Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của hai loài desmodium triflorum (l ) DC và desmodium heterophyllum (willd ) DC , họ đậu (fabaceae)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sỏi tiết niệu là một bệnh lý thường gặp trên đường tiết niệu, sỏi gây tắc nghẽn đường tiết niệu mà hậu quả có thể dẫn đến ứ nước thận và hủy hoại tổ chức thận, gây nhiễm khuẩn và gây đau, ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng người bệnh 37. Đặc biệt sỏi tiết niệu có nguy cơ tái phát cao (50% sau 10 năm và 70% sau 20 năm) 25, 33. Những vùng có tỷ lệ sỏi tiết niệu cao trên thế giới được gọi là vành đai sỏi gồm Ấn Độ, Trung Quốc, Hoa Kỳ, Bắc Âu và các nước Địa Trung Hải,… Việt Nam nằm trong vùng vành đai sỏi của thế giới với tỷ lệ sỏi tiết niệu chiếm khoảng 2 12% trong cộng đồng dân cư 5. Do gây ra những tác hại và biến chứng nguy hiểm như vậy nên hiện nay đã có nhiều phương pháp điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu được áp dụng, gồm cả điều trị nội khoa và ngoại khoa 37. Tuy nhiên các phương pháp điều trị ngoại khoa như tán sỏi qua da, tán sỏi ngoài cơ thể, phẫu thuật lấy sỏi…thường đi kèm nhiều tác dụng không mong muốn như gây ra các tổn thương thận, suy thận, tạo nhiều sỏi nhỏ gây tắc nghẽn niệu quản, nhiễm trùng…25, 37. Trong khi các tác nhân dược lý để điều trị nội khoa như muối natri citrat hay các thuốc lợi tiểu thiazid cho hiệu quả hạn chế và khả năng dung nạp kém. Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển các dược liệu có hiệu quả trong điều trị và dự phòng tái phát sỏi tiết niệu với khả năng dung nạp tốt và ít gây ra các tác dụng không mong muốn là một yêu cầu cấp thiết hiện nay 23, 38. Theo kinh nghiệm chữa bệnh dân gian, có rất nhiều cây thuốc và bài thuốc đã được sử dụng để điều trị sỏi tiết niệu, trong đó có Kim tiền thảo (Desmodium styracifolum (Osbeck) Merr., họ Đậu (Fabaceae)). Tác dụng này đã được chứng minh trên in vitro và in vivo 41, do đó, hiện nay, từ dược liệu này có rất nhiều chế phẩm được sản xuất và đưa ra thị trường. Cũng trong chi Desmodium Desv. có hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC. và Desmodium triflorum (L.) DC. cũng được người dân ở một số vùng sử dụng để điều trị sỏi tiết niệu rất hiệu quả. Trong khi đó hiện nay chưa có nghiên cứu nào được thực hiện để đánh giá tác dụng này của hai loài trên. Do đó, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của hai loài Desmodium triflorum (L.) DC. và

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ

TÁC DỤNG IN VITRO TRÊN SỎI TIẾT NIỆU CỦA HAI LOÀI Desmodium triflorum (L.) DC

VÀ Desmodium heterophyllum (Willd.)DC.,

HỌ ĐẬU (FABACEAE) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2013

NGUYỄN THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ

TÁC DỤNG IN VITRO TRÊN SỎI TIẾT NIỆU CỦA HAI LOÀI Desmodium triflorum (L.) DC

VÀ Desmodium heterophyllum (Willd.) DC.,

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tại Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội, em đã nhận được sự giúp đỡ chỉ bảo tận tình của thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng đến ThS Lê

Thanh Bình - giảng viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội - người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo em hết sức nhiệt tình và tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em cũng xin cảm ơn TS Nguyễn Quỳnh Chi, TS Nguyễn Hoàng

Anh, ThS Nguyễn Thu Hằng đã quan tâm, giúp đỡ em trong quá trình làm

thực nghiệm tại Bộ môn Dược liệu cũng như Bộ môn Dược lực

Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược lực đã tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô và cán bộ trong trường Đại học Dược Hà Nội đã cho em những kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè luôn động viên, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận này

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2013

Sinh viên Nguyễn Thị Tâm

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 Tổng quan về sỏi tiết niệu……… 3

1.1.1 Khái niệm về sỏi tiết niệu……… 3

1.1.2 Dịch tễ bệnh sỏi tiết niệu……… 3

1.1.3 Phân loại sỏi và tỷ lệ mắc bệnh……… 3

1.1.4 Nguyên nhân và bệnh sinh……… 5

1.1.5 Điều trị nội khoa và ngoại khoa……… 6

1.1.6 Quan niệm của Y học cổ truyền……… 6

1.2 Tổng quan về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Desmodium Desv ……… 9

1.2.1 Vị trí phân loại……… 9

1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố……… 9

1.2.3 Thành phần hóa học……… 10

1.2.4 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Desmodium Desv……… 10

1.3 Tổng quan về hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium triflorum (L.) DC……… 11

1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân bố……… 11

1.3.2 Thành phần hóa học……… 13

1.3.3 Tác dụng và công dụng……… 15

1.3.4 Các bài thuốc……… 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 17

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị……… 17

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu……… 17

2.1.2 Hóa chất, dung môi……… 17

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ……… 17

2.2 Nội dung nghiên cứu……… 18

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật……… 18

2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium triflorum (L.) DC trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro……… 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 18

2.3.1 Xử lý và bảo quản mẫu……… 18

2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm thực vật……… 18

2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium triflorum (L.) DC trên hình thành tinh thể calci oxalat in vitro……… 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 25

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium triflorum (L.) DC………… 25

3.1.1 Đặc điểm hình thái……… 25

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu……… 27

3.1.3 Đặc điểm bột……… 30

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của hai loài D heterophyllum (Willd.) DC và D triflorum (L.) DC……… 31

3.2.1 Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của natri citrat và dịch chiết nước……… 31

3.2.2 Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của natri

citrat và dịch chiết ethanol 70% 35

3.2.3 Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của natri

citrat và cắn các phân đoạn của dịch chiết ethanol 70% 37

3.3.1 Về đặc điểm hình thái, đặc điểm vi học của hai loài D

heterophyllum (Willd.) DC và D triflorum (L.) DC……… 46

3.3.2 Về ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat của

hai loài D heterophyllum (Willd.) DC và D triforum (L.) DC ………… 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẲT

CD: chứng dương

CHCl3: chloroform

COD: calci oxalat dihydrat

COM: calci oxalat monohydrat

EtOAc: ethyl acetat

EtOH: ethanol

ODTB: mật độ quang trung bình

RO: Reverse Osmosis (thẩm thấu ngược)

SD: standard deviation (độ lệch chuẩn)

%UC: phần trăm ức chế

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của natri citrat và dịch chiết nước ở các độ

pha loãng 1/16, 1/8, 1/4, 1/2, 1/1 trên sự hình thành tinh thể calci

oxalat in vitro của hai loài D heterophyllum (Willd.) DC và D

triflorum (L.) DC

32

3

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của natri citrat và dịch chiết ethanol 70%

trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của hai loài

Bảng 3.4 Hàm lượng cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol

70% hai loài D.heterophyllum (Willd.) DC và D triflorum (L.)

