ĐẶT VẤN ĐỀPhong thấp là một chứng bệnh mạn tính khá phổ biến ở Việt Nam. Điều trịbằng thuốc tân dược có tác dụng nhanh, mạnh nhưng có nhiều tác dụng phụ. Ngược lại, điều trị bằng thuốc cổ truyền không những có tác dụng tốt mà lại khắc phục những nhược điểm của tân dược. Tam diệu thang là một phương thuốc có hiệu lực mạnh trong y dược học cổ truyền trong điều trị chứng phong thấp nhiệt tí tương đương thể viêm khớp cấp tính, bệnh gout. Vấn đề được đặt ra là dùng dạng bào chếnào là thuận tiện và hợp lý. Dạng thuốc thang không thuận tiện cho bệnh nhân và không kiểm soát được tác dụng. Vậy để phát huy tính an toàn và hiệu quả của thuốc cổ truyền, có thể sử dụng lâu dài, giá cả phù hợp, việc nghiên cứu bào chế bài thuốc thành dạng bào chế hiện đại là cần thiết, trong đó dạng cao đặc như một bán thành phẩm trung gian để bào chế các dạng khác.Tiếp nối những nghiên cứu và kết quả của khoá luận tốt nghiệp dược sĩ 2012 và của đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường về phương thuốc Tam diệu thang gia giảm, đề tài “Nghiên cứu bào chế và xác định một số thành phần hoá học củacao đặc phương thuốc Tam diệu thang gia giảm” được tiếp tục thực hiện với mục tiêu: Bào chế cao đặc Tam diệu thang bằng phương pháp sắc và phương pháp chiết nóng với dung môi nước và ethanol. Định tính một số thành phần hóa học trong các mẫu cao bằng phương pháp hoá học và sắc kí lớp mỏng. Định lượng Berberin và Palmatin trong các mẫu cao bằng sắc kí lớp mỏng.
Trang 1BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TAM DIỆU THANG GIA GIẢM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013
Trang 2BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO ĐẶC PHƯƠNG THUỐC TAM DIỆU THANG GIA GIẢM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS Bùi Hồng Cường
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược học cổ truyền
Thời gian thực hiện: 1/2013– 5/2013
HÀ NỘI – 2013
Trang 3Người thầy – Ts Bùi Hồng Cường, Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học
Dược Hà Nội Người thầy đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khoá luận
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các chị kĩ thuật viên, cán bộ đang công tác tại bộ môn Dược học cổ truyền, đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khoá luận này
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập của mình
Trang 4ĐẶT VẤN ĐỀ … 1
Chương 1. TỔNG QUAN……… 2
1.1 Tóm lược về bệnh viêm khớp cấp tính ……… 2
1.2 Phương thuốc Tam diệu thang gia giảm……… 3
1.3 Thông tin cơ bản về các vị thuốc……… 5
1.3.1 Hoàng bá……… 5
1.3.2 Thương truật……… 7
1.3.3 Ngưu tất……… 8
1.3.4 Dây đau xương……… 9
1.3.5 Hương phụ……… 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU … 12
2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu……… 12
2.2 Nội dung nghiên cứu……… 13
2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 14
Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 16
3.1 Bào chế cao đặc……… 16
3.2 Định tính các thành phần hoá học……… 17
3.2.1.Định tính bằng phản ứng hoá học……… 17
3.2.2 Định tính bằng sắc kí lớp mỏng……… 19
3.3 Định lượng Berberin và Palmatin trong cao và vị thuốc………… 33
