Hóa học của các chất ức chế dippeptidyl peptidase 4 dùng trong điều trị tiểu đường

Các chất có trọng lượng phân tử thấp ức chế thuận nghịch dipeptidyl peptidase – 4 DPP-IV đã được nghiên cứu trong nhiều năm [142] cho thấy tác dụng hạ đường huyết tốt, tăng dung nạp gluc

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BẠCH ĐỨC HIỆP

HÓA HỌC CỦA CÁC CHẤT ỨC CHẾ DIPEPTIDYL PEPTIDASE-4 DÙNG TRONG ĐIỀU TRỊ TIỂU ĐƯỜNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

Người thầy đã dành thời gian và tâm huyết hướng dẫn tận tình, chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong suốt quá tình thực hiện đề tài.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến, DS Hoàng Văn Hải cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa

dược đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo và các thầy

cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè cũng như những người thân yêu đã luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi trong học tập và trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2013

GIP = Gastric inhibitory peptide

HbA[1c] = Glycosylated hemoglobin A1c

FDA = US Food and Drug Administration

OGTT = Oral glucose tolerance test

TZDs = Thiazolidinediones

SUs = Sulphonylurea’s

SAR = Structure-activity relationships

ĐTĐ = Đái tháo đường

POP = Prolyl oligopeptidase

HDL = Lipoprotein tỷ trọng cao

LDL = Lipoprotein tỷ trọng thấp

HTS = High-throughput screening

FAP = Fibroblast activation protein

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 ………39

Bảng 3.2 ………51

Bảng 3.3 ………52

Bảng 3.4 ………52

Bảng 3.5 ………52

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Các sulfonylurea thế hệ 1 5

Hình 1.2: Các sulfonylurea thế hệ 2 5

Hình 1.3: Một số thuốc đại diện của nhóm biguanid 5

Hình 1.4: Một số thuốc đại diện của nhóm thiazolidindion 6

Hình 1.5: Một số đại diện của nhóm meglitinid [30, 31] 6

Hình 1.6: Một số đại diện của nhóm 7

Hình 2.7: Đặc điểm vị trí của 6 thành viên trong họ DPP-IV,với sDPP-IV là dạng hòa tan của DPP-IV [10] 10

Hình 2.8: Chuỗi theo hàng ngang các acid amin trên DPP-IV và POP 11

Hình 2.9: Toàn thể cấu trúc của DPP-IV dạng homodimer 12

Hình 2.10: Cấu trúc các monomer [51] 14

Hình 2.11: Cách tấn công vào DPP-IV 15

Hình 2.12: Các vị trí hoạt động trên DPP-IV 17

Hình 2.13: Diprotin A (IIe-Pro-Ile) và các vị trí hoạt động của DPP-IV 18

Hình 2.14: Đường vào vị trí hoạt động của DPP-IV 19

Hình 2.15: Vị trí các aa trên GLP-1 và GIP [69] 20

Hình 2.16: Vị trí tác dụng của DPP-IV 20

Hình 2.17: Cơ chế hoạt động của GLP-1 trong việc điều tiết glucose. 21

Hình 2.18: Hai cách để bảo vệ dạng hoạt động của hormon incretin trước tác dụng của enzym DPP-IV [65] 21

Hình 2.19: Giản đồ cơ chất của DPP-IV 23

Hình 2.20: Tính chọn lọc trên DPP-IV của một số chất ức chế. 24

Hình 3.21: Các chất dẫn đường trong tổng hợp của DPP-IV. 26

Hình 3.22: Giản đồ cơ chất của DPP-IV. 26

Hình 3.23: Các chất ức chế nhóm peptid và không cộng hóa trị 27

Hình 3.24: Các chất ức chế cộng hóa trị. 28

Hình 3.25: Các chất dẫn đường của cyanopyrrolidin. 29

Hình 3.26: nhóm α 36

Hình 3.27: nhóm α thuận nghịch và không thuận nghịch 37

Hình 3.28: Sitagliptin 37

Hình 3.29: Một số đại diện nhóm không giả peptid. 37

Hình 3.30: Cơ sở thiết kế cấu trúc C dựa vào Alogliptin (A) và các chất ức chế DPP-IV (B) .42

