Phân lập và xác định một số saponin trong gynostemma longipes c y WU

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú và đa dạng. Trải qua quá trình lịch sử phát triển trên 4000 năm, nhân dân ta có nhiều tri thức, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ trong phòng và điều trị bệnh. Cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại, các kinh nghiệm và tri thức sử dụng thuốc từ dược liệu ngày càng trở nên có nhiều lợi thế và ưu điểm. Việc kế thừa và phát triển nền Y Dược học cổ truyền đang là nhiệm vụ quan trọng của ngành Dược Việt Nam. Giảo cổ lam là tên thường dùng của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, là một dược liệu thành phần hoạt chất chủ yếu là saponin có tác dụng hạ mỡ máu, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, chống ung thư, chống viêm, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, giải tỏa stress… Giảo cổ lam phân bố ở nhiều nước như: Nhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á... Tại Việt Nam, Gynostemma pentaphyllum lần đầu tiên phát hiện tại vùng núi Phanxipang (Lào Cai) vào năm 1997. Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về sinh học, thành phần hóa học và tác dụng của loài cây này. Nhiều sản phẩm từ Giảo cổ lam đang được lưu hành trên thị trường: trà giảm béo Giảo cổ lam, trà Giảo cổ lam Tuệ Linh hạ lipid máu… Năm 2009, Hoàng Văn Lâm và cộng sự 27 đã công bố thêm một loài mới thuộc chi Gynostemma Blume, bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam là Gynostemma longipes C.Y. Wu in C.Y. WU S.K. Qua khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học thấy Gynostemma longipes có thành phần gần giống với Gynostemma pentaphyllum nhưng lại có hàm lượng saponin cao hơn hẳn. Nằm trong nhóm ý tưởng nghiên cứu và phát triển nguồn nguyên liệu Giảo cổ lam tại Việt Nam, đề tài “Phân lập và xác định một số saponin trong

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

SAPONIN TRONG GYNOSTEMMA

LONGIPES C.Y.WU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

L ỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những

sự hỗ trợ, giúp đỡ dù nhiều hay ít, dù trực tiếp hay gián tiếp Với sự kính

trọng và lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới

ThS Phạm Tuấn Anh, người thầy đã tận tình chỉ bảo, động viên và hướng

dẫn cho tôi những kiến thức và phương pháp nghiên cứu khoa học trong suốt

thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo,

động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ môn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên trong

Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi

rất nhiều trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận tại bộ môn

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, các phòng ban và các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi trong

học tập cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Cấn Thị Thanh Loan

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm chi Gynostemma Blume 3

1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phấn bố của chi Gynostemma Blume 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố Gynostemma longipes C Y Wu ex C Y Wu et S K Chen 4

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài khác trong chi tại Việt Nam 5 1.2 Tổng quan về saponin nhân Dammaran 6

