Nghiên cứu so sánh đặc điểm vi học và thành phần hóa học của 3 mẫu rễ cây bá bệnh hướng tới xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bá bệnh là một cây thuốc gần đây ở cả Việt Nam và nước ngoài đã sử dụng nhiều để điều trị suy giảm chức năng sinh dục nam giới. Ở Việt Nam Bá bệnh có ở nhiều nơi như: các tỉnh miền Trung, các tỉnh Tây Nguyên và một số tỉnh ở miền Bắc như Quảng Ninh, Hòa Bình. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy cây mọc ở Việt Nam cũng có tác dụng khá tốt, nhưng cũng cảnh báo cây này có thể có độc với huyết và dùng lạ m dụng gây ra tiêu chảy, chán ăn. Mặt khác, nguồn dược liệu này hiện nay có bán rất sẵn ở nhiều chợ và quầy thuốc đông y, được nhập vào Việt Nam từ nhiều nguồn khác nhau như từ Campuchia, Lào, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc… dưới hình thức cả dược liệu lẫn sản phẩm dạng thực phẩ m chức năng. Trong khi đó ở Việt Nam tài liệu nghiên cứu còn ít, chưa đầy đủ toàn diện và hệ thống, chưa có tài liệu có giá trị về mặt pháp lí cho việc đánh giá chất lượng dược liệu này. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu so sánh đặc điểm vi học và thành phần hóa học của 3 mẫu rễ cây Bá bệnh hướng tới xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu” với mục tiêu: Hướng tới xây dựng tiêu chuẩn kiể m nghiệm cho dược liệu Bá bệnh. Trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số nội dung sau: Nghiên cứu đặc điểm vi học của rễ 3 mẫu Bá bệnh thu thập ở các địa phương khác nhau. Dự kiến một số tiêu chuẩn kiể m nghiệm sơ bộ dược liệu Bá bệnh.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



HOÀNG THỊ GIANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM

VI HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA 3 MẪU RỄ CÂY BÁ BỆNH

HƯỚNG TỚI XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



HOÀNG THỊ GIANG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM

VI HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA 3 MẪU RỄ CÂY BÁ BỆNH

HƯỚNG TỚI XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN

KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Hà Vân Oanh Nơi thực hiện:

1.Bộ môn Dược học cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội 2.Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI 2013

TS Hà Vân Oanh, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình

giúp tôi hoàn thành khóa luận

PGS.TS Vũ Văn Điền - Bộ môn Dược học cổ truyền

ThS.DS Lê Thanh Bình - Bộ môn Dược liệu

Là những người thầy đã hết lòng tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, động viên và

truyền đạt những kinh nghiệm quý báu giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền trường Đại học Dược

Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt

thời gian thực hiện nghiên cứu đề tài tại bộ môn

Tôi xin trân trọng cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo và các phòng ban khác trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt chương trình học tập tại trường trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn ở bên động viên và là chỗ dựa tinh thần cho tôi những lúc khó khăn trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2013

