978)

SCMC được tổng hợp qua 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: khử hóa L-cystin (IV) thành L-cystein (II) bằng tác nhân

Na/NH3 lỏng ở -400C

Giai đoạn 2: S-alkyl hóa L-cystein thành SCMC (I) bằng acid

monocloroacetic trong bầu khí Nitơ

Hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 92%, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao hơn các phương pháp khác [13]

Phương trình phản ứng:

c Phương pháp của J González-García và các cộng sự (1998)

Sử dụng phản ứng điện phân L-cystin, tại cực âm với sự có mặt của anion monocloacetat được thêm vào trong suốt quá trình điện phân Điện cực sử dụng có thể là điện cực carbon [25]

- Cực âm: Điện cực sợi carbon

- Cực dương: Kim loại

- Dung dịch cực âm: dung dịch L-cystin/NaOH Nồng độ L-cystin ban đầu 0,8- 1,3M pH dung dịch khoảng 8- 13,5

- Dung dịch cực dương: Dung dịch Na2SO4.

- Mật độ dòng điện: 250- 2000 A/m2.

- Nhiệt độ: 40- 50oC

Nồng độ L-cystin trong sản phẩm cuối luôn thấp hơn 0,5%

1.2.3 Các phương pháp tổng hợp Carbocistein đi từ nguyên liệu khác

a Phương pháp của Kazuo Nakayasu và cộng sự (1984)

Alkyl hóa acid thioglycollic (V) bằng β-cloroalanin (VI) trong môi trường

kiềm (dung dịch KOH), pH 10-13, ở nhiệt độ 20oC Sau đó acid hóa khối phản ứng

về pH 2-4, sản phẩm SCMC sẽ kết tủa [39]

Phương trình phản ứng:

b Phương pháp của Kenzo Yokozeki và các cộng sự (1988)

Quá trình sinh tổng hợp nên SCMC gồm 4 bước với sự có mặt của vi

khuẩn Pseudomonas thiazolinophilum hoặc Pseudomonas molytica, tiền chất

làDL-2-aminothiazolin-4-carboxylic acid (ATC):

- Bước 1: Sử dụng enzym ATC racemase phân tách hỗn hợp đồng phân racemic DL-ATC thành D-ATC và L-ATC

- Bước 2: Thủy phân L-ATC thành S-carbamyl-L-cystein (L-SCC) bằng enzym L-ATC hydrolase

- Bước 3: Thủy phân L-SCC thành L-cystein bằng enzym L-SCC hydroxylase

- Bước 4: L-cystein phản ứng với anion monocloroacetat tạo thành SCMC

Ps thiazolinophilum và Ps desmolytica có thể tạo ra cả 3 enzym trên với sự có mặt

của DL-ATC trong môi trường nuôi cấy [41]

c Phương pháp của Ken-Ichi Ishiwata và cộng sự (1989)

SCMC (I) được tổng hợp từ L-serin với enzym tryptophan synthease (thu

được từ nuôi cấy vi khuẩn Escherichia Coli trong môi trường dinh dưỡng thích

hợp) Enzym tryptophan synthease sẽ xúc tác cho phản ứng thay thế vị trí β của

L-serin bằng một chất nền là thioglycolic hoặc tốt hơn là alkylthioglycolat tạo thành

S-(2-Ethylhexyloxycarbonylmethyl)-l-cystein, sau đó

S-(2-ethylhexyloxycarbonylmethyl)-l-cystein sẽ bị thủy phân trong môi trường kiềm tạo

sản phẩm I [42]

d Phương pháp của Jingmin Zeng và cộng sự (2005)[18]

Các tác giả tổng hợp SCMC (I) đi từ nguyên liệu là polycystein theo sơ đồ sau:

Chuyển vị

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

Đề tài sử dụng nguồn nguyên liệu chính là L-cystein hydroclorid monohydrat

và L-cystin được tổng hợp tại phòng thí nghệm Tổng hợp hóa dược, và các hóa chất, dung môi khác có nguồn gốc Mỹ, Trung Quốc và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược

Hà Nội

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu

Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu

Bảng 2.2: Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cứu

1 Bản mỏng Silicagel GF254 70- 230 mesh Đức

8 Cốc có mỏ 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml Trung Quốc

13 Máy chuẩn độ đo thế 751 GDP Titrino Metrohm Mỹ

16 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR

Brucker AV- 500MHz (Viện Khoa học và Công nghệ

Việt Nam)

Đức

17 Máy đo phổ hồng ngoại GX- Perkin Elmer (Khoa Hóa-

Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát quy trình tổng hợp SCMC từ L-cystin và L-cystein hydroclorid monohydrat, chọn nguồn nguyên liệu thích hợp để tiến hành nâng cấp quy

mô mẻ Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất quá trình tổng hợp

SCMC khi tiến hành nâng cấp quy mô mẻ

 Khẳng định cấu trúc của sản phẩm carbocistein tổng hợp được

 Tinh chế carbocistein đạt tiêu chuẩn BP 2007

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học

 Tổng hợp Carbocistein từ L-cystein hydroclorid monohydrat

Trong một số phương pháp tổng hợp SCMC đi từ L-cystein, đề tài đã sử dụng

và cải tiến phương pháp của tác giả L Michaelis và cộng sự

 Tổng hợp Carbocistein từ L-cystin

Tiến hành phản ứng tổng hợp SCMC từ L-cystin dựa trên các phương pháp chính của Earl Pierson, thực hiện phản ứng một giai đoạn thu SCMC

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết

 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết sản phẩm thu được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

 SKLM: Tính giá trị hệ số lưu giữ Rf

 Dung môi hòa tan: dung dịch HCl 1M

 Hệ dung môi chạy sắc ký: n-Butanol: Acid acetic băng: Nước cất= 6:2:2

 Thuốc thử hiện màu: Dung dịch Ninhydrin 1% trong aceton

 Tinh chế sản phẩm được tiến hành bằng các phương pháp kết tinh trong các dung môi thích hợp, hoặc trong nước ở pH thích hợp

2.3.3 Xác định cấu trúc sản phẩm

 Phổ hồng ngoại (IR)

 Phổ khối lượng (MS)

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

2.3.4 Phương pháp kiểm nghiệm hàm lượng carbocistein

Định lượng carbocistein tổng hợp được theo Dược điển Anh BP 2007 bằng phương pháp chuẩn độ acid- base trong môi trường khan

 Thao tác: Hòa tan 0,150g chế phẩm trong 10ml acid formic khan, đun nóng nhẹ

và lắc tới khi hòa tan hoàn toàn Thêm 50ml acid acetic khan Chuẩn độ với acid percloric 0,1M, xác định điểm kết thúc bằng máy đo điện thế

1ml dd acid percloric tương đương với 17,92mg CMC

 Nguyên tắc chuẩn độ: Chuẩn độ base yếu trong môi trường khan