Phân lập một số chất từ phân đoạn nước nấm linh chi thu hái tại quảng nam đà nẵng (ganoderma lucidum (w curtis ex fr) p karst)

ĐẶT VẤN ĐỀ Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum (W. Curtis ex Fr.) P. Karst.) là một loại dược liệu quý, được sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh về tim mạch; hô hấp; gan, mật; thấp khớp; tiểu đường; ung thư;… 3, 13; với các tác dụng chính như: hạ cholesterol máu, hạ đường huyết; cải thiện chức năng vỏ thượng thận, duy trì chức năng nội tiết; ngăn ngừa và điều trị ung thư; chống dị ứng;… 3. Hiệu quả chữa bệnh của nấm Linh chi đã khẳng định vai trò của nó; do đó, từ năm 1621 đến nay đã có khoảng 927 công trình nghiên cứu trên thế giới về nấm Linh chi được ghi nhận từ kỹ thuật nuôi trồng, xác định thành phần hóa học cho đến các hoạt tính sinh học, dược lý, công nghệ chiết xuất bào chế,… Ở Việt Nam, nghiên cứu về nấm Linh chi thường tập trung trên các lĩnh vực nuôi trồng và các tác dụng dược lý; những nghiên cứu về thành thành phần hóa học còn khá ít, đặc biệt là lĩnh vực chiết tách và phân lập các hợp chất tinh khiết. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập một số chất từ phân đoạn nước nấm Linh chi thu hái tại Quảng Nam  Đà Nẵng (Ganoderma lucidum (W. Curtis ex Fr.) P. Karst.)”, với mục tiêu chính là nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân đoạn nước của nấm Linh chi. Để đạt được mục tiêu đặt ra, khóa luận được thực hiện theo các nội dung sau: 1. Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu. 2. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong nấm Linh chi bằng phản ứng hóa học. 3. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc của một số hợp chất từ phân đoạn nước của nấm Linh chi.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU

PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN NƯỚC NẤM LINH CHI

ĐÀ NẴNG (GANODERMA LUCIDUM

(W CURTIS EX FR.) P KARST.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU

PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN NƯỚC NẤM LINH CHI

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội và bộ môn Dược học cổ truyền đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua

Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến TS

Đỗ Thị Hà, TS Hà Vân Oanh  những người thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô tại khoa Hóa Thực vật − Viện Dược liệu, các thầy cô ở bộ môn Dược học cổ truyền  Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp

đỡ em trong quá suốt quá thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cám ơn đến Quỹ Phát triển Khoa Học và Công Nghệ Quốc gia (Nafosted 106.99-2011.47) đã tài trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này

Cuối cùng em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

13C- NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance spectrometry (phổ cộng

hưởng từ hạt nhân carbon 13)

nhân)

Rf Hệ số lưu

UV-VIS Ultraviolet-Visible (phổ tử ngoại  khả kiến)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1: Danh mục các loài thuộc chi Ganoderma Karst ở Việt

3 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong nấm

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum (W Curtis ex Fr.) P Karst.) là một loại

dược liệu quý, được sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh về tim mạch; hô hấp; gan, mật; thấp khớp; tiểu đường; ung thư;… [3], [13]; với các tác dụng chính như:

hạ cholesterol máu, hạ đường huyết; cải thiện chức năng vỏ thượng thận, duy trì chức năng nội tiết; ngăn ngừa và điều trị ung thư; chống dị ứng;… [3]

Hiệu quả chữa bệnh của nấm Linh chi đã khẳng định vai trò của nó; do đó, từ năm 1621 đến nay đã có khoảng 927 công trình nghiên cứu trên thế giới về nấm Linh chi được ghi nhận từ kỹ thuật nuôi trồng, xác định thành phần hóa học cho đến các hoạt tính sinh học, dược lý, công nghệ chiết xuất bào chế,… Ở Việt Nam, nghiên cứu về nấm Linh chi thường tập trung trên các lĩnh vực nuôi trồng và các tác dụng dược lý; những nghiên cứu về thành thành phần hóa học còn khá ít, đặc biệt là lĩnh vực chiết tách và phân lập các hợp chất tinh khiết