Hình 3.31: Những vị trí tấn công của C với DPP-IV 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh đái tháo đường typ 2 (T2DM) là bệnh phổ biến trên toàn thế giới và chiếm gần 6% tổng dân số Gần 200 triệu người bị bệnh tiểu đường thì có đến 90-95% số người bị T2DM Theo ước tính sẽ có khoảng 366 triệu người bị ảnh hưởng bởi T2DM trong vòng 30 năm tới nếu các biện pháp phòng ngừa không còn hiệu quả [97] Theo hãng thông tin quảng cáo Med sự lão hóa và béo phì của dân số ngày càng tăng sẽ thúc đẩy thị trường thuốc T2DM lên tới khoảng 20.5 tỷ USD vào năm 2012 Các thuốc điều trị đường uống hiện nay đối với T2DM bao gồm metformin, sulfonylurea (SU), thiazolidinedion (TZD) và các chất ức chế glycosidase Chúng đều gây ra các tác dụng phụ như: gây độc đường tiêu hóa, tăng cân, phù nề và do đó xuất hiện nhu cầu phát triển các thuốc chống đái tháo đường (ĐTĐ) Trong nhiều năm gần đây, các liệu

pháp điều trị làm tăng mức insulin đã được chứng minh là có lợi cho điều trị T2DM Các chất có trọng lượng phân tử thấp ức chế thuận nghịch dipeptidyl peptidase – 4 (DPP-IV) đã được nghiên cứu trong nhiều năm [142] cho thấy tác dụng hạ đường huyết tốt, tăng dung nạp glucose và cải thiện đáp ứng insulin để chống lại những bệnh nhân có T2DM [119] Vì vậy DPP-IV được xem

là tiềm năng cho mục tiêu điều trị của T2DM Bằng chứng chứng minh hiệu quả của các chất ức chế DPP-IV đã được chấp nhận trên thử nghiệm lâm sàng ở người và cho thấy việc cải thiện tốt lượng glucose [92, 102]

DPP-IV và các chất ức chế DPP-IV hiện đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, nghiên cứu Tuy nhiên, ở Việt Nam, vấn đề này còn khá mới lạ Vì vậy chúng tôi đã thực

hiện đề tài “HÓA HỌC CỦA CÁC CHẤT ỨC CHẾ DPP-4 DÙNG TRONG ĐIỀU TRỊ

TIỂU ĐƯỜNG” với mong muốn hệ thống hóa các chất ức chế DPP-IV Mục tiêu của đề tài này

1.1.2 Phân loại :

Hiệp hội ĐTĐ Mỹ 2009, ĐTĐ được chia làm 4 loại ĐTĐ typ 1; ĐTĐ typ 2; ĐTĐ thai kỳ

và các typ đặc biệt khác Trong đó chủ yếu nghiên cứu 2 dạng là typ1 và typ 2

 ĐTĐ typ 1

ĐTĐ typ 1 đặc trưng bởi tình trạng thiếu insulin tuyệt đối, hậu quả của sự phá hủy tế bào β

do nguyên nhân tự miễn, do virus, do hóa chất hoặc tự phát (vô căn) trong đó nguyên nhân thường gặp nhất là do tự miễn Triệu chứng của ĐTĐ type 1 bao gồm : khát nhiều, ăn nhiều, đái nhiều và giảm cân Tuổi khởi bệnh thường gặp nhất là dưới 30, tuy vậy cũng có thể gặp ở lứa tuổi cao hơn Bệnh thường có yếu tố di truyền hoặc liên quan đến 1 số yếu tố môi trường (nhiễm virus trong thời kỳ có thai, độc tố ) và có thể mắc cùng với một số bệnh tự miễn khác như :

basedow, viêm tuyến giáp Hashimoto, bệnh Addision

 ĐTĐ typ 2 :

ĐTĐ typ 2 liên quan đến sự thiếu insulin tương đối và hiện tượng kháng insulin Nồng độ insulin máu bình thường hoặc cao trong trường hợp đề kháng insulin chiếm ưu thế Nồng độ insulin giảm trong trường hợp có khiếm khuyết chức năng tiết insulin Như vậy, mặc dù tế bào β đảo tụy vẫn tiết insulin nhưng không đủ để vượt qua mức độ kháng insulin do đó glucose huyết vẫn tăng

 So sánh sự khác nhau giữa typ 1 và typ 2 :

 Typ 1 :

Hay còn gọi là bệnh tự miễn, tuyến tụy bị tấn công và phá hủy bởi chính các tế bào tự miễn, do đó làm bất hoạt khả năng tiết insulin Những người bị đái tháo đường typ 1 phải được tiêm insulin hàng ngày

 Typ2 :

Tuyến tụy sản xuất đủ insulin, tối thiểu trong các bữa ăn hàng ngày của người bị bệnh tiểu đường Nhưng do một vài nguyên nhân mà vẫn chưa được xác định rõ, các tế bào của cơ thể đã kháng lại hoặc vô tình kháng lại insulin Để bù đắp lại, các bơm của tuyến tụy tăng cường lượng insulin để đưa mức glucose về bình thường Và theo thời gian, khoảng 10 năm, việc tăng insulin không được duy trì, và khả năng sản xuất insulin của tuyến tụy bị suy giảm [14]

