Phân lập một số thành phần từ thân đoạn ethylaccetat chiết xuất từ cây cỏ seo gà

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển của tổng hợp hóa dược, công tác nghiên cứu, phát triển thuốc và sản phẩm thiên nhiên mới có nguồn gốc từ cây cỏ đang là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới. Việt Nam với lợi thế địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú, nguồn dược liệu dồi dào cùng với kho tàng tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời. Trong đó, có gần 3.900 loài thực vật bậc cao cũng như bậc thấp được các cộng đồng dân tộc sử dụng trong chăm sóc sức khỏe, phòng và trị bệnh 1. Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này được sử dụng theo kinh nghiệm của người dân mà chưa được nghiên cứu một cách khoa học và đầy đủ. Như chúng ta đã biết, cây cỏ Seo gà với tên gọi khác là cây Theo gà 12, Phượng vĩ thảo 13, cỏ Luồng 13…, là một loài rất quen thuộc và gần gũi với nhân dân ta. Theo kinh nghiệm dân gian toàn cây cỏ Seo gà được dùng để điều trị các bệnh như: lỵ mãn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da 13. Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu về thực vật, hóa học cũng như thử tác dụng sinh học của cây cỏ Seo gà đã cho những kết quả hết sức khả quan trong việc điều trị các căn bệnh nan y và mang tính thời đại như: hạ mỡ máu, chống ung thư, chống phì đại tuyến tiền liệt lành tính…

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ LÝ

PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN

TỪ PHÂN ĐOẠN ETHYLACETAT

CHIẾT XUẤT TỪ CÂY CỎ SEO GÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Thái An

2 ThS.NCS Nguyễn Duy Chí

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Dược liệu - Đại học Dược Hà Nội

2 Trung tâm KN Dược Quân đội

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè Nhờ có sự giúp đỡ quý báu đó mà em mới có thể nghiên cứu

và hoàn thành tốt khóa luận của mình Nhân dịp này, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến:

PGS TS Nguyễn Thái An, cô đã tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện,

trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khóa luận

Ths NCS Nguyễn Duy Chí đã giúp đỡ em nhiệt tình trong quá trình

thực hiện khóa luận

Em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên

bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội, Trung tâm Kiểm nghiệm Dược Quân đội đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và tạo điều kiện cho em làm khóa luận

Xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo cùng toàn thể các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để em có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong suốt 5 năm học

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, động viên em hoàn thành khóa luận này

Hà nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Phan Thị Lý

MỤC LỤC

Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ 3

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Pteris L 3

1.1.2 Đặc điểm chung của họ Cỏ Luồng (Pteridaceae) 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Pteris L 3

1.1.4 Đặc điểm thực vật của cây cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.) 4

1.1.5 Phân bố và sinh thái 5

1.1.6 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 5

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ SEO GÀ (Pteris multifida Poir.) 5

1.3 TÍNH VỊ VÀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 10

1.4 CÔNG DỤNG 12

1.5 MỘT SỐ ĐƠN THUỐC 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 14

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Các trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 14

2.2.2 Hóa chất 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.3.1 Định tính 15

2.3.2 Chiết xuất 15

2.3.3 Phân lập các chất 16

2.3.4 Nhận dạng chất phân lập 17

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 CHIẾT XUẤT 19

3.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu 19

3.1.2 Chiết xuất 19

3.1.3 Định tính một số nhóm chất trong phân đoạn ethylacetat bằng phản ứng hóa học 21

3.1.4 Định tính cắn phân đoạn ethylacetat bằng SKLM 22

3.2 PHÂN LẬP 24

3.2.1 Phân lập 24

3.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết của chất PM9 25

3.3 NHẬN DẠNG HỢP CHẤT PM9 27

3.4 BÀN LUẬN 31

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

KẾT LUẬN 34

ĐỀ XUẤT 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

11 1 H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2 Nồng độ Nồng độ ức chế tối thiểu của một số hợp chất phân lập từ cây cỏ

Bảng 3.4 Kết quả SKLM của PM9 với 3 hệ dung môi ở UV254nm và sau

khi phun TT quan sát ở AST

27

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cắn các phân đoạn từ cây cỏ Seo gà 20