3.4 Bàn luận……… 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… …… 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 5Ber Berberin
dd Dung dịch
Trang 6Trang
Bảng 3.1 Hiệu suất bào chế và độ ẩm cao đặc……… 17
Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất ……… 18
Bảng 3.3 Khối lượng mẫu nghiên cứu chiết xuất alkaloid………… 20
Bảng 3.4 Thể tích dịch phun mẫu nghiên cứu……… 21
Bảng 3.5 Kết quả phân tích alkaloid bằng sắc kí lớp mỏng………… 24
Bảng 3.6 Thể tích dịch phun mẫu nghiên cứu……… 26
Bảng 3.7 Kết quả phân tích flavonoid bằng sắc kí lớp mỏng……… 28
Bảng 3.8 Kết quả phân tích saponin bằng sắc kí lớp mỏng………… 33
Bảng 3.9 Thể tích dịch phun mẫu nghiên cứu……… 35
Bảng 3.10 Hàm lượng Berberin và Palmatin trong các mẫu……… 37
Trang 7Trang
Hình 3.7 Sắc kí đồ định lượng alkaloid quan sát ở 254 nm và 366 nm… 36 Hình 3.8 Sắc kí đồ định lượng alkaloid hiện màu bằng TT Dragendorff… 37
Trang 8ĐẶT VẤN ĐỀ
Phong thấp là một chứng bệnh mạn tính khá phổ biến ở Việt Nam Điều trị bằng thuốc tân dược có tác dụng nhanh, mạnh nhưng có nhiều tác dụng phụ Ngược lại, điều trị bằng thuốc cổ truyền không những có tác dụng tốt mà lại khắc phục những nhược điểm của tân dược Tam diệu thang là một phương thuốc có hiệu lực mạnh trong y dược học cổ truyền trong điều trị chứng phong thấp nhiệt tí tương đương thể viêm khớp cấp tính, bệnh gout Vấn đề được đặt ra là dùng dạng bào chế nào là thuận tiện và hợp lý Dạng thuốc thang không thuận tiện cho bệnh nhân và không kiểm soát được tác dụng Vậy để phát huy tính an toàn và hiệu quả của thuốc
cổ truyền, có thể sử dụng lâu dài, giá cả phù hợp, việc nghiên cứu bào chế bài thuốc thành dạng bào chế hiện đại là cần thiết, trong đó dạng cao đặc như một bán thành phẩm trung gian để bào chế các dạng khác
Tiếp nối những nghiên cứu và kết quả của khoá luận tốt nghiệp dược sĩ 2012 và của đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường về phương thuốc Tam diệu thang gia
giảm, đề tài “Nghiên cứu bào chế và xác định một số thành phần hoá học của
cao đặc phương thuốc Tam diệu thang gia giảm” được tiếp tục thực hiện với mục
Trang 9Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tóm lược về bệnh viêm khớp cấp tính:
1.1.1 Quan điểm y học hiện đại về bệnh viêm khớp cấp tính:
Viêm khớp cấp tính là giai đoạn cấp của viêm khớp, gồm: viêm khớp do thấp và viêm khớp do vi khuẩn [3]
● Triệu chứng: bệnh nhân bị các chứng sưng, nóng, đỏ, đau các khớp Tuỳ từng chứng bệnh cụ thể mà viêm một hay nhiều khớp, có đối xứng hay không đối xứng
và có thêm các triệu chứng ngoài khớp khác [3]
● Nguyên nhân: với sự tham gia của nhiều yếu tố:
Yếu tố tác nhân gây bệnh: do virus, vi khuẩn (tụ cầu, liên cầu, xoắn khuẩn), ký sinh trùng, nấm [3], [21]
Yếu tố cơ địa: giới tính, tuổi ( 70- 80% là nữ, 60- 70% trên 30 tuổi) [21]
Yếu tố di truyền: yếu tố viêm khớp dạng thấp (yếu tố kháng nguyên kết hợp với
tổ chức HLA DR4) [21]
Yếu tố thuận lợi: người mệt mỏi, suy yếu, chấn thương, lạnh ẩm kéo dài, mắc bệnh truyền nhiễm [21]
● Nguyên tắc điều trị: gồm điều trị nguyên nhân và điều trị triệu chứng [3], [21]
