Khảo sát mức độ nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc tại tỉnh bắc giang

Trong số đó, một hợp chất được phát hiện thường xuyên nhất và ở nồng độ cao nhất trong các canh trường của loài này hoặc thực phẩm mà đặc biệt là ngô nhiễm F.. Hình 1.4: Cấu trúc hoá họ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

1 Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

2 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI - 2014

Phạm Thị Thanh Hà - Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược

Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện

và hoàn thành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các đồng nghiệp ở Viện Kiểm nghiệm

an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, những người đã hết lòng tạo điều kiện thuận lợi

và trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô Bộ môn Hóa Phân tích trường Đại học Dược Hà Nội đã hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình học tập và nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy cô, cán

bộ phòng quản lý sau đại học, các phòng ban khác của trường Đại học Dược Hà Nội

đã giúp đỡ emi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè luôn động viên, khích lệ em trong học tập và cuộc sống

Hà Nội, ngày 05 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Hồng Hảo

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ 3

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát về độc tố vi nấm mycotoxin [4] 2

1.1.1 Giới thiệu chung về aflatoxin [12] 2

1.1.2 Giới thiệu chung về Fumonosin [20] 6

1.2 Hiện trạng và những công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài 8

1.3 Các phương pháp xác định mycotoxin 9

1.3.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 9

1.3.2 Phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC) 10

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 12

1.4 Giới thiệu về hệ thống LC-MS/MS 13

1.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao [3] 14

1.4.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) [2] 14

1.4.3 Ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2 Trang thiết bị, hóa chất 16

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ,: 16

2.3.1 Số lượng mẫu lấy: 18

2.3.2 Phương pháp kiểm nghiệm: 18

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1.Thẩm định phương pháp kiểm nghiệm aflatoxin 26

3.1.1 Tính đặc hiệu, tính chọn lọc 26

3.1.2 Khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 27

3.1.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 28

3.1.4 Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 29

3.1.5 Độ chính xác của phương pháp phân tích (độ đúng và độ chụm) 30

3.2 Thẩm định phương pháp kiểm nghiệm fumonisin B1 31

3.2.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc: 31

3.2.2 Xác định khoảng tuyến tính 33

3.2.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 33

3.2.4 Khảo sát độ lặp lại của hệ thống 34

3.2.5 Độ chính xác của phương pháp phân tích (độ đúng và độ chụm) 35

3.3 Đánh giá mức độ ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc 36

3.3.1 Kết quả phân tích mẫu lạc nhân 36

3.3.2 Kết quả phân tích mẫu lạc củ 38

3.3.3 Kết quả phân tích mẫu ngô 40

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 41

4.1 Về Phương pháp phân tích aflatoxin (B1, B2, G1, G2) và fumonisinB1 bằng sắc ký lỏng khối phổ 41

trong ngô 42

4.4 Đánh giá các yếu tố liên quan ảnh hưởng đến tình hình ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc 43

KẾT LUẬN 44

5.1 Thẩm định phương pháp 44

5.2 Mức độ ô nhiễm Aflatoxin trong lạc, fumonisinB1 trong ngô: 44

5.3 Đề xuất giải pháp nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm mycotoxin trong ngô, lạc 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC I 50

Phụ lục IA: Một số sắc đồ thẩm định các aflatoxins 50

Phụ lục IB: Một số sắc đồ thẩm định các fumonisinB1 55

Phụ lục II: Quy định của AOAC về độ thu hồi và độ lặp lại [22] 57

Phụ lục III: Chứng nhận kết quả mẫu liên phòng các Aflatoxins 58

Phụ lục IV: CÁC BẢNG KẾT QUẢ 59

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Commission KPH Không phát hiện

LOD Giới hạn phát hiện Limit of Detection

LOQ Giới hạn định lượng Limit of Quantification

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng hai lần khối phổ

UV Detector tử ngoại

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1: Aflatoxin nhiễm trên cơ chất lạc 3

Hình 1.2: Công thức hóa học của một số loại aflatoxin 4

Hình 1.3: Nấm mốc Fumonisin nhiễm trên ngô 6

Hình 1.4: Cấu trúc hoá học phân tử Fumonisin 8

Hình 1.5: Mô hình hệ thống LC-MS/MS 13

Hình 1.6: Bộ nguồn ion hóa 14

Hình 3.1: Sắc đồ phân mảnh của các aflatoxins 26

Bảng 3.1 Giá trị mảnh ion mẹ và hai ion con của các aflatoxins 26

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khỏang tuyến tính của các aflatoxins 27

Hình 3.2 Kết quả khảo sát khỏang tuyến tính của các aflatoxins 28

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của các aflatoxins 30

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của các aflatoxins 30

Bảng 3.6 Kết quả tham gia thử nghiệm liên phòng của các aflatoxins 31

Bảng 3.7 Giá trị mảnh ion mẹ và hai ion con của fumonisinB1 32

Hình 3.3: Sắc đồ phân mảnh của fumonisin B1 32

Hình 3.4: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của fumonisin B1 33

Hình 3.5: Sắc đồ fumonisin B1 tại LOQ - 5 ng/ml 33

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của các fumonisinB1 34

Bảng 3.9: Kết quả đánh giá độ chính xác của phương pháp trên nền mẫu ngô 35

Hình 3.6 Tỉ lệ nhiễm Aflatoxin của các mẫu lạc nhân 36

Hình 3.7 Mối quan hệ tình trạng mẫu và sự nhiễm AF trong các mẫu lạc nhân 38

Hình 3.8 Tỉ lệ số mẫu lạc củ nhiễm aflatoxin 38

Hình 3.9 Mối liên hệ giữa tình trạng mẫu và số mẫu lạc củ nhiễm AF 39

Hình 3.10: Sắc đồ mẫu lạc có aflatoxin B2 với mức nhiễm là 8,8ppb 39

Hình 3.11: Sắc đồ mẫu lạc có aflatoxin B1 với mức nhiễm 6,6ppb 40

Hình 3.12: Sắc đồ mẫu ngô không có fumonisin 40

Hình 3.13: Sắc đồ mẫu ngô nhiễm fumonisin 0.86 µg/kg 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được quan tâm bởi nó liên quan trực tiếp tới sức khỏe của tất cả người tiêu dùng Thời gian vừa qua trong nước liên tiếp phát hiện các vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có các vụ ngộ độc liên quan đến mycotoxin đã gây ra tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng khi lựa chọn thực phẩm cũng như việc sử dụng thực phẩm thế nào là đúng cách