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập PM9 từ phân đoạn ethylacetat chiết xuất từ cây

cỏ Seo gà

25

Hình 3.5 Hình ảnh SKLM của PM9 với 3 hệ dung môi sau khi phun TT

quan sát ở AST

26

Hình 3.7 Ảnh tinh thể của PM9 dưới kính hiển vi vật kính 40 28

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, cùng với sự phát triển của tổng hợp hóa dược, công tác nghiên cứu, phát triển thuốc và sản phẩm thiên nhiên mới có nguồn gốc từ cây

cỏ đang là vấn đề thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới

Việt Nam với lợi thế địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây

cỏ vô cùng phong phú, nguồn dược liệu dồi dào cùng với kho tàng tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời Trong đó, có gần 3.900 loài thực vật bậc cao cũng như bậc thấp được các cộng đồng dân tộc sử dụng trong chăm sóc sức khỏe, phòng và trị bệnh [1] Tuy nhiên, nguồn tài nguyên này được sử dụng theo kinh nghiệm của người dân mà chưa được nghiên cứu một cách khoa học và đầy đủ

Như chúng ta đã biết, cây cỏ Seo gà với tên gọi khác là cây Theo gà [12], Phượng vĩ thảo [13], cỏ Luồng [13]…, là một loài rất quen thuộc và gần gũi với nhân dân ta Theo kinh nghiệm dân gian toàn cây cỏ Seo gà được dùng để điều trị các bệnh như: lỵ mãn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da [13] Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu về thực vật, hóa học cũng như thử tác dụng sinh học của cây cỏ Seo gà đã cho những kết quả hết sức khả quan trong việc điều trị các căn bệnh nan y và mang tính thời đại như: hạ mỡ máu, chống ung thư, chống phì đại tuyến tiền liệt lành tính…

Nhận thấy, cỏ Seo gà là một cây thuốc dân gian cần được quan tâm, tuy nhiên những nghiên cứu hiện nay về cỏ Seo gà còn ít và chưa thực sự đầy đủ,

vì vậy nhằm làm sáng tỏ hơn nữa thành phần hóa học và chứng minh kinh

nghiệm sử dụng trong dân gian của cỏ Seo gà, đề tài “Phân lập một số thành

phần từ phân đoạn ethylacetat chiết xuất từ cây cỏ Seo gà” được tiến hành

với các mục tiêu sau:

1 Chiết xuất, phân lập một số thành phần từ phân đoạn ethylacetat

2 Nhận dạng chất phân lập

Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

1 Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu

2 Chiết xuất và định tính cắn phân đoạn ethylacetat bằng phương pháp hóa học và SKLM

3 Phân lập một số thành phần trong phân đoạn ethylacetat

4 Nhận dạng chất phân lập dựa trên các dữ liệu phổ MS và NMR

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 VỊ TRÍ PHÂN LOẠI, ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Pteris L

Theo [1], [9], [10], cây cỏ Seo gà thuộc chi Pteris L., họ Cỏ Luồng (Pteridaceae), bộ Cỏ Luồng (Pteridales), phân lớp Dương xỉ (Polypodiidae), lớp Dương xỉ (Polypodiopsida), ngành Dương xỉ (Polypodiophyta)

1.1.2 Đặc điểm chung của họ Cỏ Luồng (Pteridaceae) [1]

Họ Cỏ Luồng còn gọi là họ cỏ Seo gà

Cây mọc ở gần đất, có nhiều lông vảy Lá giống nhau hay có hai loại, bất thụ và hữu thụ Lá kép lông chim, chia thùy đều đặn, ít khi xẻ ngón Gân nối với nhau thành hình vành khuyên

Ổ túi bào tử ở mép lá hay ở giữa vành khuyên, có áo do mép lá gập lại, liền nhau thành một đường liên tục Vòng cơ giới không đầy đủ, đi qua chân

Họ cỏ Luồng gồm 23 chi, phân bố rộng rãi trên thế giới Ở Việt Nam, cây thường mọc hoang với khoảng 50 loài nằm trong 12 chi Trong đó, có

một loài thường được dùng làm thuốc là cây cỏ Seo gà (Pteris multifida

Poir.)

1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Pteris L

Thân rễ mọc bò [1], [32], có vảy hình mũi mác màu sắc thay đổi từ vàng nhạt tới nâu đậm, có thể có lông [32] Lá giống nhau hoặc có 2 loại là lá sinh

sản và lá không sinh sản Lá kép lông chim, gân lá nối với nhau tạo hình vành khuyên [32].