 Chương trình huấn luyện bệnh nhân

 Thuốc làm giảm đường khi cần thiết

 Các nhóm thuốc điều trị tiểu đường :

Để điều trị tiểu đường có 2 loại chính : insulin (hormon tuyến tụy) và các thuốc tổng hợp điều trị ĐTĐ

1.2.1 Insulin :

Lần đầu tiên, insulin được chiết tách thành công từ tuyến tụy của chó vào năm 1922 bởi Banting và Best Năm 1951, Sanger và cộng sự đã xác định được cấu trúc hóa học của insulin và

năm 1963, insulin đã được tổng hợp toàn phần Năm 1972, cấu trúc không gian 3 chiều của insulin đã được xác định bởi Hodg-kin cùng cộng sự bằng phân tích tia X của các đơn tinh thể.

Insulin được tổng hợp ở các tế bào β của tuyến tụy từ preproinsulin, một polypeptid mạch đơn gồm 110 aa Sau đó, nó bị tách mất 24 aa cuối cùng để tạo thành proinsulin.

Insulin được điều chế bằng cách phân lập từ tuyến tụy của lợn, bò Muốn điều chế insulin người, bán tổng hợp từ insulin lợn hoặc bằng công nghệ tái tổ hợp ADN

 Các thuốc tổng hợp điều trị bệnh ĐTĐ

Thuốc tổng hợp chống tăng đường huyết hoặc thuốc làm hạ đường huyết có tác dụng tốt trong điều trị bệnh đái tháo đường typ 2 Theo cơ chế tác dụng, có thể chia các thuốc này thành các nhóm cơ bản sau :

 Nhóm 1 : sulfonylurea:

Năm 1942 Janbon và đồng nghiệp phát hiện ra rằng, một số sulfonylurea có tác dụng hạ đường huyết Khám phá này dẫn đến việc đưa 1-butyl-3sulfonylurea (carbutamid) vào điều trị bệnh đái tháo đường Về sau, do độc tính trên tủy xương nên hợp chất này không dùng nữa Năm 1950, chất đầu tiên được sử dụng rộng rãi trong bệnh điều trị đái tháo đường là tolbutamid,

và từ đó, 20 hợp chất thuộc nhóm này được đưa vào sử dụng trong điều trị [73]

Tất cả các hợp chất này đều là dẫn chất của sulfonylurea, khác nhau ở vị trí R1 và R2 Do

có tính acid yếu nên các hợp chất nhóm này liên kết mạnh với protein trong máu Vì vậy, khi dùng đồng thời với các thuốc khác, chúng có thể đẩy các thuốc đó ra khỏi chỗ liên kết protein,

có khi gây tác dụng không mong muốn Ví dụ, khi dùng tolbutamid đồng thời cùng dicumarol,

có thể gây chảy máu

Các sulfonylurea được chia làm 2 thế hệ, thế hệ 2 tác dụng mạnh và thường lâu hơn thế hệ

1 Sau đây là công thức cấu tạo của một số hợp chất

Thế hệ 1 (Hình 1.1) :

Hình 1.1: Các sulfonylurea thế hệ 1

Thế hệ 2 (Hình 1.2) :

Hình 1.2: Các sulfonylurea thế hệ 2

 Nhóm 2 : biguanid và các dẫn chất

Thời trung cổ, ở châu Âu, người ta đã dùng cây Galera officinalis để điều trị bệnh đái tháo

đường Đầu thế kỷ 20, các nhà khoa học đã xác định được hoạt chất trong cây có tác dụng là guanadin Tuy có tính chất làm hạ đường huyết, nhưng độc tính cao nên guanadin không được dùng trong điều trị Một thời gian ngắn sau khi đưa các sulfonylurea vào điều trị, một biguanide đầu tiên là phenformin được dùng trong lâm sàng Phenformin gây nhiễm acid lactic nên ngày nay không được tiếp tục sử dụng Metformin, một biguanid khác có tác dụng tốt, ít tác dụng phụ được sử dụng rộng rãi như hiện nay

Một số thuốc đại diện (Hình 1.3) :

Hình 1.3: Một số thuốc đại diện của nhóm biguanid

 Nhóm 3 : nhóm thiazolidindion và các dẫn chất :