Trong số 10.000 loại nấm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là

có hại đối với gia súc gia cầm và con người Các loại nấm này sản sinh ra các độc tố được gọi chung là mycotoxin Mycotoxin là chất độc sinh ra từ nấm mốc, được hình thành khi nấm chuyển hóa các chất dinh dưỡng có trong thức ăn và nguyên liệu Theo

tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc thế giới có chứa một hàm lượng mycotoxin ở một mức độ nào đó Tùy vào vị trí địa lý, khả năng nhiễm mycotoxin lại khác nhau Ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới, nguy cơ nhiễm mycotoxin càng cao Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc là khá phổ biến Sự hình thành nấm mốc

và độc tố của chúng có thể bắt đầu từ khi cây còn ở trên đồng, lúc thu hoạch, trong khi bảo quản hoặc ngay cả trong quá trình chế biến thức ăn cho vật nuôi Không nơi nào trên thế giới có thể thoát khỏi nấm mốc và độc tố từ chúng, và tác hại của chúng là vô cùng to lớn đối với năng suất vật nuôi và sức khỏe con người

Với vai trò quan trọng của cây lương thực đối với đời sống con người cũng như nền kinh tế quốc dân, thì việc đánh giá các yếu tố nguy cơ có thể xảy ra đối với việc tiêu thụ thực phẩm là rất cần thiết đối với Việt Nam, vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá ô nhiễm mycotoxin trong thực phẩm với mục tiêu của đề tài là:

1 Thẩm định phương pháp xác định Aflatoxin(B1, B2, G1, G2) trong lạc và FumonisinB1 trong ngô bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS/MS)

2 Áp dụng phương pháp đánh giá mức độ ô nhiễm từng Aflatoxin(B1, B2, G1, G2) trong lạc, fumonisinB1 trong ngô

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về độc tố vi nấm mycotoxin

Độc tố nấm mốc còn gọi là mycotoxin là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi chất thứ cấp của các sản phẩm nấm mốc và gây ngộ độc đối với động vật có vú, cá và gia cầm

Những số liệu có giá trị về các mycotoxin và các bệnh về mycotoxin đã được thu nhận từ lĩnh vực thú y học Nghiên cứu về động vật thực nghiệm đã cho thấy tính độc của mycotoxin là rất lớn Bệnh nấm mốc ở người và thực vật đều không có khả năng lây lan vì chúng do tác nhân độc tố hóa học gây ra Tuy nhiên, hầu như các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo và vì thế nó có khả năng lây nhiễm trực tiếp cho thực phẩm của con người Khi gia súc ăn các thức ăn nhiễm mycotoxin, chúng không chỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, và như vậy tạo sự

nhiễm mycotoxin tiếp theo cho con người [4]

Độc tố nấm mốc đã thu hút sự quan tâm của toàn cầu bởi chúng đe dọa đến sức khỏe con người và động vật cũng như sự thiệt hại nghiêm trọng về kinh tế Điều này

đã được chứng tỏ bằng nhiều hội nghị hội thảo quốc tế, tạp chí và các bài nghiên cứu dành cho vấn đề cấp thiết này

Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus Trong

đó đáng chú ý nhất là Aspergillus flavus (A.flavus) và Aspergillus parasiticus (A.parasiticus) thường có trong các hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt

bông,…) Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức ăn nhiễm aflatoxin

1.1.1.1 Điều kiện sản sinh aflatoxin

Khả năng sinh độc tố của các chủng Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus rất khác nhau Điều đó phụ thuộc vào các yếu tố như nấm mốc, các cơ

chất, các yều tố nhiệt độ, độ ẩm cơ chất và môi trường

Ngoài việc định lượng tổng số các aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ

lệ riêng phần của các aflatoxin khác nhau đã biết nói chung, aflatoxin B1 được tạo ra

nhiều nhất cả trong thiên nhiên lẫn nuôi cấy, rồi đến AFG1, sau đó rất xa là AFB2, còn AFG2 và các AF khác thì tỉ lệ khá thấp

Cơ chất và môi trường chủ yếu từ các hạt có dầu đặc biệt là hạt lạc và các sản phẩm từ lạc, lượng độc tố chứa trong lạc cao nhất

Hình 1.1: Aflatoxin nhiễm trên cơ chất lạc

Nhiệt độ thích hợp để sản sinh aflatoxin của các chủng nấm mốc là từ 25-28oC

Nếu nuôi cấy Aspergillus flavus ở 45oC thì khả năng sinh aflatoxin sẽ bị ức chế

Hàm lượng nước trong cơ chất đóng vai trò quan trọng cho quá trình hình thành aflatoxin Ở lạc nhân, lượng nước từ 15- 30% thì sự hình thành xuất hiện sau 2 ngày; trên gạo cần lượng nước 24 -26 % và ở ngô là 19-24% Như vậy có thể nói sự sản sinh aflatoxin diễn ra rất nhanh Đặc biệt sau thu hoạch, cơ chất có hàm lượng nước khá cao, thời gian làm khô kéo dài là nguyên nhân dẫn đến nhiễm aflatoxin

1.1.1.2 Cấu trúc và tính chất của aflatoxin

1.1.1.2.1 Cấu trúc hóa học

Các aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật, hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất gồm 4 hợp chất của nhóm bis- furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm

Aflatoxin B1, B2 trong bò sữa được chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk) Afltoxin M1 có huỳnh quang xanh tím, afltoxin M2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím Afltoxin M1 là hidroxi- 4 aflatoxin B1,

và aflatoxin M2 là hidroxi - 4 aflatoxin B2

Hình 1.2: Công thức hóa học của một số loại aflatoxin

Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại aflatoxin khác và được là flavatoxin hoặc flavacuramin

1.1.1.2.2 Tính chất hóa lí của aflatoxin

Aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt

độ thông thường (ở 1200C, phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) Do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa Tuy nhiên nó tương đối không bền khi để dưới không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hòa tan trong dung môi phân cực cao nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn Các aflatoxin trong các dung môi chloroform và benzene bền vững trong nhiều năm nếu giữ trong tối và lạnh Các aflatoxin ít hoặc không bị phân hủy dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiên, khi có độ ẩm và ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định

Các aflatoxin được hòa tan trong dung môi phân cực nhẹ như cloroform, methanol và đặc biệt ở dimethylsulfosit (dung môi thường được sử dụng như phương

tiện trong việc áp dụng các aflatoxin vào các động vật thực nghiệm) Tính tan của các aflatoxin trong nước dao động từ 10 - 20mg/l

Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân trong môi trường kiềm, đặc tính này quan trọng trong bất kì quá trình chế biến thực phẩm, vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng aflatoxin của các sản phẩm, mặc dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hóa sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin ban đầu

Nhiệt độ cao (khoảng 100oC) sự mở vòng deccarboxylation xảy ra và có thể tiến xa hơn, dẫn đến sự mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm Khi có các axit vô

cơ và bổ sung nước, aflatoxin B1 và G1 chuyển hóa thành aflatoxin B2A và G2A Các sản phẩm cộng hợp tương tự của aflatoxin B1 và G1 cũng được hình thành với clorua axit formic thionyl, clorua axit axetic và axit thionyl trifluoacetic

1.1.1.2.3 Độc tính của aflatoxin [29]

Nếu hấp thu một lượng là 2,5 mg aflatoxin trong thời gian ngắn (khoảng 3 tháng)

có thể dẫn đến ung thư gan sau một năm Trong cơ thể động vật, aflatoxin gắn ARN và AND thành dạng liên kết, cản trở việc sinh tổng hợp AND, ARN và protein, gây đột biến dẫn đến ung thư và làm giảm hệ suy giảm miễn dịch Sự liên kết của aflatoxin với protein làm vô hoạt các enzyme, thay đổi tính chất của ty thể, lạp thể, suy giảm quá trình hô hấp của mô bào

Aflatoxin tích lũy trong mô, chủ yếu là mô gan, gây nhiễm độc cho người ăn thịt các loại gia cầm, gia súc này, tạo nên một dây chuyền sinh học của mầm bệnh Sự nguy hiểm của aflatoxin B1 ở chỗ nó có khả năng gây hại chỉ với liều lượng rất nhỏ, 1

kg thức ăn chỉ cần nhiễm 2 miligam cũng đã đủ làm hỏng gan

Bảng 1.1: Các giới hạn tối đa AFcủa Bộ Y tế Việt Nam [5]

ML(µg/kg)

1.1 Lạc và những hạt có dầu khác làm nguyên

liệu, hoặc cần được xử lý trước khi sử dụng

làm thức ăn hoặc sử dụng như một thành

1.12 Ngô và gạo, cần được xử lý trước khi làm

thức ăn hoặc sử dụng như 1 thành phần trong

thực phẩm

Trong các mycotoxin, mối quan tâm về các fumonisin ngày càng tăng cao

Fumonisin là độc tố mới được phát hiện gần đây do Fumonisin moniliorme tổng hợp

nên Đây là nhóm độc tính cao với động vật và con người Việc nhiễm fumonisin trong thức ăn cho người và gia súc ở quy mô trên toàn thế giới Riêng tại Mỹ, các báo cáo cho thấy 80 - 100% ngô bảo quản bị nhiễm fumonisin

Hình 1.3: Nấm mốc Fumonisin nhiễm trên ngô

Fumonisin chủ yếu do các nấm mốc thuộc giống Fusarium tổng hợp nên Loài điển hình nhất trong số này là Fusarium moniliforme Các chủng nấm mốc của loài

này, do Sheldon xác định vào năm 1904 khá phổ biến trong môi trường và thường nhiễm trong lương thực, đặt biệt là ngô

Vào năm 1988, các đặc tính của fumonisin lần đầu tiên được xác định và các sản

phẩm trao đổi chất của nó lần đầu tiên được phát hiện trong canh trường F

moniliforme Trong số đó, một hợp chất được phát hiện thường xuyên nhất và ở nồng

độ cao nhất trong các canh trường của loài này hoặc thực phẩm mà đặc biệt là ngô

nhiễm F moniliforme Hợp chất này sau đó được đặt tên “fumonisin B1”

Các nguyên cứu về sau này cho thấy rằng không chỉ có F moniliforme tổng hợp nên fumonisin mà các chủng khác thuộc Fusarium cũng tham gia tổng hợp nên độc tố loại này bao gồm F proliferatum, F subglutinans, F anthophilum, F annulatum, F

succisae, F beomiforme, F dlamini, F napiforme và F nygamai

1.1.2.1 Cấu trúc Fumonisin

Fumonisin là nhóm hợp chất diester của axit tricarxylic với các rượu bậc cao khác nhau Fumonisin chứa nhóm amin bậc nhất, tan trong nước và bền vững với nhiệt Trong số các fumonisin, chỉ fumonisin B1, B2 và B3 được phát hiện với hàm lượng đáng kể cả trong điều kiện tự nhiên và điều kiện phòng thí nghiệm (hình 1.4 sau)

1.1.2.2 Độc tính của fumonisin

Fumonisin B1 là độc tố có độc tính mạnh nhất trong số các fumonisin Fumonisin B1 có thể gây các triệu chứng nhũng não, suy gan, gây mù, gây các triệu chứng bất bình thường cho tới tử vong ở ngựa (ELEM), ung thư gan ở chuột, bệnh gan ở gà, suy tim cấp ở khỉ

Chỉ ở liều lượng 10 mg/kg thức ăn trong vòng 40 - 50 ngày, fumonisin đã có thể gây hội chứng ELEM Fumonisin B1 có liên quan tới bệnh ung thư thực quản ở gà Mới đây, Cơ quan Nguyên cứu Quốc tế về ung thư đã xếp fumonisin B1 vào nhóm 2B, nhóm các hợp chất gây ung thư cho người Nguyên cứu ảnh hưởng của các fumonisin tới người, người ta thấy có sự liên quan của bệnh ung thư thực quản và việc sử dụng các lương thực nhiễm các fumonisin

Hình 1.4: Cấu trúc hoá học phân tử Fumonisin

Độc tính của fumonisin B1 liên quan mật thiết tới các hiệu ứng lên sự trao đổi chất các sphingolipid, bao gồm quá trình tổng hợp mới, tích luỹ các sphingolipid tự do, quá trình thải loại các sphingoid tự do, tăng hàm lượng các sản phẩm lipid và sphingosin Các hiệu ứng dẫn tới hàng loạt các phản ứng sinh hoá gây ra các sự nhiễm độc khác nhau

Các nhà khoa học Mỹ đã tiến hành thí nghiệm cho chuột ăn thức ăn nhiễm fumonisin và phát hiện rằng các cơ quan đích của độc tố này là gan và thận

1.2 Hiện trạng và những công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài

Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về mycotoxin trong thực phẩm và biện pháp giảm nguy cơ ô nhiễm mycotoxin, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về đánh giá phơi nhiễm Aflatoxin Trong số các đề tài công bố gần đây như:

Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Giang, Phan Thị Kim và cộng sự Cục an toàn

vệ sinh thực phẩm (2001) cho thấy kết quả khảo sát ban đầu xác định 95,4% trong số

243 mẫu khảo sát ngô và lạc ban đầu bị nhiễm AF, trong đó có 23,64% vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế Sau 6 tháng can thiệp bằng cách tách tạp chất, sấy và bảo quản, kết quả cho thấy có sự cải thiện rõ rệt: 76,6% không phát hiện AF; 23% mẫu

nhiễm AF với hàm lượng nhỏ hơn mức quy định [1]

Nghiên cứu của Phan Thị Bích Trâm và Nguyễn Văn Bá về hàm lượng mycotoxin trong bắp tồn trữ cho thấy kết quả định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao cho thấy đã xác định được các loại Aflatoxin Bl, B2,Gl, G2 có trong các mẫu bắp tồn trữ ở các thời điểm 3, 5, 7, 9 và 12 tuần Trong điều kiện khô thoáng, nhiệt độ trung bình 27,40C và độ ẩm không khí trung bình 79,3%, độ ẩm trung bình hạt bắp thấp (11,8%) thì có thể trữ hạt đến 2 tháng mà hàm lượng aflatoxin tổng số vẫn dưới mức cho phép Hàm lượng aflatoxin tổng số ở các thí nghiệm trữ bắp ở độ ẩm 72% và 89%

sẽ đạt nhanh đến mức cao khi độ ẩm hạt ≥ 13,5% [4]

Virmani đã tiến hành nghiên cứu ở 7 vùng sinh thái của Việt Nam và đánh giá mối liên quan của nguy cơ nhiễm AF tại các vùng sinh thái tại 3 giai đoạn (1) giai đoạn sinh trưởng và phát triển, (2) giai đoạn thu hoạch và làm khô, (3) giai đoạn tàng trữ Nhìn chung kết quả cho thấy nguy cơ nhiễm AF trong lạc trong quá trình tàng trữ ở mức độ cao trên toàn Việt Nam [31]

1.3 Các phương pháp xác định mycotoxin

1.3.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Reddy và các cộng sự (2001) [28], phân tích aflatoxin B 1 (AFB 1) trong ớt bằng việc sử dụng phương pháp ELISA Mẫu của ba loại vỏ ớt được thu thập trong các cuộc điều tra năm 1998 và 1999, từ các thị trường chính và các cơ sở lưu trữ lạnh trong những khu vực trồng ớt lớn của bang Andhra Pradesh (AP), Ấn Độ Bột ớt được thu thập từ các siêu thị khác nhau tại Hyderabad, AP Để tránh ảnh hưởng của các chất gây nhiễu, dùng methanol để chiết aflatoxin trong ớt Trong chín mẫu đại diện đã có

sự kết hợp giữa phương pháp ELISA và HPLC để xác định giá trị của AFB 1 và kết quả cho thấy các quy trình áp dụng phương pháp ELISA là đáng tin cậy Từ 182 mẫu

ớt thử nghiệm, 59% số mẫu bị nhiễm với AFB 1 và 18% có độc tố ở mức không cho phép Các AFB1 cao nhất nồng độ 969 mg/kg đã được tìm thấy trong một mẫu đại diện của vỏ ớt Nhìn chung, tỷ lệ tối đa của quả ớt cho thấy AFB 1 mức cao hơn 30 mg/kg (mức độ tối đa cho phép) Vỏ ớt được bảo quản trong phòng lạnh cho thấy có chứa tỷ lệ độc tố aflatoxin thấp nhất Gần 9% của bột ớt được bán trong siêu thị có chứa hàm lượng aflatoxin vượt quá mức cho phép

Shi Chun Pei, Yuan Yuan Zhang, Sergei A Eremin, Won Jong Lee (2009) [29] cũng đã dùng phương pháp cạnh tranh gián tiếp ELISA, sử dụng kháng thể đơn dòng

để đo aflatoxin M1 (AFM1) trong sữa và sản phẩm của sữa Giới hạn phát hiện nồng

độ của AFM1 là 0,04 ng/ml Mức độ ô nhiễm AFM1 được đo trong 12 mẫu sữa nguyên liệu, 15 mẫu sữa bột, 104 mẫu sữa nước và bốn mẫu pho mát được lấy từ các siêu thị khác nhau ở Đông Bắc của Trung Quốc 135 mẫu sữa được kiểm tra, có 55 (41%) mẫu có AFM1 ở mức dao động 0,32 - 0,50 ng/ml, 24 (18%) mẫu có 0,16 - 0,32 ng/ml, và 18 (13%) mẫu có 0 - 0,16 ng/ml, trong 38 (28%) mẫu AFM1 đã không được phát hiện Kết quả cho thấy các biện pháp phòng ngừa cần thiết sẽ phải được thực hiện

để giảm thiểu ô nhiễm AFM1 trong sữa và các sản phẩm sữa từ vùng Đông Bắc Trung Quốc

Kỹ thuật này có ưu điểm: nhanh, đơn giản, tiết kiệm dung môi, đặc hiệu và khá nhạy nhưng dễ cho kết quả dương tính giả hoặc âm tính giả Phân tích ELISA thuận tiện cho việc xác định đồng thời các chất ô nhiễm trong một số lượng lớn các mẫu với chi phí tương đối thấp và thời gian ngắn Tuy nhiên, nó không thích hợp để định lượng các chất ô nhiễm vì nó có thể bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng của nhiều mẫu và có khả năng để đánh giá quá cao các chất gây ô nhiễm ở nồng độ rất thấp

1.3.2 Phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động

di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động

Jörg Stroka, Robert van Otterdijk, Elke ANKLAM (2000) [19] đã sử dụng phương pháp TLC một chiều để xác định độc tố aflatoxin (B 1, B 2, G1 , G2 ) trong các loại thực phẩm khác nhau bằng việc sử dụng dung môi clo Sử dụng cột ái lực miễn

dịch để làm sạch sau khi được chiết với methanol Các giới hạn định lượng được tìm thấy là thấp hơn so với giới hạn quy định hiện hành về kiểm soát aflatoxin bên ngoài

và trong Cộng đồng châu Âu

Phương pháp TLC là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần đầu

tư lớn Nó thay thế cho phương pháp HPLC hiện đại nếu không có thiết bị HPLC tuy nhiên không thể tách và xác định được AF khi ở nồng độ thấp