Ổ túi bào tử ở giữa hoặc ở mép lá, thường có áo do mép lá gập lại, xếp liền nhau tạo thành dải liên tục Bào tử hình tứ diện hoặc hình cầu, màu nâu nhạt hoặc đen, có nốt u sần [32]

Chi Pteris L là một chi lớn với khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, khắp tất cả các lục địa trừ Nam Cực [32]

1.1.4 Đặc điểm thực vật của cây cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.)

Tên khác: Phượng vĩ thảo, cỏ Luồng [13]; Theo gà, Phượng vĩ [12]

Tên khoa học đồng nghĩa: Pteris serrulata L f [12], [13]

Tên nước ngoài: Spider brake (Anh) [13]

Seo gà là một loại cây nhỏ, thân cỏ, cao trung bình 15-25cm, có cây cao hơn [12] Thân rễ nhỏ, ngắn, mọc bò [9], [13], nằm ngang dưới mặt đất, chừng 3-4cm, hình cong queo, sần sùi, nhiều mấu, hơi cứng, vị hơi ngọt, đắng

và tê, mùi thơm hắc [12]

Lá mọc thẳng từ thân rễ, xẻ sâu hình lông chim hai lần, gân lá rõ, có 2 loại : lá không sinh sản hay còn gọi là lá bất thụ ngắn [13], có cuống mang dìa, dài 6-12cm, phiến là dài 8-25cm [12], màu lục nhạt hơi vàng [13], chia thành nhiều phiến nhỏ dài, mép có răng cưa, phiến nhỏ ở đầu lá dài hơn cả, thoạt nhìn trông giống như những cành của cây [12]; lá sinh sản hay lá hữu thụ có cuống dài 10-50cm, phiến lá dài 10-40cm [12], màu đen sẫm gồm các thùy hình dải thuôn uốn éo, mọc đối, đầu nhọn hoắt, mép lá gập lại mang túi bào tử dày đặc ở phía trong [13], xếp thành một đường thẳng liên tục [12] Giữa các phiến là nổi rõ gân chính, từ gân này tỏa ra nhiều gân phụ hình lông chim, xếp song song với nhau [12]

Bào tử hình bốn cạnh, hơi tròn, màu vàng nhạt, có nhiều u sần nhỏ [13]

Mùa sinh sản: tháng 5 – 10 [13]

1.1.5 Phân bố và sinh thái

và Đông Bắc Á [13]

1.1.5.2 Ở Việt Nam

Cây cỏ Seo gà mọc phổ biến ở miền Bắc và miền Trung nước ta, thường gặp ở trên những vách đá, vách đất, xung quanh bờ giếng, ven đường đi, những nơi thoáng ẩm và mát [12]

Cây cỏ Seo gà là cây có sức sống dai, có thể tồn tại ở những nơi đất đồi cằn cỗi và nơi có lượng chất mùn cao ở các hốc núi đá vôi [13] Cây chịu bóng [13] và thường mọc thành túm nhỏ ở vách đất đá hay trên đất trong nhiều loại quần thể thực vật khác nhau: ven rừng rậm thường xanh, rừng thưa, trảng cây bụi thứ sinh, ở bờ tre quanh làng hay chân tường…; mọc trên các loại đất do nhiều loại đá mẹ khác nhau phong hóa ra [14]

1.1.6 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến

Toàn cây có thể dùng làm thuốc, thu hái quanh năm, rửa sạch, phơi khô dùng dần [8], [13]

Thân rễ đào về thái mỏng, phơi hoặc sấy khô [12]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CỎ SEO GÀ (Pteris multifida

Poir.)

