Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin b bằng phương pháp pha loãng ethanol

Danh mục các bảng Bảng 1.1 Một số biệt dược của amphotericin B 11 Bảng 2.1 Nguyên liệu 16 Bảng 3.1 Các điều kiện chuẩn bị pha ethanol 22 Bảng 3.2 Bảng công thức bào chế các mẫu liposome

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THUÝ NGỌC

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B

BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THUÝ NGỌC

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B

BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Nguyễn Văn Lâm

2 ThS Nguyễn Tuấn Quang Nơi thực hiện:

Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

Lời cảm ơn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:

ThS Nguyễn Văn Lâm ThS Nguyễn Tuấn Quang

Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn PGS TS Phạm Thị Minh Huệ về những

chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên

bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người

đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Phạm Thuý Ngọc

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Về liposome 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Thành phần của liposome 2

1.1.2.1 Phospholipid 2

1.1.2.2 Cholesterol và dẫn chất 3

1.1.2.3 Dược chất và một số chất khác 5

1.1.3 Các phương pháp bào chế liposome 5

1.1.3.1 Phương pháp Batzri và Korn (phương pháp pha loãng ethanol) 5

1.1.3.2 Phương pháp hydrat hoá film 7

1.1.3.3 Phương pháp bốc hơi pha đảo 8

1.1.3.4 Một số phương pháp bào chế liposome khác: 8

1.2 Về amphotericin B 8

1.2.1 Công thức hoá học và tính chất lý hoá 8

1.2.2 Tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng 9

1.2.3 Một số chế phẩm chứa amphotericin B trên thị trường 10

1.3 Về liposome amphotericin B 12

1.3.1 Lịch sử phát triển liposome amphotericin B 12

1.3.2 Cơ chế và tác dụng của liposome amphotericin B 12

1.3.3 Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B 13

1.3.3.1 Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B trên thế giới

13

1.3.3.2 Một số nghiên cứu bào chế liposome amphoteicin B tại Việt Nam

14

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp bào chế liposome amphoteiricin B 18

2.3.2 Phương pháp đánh giá liposome amphotericin B 18

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QỦA VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Nghiên cứu lựa chọn một số thông số của quy trình bào chế 21

3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện hoà tan của amphotericin B 21

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cô đặc thể tích 23

3.1.2.1 Đánh giá đặc tính lipsome phụ thuộc vào quá trình lọc tiếp tuyến 23 3.1.2.2 Đánh giá hàm lượng amphotericin B tự do 25

3.2 Khảo sát ảnh hưởng một số thông số của quy trình bào chế tới đặc tính liposome 26

3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 26

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ phối hợp hai pha 29

3.2.3 Ảnh hưởng của lực khuấy trộn hai pha 30

3.3 Đề xuất quy trình bào chế liposome amphotericn B 32

3.3.1 Quy trình bào chế 32

3.3.2 Đánh giá đặc tính liposome amphotericin B sau bào chế 34

3.4 Bàn luận 35

3.4.1 Về phương pháp đánh giá 35

3.4.2 Về lựa chọn một số thông số của quy trình bào chế 35

3.4.3 Về khảo sát 1 số yếu tố ảnh hưởng tới quy trình bào chế 37

3.4.4 Về đặc tính liposome bào chế bằng phương pháp pha loãng ethanol

39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

1 ACN Acetonitril

2 AmB Amphotericin B

3 AUC Diện tích dưới đường cong

4 BHA Butylat hydroxyanisol

10 DMSO Dimethyl sunfoxid

11 DOPC Dioleyl phosphatidylcholin

12 DOPE Dioleyl phosphatidylethanolamin

13 DPPC Dipalmitoyl phosphatidylcholin

14 DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry)

15 DSPC Distearoylphophatidylcholin

16 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol

17 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid

18 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid

chromatography)

19 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

(Hydrogenated soy phosphatidylcholin)

20 IC50 Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 %

inhibitory concentrations)

21 KTTP Kích thước tiểu phân

22 L-AmB Liposome amphotericin B

23 LD50 Liều gây chêt trung bình

Danh mục các bảng

Bảng 1.1 Một số biệt dược của amphotericin B 11 Bảng 2.1 Nguyên liệu 16 Bảng 3.1 Các điều kiện chuẩn bị pha ethanol 22 Bảng 3.2 Bảng công thức bào chế các mẫu liposome 24