Năm 1997, triglitazon, một TZD đầu tiên cũng được sử dụng tại Mỹ [45] Đây là một nhóm thuốc mới có tác dụng chống tăng đường huyết Trong nhóm này, hiện có 2 chất được dùng trong điều trị đái tháo đường typ 2 là pioglitazon và rosiglitazon

Hình 1.4: Một số thuốc đại diện của nhóm thiazolidindion

 Nhóm 4 : các chất tương tự meglitinid

Các glinid cũng được xem là một đại diện mới trong nhóm điều trị T2DM, chúng có cấu trúc tương tự với meglitinid Các glinid kích thích bài tiết insulin, tác dụng nhanh và thời gian bán thải ngắn Hoạt động bằng cách khóa kênh KATP

Hình 1.5: Một số đại diện của nhóm meglitinid [30, 31]

 Nhóm 5 : các chất ức chế α-glucosidase

Trong nhóm này có 2 chất hay được dùng trong điều trị bệnh đái tháo đường là acarbose và miglitol [45] Cơ chế tác dụng chung là ức chế thuận nghịch các enzym α-glucosidase ở ruột non nên làm giảm việc tạo thành glucose, giảm hấp thu glucose vào máu

1.3 Tác dụng trong điều trị và so sánh các nhóm thuốc :

1.3.1 Tác dụng trong điều trị của các thuốc :

Mỗi nhóm thuốc điều trị T2DM đều có những cách tấn công và tác dụng khác nhau Nhưng đều có điểm chung là :

 Làm giảm mức đường huyết

 Giúp cải thiện khả năng sử dụng glucose của cơ thể

 Làm giảm các triệu chứng tăng đường huyết

Trong đó :

 Insulin : điều trị bệnh ĐTĐ và các biến chứng của nó như ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2 (khi các

biện pháp điều trị khác không có hiệu quả) và điều trị ĐTĐ thai kỳ.

 Sulfonylure và meglitinid làm tăng khả năng bài tiết insulin từ tuyến tụy

 Metformin làm giảm lượng sản phẩm glucose từ gan và làm giảm các yếu tố kháng

insulin

 Các chất ức chế α-glucosidase làm cản trở khả năng hấp thu glucose ở ruột

 Nhóm thiazolidindion làm giảm các yếu tố kháng insulin

 Các chất ức chế DPP-IV làm tăng khả năng giải phóng insulin từ tuyến tụy ngay sau bữa ăn

 So sánh ưu nhược điểm của các nhóm thuốc :

Ưu điểm Nhược điểm

Nhóm sulfonylure (glyburid, glimepirid, glipizid) [23-25, 93]

- Tăng nguy cơ hạ đường huyết

- Glyburide có nguy cơ hạ đường huyết cao hơn glimepirid và glipizid

Metformin (nhóm biguanid)

- Nguy cơ hạ đường huyết thấp

- Không liên quan tới việc tăng cân

- Không ảnh hưởng tới việc tăng cân

- Giảm lượng triglycerid

- Không tác động lên cholesterol

- Kém nhất trong tất cả các thuốc điều trị ĐTĐ ở dạng viên trong việc

- Nguy cơ hạ đường huyết thấp

- Cũng có một phần tác dụng tốt trên

cholesterol (HDL)

- Pioglitazin có liên quan đến việc làm

giảm triglycerid

- Liều dùng thuận tiện

- Tăng nguy cơ tim mạch

- Tăng cân (trung bình cũng từ 2.25 đến 4.5 kgs

- Có nguy cơ trong việc liên quan tới triệu chứng phù

- Có nguy cơ cao trong việc liên quan tới bệnh thiếu máu

- Tăng những tác dụng không tốt trên cholesterol LDL

- Rosiglitazon liên quan tới việc tăng triglycerid và nguy cơ nhồi máu

Nhóm meglitinid (nateglinid, repaglinid)

- Không có tác dụng xấu nào trên

cholesterol

- Tốc độ tác dụng nhanh

- Repaglinid có liên quan tới việc tăng nguy cơ giảm glucose huyết và cũng làm tăng cân giống sulfonylure

- Nateglinid kém hiệu quả hơn

- Liều dùng thuận tiện (có thể uống)

- Có khả năng duy trì và hổi phục tế

bào β [94]

- Giảm HbA1c kém hơn các thuốc trị đái tháo đường khác

- Chỉ có giá trị thật sự khi dùng kèm với các thuốc trị đái tháo đường

Nguyên nhân DPL-1 và DPL-2 không có khả năng xúc tác được cho là do 1 số aa đã bị thế trong hốc xúc tác [37].