Từ cây cỏ Seo gà, Okuno Masaaki và cộng sự đã phân lập được sitosterol và β-sitosterol-β-glucosid [13]

β-Woerdenbag Herman J và cộng sự đã phân lập được 2 chất diterpen là ent-kauran-2β,16α-diol và ent-kaur-16-en-2β,15α-diol Cả hai hợp chất được chứng minh có tác dụng độc với tế bào u báng Ehrlich ở mức độ vừa phải [13] Theo bộ Trung dược Từ hải, cây cỏ Seo gà chứa các pterosin B, F, O, S, C; pterosin C-3-O-β-D-glucosid; 2β,15α-dihydroxy-ent-kaur-16-en và dẫn chất 2-O-β-D-glucosid; 2β-16α-dihydroxy-ent-kauran; apigenin-7-O-β-D-glucosid; luteolin-7-O-β-D-glucosid [13]

Một số nhà khoa học đã phân lập và xác định được cấu trúc của 24 hợp chất của các pterosin sesquiterpen và ent-kauran diterpenoids từ dịch chiết

ethanol của Pteris multifida Poir đó là: 2β,15α,18-trihydroxy-ent-kaur-16-en

(pterokauran M1); 2β,14β,15α,18-tetrahydroxy-ent-kaur-16-en (pterokauran M2); 2β,6β,16α,17-tetrahydroxy-ent-kauran (pterokauran M3); (2S,3S)-pterosin C 3-O-β-(4′-p-coumaroyl)-glucopyranosid (multifidosid A); (2R,3S)-pterosin C 3-O-β-(4′-p-coumaroyl)-glucopyranosid (multifidosid B); (2R)-pterosin B 14-O-β-(4′-p-coumaroyl)-glucopyranosid (multifidosid C); pterokauran P1; pterokauran P1 2-O- β-glucopyranosid; 2β,6β,15α -trihydroxy-ent-kaur-16-en; pterokauran P3; 2β,15α-dihydroxy-ent-kaur-16-en; creticosid A; 2β,6β,16α-trihydroxy-ent-kauran; 2β,15α,16α,17-tetrahydroxy-ent-kauran; 2β,14β,15α,16α,17-pentahydroxy-ent-kauran; siegesbeckiol; (2S,3S)-pterosin C; (2R,3S)-pterosin C; (2S,3S)-pterosin C 3-O-β-glucopyranosid; (2S,3S)-pterosin Q; (2R)-pterosin B; (2S,3S)-pterosin S; (2S,3S)-pterosin S 14-O-β–glucopyranosid; (2R)-pterosin B 14-O-β-glucopyranosid [19]

Một số nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập và xác định được 6 hợp chất có trong phân đoạn butanol từ dịch chiết EtOH của rễ cây cỏ Seo gà Bằng cách lấy rễ cây cỏ Seo gà rửa sạch, phơi khô và xay thành bột, ngâm trong EtOH 95% (15L, 7 ngày x 3) ở nhiệt độ phòng Dịch chiết thu được

đem cất thu hồi dung môi, thu được 250g cắn thô, hòa tan vào trong nước ấm

và lần lượt chiết với ete dầu hỏa, CHCl3, EtOAc, n-butanol, cô đến cắn từng phân đoạn ở áp suất giảm Phân đoạn n-butanol sau khi cất thu hồi dung môi

ở áp suất giảm thu được 78,5g cắn, các hợp chất được phân lập trên cột silical gel với hệ dung môi rửa giải là CHCl3-MeOH (8:0→1:5) có độ phân cực tăng dần và được kết nối với hệ thống TLC cho ra 3 phân đoạn A, B, C Phân đoạn

A sau khi cất thu hồi dung môi thu được 3,9g cắn, cắn này tiếp tục được phân lập trên cột silical gel với hệ dung môi rửa giải là CHCl3-MeOH (4:1) thu được chất 6 (21mg) Phân đoạn B (2,6g) tiếp tục được tinh chế bởi cột silical gel và hệ dung môi rửa giải CHCl3-MeOH (3:1→1:1) theo gradient nồng độ, thu được chất 1 (15mg) và chất 2 (12mg) Phân đoạn 3 sau khi được rửa giải bằng hệ dung môi EtOH – MeOH (3:1→2:1) trên cột silical gel thu được chất

3 và hỗn hợp còn lại Hỗn hợp còn lại tiếp tục được tinh chế bằng TLC thu được chất 4 (13mg) và chất 5 (11mg) Trong đó có 2 neolignan glycosid mới

là multifidosid A, multifidosid B cùng với 4 hợp chất khác: scaphopetalon; (−)-isolariciresinol 3α-O-β-apiofuranosyl-(1→2)-O-β-glucopyranosid; 6,7-dihydroxy-3'-methoxy-4',5' methylenedioxyisoflavon 6-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β –D glucopyranosid; polyporusteron [40], [41]