Sinh viên Hoàng Thị Giang

MỤC LỤC

Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của họ Thanh thất 2

1.1.1 Vị trí phân loại của loài 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây Bá bệnh 2

1.1.3 Phân bố - thu hái 3

1.2 Thành phần hóa học 3

1.2.1 Quassinoid 4

1.2.2 Dẫn xuất Squalen 5

1.2.3 Alkaloid 5

1.2.4.Coumarin.……… 7

1.3 Tác dụng dược lý, công dụng 7

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 9

2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 9

2.2 Phương tiện nghiên cứu 9

2.2.1 Các máy và thiết bị dùng trong nghiên cứu 9

2.2.2 Hóa chất và dụng cụ 9

2.3 Phương pháp nghiên cứu 10

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 10

2.3.1.1 Mô tả đặc điểm dược liệu 10

2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học 10

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 10

2.3.2.1 Định tính bằng các phản ứng hóa học 10

2.3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 11

2.3.3 Xác định các chỉ tiêu vật lý, hóa lý 11

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 11

PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 12

3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật 12

3.1.1 Mô tả đặc điểm dược liệu (rễ) 12

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu vỏ rễ 13

3.1.3 Đặc điểm bột rễ 15

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 17

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 17

3.2.2 Sắc ký lớp mỏng 26

3.3 Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của dược liệu 34

3.3.1 Xác định các chất chiết được bằng dung môi 34

3.3.2 Xác định độ ẩm an toàn của dược liệu 37

3.3.3 Xác định độ tro toàn phần 37

3.4 Sơ bộ xây dựng tiêu chuẩn cho vị thuốc rễ Bá bệnh 39

3.5 Bàn luận 42

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Đề xuất 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bá bệnh là một cây thuốc gần đây ở cả Việt Nam và nước ngoài đã sử dụng nhiều để điều trị suy giảm chức năng sinh dục nam giới Ở Việt Nam Bá bệnh có ở nhiều nơi như: các tỉnh miền Trung, các tỉnh Tây Nguyên và một số tỉnh ở miền Bắc như Quảng Ninh, Hòa Bình Một số nghiên cứu gần đây cho thấy cây mọc ở Việt Nam cũng có tác dụng khá tốt, nhưng cũng cảnh báo cây này có thể có độc với huyết và dùng lạm dụng gây ra tiêu chảy, chán ăn Mặt khác, nguồn dược liệu này hiện nay có bán rất sẵn ở nhiều chợ và quầy thuốc đông y, được nhập vào Việt Nam từ nhiều nguồn khác nhau như từ Campuchia, Lào, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc… dưới hình thức cả dược liệu lẫn sản phẩm dạng thực phẩm chức năng Trong khi đó ở Việt Nam tài liệu nghiên cứu còn ít, chưa đầy đủ toàn diện và hệ thống, chưa có tài liệu có giá trị về mặt pháp lí cho việc đánh giá chất lượng dược liệu này Chính vì

vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu so sánh đặc điểm vi học và thành phần hóa học của 3 mẫu rễ cây Bá bệnh hướng tới xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu” với mục tiêu: Hướng tới xây dựng tiêu

chuẩn kiểm nghiệm cho dược liệu Bá bệnh Trong khuôn khổ khóa luận này chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số nội dung sau:

- Nghiên cứu đặc điểm vi học của rễ 3 mẫu Bá bệnh thu thập ở các địa phương khác nhau

- Dự kiến một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm sơ bộ dược liệu Bá bệnh

2

PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của họ Thanh thất

1.1.1 Vị trí phân loại của loài

Cây Bá bệnh có tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack họ Thanh thất (Simaroubaceae) Bá bệnh còn có tên gọi khác là Bách bệnh, Mật nhân, Mật

nhơn, Lồng bẹt, Tho nan (tiếng tày), Hậu phác nam (Việt nam), TongkatAli

 Loài: Eurycoma longifolia

1.1.2 Đặc điểm thực vật của cây Bá bệnh

Cây nhỡ, cao 2-8 m, ít phân cành [9] Lá kép hình lông chim, mọc so le, gồm 10-36 đôi lá chét không cuống, mọc đối, mặt trên màu xanh sẫm bóng, mặt dưới có lông màu trắng, cuống lá kép có màu nâu đỏ Bá bệnh là loài đơn tính khác gốc, cụm hoa mọc ở ngọn cành thành chùm kép hoặc chùy rộng có màu đỏ nâu, cuống có lông màu gỉ sắt [2] Quả hình trứng, hơi dẹt, có rãnh ở giữa dài 1-2 cm, chứa một hạt, trên mặt hạt có nhiều lông ngắn Quả non có màu xanh khi chín có màu đỏ sẫm [19]

Mùa hoa quả từ tháng 3 đến tháng 11 [6], [14]

3

Hình 1.1 : Cây và quả Bá bệnh

1.1.3 Phân bố - thu hái

Cây phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á như: Việt Nam, Malaysia, Lào, Campuchia, Indonesia, Thái Lan, Ấn Độ…[6], [9], [19]

Ở Việt Nam, Bá bệnh phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi thấp và trung

du, thường gặp hơn ở các tỉnh Tây Nguyên, miền Trung, Đông Nam Bộ [6], [9]

Có thể thu hái rễ quanh năm, tuy nhiên rễ cây sau 4 tuổi mới có giá trị thương mại [14]