Hình 2.7: Đặc điểm vị trí của 6 thành viên trong họ DPP-IV,với sDPP-IV là dạng hòa tan của

DPP-IV [10]

Dipeptidayl peptidase IV (DPP-IV- E.C 3.4.14.5) lần đầu tiên được tìm thấy từ gan chuột năm 1966 [70, 127] Còn gọi là CD26 hay protease loại serine xuyên màng typ II hay enzym adenosine deaminase liên kết với protein (ADAbp); là một dipeptidase gồm 766 acidamin, có tốc

độ rất xúc tác nhanh ở bên trong tế bào [40, 67, 75] Một dạng hòa tan của enzym cũng đã được tìm thấy trong huyết tương [47, 74]

2.1.2 Cấu trúc của DPP-IV :

Hình 2.8: Chuỗi theo hàng ngang các acid amin trên DPP-IV và POP

Ghi chú: [133]

 hDPP-IV và rDPP-IV : DPP-IV từ người và chuột

 Hàng trên là thông tin về cấu trúc bậc 2 của DPP-IV

 Những mũi tên màu vàng và những thanh màu đỏ : chỉ biểu diễn sự khác nhau giữa các aa

 Y : các vị trí glycosyl hóa giàu điện tử

 Màu đỏ : các vị trí có khả năng glycosyl hóa

 Những đường màu xanh với các cystein : các liên kết disulphid

 Màu hồng : các gốc xúc tác

 Màu xanh da trời : biểu diễn cho tyrosin có chức năng ổn định nguyên tử oxy âm phần

 Màu xanh lá cây : các aa nằm trong liên kết của adenosine deaminase

 Màu xám : phần xuyên màng

Cấu trúc tinh thể (Hình 2.9) của vùng ngoài (từ aa 39 tới 766) của DPPIV khoảng 2.1Ao và gồm 2 phần chính: 1 N-tận gồm 8 β-chân vịt tạo thành hình dẹt (từ aa 61 tới 495) và 1 C-tận có α/β hydrolase (từ aa 39 tới 55 và 497 tới 766) [6, 104, 133]

Hình 2.9: Toàn thể cấu trúc của DPP-IV dạng homodimer

Ghi chú : Dimer màu đỏ và xanh; vị trí hoạt động của các aa hình cầu và sợi, trục xoắn α

màu vàng [6]

Các hốc vùng chân vịt tỳ vào vùng xúc tác thủy phân, và bộ ba của trung tâm xúc tác

(S630; H740 và D708) nằm tại vị trí giao thoa giữa 2 vùng Tốc độ xúc tác cho việc phân cắt cơ

chất H-Ala-Pro-7-amido-4-trifluromethylcoumarin (Ala-Pro-AFC) của DPPIV là 5.2 * 106 M-1s-1 [6, 122]

Mỗi đơn vị bất đối bao gồm 2 homodimer [51] Cấu trúc các monomer (Hình 2.10) phù

hợp với độ lệch tiêu chuẩn (RMSDs) là từ 0.64Ao tới 0.98Ao cho các nguyên tử nặng và từ

0.28Ao tới 0.56Ao cho các nguyên tử Cα Bề mặt của mỗi dimer bao gồm:

 Sợi β cuối cùng (β8) của vùng β trung tâm có cấu trúc gấp nếp

Hình 2.10: Cấu trúc các monomer [51]

2.1.3 Cách tấn công :

Dựa vào cấu trúc và hoạt tính sinh học của DPPIV, sẽ có 2 cách để tấn công vào các vị trí

hoạt động của nó (Hình 2.11) : thông qua vị trí mở của vùng chân vịt hoặc vị trí mở bên nằm

giữa bề mặt của vùng chân vịt-β và vùng xúc tác thủy phân [51, 106] :

Hình 2.11: Cách tấn công vào DPP-IV

Vị trí mở hình chân vịt liên kết với vùng lớn của chuỗi bên được hình thành từ bề mặt chung giữa vùng β-chân vịt và vùng hydrase Lỗ hình cầu này đã tạo ra cơ hội thứ 2 để tấn công vào vị trí hoạt động [51, 119]

2.1.4 Các vị trí đặc biệt trên DPP-IV :

Chuỗi peptid ở đầu N-tận được nhận biết bởi các aa tích điện âm ở trung tâm hoạt động tại E205 và E206 [26] và được cố định bởi liên kết hydro với chuỗi bên của 2 aa glutamic 2 aa glutamic này được giữ nguyên dạng cấu trúc bởi liên kết cầu muối và liên kết hydro với aa R125, Y662, D663 và N710 Khả năng xúc tác của DPP-IV cho việc phân cắt các peptid tốt nhất

là khi có 1 pro hoặc ala tại vị trí P1 [81, 83] (các tên gọi đặc biệt như : P1, S1, S2 sẽ được chỉ rõ trong giản đồ cơ chất và cơ sở thiết kế ở phần sau)