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

TCVN [6, 7, 9] và nhiều tác giả trên thế giới [17, 18, 23, 25] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có dẫn xuất sau cột và làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch hoặc làm sạch bằng chiết pha rắn với detector huỳnh quang và detector UV để xác định để xác định các mycotoxin trong các loại ngũ cốc khác nhau, ví dụ như: TCVN 7930:2008:[7] Thực phẩm Xác định aflatoxin B1 và aflatoxin tổng B1, B2, G1, G2 trong ngũ cốc, quả có vỏ và sản phẩm của chúng Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có dẫn xuất sau cột và làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch

TCVN 8162:2009:[9] Thực phẩm-xác định fumonisinB1 và B2 trong ngô – phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao có làm sạch bằng chiết pha rắn

Theo Zhaohui Fu, Xuexiang Huang, Shungeng Min (2008) đã phát triển phương pháp sử dụng UPLC với detector UV để xác định aflatoxin B1, B2, G1 và G2 trong ngô và lạc Trong phương pháp này, aflatoxin được chiết với hỗn hợp của acetonitril trong H2O (86:14) và sau đó làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch Độ thu hồi trung bình của độc tố aflatoxin từ mẫu lạc và mẫu ngô ở nồng độ 0,22 - 5 mg/kg là 83,4% và 94,7% Các giới hạn phát hiện (S/N = 3) cho B1, B2, G1 và G2 lần lượt là 0,32, 0,19, 0,32 và 0,19 mg/kg, và giới hạn định lượng tương ứng (S/N = 10) là 1,07, 0,63, 1,07 và 0,63 mg/kg [33]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp thông dụng để xác định các hợp chất hữu cơ Phương pháp này đã được ứng dụng để xác định đồng thời các nhiều hợp chất khác nhau Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy không cao khi sử dụng detector UV, còn khi sử dụng detector huỳnh quang, phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ có thể nhận biết chất phân tích thông qua thời gian lưu Đối với những nền mẫu phức tạp như thực phẩm, các chất phân tích rất dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu,

nếu chỉ dựa vào thời gian lưu sẽ rất khó để có thể khẳng định chất cần phân tích

Nhóm tác giả L.C Huang [21] đã nghiên cứu xác định một nhóm các chất aflatoxin M1, ochratoxin A, zearalanone và α-zearalenol trong sữa bằng phương pháp UHPLC-MS/MS Mẫu sữa được làm sạch bằng cột chiết pha rắn Oasis HLB Giới hạn định lượng của các mycotoxins nằm trong khoảng 0,003 - 0,015 µg/kg Hệ số tương quan cao (R2 ≥ 0,996) thu được trong khoảng nồng độ mycotoxin 0,01 - 1,00 µg/kg với độ thu hồi cao (87,0 - 109%), độ lặp lại (3,4 - 9,9%) và độ tái lập phòng thí nghiệm tốt (4,0 - 9,9%) ở mức nồng độ 0,025; 0,1; 0,5 µg/kg Tỷ lệ phát hiện mẫu dương tính là 16,7% đến 96,7% trong sữa nguyên liệu, sữa lỏng và sữa bột thu thập

từ các trang trại và các siêu thị ở Beijing

Baifen Huang, Zheng Han, Zengxuan Cai, Yongjiang Wu, Yiping Ren (2010) [13] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (UHPLC-MS/MS) để xác định đồng thời các độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1 và M2 trong đậu phộng và các sản phẩm của chúng Mẫu được chiết xuất bằng dung dịch acetonitrile 84% và làm sạch bằng cách qua cột chiết pha rắn Các hợp chất tách ra đã được phát hiện với khối phổ

tứ cực 2 lần Waters MICROMASS Quattro Ultima Phương pháp này có độ tuyến tính

( R 2 ≥ 0,9990), độ thu hồi trung bình (74,7 - 86,8%) và độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối ≤ 10,9%) Nó đã được chứng minh là một phương pháp thích hợp để xác định đồng thời sáu aflatoxin trong đậu phộng và các sản phẩm của chúng Phương pháp đã được áp dụng phân tích 73 mẫu được thu thập ngẫu nhiên từ các khu vực khác nhau ở tỉnh Chiết Giang Kết quả cho thấy 31 mẫu bơ đậu phộng, 14 mẫu đậu phộng tươi và 5 mẫu của đậu phộng mốc đã bị nhiễm độc tố aflatoxin

Eduardo Beltrán, María Ibáñez, Juan Vicente Sancho, Miguel Ángel Cortés,

Vicent Yusà, Félix Hernández (2011) [16] cũng sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao

áp (UHPLC ) cùng với khối phổ 2 lần (MS/MS) xác định các độc tố nấm mốc quy định khác nhau (aflatoxin G1, G2, B1, B2, M1, và ochratoxin A) trong các mặt hàng thức ăn trẻ em và sữa Phương pháp sử dụng để phân tích các sản phẩm sữa khác nhau (ngũ cốc sữa bột, sữa bột cho trẻ sơ sinh, sữa ngũ cốc cho trẻ sơ sinh và sữa tươi) Độ thu hồi, giữa 80% và 110%, với RSD thấp hơn 15%, đã thu được trong tất cả các mẫu thực phẩm được kiểm tra

Souheib Oueslati và cộng sự [30] sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS xác định đồng thời của các độc tố aflatoxin (AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 ), ochratoxin A (OTA), fumonisins (FB1 và FB2), deoxynivalenol (DON), T2 và HT2 độc tố trong 58 mẫu lúa mì thô (n = 34), lúa mạch (n = 5), bo bo ( n = 3), lúa mì chế biến ( n = 13) và ngũ cốc ăn sáng ( n = 3) từ các thị trường Tunisia Mức độ nhiễm độc tố nấm mốc là 50%

Wejdan Shakir Khayoon và cộng sự [32] sử dụng phương pháp HPLC detector huỳnh quang bước sóng 335 nm và 440 nm, khẳng định bằng LCMS/MS để xác định các độc tố fumonisin B1 và B2 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng cách sử dụng cột đá nguyên khối silica, thành phần pha động sử dụng methanol và đệm phosphate pH 3.35 (78:22, v/v) với tốc độ dòng chảy 1,0 ml/phút Các fumonisins tách trong khoảng 4 phút, so với khoảng 20 phút nếu sử dụng một cột hạt C18 Giới hạn phát hiện là 0,01 - 0,04 mg/ g fumonisin B1 và B2 Độ thu hồi từ 84,0-106,0 % cho fumonisin B1 và 81,0 -103,0 % cho fumonisin B2

Với những ưu điểm của của phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ chúng tôi đã chọn để phân tích từng độc tố aflatoxin(B1,B2,G1,G2) trong lạc và fumonisinB1 trong ngô khảo sát mức độ ô nhiễm trên địa bàn huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang

1.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao [3]

Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động

là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

1.4.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) [2]

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của phân

tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z)

Về bản chất, có thể coi khối phổ là một loại detector, nhưng là một detector đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện khối phổ còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện

Hình 1.6: Bộ nguồn ion hóa

- So sánh phổ khối của chất phân tích với chất chuẩn đối chiếu trong cùng điều kiện sắc ký

Phân tích định lượng :

- Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Hàm lượng phần trăm của một thành phần

trong mẫu phân tích được xác định bằng tỷ số (tính theo phần trăm) giữa diện tích pic của thành phần đó và tổng diện tích các pic của tất cả các thành phần có mặt trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và của các thành phần có hàm lượng nhỏ hơn giới hạn phát hiện của chúng) Phương pháp này thường cho kết quả không tin cậy nếu không dùng hệ số đáp ứng fi

- Phương pháp ngoại chuẩn: Đường chuẩn được lập dựa trên mối tương quan

giữa các lượng chất chuẩn đối chiếu khác nhau và diện tích pic tương ứng của chúng Nồng độ các chất phân tích trong mẫu thử được định lượng dựa trên đường chuẩn này Phương pháp thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu cùng điều kiện như phân tích mẫu bình thường Dựa trên lượng chuẩn thêm và tín hiệu các mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn từ đó tính được nồng độ chất có trong mẫu

- Phương pháp nội chuẩn: Trong phương pháp này, người ta chọn một chất

chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu Tỷ số diện tích của chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn Phương pháp này có độ chính xác cao, vì nó có thể loại bỏ được các yếu

tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu chất phân tích

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu kiểm tra đánh giá mức độ ô nhiễm mycotoxin gồm: lạc củ, lạc nhân và ngô mua tại các hộ gia đình và hộ kinh doanh tại địa bàn huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang Bằng cách ghi lại các thông tin về tình trạng mẫu phân tích và mối liên quan với các tính chất của mẫu đánh giá mối liên quan đến ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

 Áp dụng phương pháp đã thẩm định phân tích aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong lạc

và fumonisinB1 trong ngô

2.2 Trang thiết bị, hóa chất

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ,:

2.2.1.1 Máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS với hệ thống HPLC 20 AXL

của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem 2.2.1.2 Cột sắc ký Xbridge C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm) và tiền cột 2.2.1.3 Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg

2.2.1.8 Lò nung, có khả năng hoạt động ở 500 0C

2.2.1.9 Tủ lạnh đông, có thể đạt được nhiệt độ -20 0C

Aldrich hoặc tương đương) 2.2.2.3 Chuẩn aflatoxin B1, B2, G1, G2 có độ tinh khiết 99%, Supelco hoặc

tương đương (có thể sử dụng chuẩn mix) 2.2.2.4 Methanol, loại dùng HPLC (Merck hoặc tương đương)

2.2.2.5 Acetonitril, loại dùng HPLC (Merck hoặc tương đương)

2.2.2.6 Cloroform: loại tinh khiết phân tích

2.2.2.7 Diclomethan: loại dùng cho HPLC (Merck hoặc tương đương)

2.2.2.8 n-hexan: loại dùng cho sắc ký lỏng (Merck hoặc tương đương)

2.2.2.9 Magie sulfat khan (MgSO4): dạng bột, độ tinh khiết > 98%, nung ở

500 0C trong > 5 giờ để loại hết nước thừa (Merck hoặc tương đương)

2.2.2.10 Natri clorua (NaCl): (Merck hoặc tương đương)

2.2.2.11 Acid acetic: (Merck hoặc tương đương)

2.2.2.12 Pha động fumonisin: Dung dịch acid acetic 0,1 % (v/v) trong nước:

Hút 1 ml acid acetic hòa vào nước cất hai lần định mức đến 1 lít Lọc qua màng lọc 0.45 µm, dung dịch sử dụng trong 1 tuần

2.2.2.13 Hỗn hợp muối chiết fumonisin: Cân 500 mg MgSO4 (6.1.4) và 250

mg NaCl (6.1.5) trên cân (5.1.4) cho vào túi hoặc dụng cụ chứa có thể đậy kín Lắc trộn đều Mỗi hỗn hợp được sử dụng cho một mẫu phân tích Chuẩn bị một loạt các hỗn hợp đảm bảo đủ cho các lô mẫu phân tích

2.2.2.14 Nước cất hai lần

2.2.2.15 Hỗn hợp cloroform:acetone (90:10): Dùng pipet 10 ml hút chính xác

10 ml acetone vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch bằng cloroform

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Số lượng mẫu lấy:

Cỡ mẫu cho nghiên cứu sử dụng công thức tính cỡ mẫu mô tả:

Trong đó: p là tỷ lệ số mẫu bị ô nhiễm mycotoxin trong ngô và lạc, theo nghiên cứu của Lê Văn Giang tại Tân Kỳ - Nghệ An là 96% trong ngô và 98% trong lạc

d: độ chính xác tuyệt đối: 0,05 Z=1,96 với độ tin cậy α = 0,05

Từ đó ta tính được số mẫu ngô là n = 59 và số mẫu lạc là n = 30

Ta thực hiện lấy 60 mẫu ngô, 30 mẫu lạc nhân và 30 mẫu lạc củ

2.3.2 Phương pháp kiểm nghiệm:

2.3.2.1 Phương pháp kiểm nghiệm aflatoxin:

Mẫu lạc nhân và lạc củ được xác định hàm lượng AF (B1, B2, G1, G2) bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS theo [6, 7]

Nguyên lý: Mẫu được chiết bằng cloroform và làm sạch trên cột chiết pha rắn Si

Aflatoxins được tách và định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ sử dụng cột pha đảo C18

Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu rắn được xay nhỏ, trộn đều: Cân chính xác

khoảng 10-20 g trên cân phân tích vào bình nón 250 ml Mẫu nước và mẫu lỏng: Cân khối lượng hoặc hút thể tích trực tiếp tương đương khoảng 10 - 20 g vào bình nón 250

ml

Chiết aflatoxin trong các sản phẩm chứa ít chất béo: Thêm 100 ml cloroform

vào mẫu đã chuẩn bị ở trên Lắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút trên máy lắc ngang Sau đó được lọc qua giấy lọc vào bình cô quay 250 ml Dịch chiết được cô quay bằng máy cô quay chân không ở 40C đến cạn Sau đó được hòa cặn bằng 10 ml

diclomethan

Chiết Aflatoxin trong các sản phẩm nhiều chất béo: Thêm 100 ml hỗn hợp methanol: nước (85:15, ….) vào mẫu đã được chuẩn bị ở trên, lắc đều Hỗn hợp được lắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút trên máy lắc ngang Sau đó được lọc qua giấy lọc Lấy 40 ml dịch lọc ở trên cho vào phễu chiết 500 ml, thêm 40 ml dung dịch NaCl 1%, sau đó thêm 25 ml n-hexan vào và lắc đều để chiết loại chất béo Để yên đến khi phân lớp rồi lấy lớp dưới vào phễu chiết khác, lớp phía trên loại bỏ Lớp dưới được thêm 25

ml cloroform vào và lắc đều để chiết aflatoxin, để lắng đến khi phân lớp Lấy lớp dưới, lớp trên được chiết lặp lại lần 2 với 25 ml cloroform Dịch của hai lần chiết được gộp vào bình cất quay 100 ml Sau đó được cô quay bằng máy cô quay chân không ở 40C đến cạn Sau đó được hòa cặn bằng khoảng 10 ml diclomethan và làm sạch trên cột SPE-Si Cột được hoạt hóa bằng 3ml n-hexan, 3ml diclomethan Mẫu được nạp qua cột với tốc độ 1 - 2 ml/phút Sau đó được rửa tạp với 3 ml n-hexan, 3 ml diclomethan Chất phân tích được rửa giải ra bằng 10 ml hỗn hợp cloroform- acetone (90 : 10) vào bình cô quay 100 ml

Dịch rửa giải được cô quay đến cạn và hòa cặn bằng 1 ml methanol và được bơm vào hệ thống LC-MS/MS

* Mẫu kiểm tra (thu hồi, QC): Lặp tương tự các bước như trên nhưng có

thêm chuẩn aflatoxins vào mẫu trắng trước khi chiết mẫu để xác định độ thu hồi và loại bỏ sai số trong quá trình thực hiện thao tác Mẫu spike: thêm chính xác 100µl dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu trắng rồi tiến hành phân tích giống mẫu thử

* Mẫu trắng: Mẫu trắng tiến hành tương tự như mẫu thử trên mẫu đã xác định

là không có các aflatoxins nói trên

Điều kiện chạy máy

- Cột sắc ký pha đảo C18 Waters hoặc tương đương: 250 mm, 4,6 mm, 4,5µm

- Pha động: chạy theo chương trình gradient như sau:

- Điều kiện khối phổ: Bảng sau mô tả điều kiện chạy đối với thiết bị MS ABI

5500 QQQ Các điều kiện khối phổ có thể khác nhau đối với các thiết bị khối phổ khác nhau, cần thực hiện tối ưu điều kiện bằng chất chuẩn aflatoxins

Ion source gas 1 : 30 psi Ion source gas 2 : 10 psi

Năng lượng bắn phá CE = 30 eV

Định tính: Để xác nhận sự có mặt của chất phân tích trên LC-MS/MS, ngoài sự

trùng lặp về thời gian lưu tương ứng của mỗi chất còn căn cứ vào tỷ lệ đáp ứng tín hiệu của ion định lượng và ion định tính Tỷ lệ này của aflatoxin G2, G1, B2, B1 lần lượt là: 1,1-1,4; 4,3-4,6; 1,2-1,3; 0,6-0,7 Tỷ lệ này có thể thay đổi tùy thuộc vào độ nhạy của thiết bị

Với mẫu dương tính, căn cứ vào sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau

Trong đó : V: Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy (ml)

Cm: Nồng độ aflatoxin trong dịch chiết mẫu tính theo chuẩn (ng/ml)

m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)

X: hàm lượng aflatoxin trong mẫu phân tích (ng/g)

K: Hệ số pha loãng

Mỗi mẫu làm một lần Thực hiện bơm mẫu theo đúng quy trình chạy máy Mỗi lô làm ít nhất 1 mẫu thu hồi, một mẫu trắng:

Mẫu trắng phải không có tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích

2.3.2.2 Phương pháp kiểm nghiệm fumonisin B1:

Nguyên lý: Hàm lượng fumonisin B1 trong ngũ cốc được chiết lỏng lỏng với

dung môi acetonitril (ACN), methnol (MeOH), nước (25/25/50) có bổ sung muối MgSO4 và NaCl giúp cho quá trình tách lớp hiệu quả Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,2 µm Dịch chiết cuối cùng được phân tích bằng LC-MS/MS

Chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Mẫu ngũ cốc dạng hạt được nghiền bằng máy đồng nhất

mẫu Mẫu đã ở dạng bột không cần nghiền nhưng phải trộn đều trước khi phân tích

Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1 g mẫu trên cân phân tích (2.2.1.3) vào ống ly

Ghi chú: Mẫu sau khi chiết nên được phân tích ngay, nếu không thể phân tích

ngay thì có thể bảo quản ở 2-8 0C nhưng không quá 2 ngày

Mẫu trắng: mẫu trắng tiến hành tương tự như mẫu thử trên mẫu rau quả đã xác

định là không có fumonisin B1

Mẫu kiểm tra (thu hồi, QC):Tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng có cho

thêm một lượng chuẩn chính xác đã biết nồng độ Có thể lựa chọn các cách thêm sau đây nhưng tối thiểu một lô mẫu phân tích cần có một mẫu QC

Điều kiện chạy máy:

- Điều kiện LC:

+ Cột sắc ký Xbridge C18 (100 mm x 4,6 mm; 2,5 µm)và tiền cột + Tốc độ dòng 0,6 ml/min

+ Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng + Thể tích tiêm mẫu 10µl + Pha động: theo chế độ gradient như bảng dưới

- Điều kiện khối phổ:

 Nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dương (+), thế phun 4500 kV

 Nhiệt độ đầu phun (IS) 450 0C

 Curtain Gas (CUR) 20

 Collision gas (CAD) 7

 Ion source gas 1 (GS1) 20

 Ion source gas 2 (GS1) 15

Xi: Hàm lượng fumonisin B trong mẫu (ng/g)

Ci: Hàm lượng fumonisin B1 trong dịch cuối (ng/ml)

V: Thể tích dịch chiết (ml)

k: Hệ số pha loãng (nếu có)

m: Khối lượng mẫu phân tích (g)

Tính độ thu hồi của mẫu QC theo công thức:

% = × 100 Trong đó: R%: Độ thu hồi (%)

Xt: Hàm lượng fumonisin B1 tính được trong mẫu (ng/g)