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập một số chất từ phân đoạn nước nấm Linh chi thu hái tại Quảng Nam  Đà Nẵng (Ganoderma

lucidum (W Curtis ex Fr.) P Karst.)”, với mục tiêu chính là nghiên cứu chiết xuất,

phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phân đoạn nước của nấm Linh chi

Để đạt được mục tiêu đặt ra, khóa luận được thực hiện theo các nội dung sau:

1 Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

2 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong nấm Linh chi bằng phản ứng hóa học

3 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc của một số hợp chất từ phân đoạn nước của nấm Linh chi

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Thực vật học

1.1.1 Đặc điểm của chi Ganoderma Karst

1.1.1.1 Vị trí phân loại của chi Ganoderma Karst

Theo hệ thống phân loại của P Karsten (1881) chi Garnoderma Karst thuộc:

Chi Ganoderma Karst [12]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Garnoderma Karst

Quả thể có cuống hoặc không cuống, mọc trên gỗ Mũ nấm bóng láng thường

có dạng hình thận hay hình quạt hoặc hình tròn Thịt nấm là chất gỗ đến chất bì dai,

có màu nâu Ống nấm một tầng, một số ít có hai tầng Bào tử có dạng hình trứng nhụt một đầu, vỏ bào tử gồm hai lớp: lớp ngoài nhẵn, lớp trong có gai nhẹ hoặc sần sùi, có màu vàng gỉ sắt [14]

Chi Ganoderma Karst có khoảng 80 loài, phân bố rộng, đặc biệt vùng nhiệt đới

và á nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ [13] Ở Việt Nam, chi

Ganoderma Karst có 26 loài và 1 thứ trong đó có một số loài được dùng làm thuốc

[13], [15] Danh mục các loài thuộc chi Ganoderma Karst ở Việt Nam [14], [15]:

Bảng 1.1: Danh mục các loài thuộc chi Ganoderma Karst ở Việt Nam

1 Ganoderma lucidum (W Curtis ex Fr.) P Karst Dược liệu

2 Ganoderma applanatum (Pers.) Pat Dược liệu

3 Ganoderma boninense Pat Không rõ

4 Ganoderma guinanense Zhao et Zhang Không rõ

5 Ganoderma oroflavum (Lloyd) Teng Không rõ

6 Ganoderma philippii (Bres et Henn.) Bres Không rõ

7 Ganoderma cochlear (Bl & Nees) Bres Không rõ

8 Ganoderma amboinense (Lam & Fr.) Pat Không rõ

9 Ganoderma balabacence Murr Không rõ

10 Ganoderma capense (Lloyd) Pat Không rõ

11 Ganoderma annulare (Fr.) Gilbn Không rõ

12 Ganoderma australe (Fr.) Pat Không rõ

13 Ganoderma lobatum (Schw.) Atk Không rõ

14 Ganoderma subtornatum Murr Không rõ

15 Ganoderma tornatum (Pers.) Pat Không rõ

16 Ganoderma fulvellum Bres Không rõ

17 Ganoderma hainanense Zhao, Xu & Zhang Không rõ

18 Ganoderma koningsbergii (Lloyd) Teng Không rõ

19 Ganoderma tropicum (Jungh.) Bres Dược liệu

20 Ganoderma mastoporum (Lev.) Pat Không rõ

21 Ganoderma ochrolaccatum (Mont.) Pat Không rõ

22 Ganoderma rivulosum Pat et Har Không rõ

23 Ganoderma sessile Murr Không rõ

24 Ganoderma sichuanense Zhao et Zhang Không rõ

25 Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang Không rõ

26 Ganoderma tsugae Murr Không rõ

1.1.3 Đặc điểm của nấm Linh chi

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật của nấm Linh chi

Nấm Linh chi hay còn gọi là nấm Lim, nấm thần tiên, nấm trường thọ [13]; có

tên khoa học: Ganoderma lucidum (W Curtis ex Fr.) P Karst.; tên đồng nghĩa là

Boletus lucidus W Curt., Polyporus lucidus W Cent., thuộc chi Ganoderma Karst.,

Thịt nấm là chất lie cứng, khi non màu trắng, sau chuyển sang màu vàng nhạt, nâu vàng; mô đồng nhất, không phân tầng