Điều trị nguyên nhân: tùy theo nguyên nhân mà bác sĩ sẽ cho bệnh nhân dùng những loại thuốc điều trị khác nhau
Điều trị triệu chứng:
Biện pháp không dùng thuốc: Cho khớp nghỉ ngơi, tránh lạnh, ẩm, nên làm việc nhẹ Tăng cường vận động, tập luyện điều trị vật lí, tùy theo bệnh và giai đoạn bệnh Chế độ dinh dưỡng phù hợp [3], [21]
Biện pháp dùng thuốc [3], [21]: Thuốc giảm đau thông thường, thuốc kháng viêm không steroid, corticoid
Nhận xét: Thuốc tân dược có hiệu lực nhanh, mạnh, chủng loại phong phú nhưng
chủ yếu là thuốc chống viêm và kháng sinh, có nhiều tác dụng không mong muốn (đặc biệt là gây viêm loét dạ dày)
Trang 101.1.2 Quan điểm y học cổ truyền về chứng phong thấp nhiệt tý:
● Triệu chứng: các khớp sưng, nóng, đỏ, đau, ngày nhẹ đêm nặng, co duỗi cử động khó khăn, rêu lưỡi vàng mỏng, chất lưỡi đỏ, nước tiểu vàng, mạch hoạt, sác [18], [21]
● Nguyên nhân: Phong thấp (chứng tý) do cơ thể yếu bị "Phong", "Hàn", "Thấp",
"Nhiệt" thừa cơ xâm nhập kinh lộ, cơ nhục, khớp xương, làm tổn thương huyết mạch và tâm, đưa đến sưng đỏ, đau nhức, nặng nề, tê bại trong cơ thể, các khớp xương, chân tay, Phong hàn thấp ngưng trệ trong cơ thể lâu ngày đều có thể hoá nhiệt mà sinh ra chứng nhiệt tý [18]
● Điều trị: khu phong, thanh nhiệt, hoạt huyết, lợi niệu, trừ thấp (thanh nhiệt, khu phong, hoá thấp) [18], [21]
● Một số phương thuốc điều trị phong thấp nhiệt tý: Bạch hổ quế chi thang gia giảm, Quế chi thược dược tri mẫu thang gia giảm [18], Thấp khớp cấp tán, Tam diệu thang gia vị, Tứ vật hợp tam diệu gia vị thang, Nhiệt thấp thang, Nhị diệu tán,…[7], [10], [15]
1.2 Phương thuốc Tam diệu thang gia giảm:
1.2.1 Thành phần:
Hoàng bá 10g Thương truật 15g Hương phụ ( chế ) 15g Ngưu tất 15g Dây đau xương 20g
Một số vị khác, tổng khối lượng 1 thang là 110g
1.2.2 Công năng, chủ trị của phương thuốc:
- Công năng: thanh nhiệt táo thấp [10], [15]
- Chủ trị: phong thấp nhiệt tý (viêm khớp cấp tính do tăng acid uric) [15], thấp nhiệt rót xuống, gân cốt đau nhức, đầu gối sưng đau nhức, hai chân lỏng, thấp nhiệt
mà đới hạ, hạ bộ nhọt do thấp, tiểu tiện ngắn đỏ, rêu lưỡi vàng nhờn [10]
1.2.3 Một số kết quả đã nghiên cứu về phương thuốc:
Về đặc điểm các vị thuốc: Đặc điểm hình thái và đặc điểm bột dược liệu nghiên cứu phù hợp với mô tả trong DĐVN IV [20]
Trang 11 Về bào chế: Đã bào chế được cao đặc của phương thuốc Tam diệu thang gia giảm bằng phương pháp sắc đạt các chỉ tiêu chung của DĐVN IV về thể chất, hình thức và độ ẩm [5], [20]
Cụ thể: từ 2003,55 g dược liệu phương thuốc thu được 741,11 g cao đặc đạt các chỉ tiêu chung của DĐVN IV về thể chất, hình thức, độ ẩm
Về thành phần hoá học: Đã xác định thành phần các nhóm chất hoá học trong cao đặc và các vị thuốc bằng phương pháp hoá học, định tính 3 nhóm alcaloid, flavonoid, saponin trong cao và vị bằng sắc kí lớp mỏng [5], [20]
Cụ thể:
Thành phần các nhóm chất hoá học trong cao đặc và các vị thuốc:
- Hoàng bá có alcaloid, flavonoid, chất béo
- Ngưu tất có saponin, acid hữu cơ, polysaccharid
- Thương truật có flavonoid, polysaccharid
- Dây đau xương có alcaloid, polysaccharid, đường khử
- Hương phụ có alcaloid, flavonoid, saponin, chất béo, acid hữu cơ,
