Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của vi khuẩn

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC ÁNH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGỌC ÁNH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô

giáo, TS Đàm Thanh Xuân và DS Lê Ngọc Khánh, những người thầy đã

tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong thời gian làm khóa luận

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy

cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên

Nguyễn Ngọc Ánh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2

1.1.1 Phân loại khoa học 2

1.1.2 Nguồn gốc 2

1.1.3 Đặc điểm hình thái 2

1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng 3

1.1.5 Đặc điểm sinh lý 3

1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto 3

1.2 Natto và Nattokinase 4

1.2.1 Natto 4

1.2.2 Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase 5

1.2.3 Nattokinase 6

1.3 Quá trình lên men sản xuất enzym 10

1.3.1 Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật 10

1.3.2 Thu nhận chế phẩm enzym 11

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym 11

1.4 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym Nattokinase của vi khuẩn 12

1.4.1 Ngoài nước 13

1.4.2 Trong nước 13

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị sử dụng 14

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng 14

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng: 14

2.1.3 Các môi trường sử dụng: 14

2.1.4 Thiết bị 15

2.1.5 Dụng cụ 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Phân lập vi khuẩn B subtilis natto từ sản phẩm Natto và xác định enzym do Bacillus subtilis natto tạo ra .16

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của B subtilis natto 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 16

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ sản phẩm Natto 16

2.3.2 Phương pháp nhuộm Ogiestka 17

2.3.3 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 17

2.3.4 Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng 17

2.3.5 Phương pháp lên men chìm vi khuẩn 18

2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh enzym 18

2.3.7 Phương pháp xác định sự có mặt của enzym trong sản phẩm Natto 19

2.3.8 Phương pháp xác định enzym trong dịch trong và trong sinh khối của dịch lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto 19

2.3.9 Phương pháp thử hoạt tính protease: 19

2.3.10 Phương pháp thử hoạt tính amylase 20

2.3.11 Phương pháp thử hoạt tính cellulase: 20

2.3.12 Phương pháp thử hoạt tính fibrinolytic (tiêu fibrin) 21

CHƯƠNG BA: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Phân lập vi khuẩn B subtilis natto từ chế phẩm Natto và xác định enzym do vi khuẩn sinh ra 22

3.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ chế phẩm Natto 22

3.1.2 Xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra 23

3.1.3 Xác định enzym trong sản phẩm Natto 25

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của vi khuẩn B subtilis natto 26

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon 26

3.2.2 Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất 30

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng 32

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ 34

3.2.5 Xây dựng môi trường tổng hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh protease 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần chính trong 100g Natto 4 Bảng 2.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase 9 Bảng 2.1 Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng 15 Bảng 3.1 Kết quả định tính enzym trong dịch ly tâm và trong sinh

khối

24

Bảng 3.2 Hoạt tính enzym thể hiện bằng đường kính vòng phân

giải cơ chất của dịch enzym chiết từ phần hạt đậu và phần dịch

nhớt của Natto

25

Bảng 3.3 Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong

môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn

hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải

casein

27

Bảng 3.4 Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi

nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung

các nguồn hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính

vòng phân giải cơ chất

27

Bảng 3.5 Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi

cấy trong môi trường có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác

nhau

29

Bảng 3.6 Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong 30

môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các

nồng độ khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải

casein

Bảng 3.7 Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi

nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ

khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất

31

Bảng 3.8 Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong

môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung đậu tương và

casein thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất

32

Bảng 3.9 Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong

môi trường MT2 và MT2 có bổ sung một số muối vô cơ, thể hiện

bằng đường kính vòng phân giải cơ chất

34

Bảng 3.10 Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong

môi trường MT2 và môi trường tổng hợp, thể hiện bằng đường

kính vòng phân giải cơ chất

36

Bảng 3.11 Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi

nuôi cấy trong môi trường canh thang và môi trường tổng hợp

37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2 Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase 7 Hình 1.3 Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase 8 Hình 3.1 Ảnh khuẩn lạc phân lập được và hình ảnh tế bào vi

khuẩn khi soi trên kính hiển vi độ phóng đại 1.000 lần

22

Hình 3.2 Kết quả thử hoạt tính protease, amylase, cellulase

trong dịch ly tâm và dịch chiết từ sinh khối

24

Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon

đến hoạt tính enzym của vi khuẩn

28

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh khả năng sinh enzym của Bacillus

subtilis natto khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường

tổng hợp

37

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 B subtilis natto Bacillus subtilis natto