Hệ sợi dimitric gồm sợi không vách ngang và sợi bện, kích thước 2  7 μm, màng dày, nội chất hầu như không màu trong suốt Hệ sợi trong nuôi cấy ở môi trường thạch (môi trường thuần khiết) lúc đầu màu trắng, sau chuyển sang màu vàng nhạt

Bào tầng dạng ống nhỏ, trong 1 mm có 4  5 (6) ống; miệng ống nấm tròn đều, khi non màu trắng khi già chuyển sang mầu vàng nhạt Ống nấm sâu 0,2  0,7 cm Bào tử hình trứng nhụt một đầu, kích thước 5  6,5 μm x 8,5  11,5 μm; màng hai lớp (lớp ngoài nhẵn, không màu; lớp trong có gai nhẹ), có màu nâu gỉ sắt

Đảm đơn bào, hình chùy ngắn, kích thước 7  10 μm x 12  14 μm; màng là một lớp mỏng, nội chất không màu trong suốt; trên mỗi đảm có 3  4 cuống mang bào tử

Cuống nấm dài hay ngắn, có khi rất ngắn, thường đính ở bên phần lõm vào của

mũ nấm Cuống nấm có màu sắc như màu mũ nấm và có lớp vỏ bóng láng; thường

có dạng hình trụ tròn hay hơi dẹt; kích thước 0,5  1,5 (2) cm x 3  17 cm Mô cuống đồng nhất với mô của mũ [14]

Hình 1.1: Ganoderma lucidum [14]

1.1.3.2 Phân bố và sinh thái của nấm Linh chi

Nấm Linh chi phân bố đa dạng và phong phú nhất ở các khu rừng nhiệt đới và cận nhiệt đới Ngoài ra, chúng còn sinh trưởng và phát triển ở khu vực Bắc Mỹ Ở Việt Nam, nấm Linh chi có thể tìm thấy ở hầu hết các tỉnh vùng núi từ Lào Cai (Sa Pa) đến Lâm Đồng (Lang Biang)

Nấm Linh chi thường hoại sinh trên gỗ mục hoặc trên đất ngay ở nơi có gốc cây

gỗ đã mục, thuộc đại diện của các họ Caesalpiniaceae (Lim, Lim xẹt, Muồng đen,

Me,…) và Fagaceae (một số loài thuộc các chi Quercus, Lythocarpus,

Castanopsis,…) Môi trường sống của nấm thường ở rừng kín thường xanh ẩm, độ

Bào tử

1.2 Thành phần hóa học của nấm Linh chi

1.2.1 Triterpenoid

Năm 2003, Cole R J và Schweikert M A đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả và kết luận: có hơn 130 hợp chất là dẫn xuất của lannosterol (acid ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, các lucidon, acid lucidenic, ) được phân lập từ phân đoạn không phân cực chiết xuất từ nấm Linh chi [19], [42]

Một số triterpenoid được phân lập từ nấm Linh chi được thống kê trong bảng sau:

Bảng 1.2: Một số triterpenoid phân lập từ nấm Linh chi

S4

Acid ganoderic α

[27] Acid ganoderic H

S5

O

OHHO

HO

S6

1.2.3 Peptid, protein

Năm 1989, các tác giả người Nhật đã phân lập từ sợi nấm Linh chi một polypeptid (Lingzhi-8 (LZ-8)) có 110 amino acid dựa trên sắc ký lọc gel (cột Sephadex G-75) và sắc ký trao đổi ion (cột DEAE Sephadex-25) [34], [42], [49].Năm 1997, Kawagishi H và cộng sự đã phân lập được 2 protein từ các sợi nấm (GLL-M) và quả thể (GLL-F) của nấm Linh chi [34]

Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Ye B đã tìm thấy ba loại protein có hoạt tính sinh học (LZP-1, LZP-2 và LZP-3) từ quả thể và bào tử của nấm Linh chi [34].Cùng năm đó, You Y H và Z B Lin đã phân lập GLPP từ nấm Linh chi GLPP là một phức hợp polysaccharid-protein, được cấu tạo từ 16 loại acid amin và

5 loại đường khác nhau (rhamnose, xylose, fructose, galactose, glucose) [54]

Năm 2003, Sripuan T và cộng sự đã phân lập enzym α-glucosidase từ quả thể nấm Linh chi Enzym này có khả năng thủy phân p-nitro-α-D-galactopyranosid, cũng như melibiose, raffinose và stachyose [48]

Năm 2004, từ phân đoạn nước của nấm Linh chi, Sun J và cộng sự đã phân lập được GLP  một peptid có trọng lượng phân tử thấp [19]

Từ nguồn nấm Linh chi giàu selen, nhóm nghiên cứu của Du M (2006) đã phân lập được một loại protein chứa selen (Se-GL-P), bằng cách sử dụng muối amoni sulphat để kết tủa và dựa trên sắc ký trao đổi anion, sắc ký rây phân tử để phân lập [24]

Năm 2006, Wang H X Và T B Ng mô tả sự phân lập của một enzyme phân giải lecithin (ganodermin) dựa trên sắc ký cột DEAE-cellulose, gel màu xanh Affi-gel và hấp phụ trên Con A-Sepharose [42], [51]

Một số enzym phân lập từ nấm Linh chi được Huie C W và Di X tổng hợp từ các nghiên cứu về nấm Linh chi: carboxyl proteinase (II), endopolygalacturonase, endopectin methyltranseliminase, amylase, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase, endo-

và exo-polygalacturonase, cellulase, mangan superoxid dismutase, carboxymethyl cellulose, isozymes laccase [34]

heptadecanoic, acid heneicosanoic, acid tricosanoic, acid pentacosanoic, acid 14-

methyl penta decanoic

+ Acid béo không no: acid 9-hexa decenoic, acid 9-octa decenoic, acid

9,12-octa deca di-en-oic

 Khoáng chất

Trong quả thể của nấm Linh chi, ngoài các khoáng chất thông thường (Ca, Mg,

Na, Mn, Fe, Zn, Cu [15]) còn có một hàm lượng cao của germani Hàm lượng germani trong nấm Linh chi châu Á có thể tới 800  2000 ppm [3]

Ngoài ra trong thành phần của nấm Linh chi còn có các thành phần khác như acid amin, nucleotid, vitamin,… [34], [42]

Nấm Linh chi đỏ thể hiện hoạt tính khử gốc superoxid in vitro điển hình ở các cao cồn, cao MeOH, phân đoạn n-butanol và phân đoạn diethyl ether [5] Theo

nhóm nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid tổng chiết xuất từ nấm Linh chi có tác dụng chống oxy hóa (ức chế 19,94% sự tăng hàm lượng MDA so với chứng bệnh lý với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột) [16]

Cao cồn và cao nước nấm Linh chi điều chỉnh về mức bình thường hoạt tính GSH-Px trong gan chuột bị gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid [5]

 Tác dụng hạ đường huyết

Các glycan A, B và C phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng hạ đường máu rõ rệt ở chuột nhắt trắng bình thường và chuột gây đái tháo đường với aloxan [13]

 Tác dụng hạ huyết áp

Theo nghiên cứu của Morigiwa A và cộng sự (1986), dịch chiết methanol từ quả thể của nấm Linh chi có tác dụng ức chế men chuyển có liên quan trong việc

kiểm soát tăng huyết áp [42]