polysaccharid, đường khử
- Cao đặc có alcaloid, flavonoid, saponin, acid hữu cơ, polysaccharid, đường khử
Định tính bằng sắc kí lớp mỏng:
- Sắc kí đồ của alcaloid trong cao đặc và các vị thuốc:
+ Ở λ = 254 nm, cao cho 5 vết trong đó có 2 vết tương đương với mẫu Berberin và Palmatin chuẩn, có 4 vết tương đương với Hoàng bá, 3 vết tương đương với Dây đau xương, 3 vết tương đương với Hương phụ
+ Ở λ = 366 nm, cao cho 6 vết trong đó có 2 vết tương đương với mẫu Berberin và Palmatin chuẩn, có 4 vết tương đương với Hoàng bá, 3 vết tương đương với Dây đau xương, 2 vết tương đương với Hương phụ
+ Khi phun TT hiện màu, cao cho 2 vết tương đương với vết của Berberin, Palmatin chuẩn, Hoàng bá và Dây đau xương
- Sắc kí đồ cùa flavonoid trong cao đặc và vị thuốc:
Trang 12+ Ở λ = 254 nm, cao cho 11 vết trong đó có 6 vết tương đương với Hoàng bá,
9 vết tương đương với Thương truật, 7 vết tương đương với Hương phụ
+ Ở λ = 366 nm, cao cho 12 vết trong đó có 8 vết tương đương với Hoàng bá,
10 vết tương đương với Thương truật, 8 vết tương đương với Hương phụ + Khi phun TT hiện màu, cao cho 11 vết trong đó có 6 vết tương đương với Hoàng bá, 10 vết tương đương với Thương truật, 7 vết tương đương với Hương phụ
- Sắc kí đồ của saponin trong cao đặc và vị thuốc:
+ Ở λ = 254 nm, acid oleanolic cho 1 vết tương đương vết của cao và Ngưu tất; cao cho 8 vết tương đương với Ngưu tất, 6 vết tương đương với Hương phụ
+ Ở λ = 366 nm, acid oleanolic không xuất hiện vết; cao cho 9 vết trong đó có
6 vết tương đương với Ngưu tất, 3 vết tương đương với Hương phụ
+ Khi phun TT hiện màu, acid oleanolic cho 1 vết màu xanh tương đương với vết của cao và Ngưu tất; cao cho 9 vết trong đó có 8 vết tương đương với Ngưu tất, 5 vết tương đương với Hương phụ
Tiếp nối những kết quả của các nghiên cứu trước về phương thuốc, đề tài này tiếp tục nghiên cứu các nội dung sau:
với 2 dung môi nước và ethanol các độ 30%, 60%, 90%
- Định tính các nhóm chất hoá học trong các mẫu cao bằng phương pháp hoá học và sắc kí lớp mỏng
- Định lượng Berberin và Palmatin trong các mẫu cao bằng sắc kí lớp mỏng
1.3 Thông tin cơ bản về các vị thuốc:
1.3.1 Hoàng bá:
1.3.1.1 Tên khoa học vị thuốc: Cortex Phellodendri [8], [13], [16]
1.3.1.2 Bộ phận dùng: vỏ cây Hoàng bá - Phellodendron chinensis Schneid
Họ Cam (Rutaceae) [4], [8], [12], [13], [16], [22]
Trang 131.3.1.3 Thành phần hoá học:
• Thành phần chính là alcaloid: Berberin (1,5-3 %) và oxy berberin, palmatin và oxy palmatin [4], [11], [12], [24], [47], [49], [61], [62]; một lượng nhỏ phellodendrin, magnoflorin, jatrorrhizin, candixin, menisperin, γ- fagarin [4], [11], [12], [62]; 7, 8- dihydroxyrutaecarpin, 7-hydroxyrutaecarpin [64]
• Ngoài ra trong vỏ Hoàng bá còn có:
- Các chất tinh thể không chứa nitơ: obakullacton (limonin); obakunon
[4], [11], [12], [62]; canthin- 6- non, 4- methoxy- N- methyl-2- quinolon, γ-
hydroxybutenon [49], [61]
- Hợp chất phenolic (lignan, flavonoid, acid- ester phenolcarboxylic): syringin, lyoniresinol, coniferin, syringaresinol-di-O-D- glucopyranosid, sinapic aldehyd-4-O-D-glucopyranosid, methyl-5-O-ferunoyl-quinat, acid 3-O-ferunoylquinic, acid 3-O-ferunoylquinic methyl ester [61]; phellodensin và phellodenol [46]