2 E coli Escherichia coli

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới Các loại thuốc đang dùng hiện nay như urokinase, streptokinase, được sử dụng chủ yếu trong cấp cứu tai biến và có nhiều tác dụng phụ Nattokinase là enzym

có nguồn gốc từ Natto, một món ăn truyền thống của Nhật Bản

Nattokinase là một enzym protease do vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh ra,

được sử dụng để phòng và phá các cục máu đông do có tác dụng tiêu fibrin mạnh,

an toàn khi sử dụng

Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn Bacillus subtilis natto còn có khả

năng sinh nhiều enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase Việc thay đổi môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzym của vi khuẩn Vì thế, lựa chọn một môi trường tốt nhất cho enzym sinh lượng lớn protease và giảm bớt các enzym khác đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết protease, sau đó là Nattokinase

Do đó, khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả

năng sinh enzym của vi khuẩn Bacillus subtilis natto” được thực hiện với hai mục

tiêu:

1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ sản phẩm Natto trên thị trường và

xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra

2 Bước đầu lựa chọn môi trường nuôi cấy cho Bacillus subtilis natto sản xuất

protease tiêu fibrin

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto

B subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis var natto) là một chủng thuộc

loài Bacillus subtilis, được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên

vào năm 1905 [ 21]

1.1.1 Phân loại khoa học

B subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc:

Họ (Family): Bacillaceae

Chi (Genus): Bacillus

Loài (Species): Bacillus subtilis

Phân loài (Subspecies): Bacillus subtilis natto [32]

1.1.2 Nguồn gốc

B subtilis natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn truyền

thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật B subtilis natto có nhiều trong

rơm rạ, cỏ khô và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương; vi khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua [13], [22]

1.1.3 Đặc điểm hình thái

Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto [27], [30]

B subtilis natto là trực khuẩn hiếu khí, bắt màu Gram dương, nội bào tử hình que

có kích thước dưới 1μm Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành

chuỗi Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn và hình dạng bất định Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [20],[ 22]

1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng

B subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn

hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose , đường đôi như maltose, lactose, saccharose , polysaccharid như tinh bột Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển

của vi khuẩn là protein và aminoacid B subtilis natto có thể sử dụng dễ dàng acid

glutamic, arginine, acid aspartic nhưng không sử dụng được threonine, trypophan, phenylalanine và methionine [13],[22]

B subtilis natto cần biotin cho sự phát triển, trong môi trường không có biotin

các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển và bào tử của chúng không nảy mầm được Nồng độ biotin tối thiểu cần thiết cho sự nảy mầm của bào tử là 0,1% [13], [22]

1.1.5 Đặc điểm sinh lý

B subtilis natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể

phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3% B subtilis natto phát triển trong khoảng nhiệt

độ rộng Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 30- 50ºC, nhiệt độ tối ưu là

37°C Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40°C Bào tử B subtilis natto

vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0°C Ở 55°C, vi khuẩn ngừng phát triển và

sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra B subtilis natto phát triển ở pH trung tính hoặc

hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2- 7,6 Sự nảy chồi và phát triển

bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [ 13], [22]

1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto

Các sản phẩm trao đổi chất của B subtilis natto rất đa dạng, nhưng quan trọng

nhất là hệ enzym Vi khuẩn này sản xuất một lượng lớn các enzym được ứng dụng nhiều trong công nghiệp như: protease, amylase, phytase [22], trong đó có Nattokinase, một protease ngoại bào là có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi

1.2 Natto và Nattokinase

1.2.1 Natto

Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, là những hạt đậu nành đã luộc

chín và lên men với vi khuẩn B subtilis natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng 14-18 giờ [13],[19] Natto chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe trong đó enzym Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men Natto được xem là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tim mạch [19]

Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được hai loại vi khuẩn

từ Natto gồm vi khuẩn B subtilis natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn Bacillus mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt đặc

trưng và vị ngọt [21] Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình

qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B subtilis

natto Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh

dưỡng của nó Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi

khuẩn B subtilis natto [21]