Bảng 3.3 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào quá trình lọc

tiếp tuyến 24

Bảng 3.4 Bảng công thức bào chế các mẫu liposome có tỷ lệ thể

tích pha ethanol/pha nước khác nhau 26

Bảng 3.5 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào tỷ lệ thể tích

pha ethanol/pha nước 27

Bảng 3.6 Đặc tính các mẫu liposome phụ thuộc vào nhiệt độ pha

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Hình 1 Sự phân bố của cholesterol và phospholipid trong lớp

màng liposome 4

Hình 2 Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp pha

loãng ethanol 6 Hình 3 Công thức hoá học của amphotericin B 9

Hình 4 Chuẩn bị pha ethanol có và không sử dụng điều kiện hoà

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế kỉ 20-21 có thể nói là thời gian bùng nổ của ngành công nghệ nano Các ứng dụng của ngành công nghệ này đã đem lại những hiệu quả mạnh mẽ, phong phú và đa dạng Đặc biệt trong công nghệ Dược, nano đã trở thành một

xu hướng nghiên cứu được đông đảo các nhà khoa học đón nhận và hưởng ứng

Sự ra đời của liposome là một trong những thành quả lớn theo xu hướng này Liposome được đánh giá là một hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao, khả năng vận chuyển thuốc hướng đích tác dụng, tăng sinh khả dụng

và giảm độc tính của thuốc Bởi vậy, nghiên cứu và ứng dụng liposome như một mảnh đất mới mẻ, thu hút mạnh mẽ sự quan tâm của giới khoa học trên thế giới cũng như Việt Nam

Amphotericin B là dược chất được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng, nhưng gây tác dụng phụ rất nặng nề trên nhiều cơ quan, đặc biệt là thận Tuy nhiên khi bào chế amphotericin B dưới dạng liposome, các nhà khoa học nhận thấy chế phẩm mang những thay đổi lớn về tính chất dược lý theo chiều hướng tích cực, tác dụng hiệu quả trong việc giảm độc tính thuốc và giúp tăng liều điều trị

Tại Bộ môn Bào chế Đại học Dược Hà Nội đã có các nghiên cứu về liposome amphotericin B bằng phương pháp hydrat hoá phim và bốc hơi pha đảo Để phát huy ưu điểm, đồng thời giải quyết một số nhược điểm trong nghiên

cứu trước, đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng

phương pháp pha loãng ethanol” tiến hành nhằm mục tiêu:

+ Bào chế được liposome amphotericin B bằng phương pháp pha loãng ethanol

+ Khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về quy trình bào chế đến đặc tính liposome amphotericin B.

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Về liposome

1.1.1 Khái niệm

Liposome là dạng đặc biệt của vi nang, bao gồm một vỏ phospholipid kép có đầu thân nước hướng ra ngoài, gồm một hay nhiều lớp đồng trục bao bọc ngăn nước ở giữa hoặc ngăn cách bởi các ngăn nước, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [1]

1.1.2 Thành phần của liposome

1.1.2.1 Phospholipid

Là thành phần cơ bản cấu tạo nên liposome, có bản chất lưỡng tính vừa thân dầu vừa thân nước, cấu tạo từ khung phân tử glycerol gắn với các nhóm phân cực và các acid béo no hoặc không no Khi các phospholipid tự đóng vòng

để tạo thành liposome thì đầu phân cực sẽ hướng ra ngoài tương tác với môi trường nước, chuỗi acid béo sẽ quay vào trong, tạo ra lớp lipid kép [1]

Các phospholipid gồm nhiều loại:

+ Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin (PC) từ

lecitin của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidyl serin (PS), phosphatidylglycerol (PG),…

+ Phospholipid tổng hợp: Hydrogenated soybean phosphatidylcholine

(HSPC), Disteroyl phosphatidylcholin (DSPC), Dioleyl phosphatidylcholin (DOPC), Dioleyl phosphatidylethanolamin (DOPE), Dipalmitoyl phosphatidylcholin (DPPC),…

+ Một số lipid khác như sphingolipid (sphingomyelin, sphingosin,…)

Khi lựa chọn phospholipid cần chú ý:

+ Mức độ bão hòa: Các phospholipid không no (phosphatidylcholin lòng

trắng trứng, phosphatidylglycerin, ) dễ bị oxy hóa dẫn đến hỏng màng, gây rò

rỉ dược chất, ảnh hưởng đến độ ổn định của liposome Vì thế, khi bào chế phải thêm các chất chống oxy hóa như tocoferol, BHA, BHT,…