- Hợp chất sterolic: 7- dehydrostigmasterol, campesterol, β- sitosterol [61], [62]
- Acid ferulic và hợp chất ferulat (amurenlacton A, amurenamid A) [67], chất béo, isovanillin, acid caffeic ethyl ester, methyl beta-orsellinat [62]; Isocoumarin (3-acetyl-3,4-dihydro-5,6-dimethoxy-1H-2-benzopyran-1-one) [29], [61]
1.3.1.4 Tác dụng sinh học:
- Tác dụng kháng khuẩn: Hoàng bá có tác dụng kháng khuẩn đối với nhiều vi
khuẩn Gram âm và Gram dương: Staph aureus, Str hemolyticus, B diphtheriae,
B anthracis, B subtilis, Sh shigae, Sh flexneri [4], [12], [22], [24]; Helicobacter pylori [33]
- Tác dụng làm giảm nồng độ acid uric trong máu bằng cách ức chế hoạt động của xanthin oxidase [64]
Berberin là thành phần chính của Hoàng bá có nhiều tác dụng sinh hoc: kháng khuẩn, chống viêm, chống loét, tăng tiết mật, ức chế xanthin oxidase [44]; kháng virus [35]; hạ lipid máu [36], hạ đường huyết, cải thiện chức năng gan thận [62] 1.3.1.5 Tác dụng theo y học cổ truyền:
Trang 14- Tính vị, quy kinh: vị đắng, tính hàn; quy vào ba kinh thận, bàng quang, tỳ [8], [13], [22] Tính trầm mà giáng xuống, là âm dược [19]
Giải độc tiêu viêm: dùng khi bị thấp chẩn, lở ngứa, mụn nhọt [4], [8], [13], [19]
- Liều dùng: 4-16g [13]
- Kiêng kỵ: người dương hư, đại tiện lỏng, tỳ vị yếu [8], [13], [19]
1.3.2 Thương truật:
1.3.2.1 Tên khoa học vị thuốc: Rhizoma Atractylodis [8], [13]
1.3.2.2 Bộ phận dùng: thân rễ cây Thương truật (Atractylodes lancea (Thumb.))
Họ Cúc (Asteraceae) [8], [13]
1.3.2.3 Thành phần hoá học:
• Tinh dầu (khoảng 1,5 %) [4], [12], [22], [38]
- Thành phần chính trong tinh dầu là β-eudesmol hoặc β-eudesmol trong hỗn hợp với atractylon, atractylon, hinesol Cụ thể là các monoterpen (p-cymen, β-selimen…); sesquiterpen (atractylon, γ-eudesmol…); phenolic (thymol ); atractylodin; acetylenic (atractylodin, atractylodinol…) [4], [12], [22], [38], [61] Thân rễ của loài thu hái ở Nhật Bản có chứa atractylodin, eudesmol và hinesol, không có atractylon [12]
- Thành phần khác: Sesquiterpenoid glycosid: 14-O-beta-D-fructofuranosid; (5R, 7R, 10S) - isopterocarpolon beta - D - glucopyranosid…[43], Polysaccharid (actractan A, B, C) [61], Monosaccharid (arabinose, galactose, glucose) [61], Disaccarid là dẫn xuất acylsucrose [58], Vitamin A, B1, C [8], Furanocoumarin (osthol) [61]
Trang 15- Tác dụng làm giảm nồng độ acid uric trong máu và ức chế xanthin dehydrogenase gan và xanthin oxidase ở chuột [44]
Trang 16• Ngoài ra còn có: Stetol (ecdysteron, inokosteron) [8], [12], [17], [23], [24], [51]; polysaccharid là các fructan trùng hợp mạch ngắn [51]; betain chiếm khoảng 0,930- 1,029%, là 1 chất bền vững trong quá trình chế biến [27], [51]; terpen, acid amin [59]; emotin và physcion [51]
1.3.4 Dây đau xương :
1.3.4.1 Tên khoa học vị thuốc: Caulis Tinosporae tomentosae [1], [8]
1.3.4.2 Bộ phận dùng: Thân Dây đau xương Tinospora sinensis (Lour.) Merr
Họ Tiết dê (Menispermaceae) [1], [4], [8], [12], [22]
1.3.4.3 Thành phần hóa học:
• Alcaloid [4], [12], [22]: Berberin, palmatin, magnoflorin [25]