Một số acid ganoderic như acid ganoderic B, D, F, H phân lập từ nấm Linh chi

có tác dụng chống cao huyết áp, trong đó acid ganoderic F có tác dụng mạnh nhất [3]

 Tác dụng hạ lipid máu

Nghiên cứu trên chuột cống trắng có tăng cholesterol máu thực nghiệm của Nguyễn Thị Mai Anh và cộng sự cho thấy, cao nước nấm Linh chi (2 ml cao lỏng chứa 1 g nấm) có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol toàn phần, triglycerid và

LDL-C, đồng thời làm tăng HDL-C trong huyết tương [1]

Ganoderol A và B, ganoderal A và acid ganoderic phân lập từ nấm Linh chi, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol thông qua ức chế enzym lanosterol-14α-desmetilase (xúc tác cho phản ứng chuyển 24,25-dihydrolanosterol thành

cholesterol) [33]

 Tác dụng bảo vệ gan

Nghiên cứu của Đỗ Thị Hà và các cộng sự (2013) cho thấy, cao chiết methanol

và các phân đoạn n-hexan, dicloromethan, nước của dịch chiết methanol, cùng các

hợp chất phân lập được từ nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol peroxid và

ganodermanontriol) có tác dụng bảo vệ gan in vivo và in vitro liên quan đến sự kích

hoạt enzym HO-1 và các yếu tố GDT kích ứng tác dụng của protein HO-1 thông qua sự kích hoạt yếu tố chuyển vị trong nhân tế bào NRF-2, trong các con đường tín

hiệu PI3K/Akt và p38; làm tăng cường mức độ bảo vệ các tế bào gan chống lại

t-BHP gây ra các stress oxy hóa [32]

Theo nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi và cộng sự, cao triterpenoid tổng nấm Linh chi với liều 484 mg cao/kg thể trọng chuột có tác dụng bảo vệ tế bào gan Ở liều này, cao nấm Linh chi có khả năng ức chế 39,86% sự tăng hoạt độ men ALT trong huyết thanh chuột gây ra bởi paracetamol [16]

Acid ganoderic R và S trong hệ sợi; acid ganoderic A trong bào tử nấm Linh chi

có tác dụng bảo vệ gan gây ra bởi galactosamin [3]

 Tác dụng cải thiện trí nhớ

Nghiên cứu của Nguyễn Thượng Dong và cộng sự (2006) cho thấy, cao EtOH nấm Linh chi ở cả hai liều thử tương đương 10 và 20 g dược liệu/kg chuột có tác dụng cải thiện sự suy giảm khả năng học tập, nhận thức và sự suy giảm khả năng

ghi nhớ gây ra bởi scopolamin [7]

 Tác dụng tăng cường miễn dịch

Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hương và Trịnh Văn Tấn (2011), các

cao nước, cao cồn và polysaccarid thô chiết từ nấm Linh chi đỏ trồng tại Việt Nam đều có tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch trong thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid [11]

Các polysaccharid của nấm Linh chi có tác dụng tăng cường sản xuất cytocin đại thực bào và bạch cầu, làm tăng lượng interleucin (IL) 1β, IL-2, IL-6, 9 [3], [21], [43] Đây là những yếu tố tăng tiết interferon α và γ, do đó chúng được cho là có tác dụng trên hệ miễn dịch

 Tác dụng kháng HIV

Các tác giả Hàn quốc đã đánh giá tác dụng ức chế sự phát triển HIV-1 ở các tế bào lympho T ở người của cao nước nấm Linh chi Kết quả cho thấy, cao nước nấm Linh chi có tác dụng ức chế mạnh mẽ hoạt động sinh sản của loại virus này [29], [35]

Các chất như ganoderiol A, B và F, ganodermanontriol, acid ganoderic α , B, C1 và H, 3β-5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-dien được phân lập từ nấm

