Nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng hạ đường huyết của cao lỏng rễ ngưu bàng

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, trên thế giới xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Ở Việt Nam, với lợi thế về địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũng như nguồn dược liệu dồi dào cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời. Tuy nhiên nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà chưa có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học. Với vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên ưu đãi, Việt Nam có một thảm thực vật phong phú và đa dạng với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao 1, khoảng 4.000 loài được sử dụng làm thuốc. Tuy vậy chỉ có một số lượng ít loài cây và vị thuốc được sử dụng ở mức độ tương đối phổ biến theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu kỹ và đầy đủ. Ngưu bàng có tên khoa học là Arctium lappa L., họ Cúc Asteraceae thuộc chi Arctium L, cây còn có tên gọi khác như: Đại đao, á thực, hắc phong tử, thứ niêm tử, ngưu báng, ngưu bảng 7. Ngưu bàng được nhập từ Trung Quốc vào Việt Nam từ năm 1959, đã được trồng thử ở Lào Cai, Lai Châu, Nghĩa Lộ 6. Trong y học cổ truyền, Ngưu bàng mới chủ yếu dùng hạt (ngưu bàng tử) làm thuốc điều trị cảm cúm, trị viêm phổi, viêm amidal, trị sốt, chữa họng hầu sưng đau, có tác dụng cầm máu, giải độc, nhuận tràng… Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của rễ Ngưu bàng và cho những kết quảrất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như bảo vệ gan, hạ đường huyết, chống ung thư, ức chế HIV….. 53, 18.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

CỦA CAO LỎNG RỄ NGƯU BÀNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

VÀ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

CỦA CAO LỎNG RỄ NGƯU BÀNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 Ths.NCS Nguyễn văn An

2 DS Ngô Thị Thu

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Dược liệu - Đại Học Dược Hà Nội

2 Bộ môn dược lý - Đại học Y Hà Nội

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn đồng môn và gia đình Nhờ sự giúp đỡ quý báu đó mà em có thể học tập và hoàn thành tốt khóa luận của mình

Nhân dịp này, em xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc tới :

cho khóa luận hoàn thiện hơn

Em xin được cảm ơn tất cả các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội, bộ môn Dược lý Đại học Y đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em làm khóa luận

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong suốt 5 năm học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, động viên tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 02 tháng 05 năm 2013

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Thực vật học……… 3

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Arctium L……… 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Arctium L………3

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Arctium lappa L .3

1.2 Thành phần hóa học……….4

1.3 Tác dụng sinh học……… ………8

1.3.1 Tác dụng……… ………8

1.3.2 Công dụng……… ……… 11

1.4 Một số phương pháp gây tăng đường huyết trên thực nghiệm…… ………….13

1.4.1 Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng alloxan .13

1.4.2 Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng Streptozocin 14

1.4.3 Phương pháp gây tăng đường huyết bằng glucose ngoại sinh 14

1.4.4 Phương pháp gây ĐTĐ typ 2 do chế độ ăn giàu chất béo kết hợp alloxan 14

1.4.5 Một số phương pháp khác 16

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu……… 17

2.1.1 Nguyên liệu……… 17

2.2 Phương tiện nghiên cứu……… 17

2.2.1.Thuốc thử, dung môi, hoá chất……… …… 17

2.2.2 Động vật thí nghiệm 18

2.2.3 Phương tiện và máy móc……… …………18

2.3 Phương pháp nghiên cứu………18

2.3.1 Nghiên cứu về hóa học………18

2.3.2 Nghiên cứu tác dụng trên đường huyết……… 18

2.3.3 Xử lý số liệu………21

PHẦN 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ……… ……… 22

3.1 Nghiên cứu về hóa học……… ……… 22

3.1.1 Định tính một số nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 22

3.1.2 Chiết phân đoạn……… ………23

3.1.2.1 Xác định độ ẩm của dược liệu……… ……… 23

3.1.2.2 Chiết xuất……… ……….23

3.1.3 Định tính cắn toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng……… ……….25

3.1.4 Định tính cắn các phân đoạn……… ………26

3.1.4.1 Định tính phân đoạn n-hexan……… ………… 26

3.1.4.2 Định tính phân đoạn chloroform……… ……….29

3.1.4.3 Định tính phân đoạn ethylacetat……… ……….33

3.2 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao lỏng Ngưu bàng…… …………35

3.2.1 Kết quả nghiên cứu sau10 ngày uống thuốc……… ………35

3.2.2 Kết quả nghiên cứu sau 20 ngày uống thuốc……… ………… 39

3.2.3 Kết quả giải phẫu bệnh: Hình ảnh gan và tụy……… …………43

3.2.3.1 Kết quả đại thể gan, tụy chuột nhắt trắng……… ……… 43

3.2.3.2 Kết quả vi thể gan chuột nhắt trắng……… …………44

3.2.3.3 Kết quả đại thể tụy……… ……… 45

3.2.3.4 Kết quả vi thể tụy……… ……….45

3.3 Bàn luận……… ……….47

3.3.1 Về mặt hóa học……… ………… 47

3.3.2 Về tác dụng của cao lỏng Ngưu bàng trên glucose huyết và các chỉ

số sinh hóa khác……… ……… 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… ………53

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ch ữ viết tắt Ch ữ viết đầy đủ

COX-2 mRNA Cyclooxygenase-2

ĐTĐ Đái tháo đường

EtOAc Ethylacetat

GH Glucose huyết

GLUT2 Glucose transporter 2

HDL Lipoprotein tỷ trọng cao – High density lipoprotein

HE x 400 Nhuộm Hematoxylin - Eosin, độ phóng đại 400 lần

HFD Chế độ ăn giàu chất béo - High fat diet

HFF Chế độ ăn giàu chất béo và fructose – High fat diet

plus fructose LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp- Low-density lipoprotein MDA Malonyl dialdehyd

NDF Chế độ ăm bình thường-Normal fat diet

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Ký hi ệu Tên b ảng Trang

1 Bảng 1.1 Công thức hóa học của một số hợp chất phân lập từ các bộ

2 Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của chế độ ăn NFD và HFD của

3 Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ một số nhóm chất trong mẫu

4 Bảng 3.2 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ rễ Ngưu bàng 25

5 Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn toàn phần rễ Ngưu Bàng 26

6 Bảng 3.4 Kết quả định tính một số nhóm chất trong phân đoạn

7 Bảng 3.5 Kết quả định tính cắn phân đoạn n-hexan 28

8 Bảng 3.6 Kết quả định tính một số nhóm chất trong phân đoạn

CHCl3

29

9 Bảng 3.7 Kết quả định tính cắn phân đoạn CHCl3 32

10 Bảng 3.8 Kết quả định tính một số nhóm chất trong phân đoạn

EtOAc

33

11 Bảng 3.9 Kết quả định tính cắn phân đoạn EtOAc 34

12 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của chế độ ăn và cao lỏng Ngưu bàng lên cân

nặng chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 35

13 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ glucose

máu chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 36

14 Bảng 3.12

Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ cholesterol toàn phần trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc

36

15 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ

triglyceride trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 37

16 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ LDL-

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 37

17 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ HDL -

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 38

18 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên chỉ số trọng lượng

gan tương đối trên chuột nhắt trắng sau 10 ngày uống thuốc 38

19 Bảng 3.17 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên hàm lượng MDA

dịch đồng thể gan sau 10 ngày uống thuốc 39

20 Bảng 3.18 Ảnh hưởng của chế độ ăn và cao lỏng Ngưu bàng lên cân

nặng chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 39

21 Bảng 3.19 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ glucose

máu chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 40

22 Bảng 3.20

Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ cholesterol toàn phần trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc

40

23 Bảng 3.21 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ

triglyceride trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 41

24 Bảng 3.22 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ LDL-

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 41

25 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên nồng độ HDL -

cholesterol trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 42

26 Bảng 3.24 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên trọng lượng gan

tương đối trên chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 42

27 Bảng 3.25 Ảnh hưởng của cao lỏng Ngưu bàng lên hàm lượng MDA

dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng sau 20 ngày uống thuốc 43

28 Bảng 3.26 Nhận xét về hình ảnh đại thể gan chuột nhắt trắng 43

DA NH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

STT Ký hi ệu Tên hình Trang

6 Hình 3.6 Sắc ký đồ cắn toàn phần và cắn 3 phân đoạn 31

7 Hình 3.7 Hình thái vi thể gan chuột lô chứng 44

8 Hình 3.8 Hình thái vi thể gan chuột lô mô hình 44

9 Hình 3.9 Hình thái vi thể gan chuột lô uống gliclazid (1) 44

10 Hình 3.10 Hình thái vi thể gan chuột lô uống gliclazid (2) 44

11 Hình 3.11 Hình thái vi thể gan chuột lô 4 uống cao lỏng Ngưu

12 Hình 3.12 Hình thái vi thể gan chuột lô 4 uống cao lỏng Ngưu

13 Hinh 3.13 Hình thái vi thể gan chuột lô 5 uống cao lỏng Ngưu

14 Hình 3.14 Hình thái vi thể gan chuột lô 5 uống cao lỏng Ngưu

15 Hình 3.15 Hình thái vi thể tụy chuột lô chứng 45

16 Hình 3.16 Hình thái vi thể tụy chuột lô mô hình 45

17 Hình 3.17 Hình thái vi thể tụy chuột lô uống gliclazid 46

18 Hình 3.18 Hình thái vi thể tụy chuột lô uống cao lỏng Ngưu bàng

19 Hình 3.19 Hình thái vi thể tụy chuột lô uống cao lỏng Ngưu bàng

có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học

Với vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên ưu đãi, Việt Nam có một thảm thực vật phong phú và đa dạng với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao [1], khoảng 4.000 loài được sử dụng làm thuốc Tuy vậy chỉ có một số lượng ít loài cây và vị thuốc được sử dụng ở mức độ tương đối phổ biến theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu kỹ và đầy đủ

Ngưu bàng có tên khoa học là Arctium lappa L., họ Cúc Asteraceae thuộc chi Arctium L, cây còn có tên gọi khác như: Đại đao, á thực, hắc phong tử, thứ niêm

tử, ngưu báng, ngưu bảng [7] Ngưu bàng được nhập từ Trung Quốc vào Việt Nam

từ năm 1959, đã được trồng thử ở Lào Cai, Lai Châu, Nghĩa Lộ [6] Trong y học cổ truyền, Ngưu bàng mới chủ yếu dùng hạt (ngưu bàng tử) làm thuốc điều trị cảm cúm, trị viêm phổi, viêm amidal, trị sốt, chữa họng hầu sưng đau, có tác dụng cầm máu, giải độc, nhuận tràng… Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của rễ Ngưu bàng và cho những kết quả rất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như bảo vệ gan,

hạ đường huyết, chống ung thư, ức chế HIV… [53], [18]

Hiện đã có một số nghiên cứu về rễ Ngưu bàng (Ngưu bàng căn) tại trường

ĐH Dược HN, và bước đầu đã thu được các kết quả về mặt thực vật, thànhphần hóa học, một số tác dụng sinh học … Nhằm làm sáng tỏ hơn nữa thành phần hóa học

cũng như tác dụng sinh học của rễ Ngưu bàng, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng hạ đường huyết của cao lỏng rễ Ngưu bàng’’ được thực

hiện với mục tiêu sau:

1 Sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học của rễ Ngưu bàng

2 Thử tác dụng hạ đường huyết của cao lỏng rễ Ngưu bàng

Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

1 Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu

2 Chiết xuất các thành phần từ rễ Ngưu bàng bằng phương pháp chiết lỏng lỏng

3 Định tính sự có mặt của các nhóm chất trong các dịch chiết bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

4 Thăm dò tác dụng hạ đường huyết của cao lỏng Ngưu bàng trên mô hình gây đái tháo đường cho chuột bằng chế độ ăn kết hợp alloxan

Phần 1 TỔNG QUAN

1.1.THỰC VẬT HỌC

1.1.1.Vị trí phân loại của chi Arctium L

Ngưu bàng có tên khoa học là Arctium lappa L., họ Cúc Asteraceae thuộc chi Arctium L, cây còn có tên gọi khác như: Đại đao, á thực, hắc phong tử, thứ niêm

tử, ngưu báng, ngưu bảng [7]

Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtaijan, vị trí của chi Arctium L được tóm tắt như sau:[5], [8], [15]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Arctium L

Cây thảo, lá ở gốc xếp hình hoa thị, lá ở thân mọc so le [5] Cụm hoa đầu có bao chung, gồm nhiều lá bắc kéo dài thành mũi nhọn, có móc ở đỉnh Khi chín sẽ

thành móc quặp giúp cho sự phát tán nhờ động vật [5] Chi Arctium L gồm 10 loài

ở vùng ôn đới lục địa Ở nước ta có nhập trồng một loài là Arctium lappa L [7]

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố loài Arctium lappa L

Đặc điểm thực vật:

Cây thảo sống hai năm hoặc nhiều năm, cao 1,5-2m, thân thẳng phân nhánh,

có rãnh dọc, màu tím tía, có lông Lá trái xoan, mọc thành hình hoa thị ở gốc và so

le ở trên thân, mặt dưới có nhiều lông trắng mịn [5], [6], [18], cuống lá dài, phiến lá

to rộng, gốc hình tim, đầu tù hay nhọn, mép có răng cưa hay lượn sóng Lá dài 40cm, rộng 20-30cm Cụm hoa hình đầu mọc ở đầu cành, đường kính 2-4cm Hoa

màu đỏ hay tím nhạt, các lá của bao chung kéo dài thành mũi nhọn, có móc ở chóp

Quả bế, màu xám nâu điểm hồng [5], thuôn hoặc gần thành hình trứng hơi có cạnh tam giác Quả có nhiều móc quặp, phía trên có một mào lông ngắn [5] Củ tròn và dài có thể dài từ 1,2-2,7m nếu trồng từ hai năm trở lên Nở hoa vào tháng 6-7, có quả tháng 7-8 [13], [19]

Ngưu bàng có nguồn gốc ở vùng ôn đới ẩm thuộc Nam Âu hoặc Tây Á Hiện nay, cây mọc tự nhiên ở vùng cận Himalaya thuộc Ấn Độ, Nepal và Trung Quốc

Cây còn được trồng ở nhiều nơi Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên [18]

Ngưu bàng ưa ẩm, ưa sáng và thích nghi với vùng khí hậu á nhiệt đới núi cao, nhiệt độ trung bình 15-18o

C [18] Nước ta nhập trồng Ngưu bàng từ năm 1959 làm thuốc ở vùng cao Lai Châu, Lào Cai, Nghĩa Lộ [6], [19] Ở vùng cao huyện Bát Xát (Lào Cai) khảo sát thấy Ngưu bàng mọc hoang

Ngưu bàng rất dễ trồng Tuy nhiên, trong nhiều năm gần đây, cây không được chú ý phát triển nên chỉ còn một số cây được duy trì thường xuyên với mục đích giữ giống tại Trại giống Sapa- Viện Dược liệu [18]

Từ năm 2004 Ngưu bàng đã được trồng tại bãi giữa sông Hồng với hạt giống được nhập từ Úc

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Theo một số tài liệu cho thấy :

+ Trong quả Ngưu bàng có chứa:

- Nhóm lignan: arctiin (C17H34O11.H2O) [13], [19], hàm lượng 15 - 21,5% [13], aglycon là L-arctigenin, ngoài ra còn có isoarctigenin (nếu dùng KOH 2%

thủy phân thì sinh ra arctigenin-4-gentiobiosid) [19], arctigenin [18], (+)-7,8- didehydro arctigenin, diarctigenin, các lappa-ol A, B, C, D, E, F, H, neoarc- B, các etignan A-E, neoarctiin-A, neoarctiin-B [19]

- Nhóm sterol: daucosterol [18]

- Nhóm polysaccharide: inulin [18]

- Nhóm dầu béo 15-30% [18], 25-30% [13], [19] Thành phần chủ yếu gồm các

glycerid của các acid palmatic, stearic, oleic [13], acid arachidonic, một ít acid

stearic, acid palmatic, trị số iod là 138,83 [19]

- Nhóm các thành phần khác: acid chlorogenic, matairesinol, germacranolid [19] +Trong lá Ngưu bàng có chứa:

- Sesquiterpene: trong lá khô có chứa tinh dầu, arctiol (8α-Hydroxyeudesmol), Δ9(10)

- fukinon (dehydrofukinol), fukinol, fukinanolid, β-eudesmol, petasitolon, eremophilen,

taraxasterol Trong lá tươi có chứa onopordopicri, arctiopicrin [32]

- Triterpenes: các alcol terpene tự do, sterol tự do, triterpene ester Từ dịch chiết

ether dầu hỏa của lá khô đã phân lập được: triterpene alcol tự do (α-amyrine, β-amyrine,

lupeol, phytol, ω-taraxasterol, taraxasterol), triterpene alcohol acetat (taraxasterol acetat,

α-amyrine acetat, β-amyrine acetat, lupeol acetate, ω-taraxasterol acetat) alcol triterpene

este với các acid béo chuỗi dài (taraxasterolester, α-amyrine ester, β-amyrine ester,

lupeolester, phytolester, ω-taraxasterolester) [32]

- Acid béo: 94,7% acid béo no (C14- C26) và 5,3% acid béo không no (C18)

[32]

- Acid phenol carbonic: acid caffeic [32], acid ascorbic, chất nhày, tannin

Ngoài ra trong lá còn chứa artiin và artigenin [13], men oxydase [18]

+ Trong rễ Ngưu bàng (Ngưu bàng căn) có chứa:

- Nước: 70% [19], [32]

- Nhóm polysaccharide: inulin khoảng 50% [18], 56% [19], 57% (có khi tới

70%) [13], 45% [6] aretose [19], glucose 5-6% [13], fructofuranan có trọng lượng

phân tử thấp (một dạng inulin)

- Anbumin 2% [19], vitamin: B1, B2, PP,C [19]

- Hợp chất acetylen: polyacetylen [18]: hàm lượng 0,001-0,002% (tính theo dược

liệu khô kiệt), bao gồm chủ yếu: 1,11-tridecacdien- 3,5,7,9- tetrayne và 1,3,11-

tridecatrien- 5,7,9- triyne, acid artiic (hợp chất acetylen có S) [18], arctinal, arctinol A,

arctinol B, arctinon-A, arctinon-B, arctinon-A-acetat, acid arctic B, acid arctic C và acid

arctic-B-methylester [32]

+ Acid alkyl của sulfur: acid aretic có cấu trúc: 5’- (1-propynyl) - 2,2’- bithienyl- 5- carboxylic acid [19], acid gama - guanidine - n- butyric [18]

+ Acid béo: từ 0,4-0,8 % [32] bao gồm acid stearic, acid palmitic, acid oleic, acid linoleic [19]

- Các aldehyd: Fomaldehyd, acetaldehyd, propionic aldehyd, isopropyl aldehyd [19]

- Alkyl polyalkyl 0,001- 0,002%, trong đó: 1,11- tridecadien- 3,5,7,9-tetrayne chiếm 50%, 1,3,11- tridecatrie- 5,7,9- triyne chiếm 30% [19]

- Triterpene: 15,2% triterpenester, 12,8% sterol tự do (sitosterol, stigmasterol) 10,7%, triterpenacetat, 2,9% triterpenacid và 2,4% triterpenalcohol (α-amyrine, β-amyrine, lupeol, taraxasterol, phytol) được phân lập từ dịch chiết ether dầu hỏa của rễ [32]

- Nhóm lignan: neoarctin A và lignanolide arctiin [32]

Từ rễ ngưu bàng còn phân lập được baicalin và genistin [66] và Sitosterol- β - glucopyranosid [52]

D Rễ ngưu bàng còn chứa methylen chloride, alchohol [19], chất béo 0,4%, hàm lượng lớn các chất nhầy [13], [67], chất đắng, nhựa [13]; các nguyên tố vi lượng như calci, phospho, natri, sắt, men peroxydase [18], chất sợi [32]