• Nhóm Glucosid: glucosid phenolic (tinosinen I) [9], [25], [68]; dinorditerpen
Trang 17glucosid (tinosinensid A và B) [22]; lignan glucosid: tinosposid A và B [48]
• Nhóm Diterpen Glycosid: 1-deacetyltinosposid A [32], tinosporicid, tinosposinensid A-C, menispermacid [25]
Thân rễ cây Hương phụ vườn Cyperus rotundus L hoặc Hương phụ biển Cyperus
stoloniferus Retz Họ Cói (Cyperaceae) [1], [8], [12], [13], [16], [22]
1.3.5.3 Thành phần hóa học:
• Hương phụ vườn:
- Tinh dầu (0,3-2,8%): cyperen, β-caryophylen, α- cyperon, β-pinen Sau khi chế biến thì lượng tinh dầu giảm đi 40-50%, chủ yếu là hydrocarbon monoterpen [12], [22]
- Các thành phần khác: flavonoid 1,25%, tanin 1,66%, alcaloid 0,21-0,24% (rotundin A- C), saponin 0,041%, glycosid tim 0,62-0,74%, acid phenol, chất đắng, pectin 8,7%, tinh bột 9,2%, chất béo 2,98%, acid hữu cơ 3,25%, protein, vitamin C
Trang 19Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu:
Dược liệu đã chế biến được cung cấp bởi Phòng chẩn trị Phùng Gia Đường (số 4, ngõ 99, phố Trung Kính – Cầu Giấy – Hà Nội) ( Hình 2.1)
1 2 3
4 5
Hình 2.1 Phương thuốc Tam diệu Thang gia giảm
1: Hoàng bá, 2: Ngưu tất, 3: Thương truật, 4: Hương phụ chế, 5: Dây đau xương Đặc điểm hình thái và đặc điểm bột các vị dược liệu phù hợp với mô tả trong các chuyên luận riêng trong DĐVN IV
2.1.2 Thiết bị, máy móc:
- Tủ sấy Memmert (Germany)
- Máy đo độ ẩm Precisa XM 120
- Bộ dụng cụ cất dung môi
- Cân phân tích Sartorius BP 221S (Germany)
- Cân kỹ thuật Precisa (Switzeland)
- Máy ảnh Canon 10.0 mega pixels
Trang 20- Hệ thống thiết bị sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao Linomat 5 (Camag – Switzeland) (hình 2.2):
+ Thiết bị phun mẫu Linomat 5
+ Thiết bị triển khai tự động ADC2
+ Thiết bị chụp ảnh Camag
+ Phần mềm: WinCats, Videoscan
Hình 2.2: Hệ thống thiết bị sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao
2.1.3 Hoá chất, dung môi: đạt tiêu chuẩn phân tích, được cung cấp bởi Phòng Vật
tư và trang thiết bị, Trường Đại học Dược Hà Nội: nước cất, ethanol tuyệt đối, ether dầu hoả, ethylacetat, n- buthanol, cloroform, acid formic, acid acetic đặc, acid sulfuric 1N, acid hydrochloric đặc, toluene, natri hydroxyd…
2.2 Nội dung nghiên cứu:
- > Nghiên cứu bào chế cao đặc phương thuốc Tam diệu thang gia giảm: chiết xuất bằng nước và ethanol với các nồng độ 30%, 60%, 90%; bào chế dạng cao đặc -> Nghiên cứu định tính một số thành phần của cao đặc phương thuốc:
Chiết xuất một số nhóm chất từ cao đặc và vị thuốc
Định tính một số nhóm chất bằng: phương pháp hoá học, sắc kí lớp mỏng
-> Nghiên cứu định lượng Berberin và Palmatin trong các mẫu cao đặc phương thuốc bằng sắc kí lớp mỏng
Trang 212.3 Phương pháp nghiên cứu:
Bào chế cao đặc bài thuốc:
- Phương pháp: sắc, chiết nóng với dung môi: nước, ethanol các độ: 30%, 60%, 90%, cô đến dạng cao đặc, bảo quản trong hai lớp túi PE [9], [14] Tính hiệu suất chiết
- Xác định độ ẩm cao đặc: Phương pháp mất khối lượng do làm khô [1]
+ Cách tiến hành:
Sấy bì đựng mẫu trong 30 phút Bì đựng mẫu là dụng cụ thủy tinh rộng miệng đáy bằng
Cân bì (mb)