1.2 Thành phần hóa học

Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bá bệnh Cho đến nay, theo một số tài liệu cho thấy trong rễ cây có các nhóm như: quassinoid, alkaloid, ngoài ra còn có coumarin, squalen triterpen, riêng lá còn có thêm flavonoid, tannin [33]

1.2.1 Quassinoid

Các hợp chất quassinoid là nhóm hợp chất diterpenlacton phân bố chủ yếu

trong các cây thuộc họ Simaroubaceae (vì vậy chúng còn có tên là

Simaroubolid) Quassinosid có vị rất đắng nên còn được gọi là amarolid (amara, amarus nghĩa là đắng) [14]

4

Theo [23], [28] các quassinoid trong rễ cây Bá bệnh gồm: eurycomalacton, 6α-hydroxyeurycomalacton, longilacton, 5,6-dehydro-eurycomalacton , eurycomanol, eurycomanon, 13β,18-dihydroeurycomanol, 11-dehydroeurycomanol, klaineanon, 14,15β-dihydroxyklaineanon, 12-epi-11-dehydroklaineanon, 15β-O-acetyl-14-hydroxyklaineanon

Trong đó, các quassinoid đáng chú ý là: eurycomalacton, longilacton, klaineanon, eurycomanon, 14,15β-dihydroxyklaineanon

O

O

OH

O O OH

OH OH

Klaineanon Eurycomanon

O O

OH

OH OH OH

HO

O H H

H

14 15

1.2.3 Alkaloid

Chủ yếu là nhóm canthin-6-on [28] và một số thuộc nhóm β-carbolin [34] Các alkaloid được phân lập từ vỏ và gỗ như: 9,10-dimethoxycanthin-6-on, 10-hydroxyl-9-methoxy-canthin-6-on, 11-hydroxyl-10-methoxy-canthin-6-on, 5,9-dimethoxycanthin-6-on, 9-methoxy-3-methyl-canthin-5,6-dion

Theo [12], các alcaloid như: 9-hydroxycanthin – 6- on, 9-methoxycanthin- 6-on, 9-methoxycanthin-6-on-N-oxit đã được phân lập từ rễ BB

Ngoài ra còn các alkaloid carbolin

7 8 9

R1 = C2H4COOH R7 = H β-carbolin-1-propionic acid

R1 = C2H4COOH R7 = OH 7-hydroxy-β-carbolin-1-propionic acid R1 = C2H4COOH R7 = OMe 7-methoxy-β-carbolin-1-propionic acid

Hình 1.4: Nhóm canthin-6-on

Rn = H R11 = OH 11-hydroxycanthin-6-on

Rn = H R9 = OMe 9 -methoxycanthin-6-on

R5 = OMe R9 = OMe 5,9-dimethoxycanthin-6-on

R10 = OMe R9 = OMe 9,10-dimethoxycanthin-6-on

R10 = OH R9 = OMe 9-methoxy-10-hydroxycanthin-6-on R10 = OMe R11 = OH 10-methoxy-11-hydroxycanthin-6-on

3 4 5

6 7

12

+ Tăng khả năng tình dục: theo một số nghiên cứu trên chuột thì dịch

chiết rễ cây Bá bệnh có tác dụng hỗ trợ điều trị các bất thường về tình dục do làm tăng ham muốn tình dục, tăng sản xuất và chất lượng tinh trùng (tăng

tổng hợp và giải phóng Testosteron từ tế bào trưởng thành [10], [13], [19], [20], [21], [22], [23]

+ Chống khối u:

- Các quassinoid có tác động mạnh chống u nhọt, gây độc với các tế bào ung thư Theo [27], hoạt chất 14,15β-dihydroxyklaineanon có tác dụng ức chế sự tạo thành khối u do virus Epstein-Barr Theo [30], [31], [35] eurycomanon gây độc lên tế bào ung thư như CaOv-3, Hela, HepG2, HM3KO, MCF-7 nhưng tác dụng yếu lên tế bào thường Ngoài ra, hoạt chất eurylen có trong cây Bá bệnh cũng gây độc với tế bào [19], [25]