- Trong rễ tươi có chứa tinh dầu, tannin, acid stearic, một carbua hydrogen và một phytosterol [6]

Từ dịch chiết Ngưu bàng thu mua trên thị trường Hà Nội, Trần Thị Thu Trang đã phân lập được một flavonol glycosid, có công thức hóa học là C12H20O11

có tên khoa học là kaempferol 7-O-glucoside [17]

Bảng 1.1 Công thức hóa học của một số hợp chất phân lập từ các bộ phận của

O

H

[13] [32]

O OH

O

O H

O OH

OH OH O

O H

[32]

O H OH

O H

OH

[17]

OH O

OH

O

OH OH O

9 Lappaol D Quả

OH

CH 2 OH OH OMe

O

OMe OMe

MeO O H

O

[13] [19]

10 Sitosterol- β -

D-glucopyranosid Rễ

O HO

HO

OH O

OH

H H H

Cao rễ ngưu bàng có tác dụng hạ glucose máu; cuống và thân cây làm thức

ăn có tác dụng làm tăng lượng glycogen trong gan [18]

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng rễ và quả Ngưu bàng có tác dụng hạ đường huyết Sitosterol- β - D-glucopyranosid được coi là chất có hiệu quả nhất trong rất nhiều hoạt chất đã tìm thấy trong rễ Ngưu bàng Đã có nghiên cứu chứng minh tác dụng ức chế α - glucosidase của Sitosterol- β - D-glucopyranosid (α - glucosidase là enzym có khả năng phân hủy glycoprotein và glycogen) Ức chế hoạt động của glucosidase là cơ sở để điều trị tiểu đường và béo phì [52] Ngoài ra γ- glucoside-fructose ester (inulin) có khả năng điều hòa lượng glucose trong máu Inulin là một chất thuộc nhóm carbohydrat có trong rễ Ngưu bàng có thể hoạt động trên các receptor trên bề mặt tế bào, do đó tăng khả năng dung nạp glucose ở mức cao [63]

Tác dụng hạ đường huyết của hạt Ngưu bàng đã được nghiên cứu trên mô hình gây tăng đường huyết bằng alloxan Kết quả cho thấy sau 10 ngày uống dịch chiết lingan toàn phần từ hạt với các mức liều 2,0; 1,0; 0,5 và 1,38; 0,69; 0,35 g/kg nồng độ glucose huyết, triglycerid, cholesterol giảm đáng kể gần như về mức bình thường Đồng thời khả năng dung nạp glucose, nồng độ insulin máu và HDL-cholesterol tăng nhưng không có nguy cơ hạ đường huyết quá mức Do đó dịch chiết quả Ngưu bàng có tác dụng hạ đường huyết tương đối an toàn và có thể giúp ngăn ngừa các biến chứng của bệnh tiểu đường [68]

Dịch chiết ethanol rễ Ngưu bàng có tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết bằng streptozotocin Sau 14 ngày uống dịch chiết ethanol rễ Ngưu bàng cho thấy lượng insulin trong máu tăng và nồng độ glucose huyết giảm đáng kể Cơ chế có thể do dịch chiết kích thích tiết insulin và tái tạo các tế bào β tụy

đã bị streptozotocin phá hủy [36]

Ngưu bàng có tính kháng khuẩn cao [18] Thuốc ngâm hạt Ngưu bàng trong ống nghiệm có tác dụng đối với nhiều loại nấm gây bệnh và có khả năng ức chế ở các mức độ khác nhau Rễ cũng có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm [19]

Nước sắc ngưu bàng tử có tác dụng ức chế tụ cầu vàng và một số nấm ngoài

da [4]

Dịch chiết ethyl acetat của Ngưu bàng có tác dụng kháng khuẩn đối với một

số chủng vi khuẩn như: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus mutans và Candida albicans [56]

Cao toàn phần của lá Ngưu bàng có tác dụng ức chế một số chủng vi khuẩn:

Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacilus subtilis, Candida albicans [33]

Acid Chlorogenic phân lập từ lá Ngưu bàng có tác dụng kiềm chế một số vi

khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus [47]

Rễ Ngưu bàng có tác dụng chống khối u [19] (tuy nhiên tác dụng này mới được thử nghiệm ban đầu trong ống nghiệm và trên động vật, chưa được thử

nghiệm trên người [67]), có khả năng ức chế sự phát triển của virus HIV [18]

Nước sắc Ngưu bàng được ủ với một dịch treo chứa tế bào H9 và HIV, sau 4 ngày ủ ấm, nhuộm soi tìm kháng nguyên HIV bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp và tính tỷ lệ số tế bào bị nhiễm so với đối chứng Độ giảm các tế bào bị nhiễm tính theo tỷ lệ phần trăm được coi là chỉ tiêu đánh giá hoạt lực kháng virus Kết quả cho thấy, Ngưu bàng có khả năng ức chế HIV cao trong thử nghiệm này [18]

Từ quả Ngưu bàng phân lập được arctigenin- là một phenyl propanoid- có tác dụng làm giảm quá trình tăng sản tế bào tại tế bào lai MH 60 (IC50 là 1,0µM), tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ngăn cản quá trình tổng hợp nitơ oxy [22] Dịch chiết diclorua methal của Ngưu bàng và arctigenin phân lập từ Ngưu bàng có tác dụng làm giảm nguồn dinh dưỡng của yếu tố gây độc tế bào ở nồng độ C=0,01µg/ml với hiệu quả 100% [22] Cơ chế là do sự bất hoạt Akt do thiếu glucose Baicalin và genistin ức chế chọn lọc trên ADN polymerase của động vật có

vú Trong đó, genistin là dược chất kháng đột biến, ức chế chọn lọc trên hoạt động của TdT (Terminal deoxyribonucleotidyl Transferase) [66]

Cao toàn phần rễ Ngưu bàng có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng tetra cloruacarbon và bằng acetaminophen với liều 600mg/kg thể trọng chuột [46], theo cơ chế chống oxy hóa Có tác dụng chống viêm trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin; baicalin trong dịch chiết diclorua methal của ngưu bàng có tác dụng chống viêm và hạ nhiệt [42]

Dịch chiết Ngưu bàng có khả năng chống viêm thông qua cơ chế ức chế giải phóng cysteinyl leukotrienes (Cys-LTs) bởi các tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi Ngoài ra, dịch chiết Ngưu bàng còn có tác dụng ức chế các phản ứng dị ứng cấp tính trên chuột được gây phù tai [42]

Lappaol F, diarctignin và arctigenin trong hạt và lá có khả năng ức chế tổng hợp NO bởi các inducible nitric oxide synthase (iNOS) trong các đại thực bào Do