+ Khả năng tích điện: Phospholipid tích điện sẽ tạo lực đẩy tĩnh điện

giữa các lớp vỏ liposome nên làm tăng dung tích của khoang nước, do đó làm tăng khả năng đưa các dược chất thân nước vào liposome, đồng thời tạo lực liên kết tĩnh điện với dược chất

+ Nhiệt độ chuyển dạng: Liên quan đến hiện tượng chuyển pha của

phospholipid (xảy ra ở nhiệt độ nóng chảy mà tại đó phân tử lipid chuyển từ trạng thái gel có cấu trúc bền vững sang trạng thái tinh thể lỏng với cấu trúc lỏng lẻo) Nhiệt độ chuyển pha của lipid phụ thuộc vào chiều dài và mức độ no của chuỗi acid béo cũng như đặc điểm của nhóm phân cực Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều kiện sinh lí, do đó nên sử dụng các phospholipid có Tc>37ºC

+ Mức độ tinh khiết: Tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng mà có

thể lựa chọn các loại phospholipid có độ tinh khiết khác nhau phù hợp do các nhà sản xuất khác nhau cung cấp sẵn trên thị trường

cholesterol và phospholipid trong cấu trúc lớp màng liposome được thể hiện

ở Hình 1 Phospholipid được kí hiệu giống hình ô với cấu trúc lưỡng thân,

đầu thân nước hướng ra ngoài, đầu kị nước hướng vào trong, Cholesterol được kí hiệu hình tròn, nằm phân bố vào trong lớp kép phospholipid

Hình 1: Sự phân bố của cholesterol và phospholipid trong lớp màng

liposome [1]

Các phân tử phospholipid có một đầu hướng ra môi trường nước, phần đuôi hướng vào phía bên trong Các phân tử cholesterol xếp xen kẽ giữa phần đuôi của các phân tử phosphlipid và được “che” bởi sự sắp xếp liên tục của các phần đầu phân tử phospholipid (1a), màng có cấu trúc ổn định khi tỷ lệ cholesterol và phospholipid phù hợp (1b), khi tỷ lệ cholesterol dư thừa sẽ đẩy tách phần đầu của các phân tử phospholipid làm cho phospholipid không che được cholesterol phía bên trong (1c), khi cholesterol tiếp xúc với nước

sẽ kết tinh tạo thành mảng cholesterol monohydrat làm ảnh hưởng đến sự ổn định của lớp màng cholesterol (1d)

Ngoài cholesterol có thể dùng các dẫn chất khác của sterol như hydroxycholesterol, acid cholestenoic,…để kết hợp với phospholipid khi bào chế liposome [1]

1.1.2.3 Dược chất và một số chất khác

Dược chất được dùng trong bào chế các dạng thuốc liposome khá đa dạng, thường là các dược chất cần tập trung tại đích, các dược chất khó thấm như dược chất điều trị ung thư, một số kháng sinh, enzyme; hoặc để giảm độc tính của thuốc như amphotericin B Dược chất có thể được gắn vào liposome theo một trong hai cách là gắn thụ động (thực hiện trong quá trình tạo liposome) hoặc gắn chủ động (thực hiện sau khi đã hình thành liposome)

Do liposome có thể mang đồng thời cả dược chất thân dầu và thân nước nên

hệ vận chuyển này thích hợp với diện rộng dược chất

Một số liposome còn sử dụng các chất khác làm thay đổi đặc tính của

vỏ liposome như các polyme thân nước (kéo dài thời gian tuần hoàn), các chất diện hoạt (để tăng tính thấm qua da),…[1], [4], [5]

1.1.3 Các phương pháp bào chế liposome

1.1.3.1 Phương pháp Batzri và Korn (phương pháp pha loãng ethanol)

Phương pháp được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn gọi là phương pháp pha loãng ethanol, hoặc phương pháp tiêm ethanol Trong các phương pháp bào chế liposome, phương pháp pha loãng ethanol có ưu điểm nổi bật là tạo ra liposome kích thước nhỏ, tương đối đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm Quy trình bào chế của phương pháp này khá đơn giản: Hòa tan phospholipid và các thành phần tạo màng vào ethanol Bơm nhanh dung dịch này vào môi trường nước hoặc hệ đệm, vừa bơm vừa khuấy [7] Cơ chế của

phương pháp được sơ lược trong Hình 2 như sau:

PL tự do trong

ethanol

Lớp kép PL trong nước

Lớp kép PL lớn lên về kích thước

Liposome

Hình 2: Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol [20]

Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol

được mô tả trải qua bốn giai đoạn chính Giai đoạn 1: phospholipid hoà tan trong ethanol, tồn tại ở trạng thái tự do Giai đoạn 2: khi tiêm nhanh dung dịch

pha ethanol vào nước, ethanol nhanh chóng pha loãng hoặc chuyển thành pha khí, chuyển phospholipid sang pha nước Ở trong pha nước, phospholipid có

xu hướng tập hợp thành lớp kép Giai đoạn 3: lớp kép phospholipid lớn lên về kích thước Giai đoạn 4: lớp kép đóng vòng thành liposome Mỗi giai đoạn đều

đóng vai trò quan trọng trong hình thành liposome Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành và kích thước lớp kép sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kích thước liposome Bởi vậy trong phương pháp pha loãng ethanol, các yếu tố ảnh hưởng tới giai đoạn phối hợp dung dịch phospholipid vào nước cũng ảnh hưởng nhiều tới đặc tính liposome Các thông số ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng tạo liposome theo phương pháp này có thể là: nồng độ phospholipid trong ethanol, đường kính bơm tiêm, áp suất bơm, môi trường tạo liposome, tốc độ khuấy môi trường,…[11], [13], [23], [24], [29]

Các dung môi có thể thay thế ethanol trong phương pháp này là propanol, isopropanol, glycerin, propylen glycol,…

Dược chất được liposome hoá bằng phương pháp pha loãng ethanol cũng rất đa dạng Dược chất có thể được gắn theo cơ chế thụ động (gắn trong quá trình tạo liposome): dược chất thân nước được hoà tan vào pha nước, dược chất thân dầu được hoà tan trong pha alcol Dược chất cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động (tạo liposome trước rồi nạp dược chất sau): thường áp dụng với dược chất thân nước Theo cơ chế thụ động, dược chất thân dầu đạt được hiệu suất gắn vào liposome rất cao (~100%), còn dược chất thân nước đạt hiệu suất gắn rất thấp (~16%); kích thước và độ đồng nhất của liposome không khác nhau nhiều giữa hai loại dược chất Từ đó cho thấy, phương pháp pha loãng ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hoá dược chất thân dầu [16]

Liposome thu được có kích thước nhỏ (khoảng 100nm), tương đối đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm [1], [7], [23]

Bởi phương pháp pha loãng ethanol là phương pháp có các ưu điểm: quy trình đơn giản, cho liposome kích thước nhỏ, đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm, đặc biệt thích hợp với dược chất thân dầu nên nghiên cứu đã chọn phương pháp này để bào chế liposome AmB

1.1.3.2 Phương pháp hydrat hoá film

Phương pháp này ra đời sớm hơn phương pháp pha loãng ethanol, do Bangham đề xuất, cho đến nay đây vẫn là một phương pháp được sử dụng nhiều

vì tính tiện ích, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị kỹ thuật cao Quy trình tiến hành qua các bước sau: Hòa tan phospholipid và các thành phần tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (chloroform, methanol, dicloroethan…) Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay ở nhiệt độ thích hợp, phospholipid sẽ tạo thành màng mỏng bám lên thành bình cất quay Thêm dung dịch nước có hệ đệm để hydrat hóa, quay hoặc lắc mạnh để tạo thành liposome Dược chất được phối hợp vào liposome trong quá trình điều chế: Dược chất

thân nước thì hòa vào dung dịch nước, dược chất thân dầu thì cho vào dung dịch phospholipid

So với phương pháp pha loãng ethanol, liposome thu được thường là loại nhiều lớp, có kích thước không đồng nhất (từ 50 -1000nm) [1], [5]

1.1.3.3 Phương pháp bốc hơi pha đảo

Phương pháp này đưa ra bởi Szoka và Papahadjopoulos Quy trình tiến hành qua các bước: Hòa tan phospholipid trong dung môi hữu cơ (hay dùng ether) Cho thêm dung dịch nước rồi tác động bằng siêu âm ở tần số phù hợp để tạo nhũ tương mịn N/D Bốc hơi dung môi ether dưới áp suất giảm để thu được các liposome

So với phương pháp pha loãng ethanol, liposome được tạo thành bằng phương pháp này thường có cấu trúc đa lớp, kích thước tiểu phân lớn, ít đồng nhất [1], [5], [22]

1.1.3.4 Một số phương pháp bào chế liposome khác:

- Phương pháp pha loãng ether

- Phương pháp pha loãng polyol

- Phương pháp đông khô

- Phương pháp hòa tan và thẩm tách chất diện hoạt

- Phương pháp sử dụng kênh vi lỏng

- Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn

- Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn [1], [20]