DC

40

6

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của natri citrat và cắn các phân đoạn dịch

chiết ethanol 70% của hai loài nghiên cứu trên sự hình thành tinh

thể calci oxalat in vitro

41

7

Bảng 3.6 Những điểm giống và khác nhau về đặc điểm hình thái

giữa hai loài D heterophyllum (Willd.) DC và D triflorum (L.)

DC

47

DAN H MỤC CÁC HÌNH VẼ

1 Hình 1.1 Hình ảnh tinh thể dạng COM (a, b) và COD (c, d) dưới

2 Hình 1.2 Một số hợp chất đã được phân lập từ loài D

3 Hình 1.3 Một số hợp chất đã được phân lập từ loài D triflorum

4

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ dịch chiết ethanol

70% của hai loài D heterophyllum (Willd.) DC và D triflorum

(L.) DC

21

5 Hình 3.1 Ảnh chụp hai loài D heterophyllum (Willd.) DC (1)và

6 Hình 3.2 Ảnh chụp phần trên mặt đất loài D heterophyllum

(Willd.) DC (1) và loài D triflorum (L.) DC (2) 26

7 Hình 3.3 Ảnh chụp hoa (3), quả (4) loài D heterophyllum

(Willd.) DC và hoa (5), quả (6) loài D triflorum (L.) DC 26

12 Hình 3.8 Một số đặc điểm bột loài D heterophyllum (Willd.) DC 30

13 Hình 3.9 Một số đặc điểm bột loài D triflorum (L.) DC 31

14

Hình 3.10 Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện

không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citrat và trong điều

kiện có mặt dịch chiết nước hai loài D heterophyllum (Willd.)

DC (D h) và D triflorum (L.) DC (Dt) ở các độ pha loãng

33

15

Hình 3.11 Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện

không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citrat và trong điều

kiện có mặt dịch chiết ethanol 70% hai loài D heterophyllum

(Willd.) DC (D h) và D triflorum (L.) DC (Dt) ở các độ pha loãng

36

16 Hình 3.12 Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong dung

môi ethanol ở các nồng độ khác nhau 38

17

Hình 3.13 Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện

không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citratvà trong điều kiện

có mặt cắn các phân đoạn của D heterophyllum (Willd.) DC ở

các nồng độ

42

18

Hình 3.14 Hình ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong điều kiện

không có chất thử (trắng tinh thể), có natri citratvà trong điều kiện

có mặt các cắn phân đoạn của loài D triflorum (L.) DC ở các

nồng độ

43

19 Hình 3.15 Hình ảnh hai loài D heterophyllum (Willd.) DC (1)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sỏi tiết niệu là một bệnh lý thường gặp trên đường tiết niệu, sỏi gây tắc nghẽn đường tiết niệu mà hậu quả có thể dẫn đến ứ nước thận và hủy hoại tổ chức thận, gây nhiễm khuẩn và gây đau, ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng người bệnh [37] Đặc biệt sỏi tiết niệu có nguy cơ tái phát cao (50% sau 10 năm và 70% sau 20 năm) [25], [33] Những vùng có tỷ lệ sỏi tiết niệu cao trên thế giới được gọi

là vành đai sỏi gồm Ấn Độ, Trung Quốc, Hoa Kỳ, Bắc Âu và các nước Địa Trung Hải,… Việt Nam nằm trong vùng vành đai sỏi của thế giới với tỷ lệ sỏi tiết niệu chiếm khoảng 2 - 12% trong cộng đồng dân cư [5]

Do gây ra những tác hại và biến chứng nguy hiểm như vậy nên hiện nay đã

có nhiều phương pháp điều trị và dự phòng sỏi tiết niệu được áp dụng, gồm cả điều trị nội khoa và ngoại khoa [37] Tuy nhiên các phương pháp điều trị ngoại khoa như tán sỏi qua da, tán sỏi ngoài cơ thể, phẫu thuật lấy sỏi…thường đi kèm nhiều tác dụng không mong muốn như gây ra các tổn thương thận, suy thận, tạo nhiều sỏi nhỏ gây tắc nghẽn niệu quản, nhiễm trùng…[25], [37] Trong khi các tác nhân dược lý

để điều trị nội khoa như muối natri citrat hay các thuốc lợi tiểu thiazid cho hiệu quả hạn chế và khả năng dung nạp kém Vì vậy, việc tìm kiếm và phát triển các dược

liệu có hiệu quả trong điều trị và dự phòng tái phát sỏi tiết niệu với khả năng dung nạp tốt và ít gây ra các tác dụng không mong muốn là một yêu cầu cấp thiết hiện nay [23], [38] Theo kinh nghiệm chữa bệnh dân gian, có rất nhiều cây thuốc và bài thuốc đã được sử dụng để điều trị sỏi tiết niệu, trong đó có Kim tiền thảo

(Desmodium styracifolum (Osbeck) Merr., họ Đậu (Fabaceae)) Tác dụng này đã

được chứng minh trên in vitro và in vivo [41], do đó, hiện nay, từ dược liệu này có rất nhiều chế phẩm được sản xuất và đưa ra thị trường Cũng trong chi Desmodium Desv có hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium triflorum

(L.) DC cũng được người dân ở một số vùng sử dụng để điều trị sỏi tiết niệu rất hiệu quả Trong khi đó hiện nay chưa có nghiên cứu nào được thực hiện để đánh giá

tác dụng này của hai loài trên Do đó, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và tác

dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của hai loài Desmodium triflorum (L.) DC và