đó, có thể điều trị một số bệnh như viêm khớp dạng thấp, viêm mạn tính, bệnh tự miễn [23]

Dịch chiết methanol của cây Ngưu bàng có tác dụng chống viêm bằng cách

ức chế tác dụng của COX-2 dẫn tới giảm giải phóng PGE2 [23]

Theo các nghiên cứu cho thấy thành phần chính của rễ Ngưu bàng là các flavonoid và các acid phenolic [30] Các chất này có khả năng dập tắt các gốc tự do

Do đó có thể ngăn ngừa các nguy cơ xơ vữa động mạch, tai biến, lão hóa [2] Một

số nghiên cứu đã chứng minh acid caffeoylquinic (acid chlorogenic và acid dicaffeoylquinic) và quercetin (có trong rễ Ngưu bàng) có tác dụng chống oxi hóa mạnh [30]

Tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết nước và dịch chiết nước nóng rễ Ngưu bàng không có sự khác biệt đáng kể Hai dịch chiết này khi được sử dụng ở liều 1,0mg đều có khả năng thu thập 60,4-65,0% superoxide và 80,5% hydrogen peroxyd [57]

Dịch chiết methanol rễ Ngưu bàng với thành phần chính là acid chlorogenic và acid caffeic có tác dụng làm giảm quá trình oxi hóa của LDL-cholesterol, deoxiribose và protein Với liều 200µg/ml không chỉ có tác dụng tăng nồng độ của glutathion mà còn tăng hoạt tính của enzym glutathion reductase, glutahtione peroxidase [23]

Nhiều công trình nghiên cứu đã tìm ra các tác dụng dược lý khác của Ngưu

bàng như: tác dụng giảm ho [41], tác dụng trên loét dạ dày tá tràng [48], [69], trên

thần kinh vận động [19], làm giảm triệu chứng của viêm cầu thận [37], tác dụng ức chế yếu tố hoạt hóa tiểu cầu [18]…

1.3.2 Công dụng

Rễ (Ngưu bàng căn) có vị đắng cay, tính hàn, có tác dụng lợi tiểu (loại được acid uric), khử độc, ra mồ hôi, lợi mật, nhuận tràng, trị giang mai, đái đường, chống nọc độc [6]

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, rễ Ngưu bàng được xem như một dược liệu có tác dụng lọc máu, kích thích tiêu hoá Ngoài ra, còn được dùng trong hay dùng ngoài để điều trị eczema, vẩy nến, đau xương khớp và có tác dụng lợi tiểu Có thể dùng phối hợp với các vị thuốc khác để điều trị viêm họng, viêm amidal, cảm lạnh, sởi [67]

Ở Nhật Bản và một số nơi khác, rễ Ngưu bàng được sử dụng như một loại thức ăn và ngày càng trở nên thông dụng trong một loại chè để chữa ung thư [67] Canh dưỡng sinh trong đó có thành phần là rễ Ngưu bàng kết hợp với một số

vị thuốc khác có tác dụng cải thiện và chữa nhiều bệnh như: tiểu đường, ung thư, các bệnh về da và khí quản, các bệnh ở não…[11]

Y học hiện đại dùng rễ Ngưu bàng làm thuốc lợi tiểu, ra mồ hôi, lọc máu; dùng trong bệnh thấp khớp, trị đau và sưng khớp; bệnh ngoài da (hắc lào, trứng cá, mụn nhọn, lở loét) Rễ, cuống lá và thân cây dùng điều trị bệnh đái tháo đường Dạng cao thuốc hoặc thuốc bột có tác dụng hạ glucose máu và tăng lượng glycogen trong gan [18] Lá Ngưu bàng đắp vào nơi sưng tấy, mụn nhọt để tiêu viêm, trừ mủ, giảm đau Có thể dùng hoa dưới dạng thuốc hãm, rễ dưới dạng thuốc sắc để chữa mụn nhọt giảm đau, chữa trí, viêm thận và lao da [4]

Theo Hoàng Văn Vinh [19], rễ Ngưu bàng có tác dụng trừ phong nhiệt, tiêu độc sưng, trị phong độc mặt sưng, đầu chuếnh choáng, họng hầu sưng nóng, đau răng, ho, tiêu khát, mụn nhọt lở ngứa Rễ, thân chữa thương hàn nóng lạnh, trúng phong, mặt sưng, tiêu khát, trúng nhiệt, trục thủy Ngoài ra, rễ cắt vụn đảo với miến ăn chữa đầy bụng Dùng rễ, lá với chút muối giã đắp để loại mụn nhọt

Theo tài liệu cổ, Ngưu bàng có vị cay, đắng, tính hàn, quy vào 2 kinh phế và

vị Có tác dụng tán phong nhiệt, thanh nhiệt giải độc, tuyên phế, thấu chẩn Dùng chữa ngoại cảm biểu chứng, ma chẩn (đậu, sởi), vị thấu, phong chẩn, yết hầu sưng đau, ung thũng [13]

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GÂY TĂNG ĐƯỜNG HUYẾT TRÊN THỰC NGHIỆM

Đã có một số mô hình gây tăng glucose huyết trên thực nghiệm được nghiên cứu và áp dụng, các mô hình này đều làm tăng nồng độ glucose huyết nhờ một trong số các cơ chế sau:

 Đưa glucose từ bên ngoài vào cơ thể

 Tăng lượng glucose nội sinh bằng cách: Giảm sử dụng glucose ở tổ chức và

ở ngoại vi hoặc tăng phân hủy glycogen thành glucose ở gan

 Gây tổn thương hoặc phá hủy cơ quan bài tiết insulin

 Gây tăng đường huyết bằng chế độ ăn

 Kết hợp các phương pháp

1.4.1 Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng alloxan

Tác dụng gây ĐTĐ của alloxan được Dunn Sheehan và Letchie phát hiện ra đầu tiên vào năm 1943 khi nghiên cứu độc tính của chất này trên thận Liều để gây ĐTĐ tùy thuộc vào từng loài khác nhau và từng nghiên cứu Ví dụ: có thể dùng liều 150mg/kg truyền tĩnh mạch 10 phút, hoặc 60mg/kg tiêm tĩnh mạch, hoặc tiêm 125mg/kg tiêm màng bụng 1 liều duy nhất [35], [65] Ở hầu hết các loài sau khi dùng thuốc đều có biểu hiện đầu tiên là giảm glucose huyết, có lẽ là do insulin giải phóng từ tiểu đảo tụy khi bị tổn thương, tiếp sao đó là giai đoạn tăng glucose máu

ổn định và kéo dài [35]