1.2.1 Cấu trúc của saponin nhân dammran 6

1.2.2 Tác dụng và công dụng của saponin nhân dammaran 7

1.3 Các saponin trong chi Gynostemma Blume 7

1.3.1 Saponin trong chi Gynostemma Blume 7

1.3.2 Một số saponin trong Gynostemma longipes 10

1.4 Tổng quan một số phương pháp phân tách các hợp chất thiên nhiên 13

1.4.1 Sắc ký cột 13

1.4.2 Sắc ký chế hóa 14

1.4.3 Tổng quan về nhựa hấp phụ 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu: 16

2.1.2 Hóa chất, thuốc thử 16

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 16

2.2 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Chiết xuất 17

2.2.2 Phân đoạn hóa 17

2.2.3 Phân lập và tinh chế 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Thực nghiệm và kết quả 19

3.1.1 Chiết xuất 19

3.1.2 Phân đoạn hóa 19

3.1.2 Phân lập, tinh chế và nhận dạng 28

3.2 Bàn luận 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT………38

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PH Ụ LỤC

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của các saponin

Bảng 3.1 Kết quả định tính saponin và flavonoid 21

Bảng 3.3 Sắc ký đồ của B1 với các hệ dung môi 30

Bảng 3.4 Sắc ký của Bt với các hệ dung môi 35

Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn hóa bằng nhựa hấp phụ 22

Hình 3.4 Sơ đồ qui trình làm giàu phân đoạn saponin N80 26

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực

vật phong phú và đa dạng Trải qua quá trình lịch sử phát triển trên 4000 năm, nhân dân ta có nhiều tri thức, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ trong phòng và điều trị bệnh Cùng với sự phát triển của xã hội hiện đại, các kinh nghiệm và tri thức sử dụng thuốc từ dược liệu ngày càng trở nên có nhiều lợi thế và ưu điểm Việc kế thừa và phát triển nền Y Dược học cổ truyền đang là nhiệm vụ quan trọng của ngành Dược Việt Nam

Giảo cổ lam là tên thường dùng của loài Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, là một dược liệu thành phần hoạt chất chủ yếu là saponin

có tác dụng hạ mỡ máu, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, chống ung thư, chống viêm, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, giải tỏa stress… Giảo cổ lam phân

bố ở nhiều nước như: Nhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á Tại

Việt Nam, Gynostemma pentaphyllum lần đầu tiên phát hiện tại vùng núi

Phanxipang (Lào Cai) vào năm 1997 Từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về sinh học, thành phần hóa học và tác dụng của loài cây này Nhiều sản phẩm từ Giảo cổ lam đang được lưu hành trên thị trường: trà

giảm béo Giảo cổ lam, trà Giảo cổ lam Tuệ Linh hạ lipid máu…

Năm 2009, Hoàng Văn Lâm và cộng sự [27] đã công bố thêm một loài

mới thuộc chi Gynostemma Blume, bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam là

Gynostemma longipes C.Y Wu in C.Y WU & S.K Qua khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học thấy Gynostemma longipes có thành phần gần giống với

Gynostemma pentaphyllum nhưng lại có hàm lượng saponin cao hơn hẳn

Nằm trong nhóm ý tưởng nghiên cứu và phát triển nguồn nguyên liệu Giảo cổ lam tại Việt Nam, đề tài “Phân lập và xác định một số saponin trong

Gynostemma longipes C Y Wu” có mục đích nghiên cứu sâu hơn về thành

phần saponin của loài Gynostemma longipes với hai mục tiêu cụ thể là:

1 Chiết xuất và tinh chế được phân đoạn giàu saponin

2 Phân lập và xác định một số saponin trong phân đoạn thu được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chi Gynostemma Blume

1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume

Theo tài liệu [18], [7], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Bầu bí

(Cucurbitaceae) Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [39] vị trí

của chi Gynostemma Blume được tóm tắt như sau:

Ngành Ngọc lan - Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan - Magnoliopsida Phân lớp Sổ - Dilleniidae

Liên bộ Hoa tím - Violanae

Bộ Bí - Cucurbitales

Họ Bầu bí - Cucurbitaceae

Chi Gynostemma

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phấn bố của chi Gynostemma Blume

Theo Võ Văn Chi và Thực vật chí Trung Quốc [7], [23], chi

Gynostemma Blume có những đặc điểm sau:

Cây thảo, sống lâu năm, thân leo, mảnh nhẵn hoặc có lông tơ Lá kép,

có cuống, phiến lá chân vịt hoặc bàn đạp, 3-9 lá chét, ít khi là lá đơn, lá khía răng cưa Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có

lá bắc con, cuống hoa có đốt Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn Nhị 5, ở phần gốc chỉ

nhị hàn liền thành cột Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô Bầu nhụy, hình cầu nhỏ, 2-3 ngăn, 2-3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn Quả

mọng hình cầu, kích thước như hạt đậu, không mở, chứa 2-3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc, hơi sần sùi [7], [23]

Các loài thuộc chi Gynostemma Blume phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

đới châu Á tới vùng Đông Á, từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New Guinea [23]