Năm 2011, Jianqun Liu và cộng sự phân lập được hai pterosin dimers là

đồng phân của nhau: bimutipterosins A và bimutipterosins B [26]

Bằng phương pháp HPLC, một số nhà khoa học đã xác định được đồng

thời 5 flavonoid có trong Pteris multifida Poir., đó là vicenin -2, lonicerin,

rhoifolin, luteolin và apigenin [25]

Trong một nghiên cứu của trường Đại học Longdong ở Trung Quốc đã phân lập được 8 hợp chất có trong dịch chiết ethanol của rễ cây cỏ Seo gà Trong đó, có 2 hợp chất xanthon O-glycosid mới là 1-hydroxy-4,7-dimethoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-

glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosylxanthon; methoxy-8-(3-methyl-2-butenyl)- 6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosylxanthon; và 6 hợp chất khác là: quercetin; dehydrogoniothalamin; vanillin; dihydroechioidinin; saucerneol; licoagrochalcon [21]

1,3-dihydroxy-7-Năm 2013, một số tác giả đã phân lập và xác định được cấu trúc của 8

hợp chất (1- 8) có trong cây Pteris multifida Poir dựa trên các phương pháp

phổ Trong đó hợp chất (2R)-acetyl pterosin B (1) là một pterosin mới được đánh giá có tác dụng gây độc đối với các dòng tế bào khối u ở người như HL-

60, SMMC-7721, A-549, MCF-7 và SW480 (1) là một dẫn xuất acetyl của pterosin B có công thức đầy đủ: (2R)-(2,4,6-trimethyl-3-oxo-2,3-dihydro-1H-inden-5-yl) ethyl acetat Hợp chất này còn được tổng hợp từ pterosin B với acetic anhydrid trong môi trường pyridin khô Đây là lần đầu tiên (2R)-acetyl pterosin B phân lập được từ thiên nhiên Cấu trúc của các hợp chất từ 2 đến 8 được xác định là (2R,3S)-pterosin C (2); (2S,3S)-pterosin C (3); 2β,6β,15α-trihydroxy-ent-kaur-16-en (4); 2β,15α-dihydroxy-ent-kaur-16-en (5); 2β,16α-dihydroxy-ent-kauran (6); creticosid A (7); và (2S, 3S)-pterosin C 3-O-β-D-glucopyranosid (8) [36]

Bảng 1.1 Một số hợp chất phân lập từ cây cỏ Seo gà (Pteris multifida Poir.)

1 Apigenin 7-O-β-D-glucopyranosid

O

O O

OH

OH

O OH

OH

OH

O OH

HO

HO OH

OH

[13]

3 β-sitosterol

HO

H H

H H

[13]

M1: R = H; M2: R = OH

R H

H

HO

OH HO

O

OH

OH

O HO HO

O

14 13

12

15 7

O OH

HO OH

2 3 19

6 7 8

18

21 22

28 26 25

[41]

OMe Glc

Xyl

7 8

6

5 43 2

Rễ có vị ngọt, đắng, hơi tê, mùi thơm hắc [13]

Dịch chiết nước có tác dụng chống oxy hóa, loại trừ gốc tự do [35]

Một nghiên cứu tiến hành nhằm đánh giá độc tính của dịch chiết nước từ cây cỏ Seo gà trên chuột Sprague-Dawley bằng cách cho uống dịch chiết nước hằng ngày với nồng độ là 100, 500, và 1000 mg/kg thể trọng/ngày trong

28 ngày, đã đưa ra kết luận rằng không có bất cứ nguy cơ độc hại nào ở liều dùng thử [34]

 Tác dụng chống gây đột biến: Bằng phương pháp nghiên cứu sử

dụng hệ Salmonella và microsom, và chất gây đột biến là acid picrolonic và

benzopyren Cao cây cỏ Seo gà chiết bằng cách sắc với nước có kết quả ức chế mạnh sự gây đột biến do acid picrolonic và có tác dụng yếu hơn đối với benzopyren [13]