Linh có khả năng ức chế enzym protease của HIV in vitro [27], [34]

Acid ganoderic C1, G, γ, ε và ζ, acid ganolucidic A, acid lucidenic α, lucidimol

A và B, ganodermanondiol, ganodermenonol, ganodermadiol, lucialdehyd A, B và

C được phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào

Meth-A và LLC [28], [41], [55]

Các chất có tác dụng kháng khối u mạnh trong nấm Linh chi là glucurono- glucan, manno- -D-glucan và xylomanno- -D-glucan cũng như các phức hợp với protein của chúng [3]

-D- Tác dụng khác

Cao nấm Linh chi toàn phần có tác dụng dự phòng và điều trị phục hồi một

phần độc tính gây suy giảm bạch cầu của paclitaxel và carboplatin [9]

Adenosin trong nấm Linh chi có tác dụng giảm kết tập tiểu cầu, phân giải thrombin và ngăn ngừa huyết khối [3], [34], [42]

Ngoài ra, germani có với hàm lượng cao trong nấm Linh chi có tác dụng gia tăng hấp thu oxy của hồng cầu lên tới 1,5 lần; có thể tăng cường chuyển hóa và ngăn ngừa thoái hóa mô [3]

Trong y học dân gian Trung Quốc, nấm Linh chi được dùng rộng rãi để điều trị suy nhược thần kinh, viêm gan mạn tính, bệnh tim mạch, loét mạn tính đường tiêu hóa Thuốc có phạm vi tác dụng điều trị rộng [13]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

 Silica gel 60 (sắc ký cột pha thường), cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm (Merck)

 Silica gel pha đảo YMC (30 − 35 μm, FuJisilisa Chemical Ltd)

− Sephadex LH-20 (sắc ký cột sephadex)

2.1.3 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

 Các dụng cụ dùng trong quá trình thực nghiệm như bình gạn, bình nón, phễu

lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet,…

 Bản mỏng silica gel GF254 (Merck)

 Cột sắc ký

 Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI)

 Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

 Bếp điện, bếp đun cách thủy

 Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR

 Đèn UV-Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

 Máy scan CanoScan LiDe 100

 Máy siêu âm Power sonic 405

 Máy đo:

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Brucker Avance 500 Hz

 Phổ khối lượng (MS): Hewlett Packard HP 5890, Serie II

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật

2.2.1.1 Giám định tên khoa học

Mẫu nấm Linh chi tươi sau khi thu hái được giám định tên khoa học (dựa trên các đặc điểm về thực vật và đối chiếu với các tài liệu chuyên khoa phân loại thực vật như: “Thực vật chí Việt Nam”, “Thực vật chí Trung Quốc”) tại Viện Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.1.2 Phương pháp xử lý mẫu

Mẫu nấm Linh chi được thái lát mỏng và sấy ở nhiệt độ 500C  550C đến khối lượng không đổi Mẫu sau khi được sấy khô lưu một lượng nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, lượng còn lại tiến hành chiết bằng dung môi MeOH công nghiệp

Hình 2.2: Dƣợc liệu nấm Linh chi

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu hóa học

2.2.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong nấm Linh chi

Khảo sát sơ bộ các nhóm chất chính trong dược liệu bằng phương pháp hóa học theo tài liệu [2], [3]

2.2.2.2 Phương pháp chiết xuất

 Chiết dược liệu (chiết nóng): Dược liệu sấy khô chiết nóng bằng MeOH (tỷ lệ

dược liệu/dung môi là 1 : 15), ở nhiệt độ 650C trong thời gian 3 giờ x 3 lần; sau đó, gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (ở nhiệt độ 600C) tới cắn

 Chiết các phân đoạn: Hòa tan cắn MeOH vào một lượng tối thiểu nước nóng,

sau đó chiết lần lượt với các dung môi với tỷ lệ 1 : 1 (3 lần) theo thứ tự tăng dần độ

phân cực: n-hexan, dicloromethan, n-butanol Thu các phần dịch chiết, rồi đem cất

thu hồi dung môi dưới áp suất giảm tới cắn

2.2.2.3 Phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất tách từ nấm Linh

chi

 Phân lập bằng sắc ký cột:

+ Lựa chọn phân đoạn nước để tiến hành sắc ký

+ Tiến hành lần lượt qua 3 cột sắc ký: sắc ký cột sephadex (chất hấp phụ sephadex LH-20, dung môi rửa giải là MeOH); sắc ký cột pha đảo (chất hấp phụ

silica gel pha đảo YMC, hệ dung môi rửa giải là aceton và H2O (tỷ lệ 3 : 1 đến 1 :

1)); sắc ký cột pha thường (chất hấp phụ silica gel 60 (cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm) Hệ

dung môi khai triển là DCM và MeOH tăng dần độ phân cực (lượng MeOH từ 0% đến 10%))

+ Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng SKLM, phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong EtOH

 Xác định cấu trúc: Sử dụng các phương pháp phân tích phổ (phổ khối ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H/13C-NMR, phổ DEPT), tham khảo cơ sở dữ liệu phổ của các tài liệu đã công bố để biện giải cấu trúc chất phân lập được

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Giám định tên khoa học nấm Linh chi

Nấm Linh chi thu hái từ tự nhiên vào tháng 8 năm 2012 tại Tiên Phước, Quảng Nam  Đà Nẵng, có một số đặc điểm:

 Quả thể có mầu nâu đỏ, bóng láng

 Mũ nấm có hình thận Bề mặt mũ nấm mầu nâu đỏ, có vân thớ dạng phóng xạ; mép nấm hơi tù, có lượn sóng và chia thùy

 Mô nấm là chất lie cứng, đồng nhất  không phân tầng; dày 0,5 cm

 Cuống nấm dài, đính bên phần lõm vào của mũ nấm Cuống nấm có màu nâu đỏ; có dạng hình trụ tròn; lớp vỏ bóng láng

Mẫu nấm Linh chi tươi sau khi thu hái, được TS Đỗ Hữu Thư giám định tên khoa học tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật thuộc Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, là Ganoderma lucidum (W Curtis ex Fr.) P Karst., họ

nấm Lim Ganodermataceae (kết quả giám định do Nguyễn Thị Thu Hoa thuộc nhóm nghiến cứu về nấm Linh chi tại viện Dược liệu đứng tên, Phụ lục 1)

Hình 3.1: Ganoderma lucidum (W Curtis ex Fr.) P Karst

3.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học

Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hóa học có trong nấm Linh chi (Ganoderma

lucidum (W Curtis ex Fr.) P Karst.) bằng phản ứng hóa học theo tài liệu [2], [3]

Chuẩn bị dịch chiết cồn: Cân 20 g bột nấm Linh chi cho vào bình nón dung

tích 100 ml Thêm 50 ml cồn 800, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính flavonoid và coumarin

Chuẩn bị dịch chiết nước: Cân 20 g bột nấm Linh chi cho vào bình nón dung

tích 100 ml, thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính tanin, acid hữu cơ, acid amin, polysaccarid, đường khử

Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hỏa: Cân 10 g bột nấm Linh chi cho vào bình

nón 100 ml, đổ ngập ether dầu hỏa, ngâm qua đêm; lọc thu dịch lọc Dịch lọc dùng

để làm các phản ứng định tính chất béo và sterol

3.2.1 Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch

H2SO4 1 N Đun sôi, để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6 N đến pH 9  10 Chiết alcaloid bằng cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 1 N Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi thêm vào từng ống

2  3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

 Ống 1: TT Mayer, dung dịch có mầu đỏ gạch, không có tủa vàng nhạt

 Ống 2: TT Dragendorff, dung dịch trong suốt, không có tủa vàng cam

 Ống 3: TT Bouchardat, dung dịch màu nâu, không có tủa.

Nhận xét: Dược liệu không có alcaloid.