Cơ chế gây ĐTĐ: Alloxan là một hợp chất pyrimidin triketon có cấu trúc tương tự glucose và acid uric, tích lũy, gây độc trực tiếp và chọn lọc lên tế bào β của tiểu đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển glucose GLUT2 Bên trong tế bào xảy

ra quá trình tương tác giữa alloxan và các nhóm SH nội bào, đặc biệt là glutathion, sinh ra sản phẩm là acid dialuric có khả năng tự oxi hóa Quá trình tự oxi hóa của chất này đã sản sinh ra các gốc superoxid: hydrogen peroxide và gốc hydroxyl Các gốc hydroxyl là tác nhân cuối cùng gây tiêu diệt tế bào β, tế bào này có khả năng chống lại sự oxi hóa rất kém, vì vậy gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin [27], [28], [44]

1.4.2 Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng Streptozotocin

Streptozotocin gây độc trực tiếp và chọn lọc trên tế bào β của đảo tụy thông qua hệ thống vận chuyển GLUT2, bẻ gãy sợi ADN, ức chế sự sao chép ADN ức chế

sự nhân lên của tế bào, dần dần dẫn đến hủy hoại tế bào đảo tụy và gây ra tình trạng ĐTĐ phụ thuộc insulin trên động vật thực nghiệm [44]

Để gây được mô hình ĐTĐ trên động vật thực nghiệm liều dùng của streptozotocin được lựa chọn tùy thuộc từng nghiên cứu và tùy thuộc từng loài khác nhau Có thể sử dụng một liều cao duy nhất, hoặc có thể dùng liều thấp và đa liều (40mg/kg trong 5 ngày liên tiếp) để gây ĐTĐ trên các loài gặm nhấm [25]

1.4.3 P hương pháp gây tăng đường huyết bằng glucose ngoại sinh

Đây là xét nghiệm kinh điển và thường được sử dụng trong chẩn đoán ĐTĐ

ở người Việc đưa glucose từ bên ngoài vào cơ thể với liều thích hợp là một phương pháp làm đơn giản và an toàn nhằm gây tăng glucose huyết Dựa vào nồng độ GH

đo được sau 2h uống 75g glucose (hoặc 85g saccharose), có thể chẩn đoán bệnh nhân bị ĐTĐ hay ở tình trạng rối loạn dung nạp glucose Glucose được đưa vào cơ thể động vật theo đường uống hoặc đường tiêm tĩnh mạch Theo Phùng Thanh Hương, liều hợp lý nhất có thể gây tăng glucose trên chuột cống trắng là 3g/kg thể trọng [12] Ngoài glucose, người ta còn có thể sử dụng fructose thay thế để gây tăng đường huyết

1.4.4 Phương pháp gây ĐTĐ typ 2 do chế độ ăn giàu chất béo kết hợp alloxan

 Các chỉ số đánh giá: Nồng độ GH, nồng độ cholesterol toàn phần, HDL –cholesterol, LDL – cholesterol, nồng độ triglycerid huyết thanh, MDA dịch đồng thể gan

 Nguyên tắc: Chuột được nuôi béo phì trong khoảng thời gian nhất định, sau

đó được tiêm alloxan để gây ĐTĐ typ 2 Cho chuột uống thuốc trong khoảng thời gian nhất định, sau đó định lượng các chỉ số sinh hóa và giải phẫu mô bệnh học để đánh giá ảnh hưởng của thuốc trên các tác dụng này bằng cách so sánh lô uống thuốc và lô chứng bệnh

Trong mô hình của Reed, Zang F và Srinivansan K, chuột được nuôi bằng chế độ ăn giàu chất béo có nồng độ glucose huyết tương tự như chuột được nuôi

bằng chế độ ăn bình thường nhưng nồng độ insulin, acid béo tự do và triglycerid trong máu tăng cao rõ rệt Các tác giả đều nhận định chế độ ăn giàu chất béo gây ra tình trạng kháng insulin, khiến nhu cầu về bài tiết insulin tăng cao hơn so với bình thường [40], [49] Theo một mô hình khác của Fabiola, chuột cũng được nuôi bằng chế độ ăn giàu lipid nhưng có bổ sung thêm fructose 60% vào thức ăn cũng cho thấy đường huyết, nồng độ cholesterol toàn phần, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, nồng độ triglycerid của chuột ăn chế độ ăn HFF cao hơn nhiều so với chuột ăn chế độ ăn bình thường [29] Chế độ ăn giàu lipid gây ra tình trạng kháng insulin và rối loạn chuyển hóa lipid, việc trộn thêm fructose gây tăng rối loạn chuyển hóa ở gan vì khi nồng độ fructose trong gan quá cao sẽ dẫn đến tăng cường tích lũy triglycerid ở gan và làm suy giảm khả năng chuyển hóa glucose và lipid ở gan do đó làm tăng nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch [53], [59], [61] Lúc này, chỉ cần tổn thương ở tụy là có thể gây giảm sản xuất insulin, sẽ làm xuất hiện những biến đổi rõ rệt về glucose huyết và các chỉ số sinh hóa khác

Trong mô hình gây ĐTĐ bằng alloxan của Elshater chuột sau khi tiêm alloxan, theo dõi nồng độ GH và các chỉ số sinh hóa khác, kết quả cho thấy 6 tuần sau khi tiêm alloxan với liều 150mg/kg nồng độ GH, cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-choloesterol đều cao hơn so với chuột bình thường [20] Do đó có thể kết hợp hai mô hình trên để đánh giá tác dụng của thuốc không chỉ trên GH và còn trên các chỉ số hóa sinh khác Chế độ ăn HFF gây ra tình trạng stress oxi hóa tại gan gây tổn thương tế bào gan, do đó mô hình còn đánh giá được ảnh hưởng của thuốc lên khả năng chống oxi hóa của gan thông qua định lượng MDA dịch đồng thể gan

Một mô hình gây ĐTĐ typ 2 khác bằng chế độ ăn giàu chất béo kết hợp alloxan Theo mô hình này chuột được cho ăn một loại nhũ tương các chất béo với liều 10ml/kg trong 10 ngày, sau đó tiêm alloxan với liều 50mg/kg Kết quả cho thấy nồng độ glucose huyết, nồng độ acid béo tự do, nồng độ MDA của gan đều tăng cao so với bình thường Do vậy mô hình này dùng để gây tình trạng kháng insulin và rối loạn chuyển hóa tương tự như ĐTĐ typ 2 trong thời gian ngắn và chi phí thấp hơn các mô hình khác [21]

1.4.5 Một số phương pháp khác

Mô hình gây ĐTĐ typ 2 bằng chế độ ăn kết hợp STZ liều thấp [36], [45] Mô hình gây tăng GH theo cơ chế chống phá hủy tế bào β của đảo tụy bằng một số hormon tăng trưởng tuyến yên; hormon vỏ thượng thận (hydrocortison, cortison, dexamethason); hormon tủy thượng thận (adrenalin gây tăng GH nhưng ít xuất hiện glucose niệu) [12], [50]