 Tác dụng chống ung thư của các flavonoid có trong Pteris

multifida Poir trên khối u H22 ở chuột: Một số nhà khoa học Trung Quốc

đã có một cuộc nghiên cứu với mục tiêu là kiểm tra tác dụng ức chế của các

flavonoid có trong Pteris multifida Poir lên sự tăng trưởng của khối u được

cấy ghép H22 ở chuột Những con chuột thí nghiệm mang khối u H22 được tạo ra; phân chia thành từng nhóm là nhóm mẫu, nhóm sử dụng các flavonoid

trong Pteris multifida Poir liều cao; nhóm liều thấp, và nhóm CTX Các

nhóm được theo dõi liên tục trong 10 ngày, các chỉ số được tính toán tỉ mỉ So với nhóm mẫu, flavonoid trong cây cỏ Seo gà có khả năng ức chế đáng kể đối với sự tăng trưởng của khối u, với tỉ lệ ức chế khối u của nhóm liều cao và thấp lần lượt là 49,36 % và 33,97 % Nghiên cứu kết luận rằng các flavonoid

từ Pteris multifida Poir có tác dụng ức chế rõ ràng lên sự phát triển của khối

u H22; cơ chế hoạt động của nó có thể là sự kết hợp của việc cải thiện chức năng miễn dịch và tăng cường khả năng chống oxy hóa ở chuột [39]

 Khả năng gây độc đối với dòng tế bào KB (dòng tế bào ung thư

biểu mô): Một nghiên cứu cho thấy, trong các hợp chất phân lập được từ cây

cỏ Seo gà có 3 hợp chất có khả năng gây độc lên dòng tế bào người KB, đó là

pterosin C-3-O-β-D-glucopyrannosid và 4,5-dicaffeoylquinic acid gây ức chế

chọn lọc một cách đáng kể với IC50 lần lượt là 2,35µM và 5,38µM; và caffeoyl quinic acid 5-O-methyl ether gây độc ở mức độ vừa phải với IC50 = 12,3µM [20]

4- Khả năng gây độc đối với dòng tế bào HL60 thử trên in vitro

(dòng tế bào ung thư ở người bị bệnh bạch cầu): bằng phương pháp MTT

một số hợp chất pterosin secquiterpenes chiết từ Pteris multifida Poir., đã

được chứng minh có tác dụng gây độc đối với dòng tế bào HL60

Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của một số hợp chất phân lập từ cây cỏ Seo gà

 Khả năng gây độc đối với dòng tế bào HepG2 (tế bào ung thư biểu

mô gan): Multifidosid A và multifidosid B được phân lập từ dịch chiết

ethanol có hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào HepG2 với nồng độ mẫu mà tại đó có thể gây ức chế 50% tế bào, lần lượt là 8,69µM và 9,26µM [19]

 Khả năng gây độc đối với dòng tế bào ung thư Ehrlich: Từ các bộ

phận trên mặt đất của cây Pteris multifida Poir người ta đã phân lập được 2

chất diterpenes đó là: ent-kauran-2β,16α-diol và ent-kaur-16-en-2β,15α -diol

Cả hai hợp chất này đều có khả năng gây độc vừa phải đối với các tế bào ung thư Ehrlich [37]

 Tác dụng làm hạ lipid máu: Nhóm nghiên cứu thực hiện thử trên

chuột Sprague-Dawley, bằng cách so sánh nhóm có lipid máu cao do chế độ

ăn giàu cholesterol có sử dụng thêm bột cỏ Seo gà đông khô với nhóm dùng β-sitosterol Kết quả cho thấy bột cây cỏ Seo gà đông khô không những làm giảm triglycerid và cholesterol mà còn tăng đào thải chất béo và chuyển hóa các sản phẩm qua đường tiêu hóa [33]

 Tác dụng chống lại phì đại tuyến tiền liệt lành tính: Từ dịch chiết

aceton và ethanol 20% của cây cỏ Seo gà người ta đã phân lập được 22 hợp chất trong đó có 4 chất là: pterosides P’, luteolin, acid palmitic và apigenin 4′-O-α-L-rhamnopyranosid có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào biểu

mô tuyến tiền liệt chuột trong ống nghiệm [28]

1.4 CÔNG DỤNG

Toàn cây cỏ Seo gà được dùng chữa lỵ mãn tính, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, viêm đường tiết niệu, viêm họng, viêm tuyến nước bọt, sưng vú, mụn nhọt, lở ngứa, bệnh ngoài da [9], [13]