1.2 Về amphotericin B

1.2.1 Công thức hoá học và tính chất lý hoá

Kháng sinh chống nấm amphotericin B (AmB) được giới thiệu vào giữa những năm thập kỷ 50 và cho đến nay đã trở thành thuốc đầu tay trong kiểm

soát nhiễm nấm toàn thân, có công thức cấu tạo như Hình 3

Công thức phân tử:

C47H73NO17 Khối lượng phân tử: 924,08

pKa: 5,5; 10

Hình 3: Công thức cấu tạo của amphotericin B

AmB là kháng sinh tự nhiên thuộc nhóm polyen, có tính lưỡng tính bởi nhóm amin và nhóm carboxylic tự do trong phân tử, có tính chất lưỡng cực bởi vòng cồng kềnh chứa hệ nối đôi liên hợp và đường amin Do vậy AmB rất khó tan trong hầu hết các dung môi ở pH trung tính: AmB không tan trong nước, hầu như không tan trong các alcol, tan trong dimethyl sunfoxide (DMSO) [2]

1.2.2 Tác dụng dược lý, chỉ định, liều dùng

Cơ chế tác dụng của AmB, cũng như của các polyen khác, dựa trên sự liên kết giữa đuôi kỵ nước của AmB với đuôi ergosterol trên màng tế bào nấm, tạo các kênh trên màng tế bào Bởi vậy làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng, rò rỉ các tế bào chất ra ngoài và cuối cùng gây chết tế bào nấm Bên cạnh khả năng liên kết với ergosterol, AmB cũng có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào người Ái lực của AmB với ergosterol màng lớn hơn với cholesterol màng nên AmB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu nhưng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương trên thận với các biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hoá, tăng kali máu, đái nhạt…[3], [5], [15]

Amphotericin B có tác dụng kìm nấm đối với một số nấm như: Absidia spp, Aspergillus spp, Basidiobolus spp, Blastomyces dermatitis spp, Coccidioides immitis, Conidiobolus spp, Cryptococcus neoformans

Histoplasma capsulatum, Mucor spp, Paracoccidioides brasiliensis, Rhizopus spp, Rhodotorula spp và Sporothrix schenckii Mức độ nhạy cảm của nấm với amphotericin B liên quan đến nồng độ ergosterol có trong màng bào tương của nấm Trên in vivo, nồng độ trong khoảng từ 0,03 - 1 microgram/ml có thể ức chế hoàn toàn đa số các loại nấm này Trên in vitro, với liều dùng trong lâm sàng thuốc chỉ kìm nấm, nếu muốn diệt nấm phải có nồng độ trong huyết thanh gây độc [3], [5]

Bởi hạn chế hấp thu qua đường tiêu hoá, AmB được dùng chủ yếu qua đường tiêm tĩnh mạch Liều dùng cho AmB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày Các tác dụng phụ có dấu hiệu gia tăng khi liều vượt quá 35mg/ngày [3], [5], [15]

1.2.3 Một số chế phẩm chứa amphotericin B trên thị trường

Một số chế phẩm AmB đã được lưu hành trên thị trường và ứng dụng rộng rãi, giúp kiểm soát tốt tình trạng nhiễm nấm toàn thân, đặc biệt điều trị bội nhiễm ở bệnh nhân HIV-AIDs Các tính chất của chế phẩm được tổng hợp ở

Bảng 1.1 [19]:

Bảng 1.1 Một số biệt dược của amphotericin B

Dạng bào

Dạng đĩa – phức hợp AmB với cholesteryl sulfat

Dạng chuỗi – phức hợp AmB với Lipid

DMPC : DMPG (tỷ lệ mol 7:3

DSPG : HSPC : cholesterol (tỷ lệ mol 4:10:5) Nồng độ tối

đa trong

huyết thanh

(*)

1.3 Về liposome amphotericin B

1.3.1 Lịch sử phát triển liposome amphotericin B

Do AmB tan hạn chế trong nước và dung môi thân nước, các nhà bào chế đã tạo phức hợp của AmB với nhân tố khác để gia tăng độ tan Nhân tố đầu tiên được sử dụng là natrideoxycholat, nhưng phức hợp AmB-natrideoxycholat

có nhược điểm là vẫn tồn tại rất nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng giống với AmB Các nghiên cứu tiếp tục phát triển, mục tiêu tìm ra những nhân tố mới

mà khi kết hợp làm tăng sinh khả dụng, cải thiện khả năng hấp thụ và giảm độc tính, đặc biệt là giảm độc tính trên thận Một trong những nhân tố được nghiên cứu là ester methyl của AmB (những năm 1970), tuy nhiên nó đưa đến tác dụng phụ đáng lo ngại trên hệ thần kinh nên sản phẩm này bị tạm dừng phát triển Sau đó, các nhà khoa học nhận thấy có sự hiệu quả cao khi tập trung vào sản phẩm kết hợp của AmB – lipid, đặc biệt là sản phẩm liposome amphotericin B [6], [8], [9], [15], [21]