Hốc sơ nước S1 gồm các acid amin V656, Y631, Y662, W659, Y666, và V711 Hốc S2

cũng là sơ nước và được xác định bởi chuỗi acid amin R125, F357, Y547, P550, Y631, và Y666

Gốc Ser630 được hình thành bởi các aa Gly-Trp-Ser630-Tyr-Gly Chuỗi này là cần thiết cho khả năng hoạt động của DPPIV [108] và được lưu lại trong họ α/β hydrolase (Gly-X-Ser-X-

Gly) Hướng của S630 được giữ bởi những liên kết hydro nằm giữa nhóm carbonyl của S630 với amide của Y634, và amid của S630 với carbonyl của V653 [6, 122].

 Trung tâm hoạt động của DPP-IV :

Trung tâm hoạt động của DPP-IV gồm bộ 3 xúc tác: Ser630, Asp708 và His740 Ngoài ra, còn có các vị trí xúc tác cần thiết cho hoạt động của DPP-IV như: Tyr547 nằm ở vùng xúc tác thủy phân, Glu205 và Glu206 nằm ở vùng β-chân vịt [4, 99, 108, 122]

Trung tâm hoạt động này nằm ở một khoang rộng là bề mặt giao của 2 vùng : vùng β-chân vịt và vùng xúc tác thủy phân Ser630 nằm giữa sợi β5 và trục xoắn C, hình khuỷu và có tính ái nhân, mang đặc trưng loại α/β hydrolase [109] Nhóm hydroxyl của serin cộng hóa trị tốt và tạo liên kết hydro với nhóm imidazol của His740 (2.6Ao) His740 nằm giữa sợi β8 và trục xoắn F Với một khoảng cách 2.75Ao tới vòng imidazol, một trong những ion oxyanion của Asp708 tạo liên kết hydro với His740 và tạo thành bộ ba xúc tác Ion oxyanion khác của nhóm carboxyl của Asp708 có tọa độ được xác định bởi 2 chuỗi chính là các nhóm NH (Val711 và Asn710) [109]

Hai acid glutamic (Hình 2.12) thẳng hàng với các cơ chất peptid vì vậy chỉ những aa với

mặt bên nhỏ hơn, như là prolin và alanin có thể tìm đến vị trí hoạt động Cấu trúc này đã làm sáng tỏ tại sao DPP-IV ưu tiên cắt tại Xaa-Pro và Xaa-Ala và các vị trí đặc biệt khác của cơ chất [100]

Hình 2.12: Các vị trí hoạt động trên DPP-IV

Ghi chú : saxagliptin (màu đỏ tươi)

Acid gltutamic 205 và 206 hình thành cầu muối với nhóm amin nằm tại P2 của các chất ức chế [4] Các nhóm amino chứa trong các chất ức chế DPP-IV như alogliptin, saxagliptin, sitagliptin và vildagliptin đều được cho là tương tác với 2 glutamat này với độ mạnh của các

tương tác khác nhau Các tương tác này đều đã được chứng minh khi kiểm tra cấu trúc tinh thể bằng X-quang của phức hợp DPP-IV với sitagliptin [28], saxagliptin [100] và alogliptin [53] Trong đó saxagliptin có tương tác mạnh hơn so với alogliptin, sitagliptin và vildagliptin vì nó có

cả tương tác với Ser630 [100]

Asparagin 710 và arginin 125 tạo liên kết hydro với nhóm carbonyl của aa trên P2 Hốc sơ nước nhỏ được làm đầy tốt hơn với những vòng thơm nhỏ, đặc biệt là vòng pyrrolidin hoặc phenyl của chất ức chế Hai tyrosin hình thành nên lỗ oxyanion và vì thế Tyr547 được xem là quan trọng cho bộ ba xúc tác [29]

Ngoài ra, Gly628 và Gly632 cũng quan trọng cho sự thành lập cấu hình khi hướng cho Ser630 vào đúng vị trí Điều này cũng phù hợp với những nghiên cứu trên chuột có DPPIV khi

đã chỉ ra chuỗi Gly628-X-Ser630-Tyr631-Gly632 cũng cần thiết cho khả năng hoạt động của DPP-IV [108]

Để tìm hiểu rõ hơn về trung tâm hoạt động của DPP-IV, chúng ta sẽ nghiên cứu dạng phức của DPP-IV với cơ chất chọn lọc Xét cơ chất chọn lọc là :diprotin A khi gắn vào các vị trí hoạt