Sấy trong tủ sấy trong 4 h, to = 110oC
Sau đó làm nguội tới nhiệt độ phòng cân trong bình hút ẩm có silica gel
Độ ẩm được tính theo công thức:
100 )
ms mt
m m
m m
H
Nghiên cứu định tính một số thành phần:
Mẫu nghiên cứu: Các mẫu cao đặc phương thuốc, các vị thuốc
- Chiết các nhóm chất từ cao và các vị thuốc bằng dung môi thích hợp
- Định tính các nhóm chất bằng thuốc thử chung của từng nhóm chất theo phương pháp thường quy [6], [11], [16], [17]
- Định tính so sánh các mẫu cao đặc và các vị thuốc bằng sắc ký lớp mỏng [24], [61]
Nghiên cứu định lượng Berberin và Palmatin trong các mẫu cao:
Mẫu nghiên cứu: các mẫu cao đặc phương thuốc và các vị thuốc
- Mẫu thử: Chiết alcaloid từ các mẫu cao và vị thuốc bằng dung môi thích hợp
Trang 22- Mẫu chuẩn: Pha dãy dung dịch chuẩn Berberin + Palmatin với các nồng độ: 500 ng/µl, 250 ng/µl, 125 ng/µl, 63 ng/µl, 32 ng/µl, 16 ng/µl trong dung môi ethanol 96% [26]
µg/g)(
H X
Z
Y A x
x: Hàm lượng Berberin / Palmatin trong mẫu (µg/g)
A: Hàm lượng Berberin / Palmatin trong vết sắc kí (ng)
Trang 23Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Bào chế cao đặc bài thuốc:
Chiết xuất:
* Phương pháp sắc:
- Cân 110g dược liệu (1 thang thuốc), chiết làm 3 lần:
Lần 1: dung môi là 660 ml, thời gian sôi: 2h
Lần 2: dung môi là 440 ml, thời gian sôi: 2h
Lần 3: dung môi là 440 ml, thời gian sôi: 1h
Dịch chiết được lọc nóng qua vải gạc để loại tạp chất cơ học, để lắng qua đêm 14h)
(12-* Phương pháp chiết nóng:
- Dung môi: nước; ethanol các độ 30%, 60%, 90%
- Cách làm: tương tự như phương pháp sắc
Cô cao:
- Gạn dịch trong, lọc qua vải gạc Cô trực tiếp đến khi được cao lỏng 1:1 (riêng dịch chiết bằng ethanol cất thu hồi dung môi trước khi cô) Trong quá trình cô chú ý khuấy đảo liên tục để tránh lắng xuống đáy gây cháy khét và tăng khả năng bay hơi
- Cao lỏng 1:1 được chuyển sang cô cách thuỷ đến khi đạt thể chất cao đặc, hàm ẩm trong cao đạt tiêu chuẩn DĐVN IV (hàm ẩm dưới 20%)
- Đóng gói trong hai lớp túi PE, hàn kín Bảo quản nơi khô, mát
Quy trình bào chế được thực hiện lặp lại 3 lần (3 mẻ)
Kiểm tra độ ẩm của cao đặc: Phương pháp mất khối lượng do làm khô [1]
Kết quả nghiên cứu về thể chất, màu sắc, mùi vị, độ ẩm và hiệu suất của các mẫu cao đặc được trình bày ở bảng 3.1; số liệu bào chế, độ ẩm từng mẻ được trình bày ở phụ lục 1:
Trang 24Bảng 3.1 Hiệu suất bào chế và độ ẩm cao đặc
15,86
± 3,07
15,27 ± 2,35
12,70 ± 0,5
15,60 ± 0,57
Hiệu suất bào chế cao (%)
SD
30,22 ± 2,52
25,23
± 1,12
24,13 ± 0,86
22,18 ± 2,08
12,20 ± 0,21
Màu nâu đen, mùi thơm đặc trưng, vị ngọt hơi
+ Hiệu suất bào chế cao nhỏ nhất: cao chiết ethanol 90% (12,20%±0,21)
Không có sự khác biệt nhiều về hiệu suất giữa các mẫu cao chiết nước 80oC, cao chiết ethanol 30% và cao chiết ethanol 60%
- Thể chất tương đồng giữa các mẫu cao
- Các mẫu cao đặc đạt các chỉ tiêu chung theo DĐVN IV về thể chất, hình thức, độ
ẩm
3.2 Định tính các thành phần hoá học:
3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hoá học:
Kết quả được tóm tắt ở bảng 3.2:
Trang 25Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất trong các vị thuốc và các mẫu cao đặc
Et 60%
Et 90%
+++ ++