Năm 1986, tiến sĩ Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng của Natto sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh, xác định Natto có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại thực phẩm Ông đã xác định enzym Nattokinase, một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men Natto có vai trò phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu, mạnh gấp 4 lần enzym nội sinh làm tan máu đông là plasmin [21, [23]

Tại hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/4-3/5/2006) giáo sư Masafumi Kitakaze đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt các chứng mỡ máu cao (triglyceride và cholesterol) Ông kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ Natto trước nguy cơ béo phì do “thừa” dinh dưỡng và các chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày càng tăng khắp nơi trên thế giới [31]

1.2.2 Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase

Trước khi Nattokinase được nghiên cứu rộng rãi, có nhiều enzym đã được ứng dụng trong trị liệu về huyết khối như Streptokinase, Urokinase, Alteplase Cơ chế chung của các enzym này là: hoạt hóa plasminogen thành plasmin có tác dụng phân giải fibrin, fibrinogen cùng các yếu tố của quá trình đông máu (yếu tố V, VIII, XIIIa), đồng thời các sản phẩm giáng hóa của fibrin và fibrinogen cũng có tác dụng kháng thrombin, ức chế kết tập tiểu cầu để ngăn quá trình đông máu Vì thế plasmin

có tác dụng làm tan huyết khối, giúp tái lập lại sự tưới máu cho các mô [1], [2] Căn

cứ vào tính chọn lọc trên fibrin mà người ta chia các enzyme tiêu huyết khối thành hai nhóm:

a Enzym tiêu huyết khối không tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những thuốc tác

động đến cả plasminogen gắn hoặc không gắn với fibrin vì thế gây tác dụng không mong muốn là chảy máu toàn thân Một số enzym điển hình của nhóm này như:

- Streptokinase (SK): chiết xuất từ môi trường nuôi cấy các chủng Streptococcus

haemolyticus tan huyết β nhóm C Streptokinase là protein lạ nên khi vào cơ thể sẽ

kích thích cơ thể sinh kháng thể làm mất hoạt tính và gây dị ứng

-Urokinase (UK): chiết xuất từ nước tiểu người, từ môi trường nuôi cấy tế bào thận bào thai, hoặc có thể sản xuất bằng công nghệ gen

-Anistreplase (APSAC): là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công nghệ sinh học [1], [2]

b Enzym tiêu huyết khối tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những enzym hoạt hóa

plasminogen gắn trên fibrin nên có ưu điểm là ít gây chảy máu toàn thân, hiệu lực tiêu fibrin mạnh hơn và không gây dị ứng khi sử dụng Tuy nhiên, do sản xuất bằng công nghệ cao nên giá thành của chúng khá đắt Một số enzym điển hình của nhóm này như:

- Alteplase (t-PA): có nguồn gốc từ các tế bào nội mạc của thành mạch, được tiết

ra trong hầu hết dịch ngoại bào của cơ thể như huyết tương, nước tiểu, nước bọt, nước mắt Alteplase trong lâm sàng được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN

từ tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc và gọi là rt- PA

- Pro-urokinase: là tiền chất của Urokinase, có trong nước tiểu Pro-urokinase

được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp từ vi khuẩn E Coli

Mặc dù một số enzym đề cập ở trên được sử dụng rộng rãi trong điều trị huyết khối hiện nay, chúng vẫn có nhược điểm, chẳng hạn như chi phí cao, thời gian bán thải ngắn, nguy cơ chảy máu toàn thân, riêng Streptokinase còn gây phản ứng dị ứng [9] Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong tảo, nấm và thực phẩm lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối an toàn và giá rẻ [9]

1.2.3 Nattokinase

a Nguồn gốc

Nattokinase (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật Bản có tên là Natto [23]

Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP, enzyme trong Natto [32]

b Đặc điểm cấu tạo

Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid đơn gồm 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfid trong phân tử Trọng lượng phân tử là 27,728 Da và pI= 8,6 ± 0,3 [12] Là enzym thuộc họ subtilisin của protease serin, Nattokinase cũng có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và nhóm carboxyl của Asp-32 Cơ chất đặc hiệu của Nattokinase là: Suc-Ala-Ala- Pro-Phe-pNA [12]