Hiện nay trên thế giới có khoảng 17 loài thuộc chi Gynostemma Blume

Ở Trung Quốc đã được ghi nhận 14 loài [23] Ở Việt Nam, có 3 loài thuộc chi

Gynostemma Blume đã được công bố là Gynostemma pentaphyllum,

Gynostemma laxum [6], [7], [11], và Gynostemma longipes C Y Wu in C Y

cứng rải rác, mặt dưới nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa

Lá bên nhỏ dần Tua cuốn mảnh, rẽ đôi muộn Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh, dài khoảng 5-15 cm Hoa đực rất nhỏ, tỏa tia màu trắng Cuống 2,3-2,5 mm Đài 5 rời, hình tam giác, dài 0,5-0,7 mm Tràng 5, hình tam giác, rời, dài 1,2-1,4 mm, rộng 0,8-1 mm, ngọn thường quăn Nhị 5, chỉ nhị dính thành 1 cột ở trung tâm, phần trên tách 5, hình sao, bao phấn 2 ô, hướng ngoài Cụm hoa cái kép 3 lần chùm, dài 10-18 cm, cuống dài 1,8-2,0 mm, đài và tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thường bởi 3

lá noãn hàn liền, 2-3 vòi nhụy mập, rời, núm nhụy chia 2-3, bầu giữa 3 ô, mỗi

ô có 1 hạt Quả mọng, khi chín màu vàng xanh, đường kính 6-7 mm, cuống

quả dài 8-15 mm Hạt hình tim, rộng 3-4 mm, dài 3-4 mm, màu xám nhạt,

cạnh hạt lõm vào phía trong, viền hạt có răng cưa, 2 mặt có hoa văn dạng cục Đặc điểm sinh thái: Ra hoa vào tháng 8-10, quả tháng 11-12

Bộ phận dùng: Toàn cây

Phân bố: Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [27]

1.1.4 Đặc điểm thực vật và phân bố một số loài khác trong chi tại Việt Nam

a Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

Tên khác: Giảo cổ lam, Thất diệp đởm, Cổ yếm, Thư tràng năm lá (Trung Quốc) [11], Sâm phương nam [4]

Đặc điểm thực vật: Cây thảo mọc leo yếu, thân cành mảnh, phân nhánh,

có góc cạnh không lông hoặc có lông thưa thớt ở mấu Lá kép chân vịt mọc so

le, cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7 lá chét với mép có răng dài 3-9 cm, rộng 1,5-3 cm Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh Cụm hoa đơn tính khác gốc, mọc ở kẽ lá và đầu ngọn [4], [7] Cụm hoa đực dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh, phân nhánh nhiều, cỡ 10-15 cm Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, tràng màu xanh nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác cỡ 2,5-3 × 1

mm, đỉnh nhọn có 1 gân, nhị 5 Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực Hoa cái có đài và tràng giống như hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, núm nhụy có 2 thùy, nhị lép 5 ngắn Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5-6 mm, khi chín màu đen, 2 hạt Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4

mm, màu nâu, đỉnh tù gốc hình tim dẹt [7]

Mùa hoa: tháng 7-8; mùa quả: tháng 9-10 [4], [6], [7]

Trên thế giới, phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Malaysia, Indonesia, Philippin [4]

Tại Việt Nam cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi, từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000 m ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, Kom Tum, Đồng Nai… [4], [6]

Các nghiên cứu về loài G pentaphyllum ở Việt Nam cho thấy dược liệu

có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống khối u

và tăng đáp ứng miễn dịch [2], [8], [9], [13], [15], [16]

b Gynostemma laxum (Wall.) Cogn

Tên khác: Cổ yếm lá bóng, thư tràng thưa

Đặc điểm thực vật: Dây leo mảnh, phân làm nhiều nhánh, gióng dài

10-20 cm, mỏng, mép có răng cưa nhọn, gân phụ 5-7 cặp, có lông mịn hoặc không lông, vòi đơn Cây có hoa khác gốc, chùy hoa ngắn hay dài đến 30 cm, cánh hoa rời nhau, cao 3 mm, nhị 5 đính liền ở chỉ nhị và bao phấn Quả tròn,

to 6-8 mm, màu lục vàng Hạt 2 -3, hình trái xoan, hơi dẹt, dài và rộng cỡ 4

mm [6], [7]