Desmodium heterophyllum (Willd.) DC., họ Đậu (Fabaceae)” được thực hiện với

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sỏi tiết niệu

1.1.1 Khái niệm về sỏi tiết niệu

Sỏi tiết niệu là sự hình thành và hiện diện của sỏi trong đường tiết niệu Sỏi ở

vị trí nào thì có tên gọi theo vị trí giải phẫu đó như sỏi thận, sỏi niệu quản, sỏi bàng quang [2]

1.1.2 Dịch tễ bệnh sỏi tiết niệu

- Theo khu vực: Sỏi tiết niệu là bệnh phổ biến trong các bệnh đường tiết niệu,

chiếm khoảng 10 - 12% dân số ở các nước phát triển [18], [33], [37] Ở Mỹ, sỏi tiết niệu làm ảnh hưởng tới 10 - 15% dân số của đất nước này [21], [31], [38] Ở Châu

Á tỷ lệ này là 1 - 5%, ở Châu Âu là 5 - 9%, ở Trung Đông là 20 - 25% [25], [31], [36], [40] Tại Việt Nam, trong 5 năm (1991 - 1996) có 2256 bệnh nhân nằm viện ở Bệnh viện Bạch Mai có viêm thận - bể thận, trong đó có tới 216 bệnh nhân bị bệnh

do sỏi (chiếm tỷ lệ 9,5%) [8]

- Theo độ tuổi, giới tính: Tuổi mắc bệnh trung bình từ 20 - 40 tuổi [18], [33]

Tỷ lệ mắc bệnh ở nam giới cũng lớn hơn ở nữ giới [25] Tại Mỹ: tỷ lệ mắc bệnh ở nam là 12%, trong khi đó ở nữ là 5 - 6% [23] Tuy nhiên, sỏi thận đang gia tăng ở

nữ và tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ em cũng lớn hơn so với người lớn [35]

1.1.3 Phân loại sỏi và tỷ lệ mắc bệnh

Có 5 loại sỏi thường gặp là: sỏi calci, sỏi acid uric, sỏi struvit (MgNH4PO4.6H2O), sỏi oxalat và sỏi cystin [8], [21], [37]

1.1.3.1 Sỏi calci: Calci có thể kết hợp với oxalat, phosphat hay acid uric Thường là

do nước tiểu quá bão hòa muối calci Nguyên nhân nữa có thể do thiếu, giảm citrat niệu Citrat có tác dụng ức chế kết tinh các muối calci Khi có toan máu, nhiễm khuẩn tiết niệu, hạ K+ máu, citrat niệu thường giảm tạo điều kiện thuận lợi cho việc tạo sỏi [8] Sỏi calci oxalat gồm 2 dạng là calci oxalat monohydrat (COM) và calci oxalat dihydrat (COD) với hình ảnh thể hiện trên hình 1.1

- COM (Whewellite): hình que dài 6 cạnh hoặc hình bầu dục có nhân, có khả năng kết tụ cao, khả năng gắn chặt vào tế bào biểu mô ống thận, giữ lại tạo điều kiện hình thành sỏi [17], [32]

- COD (Weddellite): hình vuông, góc kết nối bằng đường giao nhau, không kết tụ thành các khối bền vững, không gắn vào tế bào biểu mô ống thận, dễ dàng bị cuốn theo nước tiểu, khó tạo thành sỏi tiết niệu [19]

(a) (b) (c) (d)

Hình 1.1 Hình ảnh tinh thể dạng COM (a, b) và COD (c, d) dưới kính hiển vi điện tử quét

1.1.3.2 Sỏi acid uric: Do tăng acid uric máu (bệnh Gút) gây nước tiểu quá bão hòa

acid uric và tạo sỏi Trong điều kiện nước tiểu acid thì acid uric càng dễ kết tinh

1.1.3.3 Sỏi struvit: Nguồn gốc là nhiễm khuẩn tiết niệu Vi khuẩn tiết ra men urease

làm phân hủy urê, tạo thành amoniac (NH4OH) Amoniac bị phân hủy tạo thành amonium NH4+ và OH- gây kiềm hóa nước tiểu Struvit (MgNH4PO4.6H2O) được tạo thành và trong điều kiện nước tiểu kiềm hóa thì khó hòa tan và tạo sỏi

1.1.3.4 Sỏi oxalat: Nguồn gốc có thể do di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường

gây loạn dưỡng oxalat Tăng oxalat niệu tạo điều kiện tạo sỏi oxalat calci ngậm 1

phân tử nước Sỏi oxalat phối hợp hằng định với lắng đọng calci

1.1.3.5 Sỏi cystin: Do rối loạn vận chuyển cystin ở ống thận và ở niêm mạc ruột,

nguyên nhân do di truyền gen lặn nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể thứ 14 Sỏi cystin thường đi kèm với một bệnh cảnh bệnh lý ống thận di truyền (đa niệu, hạ K+ máu)

Trên thực tế lâm sàng, sỏi thận tiết niệu thường là sỏi hỗn hợp Từ một sỏi đầu tiên không có calci (sỏi struvit, acid uric, cystin) nhưng sau đó lắng đọng calci

Vì vậy sỏi thận tiết niệu thường là sỏi cản quang [8]

Sỏi calci oxalat là sỏi phổ biến nhất trên toàn thế giới và chiếm 60 - 90% của sỏi niệu ở trẻ em [31], [35], [36] Sỏi struvit tạo thành khoảng 1 - 18%, sỏi calci phosphat chiếm 10 - 20%, acid uric tạo thành 5 - 10%, cystin 1 - 5% và sỏi hỗn hợp chiếm 4% của sỏi trẻ em [31], [36]

Ở nhiều nước đang phát triển, do không có sẵn các công cụ chẩn đoán cần thiết nên tỷ lệ mắc bệnh thực tế có thể lớn hơn so với các số liệu thống kê [36]

1.1.4 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

1.1.4.1 Nguyên nhân

Sự phát sinh và hình thành sỏi có nhiều nguồn gốc khác nhau, có 3 nguyên

nhân như sau [3]:

- Các chất hòa tan trong nước tiểu như calci, oxalat, phosphat, urat…vượt qua ngưỡng (cao hơn nồng độ hòa tan)

- Khi pH nước tiểu toan hóa hoặc kiềm hóa: toan hóa (pH<6) thì dễ kết tinh sỏi urat và sỏi acid uric; kiềm hóa (pH>6,5) thì dễ kết tinh sỏi oxalat và sỏi phosphat