Hình 1.2 Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase [32]

c Tính chất

Nattokinase bền vững ở pH từ 6,0 – 10,0, bất hoạt ở pH nhỏ hơn 5 và pH lớn hơn

11, hoạt tính tối ưu ở pH =8- 9 Nattokinase bền vững ở nhiệt độ dưới 40°C, bị giảm hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50°C và bị phân hủy ở 70°C [12], [13] Hoạt tính của Nattokinase bị ức chế 1 phần bởi HgCl2, H2O2 và bị ức chế hoàn toàn bởi phenylmethylsulfonyl fluorides (PMSF), ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA), các ion Fe3+ và Al3+ cũng ức chế enzym này [9], [13], [25] Hoạt tính của Nattokinase tăng lên khi có mặt MgSO4, CaCl2, MnCl2 [ 9]

d Cơ chế tiêu fibrin

Nattokinase phân huỷ fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác nhau:

Hình 1.3 Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase [19]

A Nattokinase trực tiếp giáng hoá fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hoá có trọng lượng phân tử thấp, hoà tan Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin

B Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá Pro-urokinase thành Urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm tăng plasmin nội sinh là enzyme phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể

C Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá quá trình tổng hợp t-

PA (Alteplase) trong huyết tương Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin

Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từ fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể Vì vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu bình thường [19]

e Công dụng

Nattokinase có tác dụng phòng và phá các cục máu đông do có khả năng tiêu fibrin một cách hữu hiệu (cao gấp 4 lần plasmin), đồng thời rất an toàn cho cơ thể

khi hấp thụ qua đường uống [23] Nattokinase có thể hòa tan cục máu đông khi

uống 100mg/ ngày và tác dụng của nó kéo dài 8- 12 giờ Do ưu điểm an toàn, hiệu lực cao, giá rẻ hơn rất nhiều so với các thuốc tan huyết khối thông thường,

Nattokinase có tiềm năng lớn trong trị liệu huyết khối [21],[28] Ngoài ra, Nattokinase còn có tác dụng tốt trong các bệnh tim mạch như làm giảm huyết áp, giảm lipid máu, ngăn xơ vữa động mạch [ 28]

f Nattokinase dùng trong thực phẩm chức năng và thuốc

Nattokinase lần đầu tiên được phân lập và bán trên thị trường dưới tên NSK-SD vào năm 1998 bởi Phòng thí nghiệm sinh học Nhật Bản, đã loại bỏ vitamin K2 Nattokinase đôi khi được sử dụng trong y học như là một tác nhân làm giảm cục máu đông, thay thế cho điều trị bằng aspirin hàng ngày Tuy nhiên, sự thay thế này không được khuyến cáo [28]

Hiện nay, có rất nhiều các sản phẩm chứa Nattokinase được sản xuất dưới dạng thực phẩm chức năng với mục đích hỗ trợ phòng ngừa và điều trị các bệnh lý về tim mạch [28]

Bảng 2.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase [28], [29]

Sản phẩm Hàm lượng

Nattokinase (FU)

Dạng bào chế

Nhà sản xuất

Hàn Quốc Nattokinase

plus

3.000 Viên nang Food Science of Vermont dba Da

Vinci Laboratories, Mỹ Nattokinase

plus Fucoidan

1.3 Quá trình lên men sản xuất enzym

1.3.1 Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật

a Phương pháp lên men bề mặt

Đây là phương pháp chủ yếu sử dụng cơ chất là các loại cám và bột: cám mì, cám gạo, bột đậu, bột ngô được hấp chín và làm ẩm sau đó trộn thêm trấu và mùn cưa để tăng độ xốp Vi sinh vật được nuôi ở nhiệt độ khoảng 28- 30°C, độ ẩm 55-65%, trong thời gian nuôi từ 36- 48 giờ

Ưu điểm của phương pháp lên men bề mặt là :

- Nồng độ enzym cao hơn lên men chìm

- Dễ sấy khô và ít hao tổn hoạt tính enzym

- Chế phẩm thô dễ vận chuyển

- Thiết bị đơn giản, tốn ít năng lượng

- Có thể xử lý cục bộ khi bị nhiễm

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm đó là khó kiểm soát chính xác