Ra hoa tháng 5 Cây mọc leo ở các rừng thưa [6]

Phân bố ở Việt Nam, Mianma, Trung Quốc, Thái Lan, Malayxia [6], [7] Ở nước ta cây mọc leo ở rừng thưa các tỉnh Lào Cai, Hòa Bình, Hà Nam Ninh, Ninh Bình và Quảng Trị [6], [11]

1.2 Tổng quan về saponin nhân Dammaran

Theo tài liệu [4], các nghiên cứu [13], [31], [33], [39], các loài

Gynostemma chứa nhiều chất thuộc nhóm flavonid và saponin Ngoài ra còn

chứa acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử, các nguyên tố vi lượng như

Al, Si, Ca, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag Cũng theo các nghiên cứu này, các saponin trong chi Gynostemma Blume chủ yếu thuộc

nhóm Dammaran Do đó, chúng tôi tổng quan sâu hơn về nhóm cấu trúc hóa

học này

1.2.1 Cấu trúc của saponin nhân dammran

Dammaran là nhóm saponin triterpenic, phần aglycon của nhóm này có

cấu trúc 4 vòng và một mạch nhánh Số carbon của nhân là 30 và có 6 nhóm hemiterpene ghép lại theo quy tắc đầu đuôi Các cây thuộc chi Panax, họ

Araliaceae có chứa saponin thuộc nhóm dammaran Đặc biệt cây Nhân sâm

(Panax ginseng) đã được nhiều nhà hóa học nghiên cứu [21]

1 2

3 4

5

8 9 10

11

12 13

14 15 16

17 18

Hình 1.1 Công th ức trong mặt phẳng của khung dammaran

Một số dược liệu khác có chứa saponin nhân dammaran như nhân hạt

của cây Táo (Zizyphus jujuba), Rau đắng biển (Bacopa monnieri) [21], [22]

1.2.2 Tác dụng và công dụng của saponin nhân dammaran

Các saponin triterpenoid tetracyclic nhóm dammaran có trong nhân sâm có tác dụng chống lão hóa, chống stress, chữa xơ vữa động mạch, bệnh

tiểu đường, gan nhiễm mỡ…Dùng khi suy nhược cơ thể, sau khi ốm nặng, làm việc quá sức và mệt mỏi, liệt dương, lãnh dục, ăn không ngon , suy yếu đường tiêu hóa

Saponin của hạt táo (Zizyphus jujuba) có tác dụng an thần

Saponin trong rau đắng biển (Bacopa monnieri) có tác dụng chữa ho,

lợi tiểu [20]

1.3 Các saponin trong chi Gynostemma Blume

1.3.1 Saponin trong chi Gynostemma Blume

Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong Giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran Đã có trên 100 saponin trong thành phần

Gynostemma pentaphyllum được phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có

8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng

là Rb1 (Gypenosid III) [31], [39], Rc [33], Rb3 (Gypenosid IV), Rd

(Gypenosid VIII), F2 [33], Rg3 [36] malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [30] Ngoài

ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [33] Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây và là minh chứng đầu tiên

của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ Araliaceae [32] Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài

Gymnema sylvestra [42] Các saponin còn lại chiếm phần lớn các gypenosid

được phát hiện lần đầu ở loài Gynostemma pentaphyllum Cấu trúc một số saponin trong Gynostemma pentaphyllum được trình bày ở hình 1.2, hình 1.3

g

Hình 1.2 Cấu trúc saponin trong G pentaphyllum Hình 1.3 Các cấu trúc nhóm R7

Bảng 1.1 Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của saponin trong G pentaphyllum

R1 Đường glu, rham, xyl; có thể 1 hoặc 2,

3 đường kết hợp với nhau

- OH

Gypenosid I, Rb1 Gynos TN1,Gynos TN2

và ít phổ biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3) Nhóm -OH cũng

có ở vị trí C-2(α) và C-12(β) [32]

Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vi trí C-17 cũng được phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [31] Các saponin trong giảo cổ lam đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít

ở dạng tinh thể là gypenosid A [32 ], Gynogenin II [34] và gynosaponin TN1 [37]

1.3.2 Một số saponin trong Gynostemma longipes

Năm 1993, Sun và cộng sự đã phân lập 2 saponin có tên là glycoside A

và glycoside B (hình 1.4, hình 1.5) từ Gynostemma longipes [38]

Glycoside A có tên là: 18- Norfurostan-19- al, 23-hydroxy-4, 4, 8, 14,

24 pentamethyl -3- [(2-O-β-D-xylopyranosyl-β-D-xylopyranosyl) oxy]-,(3β,

O

O

O

O HO

OH

O

HO

OH HO

HO

Hình 1.4 Công th ức cấu tạo của Glycoside A

Glycoside B có tên là: 18 - Norfurostan - 19- al, 3 - [(O - 6- deoxy - β – L - mannopyranosyl (1 → 2) – O – β – D - xylopyranosyl - (1 → 2) - β -D - xylopyranosyl) oxy] - 23 - hydroxy - 4, 4, 8, 14, 24 - pentamethyl-, (3β,16ξ,21β)- (9CI)

HO OH HO HO

Hình 1.5 Công th ức cấu tạo của Glycoside B

Năm 1993 [41], Changde đã nghiên cứu trên G longipes mọc tại tỉnh

Vân Nam - Trung Quốc và tách được 2 chất có cấu trúc dạng tinh thể Một

chất đã được xác định là α-spinasterol glucoside Chất còn lại được xác định

là có cấu trúc của flavonoid hoặc flavonol

Năm 1997, Guo và cộng sự đã phân lập được 3 saponin nhân dammaran trong đó có 1 saponin mới là Gylongiposide 1: 19 - oxo - 3β, 20(S), 21-trihydroxydammar-24-ene-3-O-{[α-L-rhamnopyranosyl(1-2)][β-D-xylopyranosyl(1-3)]} α-L-arabinopyranoside, còn 2 chất còn lại là gypenosid XLIX và ginsenoside Rb1 [26]

Năm 2000, Huang M và cộng sự đã thực hiện 1 nghiên cứu định lượng

saponin trên 3 loài Gynostemma pentaphyllum, Gynostemma pubescens và

Gynostemma longipes mọc trên núi Emei Kết quả thu được cho thấy lượng saponin của 3 loài cao nhất vào tháng 7 và thấp nhất vào thời kì tạo hạt Trong

đó lượng saponin của Gynostemma pentaphyllum là cao nhất, tiếp đến là

Gynostemma pubescens và th ấp nhất là Gynostemma longipes [28]

Năm 2010, Phan Thị Thảo đã tiến hành nghiên cứu loài Gynostemma

longipes ở Việt Nam và đã phân lập được 1 saponin là GCL1, dựa vào phổ

khối ESI – MS, 1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, HMBC, HSQC, 1H - 1H – COSY đã xác định được cấu trúc của GCL1 là (20S,24R)-3β,12β,25-trihydroxy-20,24-epoxydammaran3-O-{[α-L-rhamnopyranosy(1→2)][α-L-rhamnopyranosy(1→3)][β-D-xylopyranosy(1→6)]} β-D-glucopyranoside, đây là một saponin mới nên được đặt tên là vinagynosteside A [19]

O O

HO

OH OH HO

Me

Me HO

HO

GCL1 R= β-xylopyranosyl

Hình 1.6 Công th ức cấu tạo của vinagynosteside A

Năm 2011, Nguyễn Ngọc Nghĩa đã tiến hành nghiên cứu loài

Gynostemma longipes ở Việt Nam và đã phân lập được 2 chất EL1, EL2 dựa vào phổ LC/MS, 1H- NMR, 13C-NMR C13CPD dự đoán EL1 là 1 saponin nhân dammaran, có 2 đường là glucose và xylose nối tại vị trí số 3 và EL2 là

một saponin khung dammaran có 3 phân tử đường, có thể có nối đôi tại vị trí C24, C25 [17]