- Theo [32], các alkaloid thuộc nhóm canthin-6-on

(9-methoxycanthin-6-on, 9-hydroxycanthin-6-on, 9-methoxycanthin-6-on-N-oxit, hydroxycanthin-6-on-N-oxit ) có tác dụng gây độc với các tế bào ung thư vú, trực tràng, phổi, sarcoma sợi, u melanin máu

9-+ Chống ký sinh trùng sốt rét: Theo [27], 11β-dihydroxyklaineanon và

15β-O-acetyl-14-hydroxyklaineanon có khả năng chống ký sinh trùng sốt rét mạnh Theo [23] một số quassinoid (eurycomanon, 13,21-dihydroeurycomanon, 13(21)-epoxyeurycomanon, eurycomalacton) và một alkaloid (9-methoxycanthin-6-on) có trong dịch chiết BB có khả năng chống

ký sinh trùng sốt rét đa đề kháng với thuốc (Plasmodium falciparum P.yoelii)

Trong đó, eurycomanon và 13,21-dihydroeurycomanon có chỉ số chọn lọc cao

8

hơn các chất còn lại Theo [32], các hoạt chất 10-hydroxycanthin-6-on, eurycomanon, eurycomalacton, eurycomanol có tác dụng chống ký sinh trùng sốt rét Ngoài ra, theo [9], [31], [33] một số hợp chất từ dịch chiết từ BB có khả năng chống ký sinh trùng sốt rét

+ Kháng khuẩn: Dịch chiết cồn và aceton từ thân và lá có tác dụng

chống vi khuẩn Gram (-) và Gram (+), ngoại trừ đối với 2 chủng vi khuẩn Gram (-) (Escherichia coli và Salmonella typhi) Dịch chiết từ rễ không có tác dụng kháng khuẩn Ngoài ra, các nghiên cứu cũng cho thấy dịch chiết nước từ

lá có khả năng chống lại Staphylococcus aureus và Serratia marscesens [24]

+ Trị giun: Theo [27], hoạt chất longilacton đặc biệt có tác dụng chống

ký sinh trùng Schistosoma japonicum ở nồng độ 200 mg/ml tuy nhiên yếu hơn

praziquantel Theo [6] một số hoạt chất có trong dịch chiết BB có tác dụng điều trị giun

+ An thần, giảm lo âu: dịch chiết BB thử nghiệm trên chuột thí nghiệm

cho thấy có tác dụng tương tự diazepam [32]

+ Giảm đường huyết: Cao chiết nước của rễ Bá bệnh làm giảm lượng

glucose huyết trên chuột thử nghiệm có đường huyết cao và làm giảm không đáng kể đối với chuột có đường huyết bình thường [26], [35]

+ Tác dụng khác như: hạ sốt, đau đầu, ho dai dẳng, phù, tiêu

chảy…[6], [19], [32], [31] Ức chế sự nhân lên của virus HIV [27], chống loét

[32]

9

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Dược liệu là rễ cây Bá bệnh được thu thập dạng rễ khô tại chợ tỉnh Tây Ninh, Khánh Hòa, rễ tươi được thu hái tại vịnh Bái Tử Long Quảng Ninh, rễ thu về được rửa sạch thái thành miếng nhỏ phơi sấy khô ở 600C, bảo quản trong túi polyethylen kín, để nơi khô ráo ở nhiệt độ phòng để nghiên cứu

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Các máy và thiết bị dùng trong nghiên cứu

 Tủ sấy dược liệu SHELLAB

 Bản mỏng sắc ký hoạt hóa trong tủ sấy BINDER ở nhiệt độ 105-1100C trong 60 phút

 Máy xác định độ ẩm SATORIUS

 Cân kỹ thuật Satorious

 Cân phân tích Precisa

 Máy đo phổ tử ngoại UV-VIS Spectrophotometer carry

 Lò nung Nabertherm

 Kính hiển vi Labomed

 Hệ thống máy chấm sắc ký: thiết bị bơm mẫu tự động LIMONAT5), máy nén khí, phần mềm winCATS, videoSCAN

(CAMAG- Máy ảnh canon 4.0, sony 16.0

 Máy sấy Panasonic

2.2.2 Hóa chất và dụng cụ

 Hóa chất và thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích theo Dược Điển Việt Nam IV