độ ẩm, sinh khối, lượng O2, CO2 nên chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều, tốc độ sản xuất sản phẩm thấp hơn lên men chìm, khó cơ giới hóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi lớn [4], [5] Hiện nay, phương pháp lên men bề mặt ít được sử dụng trong sản xuất kháng sinh và các chế phẩm sinh học nhưng vẫn được

sử dụng trong lên men sản xuất enzym [4]

b Phương pháp lên men chìm

Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất là tinh bột, nitơ, chất khoáng Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy

Ưu điểm của phương pháp lên men chìm là:

- Dễ kiểm soát quá trình do đó có thể sản xuất công nghiệp, cơ giới hóa, tự động hóa

- Năng suất cao và chất lượng đồng đều

- Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh enzym cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy

- Enzym thu được tinh khiết hơn lên men bề mặt, đảm báo vệ sinh, vô trùng Tuy nhiên do nồng độ enzym thu được thấp nên enzym thu được sau khi tách và thu hồi sẽ có giá thành cao, nếu không đảm bảo vô trùng ở tất cả các bước thì sẽ bị nhiễm hàng loạt, gây hao phí lớn [4], [5]

1.3.2 Thu nhận chế phẩm enzym

Enzym thương phẩm được sản xuất dưới hai dạng: dạng bột khô và dạng lỏng, có thể là dạng thô hoặc dạng tinh khiết Đối với lên men bề mặt có thể đồng hóa nếu cần, sau đó dùng dung dịch đệm hay nước cất để chiết rút enzym ta có dịch chiết enzym Đối với lên men chìm chỉ cần lọc bỏ sinh khối là có dịch chiết như trên sau

đó có thể dùng tác nhân kết tủa thuận nghịch như aceton, ethanol, muối trung tính

để có chế phẩm enzym ở dạng sạch hơn Từ chế phẩm sạch này, bằng kỹ thuật điện

di, lọc gel ta có thể tách từng phần để có enzym tinh khiết hơn [4], [5]

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym

a Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và tổng hợp enzym của vi sinh vật Cùng một loại vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trên các môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau thì mức độ tạo thành enzym và thành

phần enzym được tạo thành cũng khác nhau

Ví dụ: nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường cám đại mạch thì thì có thể

tạo được nhiều enzym, trong đó có các loại enzym hoạt tính cao như amylase, protease, maltase, pectinase nhưng nếu nuôi cấy trên môi trường Czapek cải tiến với nitrat và tinh bột thì chỉ tạo thành chủ yếu là α – amylase, còn các enzym khác tạo thành với lượng không đáng kể

Hiện tượng này chỉ thấy ở vi sinh vật chứ không thấy ở động và thực vật Khi trong môi trường có những chất khó đồng hóa, vi sinh vật phải tiết vào môi trường những enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được Vì

vậy khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật có thể tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường Trong công nghệ sản xuất enzym cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong môi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất [4], [5]

b Ảnh hưởng của pH của môi trường

pH môi trường biến đổi khá rõ rệt trong quá trình nuôi cấy và gây ảnh hưởng lớn đến sự tổng hợp enzym Do đó người ta thường điều chỉnh pH để thu được enzym với hiệu suất cao nhất Mỗi loại enzym thường được tổng hợp mạnh trong một vùng

pH xác định đối với từng loại vi sinh vật Ví dụ: amylase và pectinase của nấm mốc được tổng hợp mạnh trong môi trường có pH= 4,5 - 5,0 còn protease thì pH=6 - 6,5 [4], [6]

c Ảnh hưởng của nhiệt độ

Phần lớn các vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzym đều thuộc loại ưa nhiệt trung bình, có nhiệt độ tối thích 22- 32oC, một số vi khuẩn thích hợp ở nhiệt độ cao hơn (35-55 oC) và chúng có khả năng tổng hợp các enzym có độ bền nhiệt cao Khi nâng nhiệt độ môi trường tới quá mức thích hợp thì khả năng sinh tổng hợp enzym

bị giảm rõ rệt [4], [6]

d Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời gian cho phép tích tụ enzym tối đa Thời gian đó phụ thuộc vào từng chủng vi sinh vật và ít phụ thuộc vào enzym chúng tổng hợp

Ngoài ra, tùy từng loại vi khuẩn mà ta lựa chọn điều kiện cấp khí và độ ẩm cho

ph ù hợp [4], [5]