Một trong những nghiên cứu đầu tiên về liposome amphotericin B được Graybill và các cộng sự tiến hành: chuột nhiễm nấm Cryptococcus neoformans, được điều trị bằng AmB-deoxycholat và liposome có kết hợp AmB Kết quả cho thấy chuột điều trị bằng liposome có kết hợp AmB sống sót lâu hơn và có

số mô nhiễm nấm ít hơn so với chuột điều trị bằng AmB-deoxycholat hoặc chuột không điều trị Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra khả năng chấp nhận liều cao gia tăng ở lô chuột dùng liposome có kết hợp AmB [12]

1.3.2 Cơ chế và tác dụng của liposome amphotericin B

Cơ chế giảm độc tính và tăng khả năng chấp nhận liều cao của liposome AmB (L-AmB) trên bệnh nhân cho đến nay vẫn chưa thực sự rõ ràng Krause

và Juliano cho rằng sự giảm độc tính của L-AmB so với AmB liên quan đến sự vận chuyển chọn lọc của liposome mang thuốc tới tế bào nấm, gây ra tác dụng trên tế bào nấm mà không gây độc với các tế bào lành [25] Brajtburg và cộng

sự cho rằng AmB liên kết mạnh với các lipoprotein trong huyết tương nên nó gây ra các độc tính trên tế bào máu, hơn nữa AmB kết hợp với LDL và VLDL

có thể liên quan tới tác dụng có hại trên thận Sự giảm độc tính của L-AmB có thể do thay đổi khả năng liên kết của L-AmB tới các lipoprotein này [6], [10]

Mặc dù vậy, các thử nghiệm lâm sàng đều cho thấy tác dụng nổi trội của L-AmB trong việc giảm tác dụng phụ và khả năng chấp nhận liều cao trên bệnh nhân So sánh tác dụng của AmB-deoxycholat, ABCD (phức hợp AmB với cholesteryl sulfat) và L-AmB; thấy LD50 của L-AmB gấp 20 lần so với AmB-deoxycholat và độc tính của L-AmB chỉ bằng ½ so với ABCD ở cùng liều điều trị là 5mg/kg/ngày Các kết quả nghiên cứu lâm sàng cho thấy chế phẩm liposome chứa amphotericin B chỉ với liều 1 mg/kg/ngày đã mang lại hiệu quả điều trị thành công trên 91,1% bệnh nhân bị nấm hệ thống (invasive, system fungus infection) hoặc Leishmaniasis so với hiệu quả 46% khi sử dụng 4-6 mg/kg/ngày chế phẩm phức hợp lipid amphotericin B (Amphocil/Amphotec) Chỉ có 2 trong tổng số 109 bệnh nhân phải tạm thời ngừng sử dụng chế phẩm liposome nhưng sau đó đã tiếp tục điều trị thành công trong khi 34-60% bệnh nhân sử dụng chế phẩm amphotericin B dạng thuốc quy ước (AmB-deoxycholat) phải chịu các độc tính đối với thận [5] Với những ưu việt của chế phẩm nêu trên, đề tài đã lựa chọn dạng bào chế liposome để nghiên cứu hệ vận chuyển thuốc amphotericin B

1.3.3 Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B

1.3.3.1 Một số nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B trên thế giới

A Manosroi cùng cộng sự (2004) đã nghiên cứu bào chế liposome AmB với nguyên liệu là HSPC, chol và các phospholipid tích điện: dicetylphosphat (-), stearylamin (+) với các tỷ lệ 1:1:0, 7:2:0, 7:2:1 (-), 7:2:1 (+), ở nồng độ 0,05

mg AmB/mg lipid bằng phương pháp hydrat hóa màng film, sử dụng kĩ thuật siêu âm để đồng nhất hóa và giảm KTTP, sử dụng phân tích nhiệt vi sai để đánh

giá mức độ ổn định của liposome Đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng phương pháp li tâm với lực li tâm là 50000 vòng/phút (ở 4 ºC), trong 1h Kết quả thu được các liposome có KTTP từ 115 – 364 nm, hiệu suất liposome hóa trên 85 % với tất cả các mẫu, trong đó mẫu 7:2:1 (+) AmB cho hiệu suất gắn thuốc cao nhất và ổn định nhất [17]