1 2 3 4 5

8 9 10 11

12 13 14 15 16 17 18 19

O HO

B ảng 1.7 Công thức cấu tạo của EL1

1.4 Tổng quan một số phương pháp phân tách các hợp chất thiên nhiên 1.4.1 Sắc ký cột

Nguyên t ắc: Một mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ

(thường là silica gel, nhôm oxit) Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò là

một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân khác nhau nên ái lực của chúng đối với pha tĩnh cũng khác nhau, vì vậy chúng sẽ bị dung môi giải hấp phụ và bị đẩy đi với vận tốc khác nhau, tạo thành băng có

vị trí khác nhau, ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau

M ục đích: Dùng phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lượng phân

- Chuẩn bị dung môi khai triển

- Chuẩn bị các dụng cụ khác: quả bóp, ống đong, phễu, các loại pipet…

- Nạp dung môi khai triển và bảo vệ mặt cột

- Khai triển cột, theo dõi cột và thu các phân đoạn [12]

1.4.2 Sắc ký chế hóa

Nguyên tắc: một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất

hấp phụ (thường là silica gel) tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển

dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử các cấu tử của mẫu thử theo

một vận tốc khác nhau tạo thành sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau

Mục đích: Dùng để tách một lượng nhỏ đơn chất (hàng chục mg) từ

một hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử)

Yêu cầu: Cấu tử nghiên cứu phải dễ phát hiện (tốt nhất là phát hiện được bằng đèn UV) Dùng bột silica gel rời (silica gel H, HF, G, GF, nhưng

tốt nhất là silicagel PF) tạo hỗn dịch bền trong nước rồi tráng trên kính phẳng

có độ thành các bản có độ dày 0,5- 2,0 mm (có thể dày đến 10 mm, tùy vào yêu cầu sử dụng Hiện nay có rất nhiều nơi cũng sử dụng lớp mỏng chế hóa

loại tráng sẵn với độ dày khác nhau

Tiến hành SK: Mẫu thử được chấm thành băng liên tục, băng có thể từ 1-2 mm, cách mép bản 1,5-2 cm Để vết chấm được gọn, nên chấm dưới một nguồn nhiệt Nếu để phân tích có thể dùng mao quản thông thường; nếu để bán định lượng nên dùng vi mao quan có thể tích nhất định, loại này thường được bán sẵn với các cỡ 1-2-5-10 µl [12]

1.4.3 Tổng quan về nhựa hấp phụ

a Nhựa hấp phụ

Nhựa hấp phụ là hạt polymer hình cầu, màu trắng, có cấu trúc xốp với các lỗ lớn trên bề mặt (được sử dụng rộng rãi với đường kính >50Ao) để hấp

phụ các phân tử có kích thước lớn Nguồn gốc của nhựa có thể bắt nguồn từ

việc ngưng tụ polymer từ việc đồng trùng hợp formaldehyde với phenolic và

dẫn xuất amin thơm vào năm 1930 bởi B A Adams và E L Holmes [30]

Nhựa hấp phụ có thể được chia thành hai loại chính: không phân cực và phân cực Theo độ phân cực được chia thành phân cực yếu, phân cực trung bình và phân cực mạnh Được sử dụng nhiều hiện nay gồm các loại nhựa: D101, DA201, D, chuỗi SIP, X5, AB8, GDX104, LD605, LD601, CAD40, DM130, RA, CHA111, WLD (loại hỗn hợp), H107, NKA9… [25]

b Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin

Ứng dụng chính của nhựa hấp phụ là để tinh chế các loại đường, hấp

phụ khí, xử lý nước thải, tách và tinh chế các nhóm chất tự nhiên (flavonoid, polyphenol, saponin, serotonin…), tinh chế các sản phẩm sinh học khác [30]