10

 Hóa chất: Javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ carmin…

 Dung môi hữu cơ: Chloroform, Methanol, Ethanol, EtOAc, n-Hexan, Toluen, Acid formic…

 Thuốc thử: các thuốc thử dùng trong phản ứng định tính và sắc ký

 Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của Merck

 Dụng cụ: dụng cụ thủy tinh và các bộ dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm như: cốc có mỏ, bình nón, đũa thủy tinh, chày, cối, thuyền tán, lam kính, ống nghiệm …

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

2.3.1.1 Mô tả đặc điểm dược liệu

Quan sát trực tiếp bằng mắt thường và kính lúp dưới ánh sáng thường để

mô tả đặc điểm bên ngoài, thể chất và mặt cắt ngang của dược liệu

2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học [16] [17]

 Soi bột: các mẫu rễ dược liệu được nghiền nhỏ bằng thuyền tán, cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản và quan sát, chụp ảnh dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột

 Vi phẫu: các mẫu dược liệu được ngâm trong EtOH 40%, cắt vi phẫu bằng máy cắt cầm tay, tẩy nhuộm theo phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu dưới kính hiển vi

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.3.2.1 Định tính bằng các phản ứng hóa học

 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong mẫu dược liệu theo các phương pháp hóa học thường quy được ghi trong các tài liệu hóa thực vật

như:

11

 Bài giảng dược liệu tập I [3], II [15]

 thực tập dược liệu – phần hóa học [17]

 phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [7]

 Xác định lượng chất chiết được trong dược liệu bằng phương pháp

chiết lạnh theo phụ lục 12.10 Dược Điển Việt Nam IV [ 5]

2.3.2.2 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng: [7]

 Sử dụng bản mỏng silicagel GF254 tráng sẵn của Merck

 Chuẩn bị dịch chiết dược liệu trong MeOH

 Chấm sắc ký bằng hệ thống máy chấm sắc ký CAMAG, hiện vết dưới đèn UV ở bước sóng 254nm và 366nm, phun thuốc thử hiện màu vanilin 1% bão hòa trong cồn trong H2SO4 đặc

 Chụp ảnh sắc ký và phân tích pic bằng phần mềm winCATS, videoSCAN

2.3.3 Xác định các chỉ tiêu vật lý, hóa lý

 Cảm quan: quan sát các mẫu ở ánh sáng thường về các chỉ tiêu màu sắc, mùi vị

 Xác định độ ẩm bằng máy đo độ ẩm SATORIUS

 Xác định tro toàn phần theo Dược Điển Việt Nam IV phụ lục 9.8 [5]

12

PHẦN III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Nghiên cứu về đặc điểm thực vật

3.1.1 Mô tả đặc điểm dược liệu (rễ)

Rễ hình trụ, thẳng hay hơi cong queo Lớp vỏ ngoài có màu vàng nhạt, rễ hóa gỗ, thể chất cứng, chắc, mặt cắt ngang có màu vàng Không mùi, vị rất đắng

Hình 3.1: Rễ cây Bá bệnh

và dãy xuyên tâm (10 - 20 hàng) Tiếp đến là phần mô mềm vỏ gồm rất nhiều

tế bào hình đa giác, phía ngoài thành mỏng bị ép bẹt, phía trong có các tế bào thành dày hóa gỗ xếp lộn xộn xen kẽ các tế bào mô mềm Trong mô mềm là các bó libe rất phát triển, libe được cấu tạo bởi các tế bào nhỏ xếp từ ngoài vào trong, nhỏ ở ngoài và loe rộng dần ở phía trong Nằm xen kẽ giữa các bó libe là các tia ruột Hình ảnh vi phẫu vỏ rễ được thể hiện ở hình 3.3:

5 Các tế bào thành dày hóa gỗ

Nhận xét: Quan sát đặc điểm vi phẫu vỏ rễ Bá bệnh có thể nhận thấy các

mẫu Bá bệnh thu hái từ 3 địa phương khác nhau đều có các đặc điểm tương

mô mềm mang tinh bột (3); bó sợi (5); các hạt tinh bột có rốn dài hình tròn hoặc gần tròn (6), đường kính khoảng 19-23 µm, và các hạt tinh bột hình trứng hoặc thuôn dài (7), dài 39,48µm - 56,7µm, đường kính 14,7 µm - 18,9