Cc: Hàm lượng fumonisin B1 thêm vào ban đầu (ng/g)

Hơn nữa để xác định chắc chắn phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu/chọn lọc cao, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu trắng không cho tín hiệu phân tích, mẫu trắng có thêm chất chuẩn

2.3.2.3.2 Khoảng tuyến tính

Khảo sát khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic chất chuẩn với nồng độ của chất đó

Phương trình hồi quy tuyến tính y  a  x  b

Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích chất chuẩn

x là nồng độ chất khảo sát

2.3.2.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được nhưng không nhất thiết phải định lượng được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc ký LOD có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 3 (S/N =3)[10]

Hoặc có thể tính LOD dựa vào độ lệch chuẩn như sau:

Tính giá trị nồng độ trung bình xtb, độ lệch chuẩn SD (S)

LOD = 3.S

Để đánh giá LOD đã tính được ta kiểm tra qua giá trị R = LODxtb

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch đem thử là phù hợp và giá trị LOD tính được là đáng tin cậy

Giới hạn định lượng LOQ (Limit of quantification) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng

và độ chụm nhận được Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N

=10) Có thể tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD [10]

2.3.2.3.4 Độ lặp lại

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích Các công thức tính toán như sau [10]:

Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại

x n

1 x

Trong đó x là giá trị trung bình số học của tập hợp các giá trị xi còn xi là giá trị kết quả của mỗi lần thí nghiệm

+ Độ lệch chuẩn :

1 n

) x x ( SD

2 n

1 i i

N

i i

x 100

x : kết quả phân tích được

: giá trị đúng của chất phân tích Trong trường hợp tham gia phân tích các mẫu thử nghiệm liên phòng thí nghiệm, có thể đánh giá kết quả thông qua giá trị Zscore Zscore được tính như sau:





x

Trong đó: là độ lệch chuẩn tham chiếu

Nếu |Zscore| ≤ 2: Kết quả được chấp nhận

2 < |Zscore| ≤ 3: Kết quả có nghi ngờ

- Khảo sát độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn

Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát Độ thu hồi (R%) được tính như sau:

100 C

C C

% R

c

m c

- Tính toán kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel

- Tính toán thời gian lưu, diện tích pic, chiều cao pic và tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu bằng phần mềm của thiết bị

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Thẩm định phương pháp kiểm nghiệm aflatoxin

3.1.1 Tính đặc hiệu, tính chọn lọc

Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc đối với AF tiến hành xác nhận giá trị IP bằng cách kiểm tra phân mảnh của các AF, phân tích các mẫu trắng và kiểm tra tỷ lệ đáp ứng tín hiệu của ion định lượng và ion định tính bằng cách thực hiện trên chuẩn và

trên mẫu lạc không có AF

Hình 3.1: Sắc đồ phân mảnh của các aflatoxins

Bảng 3.1 Giá trị mảnh ion mẹ và hai ion con của các aflatoxins

Tên chất

phân tích

Mảnh mẹ (m/z)

Mảnh con (m/z)

Aflatoxin G1

Nhận xét: theo như kết quả phân mảnh của các AF (hình 3.1) và (bảng 3.1) mỗi

AF mẹ có hai AF con, một mảnh mẹ 1,0 điểm IP, 1 con được 1,5 điểm IP như vậy

điểm IP của từng AF là 4 Mặt khác trên sắc đồ mẫu trắng (Phụ lục IA: hình 1) không

xuất hiện pic tại các thời gian lưu của các AF nghiên cứu Còn trên sắc đồ mẫu thêm

chuẩn có xuất hiện các pic tại các thời gian lưu tương ứng (Phụ lục IA: hình 2) Như

vậy phương pháp có tính đặc hiệu và chọn lọc đáp ứng yêu cầu

3.1.2 Khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn

Pha chuẩn hỗn hợp có các nồng độ từ 0,3 đến 300ppb tiến hành bơm vào hệ

thống LC-MS/MS các sắc đồ dãy chuẩn (Phụ lục IA: hình 3) Xây dựng mối quan hệ

phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích píc sắc ký ta có bảng và hình biểu diễn sau:

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khỏang tuyến tính của các aflatoxins

Diện tích pic

AFG1 15200 44100 218000 1390000 2330000 Diện tích pic

AFG2 12700 26200 109000 507000 1030000

Hình 3.2 Kết quả khảo sát khỏang tuyến tính của các aflatoxins

Nhận xét: Như vậy trong khoảng nồng độ 0,3 đến 150ppb, sự phụ thuộc giữa

nồng độ từng aflatoxins và diện tích píc sắc ký là tuyến tính với hệ số tương quan tuyến tính R2 > 0,999 Vậy khoảng tuyến tính của các AF nghiên cứu là từ 0,3 đến 150ppb

3.1.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

Để xác định giới hạn phát hiện dựa trên độ lệch chuẩn, chúng tôi đã tiến hành làm trên nền mẫu thử Làm 10 lần song song, cân chính xác khoảng 10g mẫu lạc trắng

y = 7278.7x + 18437 R² = 1

0 500000 1000000 1500000

Đường chuẩn AFB1

y = 837.44x - 424.73 R² = 0.9997

0 50000 100000 150000

y = 15578x - 9048.4 R² = 1

0 1000000 2000000 3000000

Đường chuẩn AFG1

y = 6818.9x + 3533.9 R² = 0.9999

0 500000 1000000 1500000

Đường chuẩn AFG2

cho vào bình nón 250 ml, thêm chuẩn các chất ở nồng độ 0,5 ng/ml (gấp 5 lần LOD ước lượng, LOD ước lượng là: 0,1 ng/ml) Thực hiện tiến hành xử lý mẫu theo quy

trình và đo nồng độ từng AF (sắc đồ (Phụ lục IA: hình 4) ) có các kết quả sau:

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát xác định LOD, LOQ của các aflatoxins

Nhận xét: Từ bảng kết quả thu được nhận thấy các chất đều có giá trị R thỏa

mãn yêu cầu 4<R<10, hơn nữa giá trị RSD (%) thu được 6,4 đến 9,1, cũng thỏa mãn

theo AOAC trong khoảng nồng độ 1ppb thì cho phép RSD% tối đa là 30% (Phụ lục II)

nên phương pháp áp dụng có độ chụm đạt yêu cầu Vì vậy các giá trị LOD, LOQ thu được ở bảng trên là đáng tin cậy

3.1.4 Khảo sát độ lặp lại của hệ thống

Xác định độ lặp lại của hệ thống bằng cách phân tích mẫu lặp lại 6 lần chuẩn