U.S Kadimi và cộng sự (2007) đã nghiên cứu bào chế liposome AmB bằng phương pháp mới sử dụng khí CO2 siêu tới hạn Amphotericin B và phosphatidylcholin được hoà tan trong dung môi thích hợp, sau đó đưa vào dung môi CO2siêu tới hạn để tạo liposome Cuối cùng, đưa hệ đệm muối NaCl 0,9% vào để đuổi CO2 Chế phẩm liposome tạo ra có kích thước trong khoảng 0,5-15 μm [14]

Deepak Singodia cùng cộng sự (2012) nghiên cứu bào chế liposome AmB sử dụng phosphatidylglycerol, chol và DMPC (F - 1a) hoặc SPC (F - 2a) bằng phương pháp pha loãng ethanol như sau: AmB hòa tan trong dimethyl acetamid được acid hóa bằng dung dịch HCl 0,1 %, trộn lẫn với dung dịch lipid hòa tan trong ethanol rồi tiêm nhanh vào 1 thể tích lớn dung dịch dextrose 5 %

để thu được liposome AmB Kết quả cho thấy các liposome bào chế bằng phương pháp này có KTTP khoảng 100 nm, thế zeta -43,3 ± 2,8 mV và hiệu suất gắn thuốc trên 95 % đối với tất cả các mẫu, khả năng giải phóng dược chất

in vitro trong 24 giờ và giá trị IC50 của 2 công thức hầu như không có sự khác

biệt so với chế phẩm AmBisome [26]

1.3.3.2 Một số nghiên cứu bào chế liposome amphoteicin B tại Việt Nam

Tại Bộ môn Bào chế Đại học Dược Hà Nội, đã thực hiện các nghiên cứu

về liposome AmB bằng phương pháp bốc hơi pha đảo và hydrat hoá film

ThS Đào Thị Thùy Dung (2013) đã nghiên cứu bào chế liposome AmB bằng 2 phương pháp bốc hơi pha đảo và hydrat hóa film đồng thời đánh giá được các yếu tố thuộc về công thức, quy trình bào chế, môi trường phân tán và

nồng độ lipid ảnh hưởng đến các đặc tính của liposome Với phương pháp bốc hơi pha đảo đã lựa chọn được công thức có tỷ lệ % mol dược chất/ tổng lượng lipid là 3%; tỷ lệ SPC: Chol là 5:5; môi trường phân tán là đệm phosphat pH 7,4; có hiệu suất liposome hóa là 89,5%; KTTP trung bình là 288nm; PDI = 0,262 Còn với phương pháp hydrat hóa film đã lựa chọn được công thức có tỷ

lệ % mol dược chất/ tổng lipid là 3%; tỷ lệ SPC: chol là 6:4; môi trường hydrat hóa là glucose 5%; hiệu suất liposome hóa là 98,18%; liposome có KTTP là 160,8nm và PDI = 0,288 [5]

Nghiên cứu trên vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như hàm lượng AmB trong công thức thấp (10mg AmB/ 10ml hỗn dịch), thời gian quy trình kéo dài (>10h), liposome tạo ra kích thước lớn, không đồng nhất, đa lớp, các biện pháp đồng nhất hoá và giảm kích thước tiểu phân ít hiệu quả, sự phơi nhiễm dung môi cao… Bởi vậy đề xuất nghiên cứu phương pháp pha loãng ethanol với mục tiêu khắc phục một phần các nhược điểm này, đồng thời bổ sung hoàn thiện các phương pháp bào chế liposome

Chương 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ,

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: liposome AmB

- Nguyên liệu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu

1 Acetonitril dùng cho HPLC Baker – Mỹ NSX

2 Amphotericin B Trung Quốc USP

3 Cholesterol Sigma-Aldrich NSX

4 Dinatrisuccinat hexahydrat Trung Quốc TKHH

5 Đường sucrose Trung Quốc TKHH

6 Ethanol Trung Quốc TKHH

7 Hydrogenated soybean

phosphatidylcholin (HSPC) Lipoid– Mỹ NSX

8 Methanol Trung Quốc TKHH

9 Methanol dùng cho HPLC Baker - Mỹ NSX

10 N,N-dimethylacetamid

(DMA) Trung Quốc NSX

11 Natri EDTA Trung Quốc NSX

12 Nước tinh khiết Việt Nam DĐVN

- Phương tiện nghiên cứu:

+ Bơm tiêm 20ml/cc with với đầu kim 25G×1” (Vinahankook medical supplies Co., LTD, Việt Nam)

+ Máy đồng nhất hoá CAT Unidrive X1000 (Ingenieurbüro CAT – Đức) + Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh) + Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Hitachi High Technologies America (Mỹ)

+ Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Moducles, màng polysulfon, kích thước lỗ l0kD, diện tích lọc 20cm2

+ Kính hiển vi điển tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản)

+ Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kĩ thuật, các dụng cụ thủy tinh

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp pha loãng ethanol

 Lựa chọn một số điều kiện thích hợp cho các giai đoạn bào chế: điều kiện hoà tan AmB, điều kiện cô đặc để giảm thể tích dung môi và loại AmB tự do

 Đánh giá một số đặc tính của liposome: kích thước tiểu phân, độ đồng nhất hoá, hiệu suất quy trình

- Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về quy trình bào chế đến đặc tính liposome amphotericin B

 Đánh giá ảnh hưởng đến đặc tính KTTP, độ đồng nhất liposome, hiệu suất quy trình của một số yếu tố: tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước, nhiệt độ pha nước, tốc độ khuấy trộn

Từ đó đề xuất ra quy trình bào chế liposome AmB, đánh giá liposome sau bào chế với các thông số: KTTP, độ đồng nhất hoá, hiệu suất quy trình, hình thái cấu trúc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế liposome amphoteiricin B

Công thức liposome amphotericin B

Dựa theo tài liệu tham khảo, lựa chọn công thức bào chế cho 10ml hỗn dịch như sau [26], [30]:

Ethanol, DMA, nước vừa đủ

Quy trình bào chế liposome amphotericin B

Tiến hành quy trình bào chế liposome AmB với các bước tiến hành như sau:

- Chuẩn bị pha nước: Hoà tan sucrose, dinatrisuccinat theo đúng tỷ lệ công thức, tạo dung dịch cuối cùng: 9% sucrose + đệm dinatrisuccinat 10mM, pH 5-6

- Chuẩn bị pha ethanol: Hoà tan AmB, HSPC, cholesterol vào ethanol với thể tích thích hợp

- Phối hợp hai pha: Tiêm pha ethanol vào pha nước, có kiểm soát và đánh giá ảnh hưởng các yếu tố: tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước, nhiệt độ pha nước, lực khuấy trộn hai pha

- Cô đặc: Loại bớt dung môi, loại AmB tự do để thu được 10ml hỗn dịch liposome AmB

- Bảo quản: Đóng lọ, nút kín, bảo quản 2- 80C tránh ánh sáng

2.3.2 Phương pháp đánh giá liposome amphotericin B

- Đo kích thước tiểu phân và độ đồng nhất: Sử dụng phương pháp tán xạ ánh

sáng động với thiết bị Zetasizer ZS90 Pha loãng hệ phân tán liposome 100 lần

bằng nước cất rồi tiến hành đo kích thước tiểu phân Đánh giá kết quả thông qua đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, kích thước tiểu phân trung bình

- Nghiên cứu hình thái cấu trúc tiểu phân: Sử dụng phương pháp chụp hiển

vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản [5]

- Hiệu suất quy trình: Định lượng AmB trong liposome bằng phương pháp

HPLC với điều kiện sắc ký: Cột sắc kí: cột Cosmosil 5C18 – MS - II, kích thước cột 250 × 4,6 mm; đường kính hạt nhồi 5 µm Pha động: hỗn hợp acetonitril (ACN) và natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) với tỷ lệ 40: 60 về thể tích (v/v) Tốc

độ dòng: 0,8 ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 20 µl Detector UV, bước sóng 405

Mẫu thử:

Hút chính xác 0,5 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp dung môi methanol: chloroform tỷ lệ 3:1 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch Hút chính xác 5 ml dung dịch trên, pha loãng bằng hỗn hợp dung môi ACN: natri EDTA 0,02 M (pH 5,0) tỷ lệ 60:40 v/v trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích đến vạch Lọc mẫu qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

Hàm lượng AmB trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

CT = St

Sc× mc × k Trong đó: CT : nồng độ AmB trong hỗn dịch liposome (mg/ml)

St: diện tích peak mẫu thử (mAU.s)

Sc: diện tích peak mẫu chuẩn (mAU.s)

mc: khối lượng cân của mẫu chuẩn (mg)