Jing Li và Howard A Chase nghiên cứu về khả năng hấp phụ của 4 loại

nhựa (D101, DA201, DM301, DS401) trong quá trình tinh chế 2 nhóm saponin steroid trong rễ tam thất (Panax pseudoginseng) cho thấy DS401 hấp

phụ đối với saponin steroid là tốt nhất (saponin steroid trong sản phẩm tăng

gấp 4,83 lần so với sản lượng thu hồi 85,47%) Phương pháp sử dụng nhựa

hấp phụ tinh chế đơn giản và có tác dụng làm giàu cũng như tinh chế saponin

tốt hơn hai phương pháp còn lại, đây là một cơ sở khoa học cho việc chuẩn bị quy mô lớn [29]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Phần trên mặt đất của loài Gynostemma longipes C.Y.Wu ex C.Y et

S.K.Chen thu hái tại Hòa Bình vào tháng 4-2010 Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 50-60o

C trong tủ sấy Shellab có

quạt thông gió Dược liệu sau sấy khô được bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô mát

2.1.2 H óa chất, thuốc thử

- Dung môi chiết xuất: Sử dụng các dụng môi công nghiệp như: Ethanol, Butanol (Công ty Xilong - Trung Quốc); Methanol, chloroform, dichloromethan (Công ty công nghiệp hóa chất INCHEMCO); Nước cất do phòng Giáo tài-trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp

n Dung môi dùng cho sắc ký: Methanol, chloroform, acetonitril loại tinh khiết (Daejung-Hàn Quốc)

- Thuốc thử Vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc

- Nhựa hấp phụ D101 của Anhui sanxing resin Technology Co Ltd

- Tủ sấy Mermet dùng để sấy dược liệu

- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius

- Bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silica gel GF254nm, Merk

- Silica gel cho sắc ký chạy cột, cỡ hạt 40-63 µm, Merck

- Silica gel pha đảo C18 cho sắc ký cột, Merck

2.2 Nội dung và Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất

Chiết xuất dịch toàn phần: Cân lấy 1kg dược liệu, nghiền nhỏ và chiết

hồi lưu bằng dung môi MeOH: H2O (80: 20) Toàn bộ dược liệu được chiết 3

lần, mỗi lần 2 giờ Gộp tất cả dịch chiết được 10 lít và đem thu hồi dưới áp

suất giảm đến còn 2 lít dịch chiết nước

2.2.2 Phân đoạn hóa

S ử dụng nhựa hấp phụ D101: Dịch chiết nước được hấp phụ trên bề

mặt nhựa Dung môi rửa giải EtOH ở các nồng độ khác nhau 0%, 30%, 50%, 80%, 96% Các phân đoạn sẽ được cô đến 10-20 ml sau đó lắc với nBuOHbh/H2O, gạn lấy lớp trên lắc tiếp với NaOH 10% để loại flavonoid

Phần n-BuOH thu loại nước bằng Na2SO4(khan)

Phân đoạn hóa bằng chiết rắn lỏng: cắn cần chiết được được hòa tan

hoàn toàn vào dung môi MeOH: nước (80: 20) rồi được hấp phụ vào silicagel

đã được hoạt hóa ở 110ºC trong 1 giờ Sau đó silica gel đã hấp phụ cắn được bay hơi dung môi đến khô tơi rồi chuyển lên cột Lần lượt chiết bằng các hệ dung môi có độ phân cực khác nhau thu được các phân đoạn

2.2.3 Phân lập và tinh chế

Để phân lập các chất, chúng tôi sử dụng các phương pháp cơ bản như

sắc ký cột pha đảo C18 và sắc ký lớp mỏng điều chế

+ Sắc ký cột pha đảo C18, pha tĩnh là silica gel có thêm mạch hydrocarbon kém phân cực Dịch rửa giải được theo dõi bằng sắc ký lớp

mỏng, bản mỏng là silica gel pha đảo, có sử dụng thuốc thử vanillin 1% trong

cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc

+ Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254nm (Merck), phát hiện vết chất bằng cách cắt rìa bản mỏng, phun

thuốc thử vanillin 1% trong cồn tuyệt đối và acid sulfuric đặc để phát hiện vết

chất, ghép lại bản mỏng như cũ để phát hiện vùng chất, sau đó cạo lớp silica gel có chất, phản hấp phụ bằng dung môi n-BuOH bão hòa nước