Rễ và lá được dùng làm thuốc chữa tiêu chảy, đi ngoài ra máu, lỵ dưới dạng thuốc sắc hay thuốc ngâm rượu, nước sắc đôi khi còn thấy ra giun [12]

Rễ, lá sao vàng, tán nhỏ đun với dầu vừng thành thuốc dầu bôi chữa một

1.5 MỘT SỐ ĐƠN THUỐC

Chữa kiết lỵ: cỏ Seo gà (toàn thân), dây mơ lông, rễ cỏ tranh, rễ phèn

đen, mỗi vị 20g; gừng sống 3 lát, sắc uống làm 2-3 lần trong ngày, vào lúc đói Có thể dùng Seo gà 30g, vỏ sắn thuyền 12g, cám gạo rang vàng 6g hoặc đậu đen rang cháy 20g, sắc uống, chia làm 3 lần trong ngày [13]

Chữa lở loét, bệnh ngoài ra: Toàn thân cây cỏ Seo gà đốt thành than,

tán bột, trộn với dầu vừng rồi bôi Có thể dùng cây tươi giã đắp [13]

Chữa kiết lỵ (trực trùng): Rễ và lá cỏ Seo gà sao cho thơm 24g, nước

100ml, đun sôi trong vòng 30 phút Chia 2 hay 3 lần uống trong ngày trị lỵ trực trùng [12]

Chè tươi 100g, cỏ Seo gà khô 24g, nước 150ml, đun sôi trong 30 phút Chia hai hay ba lần uống trong ngày trị lỵ trực trùng [12]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

 Mẫu nghiên cứu cây cỏ Seo gà bao gồm:

 Mẫu cây tươi mang bộ phận sinh sản, để giám định tên khoa học

 Lấy cây tươi, phơi se, sấy trong tủ sấy ở 50° đến khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu

về mặt hóa học

 Nơi thu hái: Ba Vì - Hà Nội

 Thời điểm thu hái mẫu: 10/2012-1/2013

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

 Tủ sấy Shellab, tủ sấy Memmert, tủ hút độc

 Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của Merck (Đức)

 Bể cách thủy ổn nhiệt WNB14 – MEMMERT

 Cân phân tích Metler Toledo

 Máy ảnh

 Cột sắc ký

 Đèn tử ngoại

 Máy xác định hàm ẩm Sartorius

 Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200

 Kính hiển vi 2 mắt YS100, kính hiển vi quang học Mocros MCX

100

 Máy đo phổ khối lượng (ESI-MS): LC/MS Single Quadrupole Agilent 1260 Series (USA), Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Bruker AM500 NRM Spectrometer, Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

FT- Máy đo điểm nóng chảy: Kofler micro hotstage, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Bã lại được tiến hành ngâm lần 2, lần 3 tương tự như lần 1

Dịch chiết thu được đem cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay Buchi Rotavapor R-200, tốc độ quay từ 30-200 vòng/phút Thu được cắn toàn phần

Cắn toàn phần được hòa tan vào nước cất nóng 600C, sau đó chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần Sau mỗi phân đoạn chiết, cất thu hồi dung môi đến khối lượng không đổi Cân cắn và tính hiệu suất chiết của từng phân đoạn

- Hiệu suất chiết:

Hàm lượng % của cắn so với khối lượng bột dược liệu được tính theo công thức sau:

) 1 (

% 100

%

x M

a X

2.3.3.1 Tiến hành phân lập các chất

- Chuẩn bị cột:

Cột rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên một giá cố định

Dùng đũa thủy tinh dài để lót một lớp bông (loại bông thấm nước) lên trên ống thoát dịch của cột

Cân một lượng silica gel cần dùng vào cốc có mỏ Thêm dung môi rửa giải vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tới khi hết bọt khí

Mở vòi, rót hỗn dịch trên vào cột, cho dung môi chảy và để silica gel lắng tự nhiên xuống đáy cột Khi dung môi chảy gần hết trong cột, tiếp tục rót hỗn dịch vào trên cột Chú ý không để khô dung môi ở trên cột Tiếp tục dùng dung môi hứng được rót lên cột và cho chảy liên tục một thời gian Ổn định cột trong 12h

- Nạp mẫu vào cột:

Trộn đều một lượng bột silica gel với dung dịch cắn ethylacetat, để dung môi bay hơi rồi đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều đặn trên mặt silica gel