1.4 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym Nattokinase của vi khuẩn

Cùng với sự quan tâm ngày càng nhiều đối với Nattokinase, những năm gần đây

có nhiều nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho vi khuẩn sản xuất lượng Nattokinase lớn nhất

1.4.1 Ngoài nước: Junguo Liu và cộng sự (2006) nghiên cứu tối ưu hóa các điều

kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis

natto NLSSE Khảo sát các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamat, casein, pepton từ đậu nành và khảo sát các nguồn carbon: glucose, sucrose, maltose, xylose và glycerol Kết quả nguồn carbon tốt nhất là maltose 2%, nguồn nitơ tốt nhất là pepton đậu nành, hoạt tính Nattokinase đạt 1.300 U/ml với thành phần môi trường tối ưu (g/l): pepton đậu nành: 8,28, CaCl2:0,64 và cao nấm men: 0,74 [18] Deepak và cộng sự (2008) nghiên cứu tối ưu hóa môi trường cho sinh tổng hợp

Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis Các nhân tố được chọn để khảo sát: glucose,

pepton, MgSO4, và CaCl2 ở 5 mức độ Hoạt tính đạt 3.194 U/ml với thành phần môi trường (%): glucose 1%, pepton 5,5%, MgSO4 0,2% và CaCl2 0,5% [10] Li Hui Rong (2011) xác định môi trường tối ưu cho sản xuất Nattokinase từ vi khuẩn

Bacillus subtilis natto gồm: MgSO4 0,02%, K2HPO4 0,02%, KH2PO4 0,01%, CaCl20,05%, maltose 3%, peptone từ đậu nành: 3% [16]

1.4.2 Trong nước

Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus

sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzyme làm tan huyết

khối (Nattokinase) từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Viện

Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực phẩm Natto; hoạt tính Nattokinase và protease của mẫu NP3 và 7.2 tương đương với một số thực phẩm chức năng hiện đang bán trên thị trường [7] Hoàng Thị Khánh Hồng (2012) đã nghiên cứu khả

năng biểu hiện và tiết Nattokinase nhờ ADN bộ gen Bacillus spp phân lập từ sản phẩm Natto [3] Hin Vireak (2012) xác định môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis

natto cho hoạt tính protease tốt nhất là canh thang bổ sung casein 0,5 % [8].

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị sử dụng

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng: Vi khuẩn B subtilis natto được phân lập từ sản phẩm

Natto của Nhật Bản

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng:

Bảng 2.1 Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng

2.1.5 Dụng cụ: bình nón (100ml, 250 ml), cốc có mỏ, ống nghiệm, pipet, đĩa petri,

que cấy, ống đong…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Phân lập vi khuẩn B subtilis natto từ sản phẩm Natto và xác định enzym

do Bacillus subtilis natto tạo ra

- Phân lập vi khuẩn B subtilis natto từ chế phẩm Natto

- Xác định enzym do B subtilis natto tạo ra khi lên men chìm trong môi trường

MT2

- Xác định enzym trong sản phẩm Natto

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của B subtilis natto

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon: glucose, saccharose, maltose,

lactose

- Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương (dạng bột và dạng hạt) và của chất cảm ứng

(casein)

- Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ: MgSO4, MnCl2, CaCl2

- Tạo môi trường tổng hợp và so sánh khả năng tạo enzym của Bacillus subtilis

natto khi nuôi cấy trong môi trường tổng hợp với trong môi trường ban đầu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ sản phẩm Natto [6]

Cân 10 g Natto cho vào bình nón 250ml có chứa 90ml nước cất vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1 Chuẩn bị 8 ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 8 Dùng micropipete hút 1ml từ bình nón chứa mẫu

có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng Tất cả các thao tác đều được tiến hành trong tủ cấy vô trùng Pha 100ml môi trường MT1 trong cốc có mỏ Đun môi trường trong lò vi sóng cho thạch tan hoàn toàn, hấp tiệt khuẩn ở 115ºC; 0,6 atm trong 20 phút Sau đó, chia đều môi trường vào khoảng 6 đĩa petri đã hấp tiệt trùng Dùng pipet hút 0,1ml từ mỗi nồng độ pha loãng 10-7, 10-8, 10-9 cho lên đĩa