động của DPP-IV (Hình 2.13 và Hình 2.14) :

 Với diprotin A :

Diprotin A (Ile-Pro-Ile), một chất ức chế cạnh tranh [120, 121] , nó có liên kết cộng hóa trị với vị trí hoạt động Ser630 của DPP-IV Đầu N-tận Ile (P2) và Pro gốc (P1) có khả năng tương tác với các vị trí liên kết của cơ chất

DPP-IV làm thủy phân các oligopeptid và protein từ N-tận, cắt các đơn vị dipeptid khi đoạn thứ 2 là prolin, hydroxyprolin, dehydroprolin, pipecolic acid hoặc alanin Các tiểu đơn vị

prolin tại vị trí P1 của diprotin A ở dạng trans và khớp với các vị trí hoạt động trên enzym Hốc

S1 gồm: Val711, Val656, Tyr662, Tyr666, Trp659, và Tyr631, kỵ nước, có thể được làm đầy bởi prolin tốt hơn là alanin

Điều cần thiết cho việc liên kết của cơ chất là N-tận của cơ chất, nó có thể được bảo vệ hoặc không được bảo vệ Phức hợp diprotin A đã cho thấy nhóm NH3+ - tận được giữ vị trí rất chính xác bởi tương tác mạnh với carboxylat của cặp phân tử Glu (Glu205 và Glu206 ) cũng như OH- của Tyr662 Glutamic thứ 3, Glu204, có một liên kết hydro với NH của Arg125, His126 và Ser127 cũng như nhóm OH- của Ser127

Hình 2.13: Diprotin A (IIe-Pro-Ile) và các vị trí hoạt động của DPP-IV

Ghi chú :

 Cơ chất diprotin A được giữ trong một hình tứ diện theo liên kết cộng hóa trị với

Ser630

 Các liên kết màu xanh da trời tối : protein.

 Xanh da trời sáng: phối tử

 Xanh lá cây : vị trí hoạt động của Ser630

 Những đường nét đứt : các liên kết hydro.

Hình 2.14: Đường vào vị trí hoạt động của DPP-IV

 DPP-IV là mục tiêu phân tử trong điều trị T2DM

DPP-IV cũng là enzym màng phổ biến, cũng có vai trò điều chỉnh các quá trình sinh lý như dinh dưỡng, trao đổi chất, miễn dịch và nội tiết trong đó quan trọng là ảnh hưởng tới sự cân bằng glucose nội môi [19, 42, 46, 111] DPP-IV xúc tác thủy phân các dipeptid tại N-tận từ polypeptid với prolin hoặc alanin ở vị trí áp chót [100, 119]

Có liên kết chọn lọc với các cơ chất chứa prolin ở vị trí P1, do đó nhiều chất ức chế

DPP-IV có dị vòng 5 cạnh mô phỏng cấu trúc prolin…ví dụ như pyrrolidin, cyanopyrrolidin, thiazolidin và cyanothiazolidin [8] Các chất này thường hình thành liên kết cộng hóa trị với Ser630 [90]

DPP-IV có khả năng làm bất hoạt các incretin [65], đặc biệt là GLP-1 và GIP, đều là các hormon từ ruột được bài tiết để đáp ứng với lượng thức ăn [66, 69, 116, 119]

Hình 2.15: Vị trí các aa trên GLP-1 và GIP [69]

Hình 2.16: Vị trí tác dụng của DPP-IV

Hình 2.17: Cơ chế hoạt động của GLP-1 trong việc điều tiết glucose.

Ngay sau khi được giải phóng từ niêm mạc tiêu hóa trong các bữa ăn, các hormon incretin (GLP-1 và GIP) tham gia như chất hỗ trợ giúp insulin được tiết ra từ các tế bào β đảo tụy làm giảm lượng glucose [119, 137]

Hình 2.18: Hai cách để bảo vệ dạng hoạt động của hormon incretin trước tác dụng của enzym

DPP-IV [65]

Khi GLP-1 nhanh chóng bị thải trừ (thời gian bán thải khoảng 1 phút) vì chúng bị phân cắt bởi DPP-IV thành dạng mất hoạt tính, đã có các nghiên cứu được đưa ra như sử dụng các GLP-1 ngoại sinh, các GLP-1 protein nhiệt hạch và các chất tương tự GLP-1 kháng DPP-IV để điều trị T2DM Dùng GLP-1 cho bệnh nhân di truyền mạn tính đã dẫn tới việc giảm đáng kể cả lượng glucose trong máu và huyết tương HbA1c [39, 148]