- Yếu tố di truyền: đối với sỏi cystin và sỏi acid uric yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng

1.1.4.2 Cơ chế bệnh sinh

Sỏi tiết niệu là một quá trình phức tạp, gồm nhiều giai đoạn, trong đó có 3

giai đoạn chính [3], [6]:

- Giai đoạn chưa bão hòa: chưa có sự kết tinh của tinh thể

- Giai đoạn trung gian: khi đó tinh thể chỉ kết tinh lúc có một chất khởi xướng để hình thành một nhân dị chất

- Giai đoạn không bền: trong đó các tinh thể kết tinh tự nhiên từ một nhân dị hay đồng chất

Ngoài cơ chế chung nêu trên mỗi loại sỏi lại có đặc thù riêng:

+ Sỏi acid uric xuất hiện khi sự chuyển hóa purin tăng do chế độ ăn hay do nguyên nhân nội sinh và khi pH nước tiểu <5,3 Với pH bình thường nước tiểu bệnh

nhân chứa một hỗn hợp acid uric và urat, khi pH hạ acid uric ít hòa tan sẽ tủa trong khi urat dễ hòa tan lại giảm đi rõ rệt

+ Sỏi struvit được hình thành khi bệnh nhân tiết lượng acid phosphat và amoni khá lớn kèm theo sự tăng pH nước tiểu lên > 7,2 Sở dĩ pH nước tiểu tăng là

do nhiễm khuẩn, vì vậy sỏi này cũng được gọi là sỏi nhiễm khuẩn

1.1.5 Điều trị nội khoa và ngoại khoa

1 1.5.1 Điều trị nội khoa

Điều trị nội khoa nhằm giải quyết nguyên nhân và cơ chế tạo sỏi, có tác dụng hạn chế tái phát sỏi, giảm bớt các chỉ định ngoại khoa và tránh các biến chứng ngoài thận Nguyên tắc chung trong điều trị nội khoa là [3]:

- Giảm đau (khi có chẩn đoán cụ thể)

- Kháng sinh chống viêm nhiễm khi cần thiết

- Thay đổi pH nước tiểu, uống nhiều nước (> 2 lít/ngày)

- Chế độ ăn uống phù hợp

1.1.5.2 Điều trị ngoại khoa [8]

- Tán sỏi ngoài cơ thể: đối với sỏi < 2cm, vị trí: sỏi ở bể thận, hoặc đoạn đầu, đoạn cuối niệu quản

- Tán sỏi qua nội soi: sỏi bàng quang hoặc sỏi niệu quản đoạn cuối

- Lấy sỏi qua soi niệu quản: áp dụng trong trường hợp sỏi nhỏ, sỏi đã xuống thấp ở đoạn cuối niệu quản và không có nhiễm khuẩn bàng quang

- Lấy sỏi niệu đạo: trong trường hợp sỏi nhỏ, ra sát ngoài niệu đạo

1.1.6 Quan niệm của Y học cổ truyền

1.1.6.1 Quan niệm về sỏi tiết niệu

Sỏi tiết niệu được mô tả trong chứng thạch lâm của Y học cổ truyền (thạch

lâm: tiểu ra sỏi) [3]

- Thạch lâm là một trong năm chứng lâm được Y học cổ truyền gọi là ngũ lâm, đó là: nhiệt lâm , cao lâm, huyết lâm, thạch lâm, lao lâm Những viên sỏi lớn

gọi là thạch lâm, sỏi nhỏ là sa lâm

- Chứng trạng của thạch lâm: bụng dưới đau co cứng, một bên thăn lưng đau quặn, đau lan xuống bụng dưới và bộ phận sinh dục, tiểu tiện đau buốt khó đi, nước tiểu có khi vàng đục, có khi ra máu, có khi ra lẫn sỏi cát

- Nguyên nhân do thấp nhiệt ở hạ tiêu khiến ngưng kết trong nước tiểu mà sinh bệnh

1.1.6.2 Chẩn đoán theo y học cổ truyền [3]

 Thể thấp nhiệt (tương ứng với sỏi tiết niệu có viêm nhiễm kèm theo)

- Đau từ eo lưng lan xuống đùi và bộ phận sinh dục ngoài

- Tiểu tiện vàng sẻn, đỏ đục, nóng rát ống tiểu, tiểu nhiều lần, có thể đi tiểu

 Thể khí huyết ứ trệ (tương ứng với sỏi niệu ra máu)

- Khi đi tiểu thấy đau tức và nặng trước âm nang, tiểu tiện ra máu đỏ tươi, tiểu không hết

- Nước tiểu vừa có máu vừa đục

- Lưỡi có điểm ứ huyết

- Mạch khẩn

 Thể thận hư (tương ứng sỏi tiết niệu có biến chứng)

- Tiểu ít, đục có mủ, bệnh âm ỉ, sốt kéo dài

- Người mệt mỏi, bụng trướng hoặc phù thũng, sắc mặt trắng bệch

- Lưỡi nhợt bệu, rêu trắng dính

- Mạch tế sác vô lực

1.1.6.3 Điều trị theo YHCT

Có nhiều bài thuốc nam theo kinh nghiệm dân gian và nhiều bài thuốc cổ phương đã được sử dụng điều trị bênh sỏi tiết niệu [3]:

 Thể thấp nhiệt

- Phép trị: thanh nhiệt, bài thạch, trừ thấp, lợi niệu

- Bài thuốc:

+ Bài thuốc nam kinh nghiệm dân gian:

Kim tiền thảo 40g Xa tiền tử 20g Ngưu tất 10g Uất kim 16g Trạch tả 10g

Sắc uống ngày 1 thang

+ Bài thuốc cổ phương:

Sinh địa 12g Cam thảo 10g Trúc diệp 16g

Xa tiền tử 10g Mộc thông 16g

Gia thêm : Kim tiền thảo 20g, Kê nội kim 10g

Sắc uống ngày 1 thang

 Thể khí huyết ứ trệ

- Phép trị: lý khí hành trệ, thông lâm bài thạch

- Bài thuốc:

+ Bài thuốc nam kinh nghiệm dân gian:

Đào nhân 8g Uất kim 8g Ngưu tất 8g Chỉ xác 6g Kim tiền thảo 20g Xa tiền tử 12g

Kê nội kim 8g Ý dĩ 12g Bạch mao căn 16g Sắc uống ngày 1 thang

+ Bài thuốc cổ phương: Huyết phủ trục ứ thang

Đương quy 12g Sinh địa 8g Đào nhân 8g Hồng hoa 8g Chỉ xác 6g Xích thược 8g Sài hồ 8g Cam thảo 4g Ngưu tất 8g Xuyên khung 8g