Trang 26- Hoàng bá có alcaloid, flavonoid, chất béo
- Ngưu tất có saponin, acid hữu cơ, polysaccharid
- Thương truật có flavonoid, polysaccharid
- Dây đau xương có alcaloid, polysaccharid, đường khử
- Hương phụ có alcaloid, flavonoid, saponin, chất béo, acid hữu cơ, polysaccharid,
đường khử
- Các mẫu cao có alcaloid, flavonoid, saponin, acid hữu cơ, polysaccharid, đường
khử
3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng:
Mẫu nghiên cứu: Các mẫu cao đặc và các vị dược liệu: Hoàng bá, Ngưu tất, Thương
truật, Dây đau xương, Hương phụ
a, Chiết xuất và định tính nhóm tách bằng cloroform 1 (chủ yếu alcaloid):
Mẫu nghiên cứu: Các mẫu cao đặc, Hoàng bá, Dây đau xương
* Mẫu thử: Chiết alcaloid từ các mẫu cao đặc và bột các vị dược liệu Khối lượng
mỗi mẫu được trình bày trong bảng 3.3:
Trang 27Bảng 3.3 Khối lượng mẫu nghiên cứu chiết xuất alcaloid
kín để trong 30 phút
Các mẫu cao đặc (trừ cao chiết ethanol 90%): hoà vào 10 ml nước cất (đun nóng để hoà tan hoàn toàn), thêm ethanol 90% (20 ml x 2 lần), đun nóng, gạn lấy dịch trong,
Riêng cao chiết ethanol 90%: hoà vào 10 ml ethanol 90% (đun nóng để hoà tan hoàn toàn), thêm nước cất (20 ml x 2 lần), đun nóng, để lắng, gạn lấy dịch trong, cô
– 20 ml; 10g – 40 ml; 15g – 60 ml), lắc đều, ngâm trong 1h, thỉnh thoảng lại lắc
- Lắc dịch chiết với dd HCl 5% (15 ml x 4 lần), gạn lấy dịch chiết nước
- Kiềm hoá dịch chiết bằng dd NaOH 10% (đến pH= 9 – 10)
- Hoà tan cắn trong 2 ml ethanol 90% để chấm sắc kí
* Mẫu chuẩn đối chiếu:
- Berberin clorid chuẩn 0,025 %
- Palmatin clorid chuẩn 0,025 %
Lấy 0,0025 g mỗi chất chuẩn vào từng lọ đựng mẫu, hoà tan trong 10 ml ethanol
* Điều kiện sắc kí:
Trang 28- Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), 20 x 10 cm, hoạt hoá ở 110oC trong 1h
- Pha động: n- Buthanol – acid acetic đặc – nước (7:1:2)
+ Vị trí phun: cách cạnh dưới 10 mm, cách cạnh bên 20 mm
+ Phun trên băng dài 8 mm
Bảng 3.4 Thể tích dịch phun mẫu nghiên cứu
* Triển khai:
+ Thiết bị triển khai sắc ký tự động ADC2
+ Điều chỉnh độ ẩm: dd KSCN bão hòa trong 10 phút
+ Bão hòa bình triển khai 20 x 10 trong 30 phút (giấy lọc) bằng 25 ml dung môi pha động
+ Thể tích dung môi khai triển: 10 ml
Trang 29+ Khoảng cách triển khai là 80 mm kể từ đáy bản mỏng Bản mỏng được làm khô trong 5 phút
* Kết quả được trình bày trong hình 3.1, 3.2 và bảng 3.5:
Hình 3.1 Sắc kí đồ alcaloid hiện màu bằng TT Dragendorff
Trang 30Hình 3.2 Sắc kí đồ alcaloid quan sát ở bước sóng 254 nm và 366 nm
Trang 31Bảng 3.5 Kết quả phân tích alcaloid của cao và các vị bằng sắc kí lớp mỏng
(λ = 366 nm)
Sắc kí đồ của alcaloid trong các mẫu cao và các vị thuốc ở λ = 366 nm cho thấy:
Berberin và Palmatin chuẩn, 1 vết tương đương với Hoàng bá và Dây đau xương, 1 vết tương đương với Dây đau xương
tương đương với mẫu Berberin và Palmatin chuẩn, 1 vết tương đương với Hoàng bá
và Dây đau xương, 2 vết tương đương với Dây đau xương
b, Chiết xuất và định tính nhóm tách bằng ethyl acetat (chủ yếu flavonoid):
Mẫu nghiên cứu: Các mẫu cao, Hoàng bá, Thương truật, Hương phụ
* Mẫu thử: Chiết từ các mẫu cao và bột các vị dược liệu Khối lượng mỗi mẫu là 10g