µm, các hạt tinh bột kép đôi, ít hạt tinh bột kép ba, hoặc tập trung thành đám, các hạt tinh bột bắt màu xanh đen trong dung dịch Lugol (8); mảnh mạch điểm (4); tinh thể calcioxalat (9) hình khối có chiều dài 21-25 µm, chiều rộng 17-19µm ( Hình 3.4 – 3.6 và bảng 3.1)

Hình 3.4: Đặc điểm bột mẫu Tây Ninh

16

Hình 3.5: Đặc điểm bột mẫu Quảng Ninh

Hình 3.6: Đặc điểm bột mẫu Khánh Hòa

17

Bảng 3.1: Kích thước các hạt tinh thể, tinh bột của 3 mẫu

Đặc điểm hạt Mẫu TN (µm) Mẫu QN (µm) Mẫu KH (µm) Tinh thể 21,00 * 17,00 25,00 * 19,00 23,00 * 19,00 Tinh bột tròn hoặc gần

tròn 21,00 * 18,00 22,26 *19,32 23,00 * 22,00 Tinh bột hình trứng

hoặc thuôn dài 39,48 * 14,70 43,26 * 15,40 56,70 * 18,90

Nhận xét: Soi trên kính hiển vi với 3 mẫu dược liệu đều quan sát thấy đầy

đủ các đặc điểm nêu trên Tuy nhiên, có sự khác nhau giữa các mẫu về kích thước tinh thể, tinh bột và số lượng tinh bột Trong đó, mẫu TN có số lượng tinh bột ít nhất, kích thước tinh bột, tinh thể nhỏ nhất, tiếp đến là mẫu QN, cuối cùng là mẫu KH có kích thước tinh thể, tinh bột lớn nhất, số lượng tinh bột nhiều nhất Sự khác nhau này có thể do các mẫu dược liệu thu mua có tuổi cây không giống nhau hoặc do điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng mỗi vùng khác

nhau

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học

3.2.1.1 Định tính alkaloid

Cho khoảng 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dd amoniac đặc Đậy kín bình trong vòng 30 phút Cho 25ml chloroform lắc đều, ngâm 12 giờ Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn Sau đó lắc kỹ 2 lần, mỗi lần với 10ml dd H2SO4 1N Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết acid

 Ống 1: Nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Mayer

 Ống 2: Nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Dragendroff

 Ống 3: Nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Bouchardat

18 Thực hiện các bước tương tự với cả 3 mẫu

Kết quả: với cả 3 mẫu dược liệu đều thu được kết quả như sau:

+ Quan sát hiện tượng tạo bọt:

Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước đun sôi nhẹ, lọc nóng Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước, lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm Để yên 15 phút

Kết quả: Quan sát thấy cột bọt bền sau khi ngừng lắc 15 phút đối với cả 3

mẫu

+ Phản ứng Rosenthaler:

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết nước, thêm 1ml vanilin 1% trong cồn và vài giọt H2SO4 đặc Quan sát thấy dung dịch có màu tím hoa cà ở cả 3 mẫu

+ Phản ứng phân biệt 2 saponin:

Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5ml EtOH 90%, đun cách thủy đến sôi, lọc nóng Lấy dịch lọc làm thí nghiệm sau:

- Ống 1: cho 5ml dd NaOH 0,1N thêm 5 giọt dịch lọc trên

- Ống 2: 5ml dd HCl 0.1N thêm 5 giọt dịch lọc trên

Lắc đều 2 ống nghiệm trong 1 phút Để yên, thấy cột bọt ở ống 1 cao hơn ống 2 với cả 3 mẫu dược liệu

Sơ bộ kết luận: dược liệu có chứa saponin triterpenoid

Kết luận: Dược liệu nghiên cứu có Saponin

Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kim loại, rồi cho

4 – 5 giọt acid HCl đặc Đun cách thủy vài phút không thấy dung dịch chuyển

từ vàng sang hồng (ở cả 3 mẫu)

+ Phản ứng với kiềm:

 Phản ứng với NH3 : Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi

hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút thấy màu vàng của vết dịch chiết không thay đổi ở cả 3 mẫu

 Phản ứng với NaOH : cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy màu vàng của dịch chiết không thay đổi ở cả

3 mẫu

+ Phản ứng với FeCl 3 5% :

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2 – 3 giọt dd FeCl3 5% không thấy xuất hiện màu xanh đen ở cả 3 mẫu

+ Phản ứng với AlCl 3 3% trong cồn :

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm 2 – 3 giọt dd AlCl3 % trong

cồn không thấy xuất hiện màu xanh ở cả 3 mẫu

Kết luận: Trong rễ cây bá bệnh không có flavonoid

3.2.1.4 Định tính anthranoid

+ Phản ứng Borntrager:

Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml dd H2SO4

10% Đun sôi cách thủy trong 15 phút Lọc nóng vào bình gạn Để nguội rồi lắc với 5ml ether ethylic Gạn lấy phần ether cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết

20

- Ống 1: Thêm 1ml dd NH4OH 10%

- Ống 2: Thêm 1ml dd NaOH 10%

Thực hiện tương tự với cả 3 mẫu dược liệu

Kết quả: Quan sát thấy lớp nước có màu vàng nhạt ở cả 2 ống nghiệm đối

với cả 3 mẫu dược liệu

+ Vi thăng hoa:

Cho 1g bột dược liệu trên nắp nhôm Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên miệng nắp nhôm một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh Đốt nắp nhôm trên ngọn lửa đèn cồn Sau 5 – 10 phút lấy lam kính ra để nguội Soi dưới kính hiển vi Thực hiện tương tự đối với 3 mẫu dược liệu

Kết quả: Soi dưới kính hiển vi không thấy tinh thể ở cả 3 mẫu

Kết luận: Dược liệu không có anthranoid

3.2.1.5 Định tính glycosid tim

Cho 10g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 60ml EtOH 20%, lắc đều, ngâm qua đêm Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) bằng chì acetat 30% để dư Để lắng, lọc Loại chì acetat dư bằng dd

Na2SO4 bão hòa đến khi không còn tủa với Na2SO4 nữa Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với chloroform, mỗi lần 20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nước bằng cách lọc qua bông Cho dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ, đem cô cách thủy đến khô Cắn thu được để làm các phản ứng:

21

+ Phản ứng Liebermann:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho đến khi tan hết cắn Đặt nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1ml dd H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành hai lớp

Kết quả: Quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng có màu tím đỏ

ở cả 3 mẫu Phản ứng dương tính

+ Phản ứng Legal:

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml EtOH 90%, lắc đều cho tan hết cắn thêm 5 giọt dd natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dd NaOH 10%, lắc đều

Kết quả: Xuất hiện màu đỏ ở cả 3 mẫu Phản ứng dương tính

Kết luận: cả 3 mẫu dược liệu có chứa glycosid tim

3.2.1.6 Định tính coumarin

Cho 3g bột dược liệu vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 30ml EtOH 90% Đun cách thủy 5 phút Lọc nóng Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:

Kết quả: Có màu đỏ gạch với cả 3 mẫu

 Quan sát huỳnh quanh của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (PƯ chuyển dạng đồng phân từ cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)

Nhỏ vài giọt dịch chiết coumarin lên giấy thấm Nhỏ tiếp vài giọt dd NaOH 5% Sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (đồng xu, chìa khóa…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ miếng kim loại ra soi tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại phần bị che sẽ sáng dần lên, sau vài phút cả hai phần đều phát quang như nhau

Kết quả thu được đều tương tự ở cả 3 mẫu

Kết luận: Dược liệu có chứa coumarin

3.2.1.7 Định tính tanin

Cho vào ống nghiệm lớn 1g bột dược liệu, thêm 10ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: Ống 1: 1ml dịch lọc + vài giọt dd FeCl3 5%

Ống 2: 1ml dịch lọc + vài giọt dd chì acetat 10%

Ống 3: 1ml dịch lọc + vài giọt dd đồng acetat 10%

Ống 4: 1ml dịch lọc + 1ml dd gelatin 1%

Kết quả: Với cả 3 mẫu