Gia thêm: Kim tiền thảo 20g, Hạn liên thảo 20g

Sắc uống ngày 1 thang

 Thể thận hư:

- Phép trị: bổ thận, lợi niệu, thông lâm

- Bài thuốc:

+ Bài thuốc nam kinh nghiệm dân gian:

Dây tơ hồng 30g Thổ phục linh 20g Củ mài 30g

Tỳ giải 30g Mã đề 16g Hạt sen 30g Sắc uống ngày 1 thang

+ Bài thuốc cổ phương: Tế sinh thận khí hoàn gia vị (Tế sinh phương)

Phụ tử 8g Thục địa 16g Hoài sơn 12g Sơn thù 12g Đơn bì 12g Thổ phục linh 12g Trạch tả 8g

Gia thêm: Kim tiền thảo 20g, Xa tiền tử 16g

Tán bột làm hoàn, ngày uống 30g

1.2 Tổng quan về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học

của chi DesmodiumDesv

1.2.1 Vị trí phân loại

Theo khóa phân loại thực vật của Armen Takhtajan [14] chi Desmodium

Desv có vị trí phân loại như sau:

Phân họ Đậu (Faboideae)

Chi Desmodium Desv

1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

Chi Desmodium Desv có khoảng 450 loài [42], là cây thảo, hoặc bụi Lá kép, mọc cách, có khi 3 lá chét, có khi 1, có lá kèm Hình dạng phiến lá đa dạng, 2

lá chét bên thường nhỏ hơn so với lá chét ở đỉnh Đài hoa hình chuông, 4 - 5 thùy,

có răng cưa toàn bộ hoặc 2 răng ở đỉnh Cụm hoa phần lớn dạng chùm hoặc chùy, mọc ở đỉnh hoặc nách lá Lá bắc thường nhiều, sớm rụng; những lá bắc sơ cấp

thường có hình trứng dẹt Hoa có cuống, cánh tràng thường đa dạng về màu sắc: trắng, trắng xanh, hồng, tím, tía; hình dạng: elip, chuông đến trứng; nhị 10 Bầu thượng, nhiều noãn Quả giáp thuôn dài, hẹp, nhiều hạt Hạt nhỏ, hình bầu dục hay hình trứng dẹp [22]

Các loài thuộc chi Desmodium Desv phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt

đới hoặc cận nhiệt đới ẩm hoặc nửa ẩm [10], [22] Chúng ưa đất chua (pH <6,5) và thường mọc dưới tán rừng thưa, ven rừng, trên đất rừng sau nương rẫy, ven đường, trên đồng cỏ [10]

Hầu hết các loài trong chi là cây tự thụ phấn Tuy thế, trong tự nhiên hiện tượng thụ phấn chéo cũng có thể xảy ra với một số loài [10]

1.2.3 Thành phần hóa học của chi Desmodium Desv

Nghiên cứu về thành phần hóa học được thực hiện trên 15 loài Desmodium:

D adscendens (Sw.) DC., D blandum Meeuwen, D canum (Gmel.) Schinz and Thell., D caudatum (Thunb.) DC.,D gangeticum (L.) DC., D gyrans (L f.) DC.,

D microphyllum (Thunb.) DC., D oxyphyllum DC., D podocarpum DC., D pulchellum (L.) Benth., D sambuense (D Don.) DC., D styracifolium (Osbeck) Merr., D tiliaefolium G Don., D triflorum (L.) DC và D uncinatum (Jacq.)

DC Kết quả đã phân lập được 81 flavonoid, 40 alcaloid, 14 terpenoid, 13 steroid,

10 phenol, 8 phenyl propanoid, 2 glycosid và một số tinh dầu Trong đó nhiều nhất

là các flavonoid, đặc biệt là các isoflavonoid Các loại flavonoid chính đã phân lập

được trong chi Desmodium Desv là flavon, 7, 8-prenyl-lacton flavonoid, flavonol,

flavan-3-ol và flavanonol, còn các isoflavonoid bao gồm isoflavon, isoflavanon, pterocarpan và coumaronochromon 40 alcaloid được phân lập từ các loài

Desmodium Desv chủ yếu là dẫn xuất của indol, phenylethylamin, pyrrolidin, amid

và alkylamin đơn giản [41]

1.2.3 Tác dụng dược lý của một số loài thuộc chi Desmodium Desv

Một số loài thuộc chi Desmodium Desv đã được chứng minh có rất nhiều tác

dụng dược lý như:

* Tác dụng trên hệ tiết niệu: D styracifolium (Osbeck.) Merr đã được chứng minh là có tác dụng in vitro và in vivo trên sỏi tiết niệu [41]

* Tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm: Các thử nghiệm trên chuột với các loài D triflorum (L.) DC có tác dụng chống phù nề [41], với D adscendens (Sw.)

DC có tác dụng hạ sốt [41], với D styraciflorum (Osbeck.) Merr có tác dụng chống viêm [41]

* Tác dụng chống oxy hóa: Tác dụng chống oxy hóa của D styracifolium (Osbeck.) Merr được đánh giá bằng phương pháp trắc quang [41]

* Tác dụng kháng khuẩn và ký sinh trùng: Flavonoid được phân lập từ dịch chiết ethanol của rễ D caudatum (Thunb.) DC.cho thấy tác dụng kháng khuẩn in vitro đối với vi khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis và Streptococcus facialis [41]

Các dịch chiết nước, cồn và aceton của D barbatum (L.) Benth cũng thể

hiện đáng kể tác dụng kháng khuẩn [41]

* Tác dụng trên hệ tim mạch: Dịch chiết nước của D styracifolium (Osbeck.) Merr thể hiện tác dụng hạ huyết áp mạnh cả trên in vitro và in vivo [41]

Loài D gangeticum (L.) DC được chứng minh có tác dụng bảo vệ tim [41]

* Tác dụng điều hòa miễn dịch: Flavonoid từ D canadense (L.) DC cải thiện đáng kể hoạt động thực bào của bạch cầu trung tính cả in vivo và in vitro [41]

* Tác dụng chống phản vệ: dịch chiết nước của lá và thân D adscendens

(Sw.) DC có tác dụng làm giảm các cơn co thắt phản vệ trên chuột lang [41]