Mô hình gây tăng GH do phá hủy tế bào β đảo tụy bằng các hóa chất khác như: N-ethyl nitrosoure, vacor, dithizone, 8-hydroxyquinolon, monosodium glutamat [25], [35], [54]

 Mô hình gây tăng GH bằng virus: một số virus dễ gây ĐTĐ như virus gây viêm não, viêm cơ tim dạng D, virus gây sởi Đức, virus gây bệnh bại liệt và quai bị [35]

 Gây triệu chứng ĐTĐ tạm thời trên chuột lang bằng cách tiêm cho chuột huyết thanh của loài khác mà có chứa kháng thể kháng insulin để gây ra tình trạng thiếu hụt insulin ở chuột [35]

 Mô hình gây ĐTĐ bằng cắt bỏ tuyến tụy: mức độ trầm trọng của bệnh tùy thuộc vào việc cắt bỏ một phần hay hoàn toàn tuyến tụy

Phần 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu

- Mẫu nghiên cứu:

+ Cành mang hoa, lá tươi để giám định tên khoa học

+ Rễ Ngưu bàng tươi rửa sạch, thái mỏng, phơi se, rồi sấy khô ở 60ºC, nghiền thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng hạ đường huyết

- Nơi thu hái: Hà Nội

- Thời gian thu hái: 2/2012

Mẫu nghiên cứu được PGS TS Nguyễn Khắc Khôi - Viện Sinh Thái và Tài

Nguyên sinh vật giám định tên khoa học là: Arctium lappa L., họ Cúc (Asteraceae)

- Mẫu nghiên cứu tác dụng sinh học:

Nguyên liệu được làm nhỏ sấy khô đem chiết bằng nước 3 lần theo phương pháp sắc mỗi lần sắc khoảng 2 giờ, dịch lọc thu được đem cô cách thủy ở 60-70o

C đến cao lỏng 1:1

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất

- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam III, IV

+ Gliclazid (biệt dược Diamicron MR viên 30 mg) do Công ty Servier (Pháp) sản xuất

+ Alloxan lọ 20g của Hãng Bio Basic INC, Canada

+ Kit định lượng glucose hãng Terumo, Nhật Bản

+ Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), LDL- cholesterol (LDL-C), HDL- cholesterol

(HDL-C) của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo)

+ Các hóa chất làm xét nghiệm mô bệnh học đạt tiêu chuẩn

2.2.2 Động vật thí nghiệm

- Thử tác dụng hạ glucose hu yết : chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoẻ mạnh,

cả hai giống trọng lượng trung bình 20 ± 2g, được chăn nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm ổn định về nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng; đạt tiêu chuẩn thí nghiệm được đặt hàng tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

2.2.3 Phương tiện và máy móc

- Tủ sấy SHELLAB

- Cân phân tích Precisa,

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Máy cất quay BUCHI ROTAVAPOR R-200

- Kính hiển vi Leica BME

- Máy ảnh, máy xác định hàm ẩm Sartorius

- Máy đo quang ELISA

- Bản mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 của hãng MERCK (Đức)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3 1 Nghiên cứu về hóa học

- Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu và các phân đoạn bằng các phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng theo tài liệu:

+ Bài giảng dược liệu, tập I và II [2]

+ Thực tập dược liệu- Phần hóa học [3]

+ Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [10]

2.3.2 Nghiên cứu tác dụng trên đường huyết

Tiến hành theo phương pháp của Fabiola (2011) và Elshater (2009).[20], [29]

Phương pháp gây tăng đường huyết bằng chế độ ăn giàu lipid và fructose kết hợp với tiêm alloxan trên chuột nhắt

Nguyên tắc: Chuột được nuôi béo phì trong khoảng thời gian nhất định sau đó được tiêm alloxan để gây ĐTĐ typ 2 Cho chuột uống thuốc trong khoảng thời gian nhất định, sau đó định lượng các chỉ số sinh hóa và giải phẫu mô bệnh học để đánh giá ảnh hưởng của thuốc trên các tác dụng này bằng cách so sánh lô uống thuốc và lô chứng bệnh

 Cách tiến hành:

Chuột nhắt trắng giống đực khỏe mạnh được chia làm 5 lô:

- Lô 1: Lô chứng: chế độ NFD + uống nước cất

- Lô 2: Lô mô hình: chế độ HFF + tiêm alloxan + uống nước cất

- Lô 3: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống gliclazid liều 30 mg/kg

- Lô 4: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 1

- Lô 5: Chế độ HFF + tiêm alloxan + uống thuốc cần thử với liều 2

Trong đó chế độ HFF là chế độ ăn giàu chất béo và fructose (high fat diet plus fructose) và chế độ NFD là chế độ ăn bình thường (normal fat diet)

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của chế độ ăn NFD và HFD của chuột nhắt

lượng glucose máu lần 3, chọn các chuột ở các lô tiêm alloxan bị đái tháo đường (có mức glucose khi đói trên 10mmol/l) được tham gia nghiên cứu Các lô chuột được uống nước cất hoặc thuốc cần thử tác dụng sau 1 thời gian nhất định sau khi gây mô hình Ngày cuối cùng sau khi uống thuốc 1 giờ (trước đó chuột đã được nhịn đói qua đêm) định lượng glucose máu lần 4 và các chỉ số lipid máu, đồng thời lấy gan định lượng MDA trong dịch đồng thể gan và làm giải phẫu vi thể và lấy tụy để làm giải phẫu vi thể

Nguyên lý của phương pháp: MDA phản ứng với acid thiobarbituric để tạo phức

trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 530-532nm

Mật độ quang OD (XE) của dung dịch đo tỷ lệ thuận với nồng độ MDA Hàm lượng MDA được tính theo hệ số chuyển đổi trên đường cong chuẩn sử dụng MDA tinh khiết từ 2 nmol đến 40 nmol Độ dốc đường công chuẩn là 28,2

Tiến hành: cân 0,25g gan chuột nhắt trắng nghiền với 6 ml KCl

Bước 1: 1ml dung dịch nghiền từ phủ tạng thêm vào 0,25 ml acid ascorbic và 0,25 ml muối Mohr

Bước 2: Ủ 370C trong 30 phút lấy ra cho thêm vào 0,5 ml dung dịch acid tricloacetic vào các ống, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 3: Lấy 1ml dịch nổi thêm vào 0,5 ml acid thiobarbituric

Bước 4: Đun sôi cách thuỷ 20 phút sau đó để lạnh ở nhiệt độ phòng, dung dịch

Khi chuột được lấy máu xét nghiệm lần cuối, tiến hành mổ chuột lấy gan và tụy Xác định trọng lượng gan và hàm lượng MDA Quan sát mô bệnh học gan và tụy (đại thể, vi thể) của 30% số chuột mỗi lô