3.1.2 Định tính glycosid tim

Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250 ml Thêm 100 ml cồn 25%, ngâm trong 24 giờ Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30% khuấy đều Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc có mỏ Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat Nếu xuất hiện tủa thì ngừng

lọc, thêm khoảng 1 ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với CHCl3 − MeOH (4 : 1) mỗi lần 8 ml Gạn dịch chiết CHCl3

vào cốc có mỏ, loại nước bằng Na2SO4 khan Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:

 Phản ứng Liebermann-Burchardt: Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml

anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở giữa hai lớp chất lỏng không có vòng màu đỏ tím

 Phản ứng Legal: Hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 900; nhỏ

1 giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%; lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ cam

 Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90% Lắc

đều cho tan hết cắn; nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet, không quan sát thấy có hiện tượng gì

Nhận xét: Dƣợc liệu không có glycosid tim

3.2.3 Định tính flavonoid

 Phản ứng cyanidin: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột

magie kim loại; nhỏ từng giọt HCl đặc (3  5 giọt); để yên một vài phút, màu của dung dịch không thay đổi

 Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ

khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc không thấy màu vàng hiện rõ

Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn,

thêm vào 2  3 giọt dung dịch FeCl3, không có tủa màu xanh đen

Nhận xét: Dƣợc liệu không có flavonoid

Quan sát hiện tượng huỳnh quang:

Nhỏ 2  3 giọt dịch chiết cồn lên một khoang giấy thấm Nhỏ 2  3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết, sấy nhẹ Che 1 phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng 1 miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong 1 vài phút Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy cả 2 phần đều phát quang giống nhau

Nhận xét: Dƣợc liệu không có coumarin

3.2.5 Định tính tanin

Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết nước, làm các phản ứng sau:

 Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%: cho vào ống nghiệm dịch chiết nấm Linh

chi 2  3 giọt dung dịch FeCl3 5%, không có tủa màu xanh đen

 Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2  3 giọt dung dịch gelatin 1% vào ống nghiệm chứa dịch chiết, không quan sát thấy tủa bông vàng

 Phản ứng với chì acetat: cho vào ống nghiệm dịch chiết nấm Linh chi 2  3

giọt dung dịch chì acetat 10%, không thấy có tủa bông trắng

 Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết nấm Linh chi

2  3 giọt đồng acetat, không thấy xuất hiện tủa nâu

Nhận xét: Dƣợc liệu không có tanin

3.2.6 Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước nấm Linh chi một ít tinh thể Na2CO3, quan sát thấy có bọt khí

Nhận xét: Dƣợc liệu có acid hữu cơ

3.2.7 Định tính acid amin

Lấy 2 ml dịch chiết nấm Linh chi vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2  3 ml giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút thấy dung dịch chuyển sang màu tím

Nhận xét: Dƣợc liệu có acid amin

Cho vào ống 1, 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol; ống 2, 4 ml dịch chiết

nấm Linh chi và 5 giọt thuốc thử Lugol thấy xuất hiện màu nâu đỏ

Nhận xét: Dƣợc liệu có polysaccharid.

3.2.10 Định tính chất béo

Nhỏ 2 giọt dịch chiết n-hexan lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi

thấy để lại vết mờ trên giấy lọc

Nhận xét: Dƣợc liệu có chất béo

3.2.11 Định tính sterol

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết n-hexan, bốc hơi dung môi đến khô Thêm

vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 450 nhỏ từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Kết quả cho thấy giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ

Nhận xét: Dƣợc liệu có sterol

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong nấm Linh chi bằng phản ứng hóa

học được tóm tắt trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong nấm Linh chi bằng

(Ghi chú : () âm tính, (+) dương tính)

Nhận xét: Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy, nấm Linh chi có

chứa acid hữu cơ, đường khử, acid amin, polysaccharid, sterol và chất béo, không thấy sự có mặt của alcaloid, glycosid tim, tanin, flavonoid và coumarin