* Ngoài ra, một số loài Desmodium còn có tác dụng ức chế sự co thắt cơ

trơn, tác dụng chống loét dạ dày, tác dụng làm lành vết thương, tác dụng chống xơ, tác dụng tương tự hormon estrogen, tác dụng nootropic và chống mất trí nhớ [41]

1.3 Tổng quan về hai loài Desmodium triflorum (L.) DC và Desmodium

heterophyllum (Willd.) DC

1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

1.3.1.1 Loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC

• Tên Việt Nam: Sơn lục địa, Hàn the [9], [12], [13]

• Đặc điểm:

Hàn the là loại cỏ nhỏ sống nhiều năm, bò lan trên mặt đất Cây phân cành từ gốc Lá mọc so le, có những lá đơn và lá kép, gồm 3 lá chét hình bầu dục hoặc hình xoan, đầu lá tròn, dài 1 - 2 cm, rộng 0,5 - 1 cm, mặt trên xanh sẫm, mặt dưới nhạt màu có lông, mặt trên nhẵn Cụm hoa ngắn và thưa, mọc ở nách lá, không cuống, màu tím hồng Quả thuôn không cuống, có 4 - 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt [4], [7],

[10], [11], [22]

Cây có khả năng sống tốt trên nhiều loại đất từ sét đến cát Cây cũng có khả năng chịu được các loại đất có độ pH khác nhau và không có khả năng chịu mặn Cây nhân giống bằng hạt [10]

• Phân bố:

Hàn the là loài bản địa ở vùng châu Á ôn đới (Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan) và Châu Á nhiệt đới (Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái lan, Myanma, Indonesia, Malaysia, Philippin, Papua New Guinea, Ấn Độ, Sri Lanka) [22], [40]

1.3.1.2 Loài Desmodium triflorum (L.) DC

• Tên Việt Nam: Hàn the ba hoa hay thóc lép ba hoa, tràng quả ba hoa [7], [10], [11]

• Đặc điểm:

Cây thảo cứng có gốc hoá gỗ Thân phân cành nhiều, cành non mảnh, dạng sợi, có lông trắng Lá có 3 lá chét, nhỏ; phiến lá chét hình xoan ngược, gốc tù, lúc non có lông trắng; lá kèm hình trái xoan nhọn, có nhiều vằn Hoa xếp 2 - 3 cái ở nách, không cuống, lá bắc dạng lá kèm, cuống dài 5 - 7mm, đài không lông, tràng hoa màu xanh lơ hay tím, cao 6 - 7mm Quả hơi cong hình cung dài 1,5cm, rộng 2 - 3mm, chia 3 - 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt, hơi có lông [4], [7], [10], [11], [22]

Ra hoa kết quả quanh năm, thường thấy vào mùa hè, thu [4]

• Phân bố:

Loài liên nhiệt đới, thường gặp ở sân cỏ, dọc đường đi, vùng đồng bằng khắp nước ta [11] Cây mọc ở khu đất trống, lề đường, bờ sông, đất cát; phân bố ở Trung quốc, Campuchia, Ấn Độ, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, SriLanka, Thái Lan,

Việt Nam, vùng nhiệt đới của châu Phi, châu Mỹ, Tây Nam Á, Úc, đảo Thái Bình Dương [22], [40]

1.3.2 Thành phần hóa học

1.3.2.1 Thành phần hóa học của D heterophyllum (Willd.) DC

Từ loài D heterophyllum (Willd.) DC thu hái ở Thái Nguyên đã xác định

được sự có mặt của các nhóm chất: đường khử, alcaloid, steroid, flavonoid, polyphenol, coumarin và saponin Cũng từ mẫu này, sau khi chiết xuất dược liệu bằng ethanol rồi chiết xuất phân đoạn với các dung môi có độ phân cực khác nhau n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol, bằng phương pháp sắc ký cột với chất nhồi cột silicagel đã phân lập được 4 chất tinh khiết là: Stigmast-5,22-dien-24R-3β-

ol (1); 3-O- β-D-glucopyranozylstigmasterol (2); β-sitosterol-3-β-D-glucopyranosid (3) và 8-C-β-D-glucopyranozylapigenin (vitexin) (4) [9] (Hình 1.2)

Một số nghiên cứu về D triflorum (L.) DC đã công bố loài này có chứa các

nhóm alcaloid, flavonoid, steroid và tinhdầu [24], [41] Cụ thể một số chất đã phân lập từ loài này như:

+ Các hợp chất flavonoid: apigenin (5), 2-O-glucosylvitexin (6), xylosylvitexin (7), vitexin (4), isovitexin (8) [41] (Hình 1.3)

2-O-β-D-+ Các hợp chất alcaloid: N,N-dimethyltryptophanmethyl ester (9), bufotenin N-oxyd (10), hypaphorin methyl ester (11), indol-3-acetic acid (12), stachydrin (13), tyramin (14), hordenin (15), 3,4-dihydroxyphenethyltrimethyl ammonium hydroxyd (16), trigonellin (17) [41] (Hình 1.3)

HO

N+OHHO

+ Các hợp chất steroid: 24-ethylcholesta-5,22-dien-3β-ol; 5-en-3β-ol; 24-ethylcholesta-5-en-3β-ol, fucosterol [41]

24-methylcholesta-+ Tinhdầu: pinitol [41]

1.3.3 Tác dụng và công dụng

1.3.3.1 Tác dụng và công dụng của D heterophyllum (Willd.) DC

Theo sách đông y (Y học Cổ truyền Tuệ Tĩnh), lá Hàn the có vị hơi chua chát, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt hạ sốt, tiêu sưng, tiêu viêm, cầm máu Rễ làm thông hơi, bổ, lợi tiểu Lá lợi sữa [4]

Cây Hàn the thường dùng chữa các chứng lậu ra máu, đái buốt, bí tiểu tiện

do cơ thể bị nhiệt quá, dùng giải nhiệt, chữa sốt và ho khò khè, đau dạ dày, viêm loét hành tá tràng Còn dùng chữa kiết lỵ và băng huyết sau khi đẻ Ngày dùng 8 - 16g sắc uống hoặc hãm uống Thường phối hợp với các vị thuốc khác [4], [11] Dùng ngoài, giã nát đắp bó gãy xương, chữa vết thương lở loét, rò, mụn mủ [4]