Thêm một lớp mỏng silica gel lên phía trên để đảm bảo mặt phẳng silica gel lắng bên dưới không bị ảnh hưởng khi đổ dung môi rửa giải lên

- Rửa giải:

+ Sử dụng hệ dung môi thích hợp

+ Kiểm soát tốc độ dòng chảy

+ Hứng dịch rửa giải vào bình nón, ống nghiệm với thể tích thích hợp + Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng, các phân đoạn cho sắc ký đồ giống nhau thì gộp thành một phân đoạn

2.3.3.2 Tinh chế các chất phân lập

Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiểu lần bằng dung môi ít hòa tan chất phân lập

2.3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập

Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng SKLM Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau

2.3.4 Nhận dạng chất phân lập

Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết được khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hình, điểm nóng chảy, độ tan Khi các chất đủ sạch, tiến hành ghi các phổ: phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton (1H-NMR), 13C-NMR), phổ DEPT, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều HMBC và HSQC Các dữ liệu phổ thu được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 CHIẾT XUẤT

Hiệu suất của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần và so với bột cây

cỏ Seo gà đem đi chiết được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ cây cỏ Seo gà

STT Phân đoạn Khối lượng cắn

(g)

% so với cắn toàn

phần

% so với nguyên liệu khô

Dược liệu

Dịch chiết methanol

Methanol Lọc

Cắn toàn phần Methanol thu hồi

Cắn E

Ethylacetat thu hồi

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cắn các phân đoạn từ cây cỏ Seo gà

Phân đoạn ethylacetat được lựa chọn để tiến hành phân lập chất tinh khiết

3.1.3 Định tính một số nhóm chất trong phân đoạn ethylacetat bằng phản ứng hóa học

Tiến hành định tính mẫu nghiên cứu các nhóm chất thường gặp trong phân đoạn ethylacetat của dược liệu bằng các phản ứng hóa học, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định tính một số nhóm chất trong cắn ethylacetat

Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

Có Phản ứng với dung dịch kiềm loãng ++

Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% +++

Phản ứng với dd chì acetate 10% ++

Ghi chú : (-) phản ứng âm tính

(+) phản ứng dương tính (++) phản ứng dương tính rõ

Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học thường quy, kết quả cho thấy trong cắn

phân đoạn ethylacetat của cây cỏ Seo gà có chứa các nhóm chất: flavonoid, coumarin; không chứa tanin

3.1.4 Định tính cắn phân đoạn ethylacetat bằng SKLM

+ Mẫu thử : cắn ethylacetat được hòa tan trong methanol

+ Bản mỏng silica gel GF254 (Merck) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110°C trong 1h Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi

Hệ I: Toluen - ethylacetat - acid formic (6:2:1)

Hệ II: Toluen - ethylacetat - acid formic (5:4:1)

Hệ III: Ethylacetat - methanol (8,5:1)

Hệ IV: Ethylacetat - methanol - H2O (8:1:1)

Hệ V: Ethylacetat - acid formic - H2O (10:1,35:1)

Thuốc thử hiện màu: dd vanilin/H2SO4 10% và soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 254nm và 366nm

- Tiến hành: chấm dịch chiết methanol lên bản mỏng Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ 5 phút cho bay hơi hết dung môi Phát hiện vết dưới ánh sáng tử ngoại Sau đó phun thuốc thử hiện màu, sấy ở nhiệt độ khoảng 110°C Sau nhiều lần triển khai thấy hệ V tách tốt nhất (hình 3.2) Kết quả định tính bằng SKLM của cắn toàn phần với hệ dung môi V được trình bày ở bảng 3.3:

Hình 3.2 : Sắc ký đồ của cắn ethylacetat với hệ dung môi V

1 không phun TT, AST 3 không phun TT, UV366nm

2 không phun TT, UV254nm 4 phun TT, AST

Bảng 3.3 Màu sắc và giá trị R f của cắn ethylacetat trên SKLM với hệ dung

môi khai triển V

STT Không có thuốc thử Có thuốc thử R f x 100

Phân đoạn F11 tiến hành sắc ký trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi methanol : nước (1:1) thu được 2 phân đoạn F11A và F11B

Phân đoạn F11B tiếp tục tinh chế trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ dung môi aceton : nước (1:2,3) thu được chất PM9 (30 mg)