2.3.3 X ử lý số liệu:

Số liệu được nhập và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel [9]

Biểu diễn số liệu: giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (M±SD)

Sự khác biệt của các giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê khi p ≤ 0,05

Phần 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC

3.1.1 Định tính một số nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học

Tiến hành chiết xuất và xác định sự có mặt của các nhóm chất trong mẫu nghiên cứu dựa trên các phản ứng hóa học thường quy Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ một số nhóm chất trong mẫu nghiên cứu

Phản ứng với TT Bouchardat -

4 Coumarin

Phản ứng mở đóng vòng lacton +++

Có

Phản ứng với dd FeCl3 5% ++++

Có Phản ứng với dd gelatin 1% ++++

Phản ứng với dd chì acetat 10% +++

Phản ứng với dd đồng acetat 10% ++

10 Đường khử Phản ứng với TT Fehling A&B ++ Có

14 Phytosterol Phản ứng Libermann- Burchardt ++++ Có

Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong rễ Ngưu bàng có chứa flavonoid, coumarin,

tannin, acid hữu cơ, đường khử, phytosterol, acid hữu cơ, chất béo, acid amin, polysaccharid; không có alcaloid, anthranoid, carotenoid, glycosid tim, saponin

3.1.2 Chiết phân đoạn

3.1.2.1 Xác định độ ẩm của dược liệu

Lấy khoảng 1g bột dược liệu để xác định độ ẩm Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 110°C Đổ dược liệu lên đĩa cân và trải lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình, sau 10 phút đọc kết quả Độ ẩm của dược liệu là 8,62%

3.1.2.2 Chiết xuất

Cân chính xác 800,00g bột khô dược liệu, chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với methanol Chiết 3 lần, lần lượt sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày rút dịch chiết Lọc các dịch chiết thu được, gộp chung và cất thu hồi dung môi Đem cô đến khối lượng không đổi thu được 52,00 g cắn toàn phần

Lấy lượng cắn toàn phần, hòa tan vào nước cất nóng 60°C Dịch chiết nước được tiến hành chiết lỏng lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần gồm n-hexan, chloroform, ethyl acetat Các dịch chiết được cất dưới áp suất giảm thu hồi dung môi (hình 3.1)

Cắn các phân đoạn được đem sấy ở 60°C tới khối lượng không đổi Cân cắn

và tính hàm lượng các chất trong các phân đoạn theo công thức:

X=

a

× 104

M × (100- x) Trong đó: X: hàm lượng chất (%)

a: khối lượng cắn (g) M: khối lượng dược liệu đem cân (g) x: độ ẩm của dược liệu (%)

Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và so với bột rễ Ngưu bàng đem chiết (800,00g bột, hàm ẩm 8,62%) được trình bày trong các bảng 3.2

Hình 3.1 S ơ đồ chiết xuất

Dịch chiết nước

Cắn EtOAc

Ethylacetat thu hồi

Choloroform thu hồi

Cắn CHCl 3

Dịch chiết Ethylacetat

ethylacetat

Dịch chiết nước Dịch chiết chloroform

Cắn n-hexan

Dịch chiết nước Dịch chiết n-hexan

Dược liệu

Dịch chiết nước

n-hexan Nước nóng, lọc

Methanol

Methanol thu hồi

Cắn toàn phần Dịch chiết methanol

Bảng 3.2 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ rễ Ngưu bàng

STT Phân đoạn Khối lượng cắn

(g)

% so với cắn toàn phần

% so với nguyên liệu khô

3.1.3 Định tính cắn toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng

- Dịch chấm sắc ký: Cắn toàn phần hòa tan trong MeOH

- Bản mỏng: Silicagel GF254(Merck) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110°C trong 1h Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi:

Hệ I : CHCl3 : EtOAc : n-hexan (19:1:1)

Hệ II : Toluen : aceton : MEOH (6:1:1)

Hệ III : Toluen : EtOAc : Acid formic (5,5:4:0,5)

Hệ IV : CHCl3 : MeOH (9:1)

- Thuốc thử hiện màu: Acid sulfuric 10%, vanilin 10% trong cồn

- Tiến hành: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc kí đã bão hòa dung môi Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ

15 phút cho bay hơi hết dung môi Phát hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại Sau đó phun thuốc thử hiện màu Sau nhiều lần triển khai thấy hệ III tách tốt nhất (hình 3.2)

Kết quả định tính bằng SKLM của cắn toàn phần chạy với hệ dung môi III được trình bày ở bảng 3.3

+ Khi chưa phun thuốc thử:

Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn toàn phần rễ Ngưu Bàng

Trong các vết, nhận thấy một số vết đáng lưu ý:

- Vết 5 quan sát được ở ánh sáng thường, 2 bước sóng tử ngoại và hiện màu khi phun thuốc thử

- Vết 1 quan sát được rất rõ ở ánh sáng thường, UV254, UV366

3.1.4 Định tính cắn các phân đoạn

3.1.4.1 Định tính phân đoạn n-hexan

Tiến hành xác định sự có mặt của một số nhóm chất trong phân đoạn n-hexan, bằng phản ứng hóa học và bằng sắc ký lớp mỏng Kết quả thể hiện bằng bảng 3.4, bảng 3.5 và hình 3.3

Bảng 3.4 Kết quả định tính một số nhóm chất trong phân đoạn n-hexan

P.ư với dd FeCl3 5%

P.ư với NaOH 10%

- + + +++

Màu không thay đổi

Màu xanh đen Màu vàng cam

2 Coumarin

P.ư mở đóng vòng lacton P.ư chuyển vị đồng phân cis- trans P.ư diazo

+++

++

+ Màu đỏ gạch

P.ư với dd FeCl3 5%

P.ư với dd đồng acetat 10%

P.ư với dd chì acetat 10%

P.ư với dd gelatin 1%

+ ++

+++

+

Màu xanh đen Màu xanh ngọc Tủa bông trắng Tủa bông trắng

5 Phytosterol Phản ứng Libermann ++ Có

Sơ bộ kết luận phân đoạn n-hexan có: Coumarin, tannin, chất béo, phytosterol

- Tiến hành chạy SKLM cắn phân đoạn n-hexan với các hệ dung môi sau:

Hệ I: EtOAc : HCOOH : H2O (5:3:1)

Hệ II: n- hexan: EtOAc (5:5)

Hệ III: Toluen : EtOAc : Acid formic (5,5:4:0.5)

Hệ IV: ether dầu hỏa : diethylether: acid acetic (90:30:1)

Sau nhiều lần khai triển thấy hệ III tách tốt nhất (hình 3.3)

Kết quả định tính cắn n-hexan bằng SKLM chạy với hệ dung môi III được trình bày trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả định tính cắn phân đoạn n-hexan