1.3.3.2 Tác dụng và công dụng của D.triflorum (L.) DC

Theo y học cổ truyền: Hàn the ba hoavị đắng, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt lợi thấp, điều kinh chỉ thống Lá lợi sữa, cầm ỉa chảy và lỵ, tiêu viêm.Ta thường dùng làm thuốc chữa cảm nắng, bụng to, da vàng [4]

Ở Campuchia, phần thân mang lá dùng phối hợp với các vị khác sắc nước cho phụ nữ sinh đẻ uống để tăng lực [4]

Ở Ấn Độ, lá được dùng trị ỉa chảy, lỵ và co giật Lá tươi giã đắp vết thương

và apxe [4]

Ở Trung Quốc, cây được dùng chữa sưng vú, phát sốt phát rét, ăn uống không tiêu, rắn cắn; hoàng đản, kiết lỵ, viêm ruột, kinh nguyệt không đều, đau bụng kinh [4]

Dịch chiết methanol của loài D triflorum (L.) DC còn có tác dụng giảm đau, chống viêm [29] D triflorum (L.) DC còn được chứng minh có tác dụng chống

oxy hóa [30] và độc tính của loài này đã được thử nghiệm trên chuột [41]

1.3.4 Các bài thuốc

Trong dân gian có một số bài thuốc sử dụng dược liệu Hàn the [1], [10], [13]

Tuy nhiên do hai loài D heterophyllum (Willd.) DC và D.triflorum (L.) DC khá

giống nhau về đặc điểm hình thái nên thực tế người dân thường sử dụng lẫn và gọi tên chung hai loài này là Hàn the Một số bài thuốc dân gian có sử dụng Hàn the để điều trị các chứng bệnh như:

+ Sốt, viêm đường tiết niệu: Hàn the 40g, Lá tre 40g, thân cây Sậy 40g Nấu sắc uống

+ Phù thiểu niệu do suy tim, suy thận: Hàn the 30g, lá Mã đề 30g, Cam thảo đất 30g Nấu sắc uống

+ Chữa kiết lỵ ra máu nhiều: Hàn the (tươi hoặc khô), Cỏ seo gà, Rau má, Cỏ sữa; mỗi thứ 20g, sắc 3 bát nước còn 1 bát uống 1 lần; ngày sắc uống 4 - 5 lần

+ Chữa bí tiểu tiện, tiểu tiện ra máu: Hàn the 30g, Mộc tặc 30g, hai vị để tươi,thái nhỏ sao vàng cho thơm, sắc với 400ml nước còn 100ml, uống làm 2 lần trong ngày + Chữa đái buốt, đái rắt: cả cây Hàn the 30g, Củ gai 30g, giã nhỏ chế lấy nước, vắt lấy nước cốt, uống trong ngày Hoặc dùng hai thứ bằng nhau, mỗi vị một nắm sắc uống

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Mẫu dược liệu gồm toàn bộ cây mang lá, hoa, quả của hai loài nghiên cứu

được thu hái ở Hải Dương vào tháng 9 và tháng 11năm 2012

Dược liệu sau khi làm sạch, được sấy khô ở nhiệt độ dưới 60°C, tán nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo

Mẫu dược liệu được DS Nghiêm Đức Trọng - Bộ môn Thực vật - Trường

Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium triflorum (L.) DC., họ Đậu (Fabaceae)

2.1.2 Hóa chất, dung môi

- Dung môi: ethanol, chloroform, ethylacetat, n-hexan, nước

- Hóa chất: Natri clorid (NaCl), kali clorid (KCl), dinatri hydrophosphat (Na2HPO4), amoni sulfat ((NH4)2SO4), amoni clorid (NH4Cl), magie clorid (MgCl2), natri citrat (Na3C6H5O7), calci clorid (CaCl2), acid oxalic dihydrat (H2C2O4.2H2O), cloramin B, cloralhydrat, acid acetic, đỏ carmin, xanh methylen, glycerin

- Các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị dùng cho nghiên cứu tác dụng dược lý: Máy cất nước 2 lần Hmillton, Hoa kỳ; máy lọc nước RO Arium 611 Sartorius, Đức; thiết bị khuấy từ Heidolph, Đức; máy điều chỉnh pH Euteck instruments pH 510, Singapore; bản nhọn 96 giếng; máy lắc Vortex Genius 3 IKA, Đức; máy đọc khay vi tinh thể Biotek, Mỹ; máy ủ lắc Star- Fax - 2200 Awareness Technology, Mỹ kết nối máy tính Sunpac của Phúc Anh, Việt Nam; tủ ấm Memmert, Đức; kính hiển vi Olympus CKX41 kết nối với máy ảnh Canon, Nhật; pipet 1 đầu côn loại 10-100µl và loại 100-1000µl; pipet 8 đầu côn loại 10-100µ và loại 10-300µl; máy cất quay Rotavapor R-200, máy ly tâm Harmonic Series, máy đo độ ẩm Sartorius, pipet Pasteur, pipet chính xác, bình nón, bình gạn…

- Thiết bị dùng cho nghiên cứu đặc điểm vi học: Phiến kính, lamen, dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, kính hiển vi có gắn máy ảnh, trắc vi vật kính và trắc vi thị kính

- Một số thiết bị khác: cân phân tíchPrecisa, cân kỹ thuật Sartorius, tủ sấy…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

Nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm bột và vi phẫu của lá, thân hai loài

Desmodium heterophyllum ( Willd.) DC và Desmodium triflorum (L.) DC

2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium triflorum (L.) DC trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro

- Chuẩn bị dịch chiết toàn phần bao gồm: dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 70%

- Từ dịch chiết ethanol 70%, chiết xuất các phân đoạn n-hexan, chloroform, ethyl acetat và phần nước còn lại sau khi lắc với các dung môi hữu cơ này

- Đánh giá ảnh hưởng của các dịch chiết và phân đoạn dịch chiết lên sự hình

thành tinh thể calci oxalat trên mô hình tạo tinh thể calci oxalat in vitro ở bản nhựa

96 giếng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xử lý và bảo quản mẫu

Mẫu dược liệu là dược liệu tươi và dược liệu đã qua phơi khô sau khi thu hái Dược liệu được bảo quản cụ thể như sau:

- Mẫu dược liệu cắt vi phẫu dùng mẫu tươi hoặc khô bảo quản trong dung dịch ethanol 50%