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Thực nghiệm và kết quả

3.1.1 Chiết xuất

Phương pháp chiết xuất: Phương pháp chiết hồi lưu

Cân lấy 1kg dược liệu, nghiền nhỏ và chiết hồi lưu bằng dung môi MeOH: H2O (80: 20) Toàn bộ dược liệu được chiết 3 lần, mỗi lần 2 giờ Gộp

tất cả dịch chiết được 10 lít và đem thu hồi dưới áp suất giảm đến còn 2 lít

dịch chiết nước

Hình 3.1 Sơ đồ qui trình chiết xuất

3.1.2 Phân đoạn hóa

3.1.2.1 S ử dụng nhựa hấp phụ D101

a Khảo sát nhựa hấp phụ D101

- Chuẩn bị dịch chiết: Hút lấy 10 ml dịch chiết nước ở trên (tương ứng với

5 g dược liệu) lọc qua giấy lọc để chuẩn bị đưa lên cột nhựa hấp phụ

D ược liệu (1 kg)

MeOH thu h ồi

D ịch chiết trong MeOH

- Chuẩn bị cột nhựa hấp phụ: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 2 cm, chiều dài 30 cm, rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều

thẳng đứng, lót một lớp bông thủy tinh ở đáy cột

Rót từ từ nhựa hấp phụ D101 sau khi được ngâm trong nước cất lên cột,

rửa thành cột, cho thêm một lớp bông ở trên để tránh xáo trộn, ổn định cột

bằng cách rửa nhiều lần bằng nước cất đến khi dịch rửa giải trong, sau đó khóa cột

- Hấp phụ dịch chiết lên cột: Dịch chiết được đưa từ từ lên cột, cho dịch

chảy xuống đến sát bề mặt nhựa, khóa cột, để khoảng 30 phút để dịch chiết được ổn định trên cột

- Rửa giải các phân đoạn:

+ Đưa nước cất lên cột, mở khóa cho dịch chảy xuống, duy trì lượng dung môi trên cột sao cho nhựa luôn ngập trong dung môi Rửa giải cho đến khi

dịch thu được hết màu, đem gộp lại, cô đến khi còn 20 ml đem lắc với BuOHbh/H2O 3 lần, mỗi lần 5 ml Gộp dịch n-BuOH, cô đến còn 1 ml (M0), dùng để kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng

n-+ Đưa EtOH 30% lên cột, mở khóa cho dịch trên cột chảy xuống, tiếp tục rửa

giải đến khi dịch thu được hết Dịch hứng được gộp lại đem cô đến khi còn khoảng 20 ml đem chiết với n-BuOHbh/H2O, gạn lấy lớp n-BuOH Chia dịch thu được thành 2 phần bằng nhau, cô phần 1 trên bếp cách thủy đến khi còn 0,5 ml dịch chiết n-BuOH (M30) Phần còn lại đem lắc với NaOH 10%, 3 lần,

lớp NaOH hết màu, gạn lấy lớp trên, loại nước bằng natrisulfat khan, cô trên

bếp cách thủy còn 0,5 ml (N30)

+ Tiếp tục đưa lần lượt EtOH 50%, 80%, 96% thu được 0,5 ml các phân đoạn

M50, M80, M96, N50, N80, N96

- Ki ểm tra saponin và flavonoid trong các phân đoạn: Trong quá trình rửa

giải cột, ở mỗi phân đoạn, lấy 2 ống nghiệm sạch, hứng mỗi ống 0,5 ml dịch

Kết quả được trình bày ở bảng 3.1

B ảng 3.1 Kết quả định tính saponin và flavonoid

Hình 3.2 Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn bằng nhựa hấp phụ

- Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

Dịch chấm sắc ký: Dùng dịch n-BuOH thu được ở trên đem chấm sắc ký

Bản mỏng Silica gel GF254 (MERCK) tráng sẵn, hoạt hoá ở 110o

C trong

60 phút

Hệ dung môi: CH2Cl2- MeOH- H2O (7: 2: 0,2)

MeOH thu h ồi

D ịch chiết MeOH

n-L ắc, gạn với NaOH10%

N 96

M t

N 30