- Mẫu dược liệu dùng soi bột được sấy khô, nghiền thành bột mịn, bảo quản trong lọ có nút kín,ghi nhãn để nơi khô ráo

- Mẫu dược liệu dùng để nghiên cứu tác dụng dược lý được thái nhỏ, sấy khô

ở nhiệt độ < 60°C, bảo quản nơi khô ráo

2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

2.3.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa; chụp ảnh; thu hái; làm tiêu bản dược liệu

2.3.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu

Tiến hành làm tiêu bản vi phẫu như sau:

- Chọn phần mẫu thích hợp

- Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay

- Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch cloramin B, rửa sạch bằng nước, tẩy tiếp bằng cloralhydrat 75%, rửa lại bằng nước, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước đến hết acid Sau đó tiến hành nhuộm kép với đỏ carmin và xanh methylen

- Quan sát, mô tả và chụp ảnh: lên tiêu bản bằng dung dịch glycerin rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn máy ảnh

2.3.2.3 Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu

- Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị

- Lên tiêu bản bột dược liệu bằng nước cất, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên kính hiển vi có gắn máy ảnh Sử dụng trắc vi vật kính và trắc vi thị kính để đo một số đặc điểm bột dược liệu Ảnh các đặc điểm được chuyển vào máy tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh

2.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch

chiết của hai loài Desmodium heterophyllum (Willd.) DC và Desmodium

triflorum (L.) DC trên hình thành tinh thể calci oxalat in vitro

- Ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của 2 loài Desmodium Desv được đánh giá trên mô hình tạo tinh thể calci oxalat in vitro trên bản nhựa 96 giếng theo mô tả bởi

Gohel MD và Wong SP [23]

- Nguyên tắc của mô hình là tạo tinh thể calci oxalat in vitro trong môi

trường nước tiểu nhân tạo, theo dõi sự hình thành tinh thể và khả năng ức chế hình thành tinh thể của dược liệu thông qua việc xác định mật độ quang ở bước sóng

620nm (OD620nm), quan sát và chụp ảnh tinh thể calci oxalat tạo thành trong các giếng dưới kính hiển vi soi nổi

2.3.3.1 Chuẩn bị dịch chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết

- Dịch chiết nước:

Dịch chiết nước thu được bằng phương pháp sắc (5gam dược liệu trong 50ml nước cất, sắc 3 lần, mỗi lần 30 phút) Dịch chiết nước sau đó được cô đặc đến dạng cao lỏng 1:1 (1ml tương ứng với 1gam dược liệu khô) Để thử tác dụng dược lý, cao lỏng được pha loãng với nước thành các dung dịch có độ pha loãng 1/2; 1/4; 1/8; 1/16

- Chiết xuất các phân đoạn:

Các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% được chiết xuất bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, chloroform, ethyl acetat Bay hơi dung môi thu được các cắn phân đoạn Phần nước còn lại sau khi lắc với dung môi hữu cơ cũng được cô đặc đến cắn Cắn được cân và pha với dung môi thích hợp tạo thành các dung dịch có nồng độ 10µg/ml, 100µg/ml, 1000µg/ml

Quy trình chiết xuất phân đoạn được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% của hai

loài D heterophyllum (Willd.) DC và D triflorum (L.) DC

+ EtOH 70% (chiết hồi lưu 3lần/2 giờ), lọc

+ Cất thu hồi dung môi dưới

áp lực giảm rồi cô đặc

2.3.3.2 Chuẩn bị nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic và dung dịch chứng dương natri citrat

• Chuẩn bị dung dịch nước tiểu nhân tạo:

Dung dịch nước tiểu nhân tạo được pha theo công thức của Kavanagh và cộng sự (1990) [27] và có điều chỉnh để phù hợp với mô hình trên bản nhựa 96 giếng như sau:

Bảng 2.1.Thành phần nước tiểu nhân tạo theo Kavanagh và cộng sự [27]

• Chuẩn bị dung dịch acid oxalic:

Pha dung dịch acid oxalic dihydrat 0,04N, để ổn định ở 37°C

• Chuẩn bị dung dich chứng dương natri citrat (ký hiệu CD):

Pha dung dịch Natri citrat dihydrat nồng độ 150mM, để ổn định ở 37°C

2.3.3.3 Bố trí thí nghiệm và đánh giá kết quả

a Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 70% trên sự hình

thành tinh thể calci oxalat in vitro của hai loài nghiên cứu

Để đánh giá ảnh hưởng trên sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro của

dịch chiết nước và dịch chiết ethanol 70% với các độ pha loãng 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 thí nghiệm được tiến hành trên 12 lô, mỗi lô 8 giếng của bản nhựa 96 giếng Thành phần cho vào mỗi giếng của từng lô như sau:

+ 1 lô trắng tinh thể: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl nước + 20μl dung dịch acid oxalic

+ 1 lô chứng dương: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl dung dịch natri citrat + 20μl dung dịch acid oxalic

+ 5 lô trắng mẫu thử: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl nước + 20μl dung dịch mẫu thử

+ 5 lô thử: 160μl nước tiểu nhân tạo + 20μl dung dịch mẫu thử + 20µl dung dịch acid oxalic

b Đánh giá ảnh hưởng của cắn phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% trên sự hình

thành tinh thể calci oxalat in vitro

+ Khảo sát ảnh hưởng của dung môi ethanol trên sự hình thành tinh thể calci

oxalat in vitro

Để đánh giá ảnh hưởng của các cắn phân đoạn trên sự hình thành tinh thể

calci oxalat in vitro, ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol sử dụng để hòa tan

cắn đến sự hình thành tinh thể cần được khảo sát để lựa chọn nồng độ phù hợp

Thí nghiệm được bố trí đánh giá ảnh hưởng của dung môi ethanol ở các nồng

độ 80%, 50%, 20%, 10% và 5% (thể tích/thể tích) trước khi cho vào giếng song song với mẫu trắng tạo tinh thể trong môi trường nước Cách tiến hành như phần a

+ Đánh giá ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết

Thí nghiệm bố trí tương tự phần a với 8 lô, mẫu thử là cắn các phân đoạn từ dịch chiết ethanol 70% được hòa tan trong ethanol ở nồng độ thích hợp để thu được các dung dịch có nồng độ 10µg/ml, 100µg/ml, 1000µg/ml Với lô trắng tinh thể, 20µl nước được thay thế bằng 20µl dung dịch ethanol có cùng nồng độ với ethanol