Các nghiên cứu lâm sàng trên người cũng đưa ra các bằng chứng chứng minh hiệu quả của việc giảm glucose huyết khi dùng sitagliptin và vildagliptin đơn độc hoặc kết hợp với các tác nhân chống ĐTĐ khác hiện có Cơ chế tác dụng mà các chất ức chế DPP-IV làm giảm đường huyết là khác biệt so với các tác nhân làm hạ đường huyết khác Chúng kiểm soát lượng đường trong máu cao bởi việc gây cho tuyến tụy tăng tiết insulin, tăng tuần hoàn GLP-1, giảm tiết glucagon và truyền tín hiệu cho gan để giảm sản xuất glucose [103] Đánh giá này đã nhấn mạnh

sự phát triển của các chất khác nhau ức chế DPP-IV dựa trên các nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng Nó bao gồm cả tiềm năng phát triển các chất ức chế DPP-IV theo tác dụng của GLP-1 [66]

Ngoài ra, các thử nghiệm trong lâm sàng của vildagliptin đối với những người bị T2DM đã được tiến hành khi dùng đơn liều hay dùng kết hợp với metformin, pioglitazon hoặc insulin và cũng đã chứng minh được khả năng cải thiện lượng đường huyết [101, 118, 123] Những bệnhnhân được điều trị với liều 100mg vildagliptin/ngày trong khoảng 24 tuần cho thấy mức giảm

A1C ( trong đó, A1c là tỉ lệ phần trăm của HbA1c (đã gắn glucose) trên tổng Hb toàn phần, giúp đánh giá lượng đường trung bình có trong máu trong vòng 2-3 tháng gần nhất bằng cách đo nồng

độ của glycosylated hemoglobin) trung bình là 1.1% từ mức ban đầu là 8.7 % trên 1.301 bệnh

nhân [105] Khi dùng kết hợp vildagliptin với metformin cũng cải thiện đáng kể khả năng kiểm soát đường huyết và tốt hơn so với dùng kết hợp metformin và giả dược Sau gần 1 năm dùng kết hợp vildagliptin với metformin; 41,7% các đối tượng đạt mức A1C là 7% (từ mức A1C ban đầu

là 7.6-7.8%) Ngược lại, chỉ 10.7% bệnh nhân dùng metformin kết hợp với giả dược có A1C

<7%

Vildagliptin cũng đã cho thấy tác dụng của nó khi dùng với pioglitazon [62, 124] Các bệnh nhân được điều trị với liều :

 50mg vildagliptin/ngày và 15mg pioglitazon /ngày

 Hoặc 100mg vildagliptin /ngày và 30mg pioglitazon /ngày

trong khoảng 24 tuần đã cả thiện đáng kể mức A1C so với các bệnh nhân chỉ dùng 30mg/ngày pioglitazon Mức giảm A1C trung bình tương ứng là -1.7%; -1.9% và -1.4%

Một thử nghiệm lâm sàng khác với 256 bệnh nhân bị tiểu đường mà dùng insulin vẫn chưa kiểm soát được lượng đường huyết Nghiên cứu này đã chứng minh rằng việc kết hợp với vildagliptin đã dẫn tới cải thiện triệt để khả năng kiểm soát đường huyết cho những bệnh nhân

đó [58] Những bệnh nhân này uống 50mg vildagliptin 2 lần hàng ngày khi dùng kết hợp với insulin có A1C giảm 0.5% so với nhóm dùng insulin và giả dược chỉ giảm có 0.2% sau 24 tuần điều trị

Kết luận, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vildagliptin có tác dụng trong việc kiểm soát lượng đường huyết ở những bệnh nhân T2DM khi dùng như một liệu pháp điều trị đơn độc và khi được sử dụng kết hợp với metformin, pioglitazon hoặc insulin

 Một số cơ chất của DP-IV:

Hình 2.19: Giản đồ cơ chất của DPP-IV

Dựa trên các nghiên cứu in vitro, một loạt các cơ chất đã được tìm ra như : GLP-1 (7-37*)

và GLP-1 (7-36*) amid, neuropeptid Y, diprotin A, interleukin-2, interleukin-1β, bradykinin, thyrotropin α, vasostatin-1, GLP-2 (1-33), prolactin, GIP (1-42), glucagon, trypsinogen [56, 63]

2.4 Tầm quan trọng của việc ức chế chọn lọc trên DPP-IV:

DPP-IV, DPP8, và DPP9 là các thành viên của gia đình DPP-IV Vì thế khi một chất ức chế không chọn lọc DPP-IV có thể gây ra những tác dụng không mong muốn Các nhà khoa học

của Merk đã công bố độc tính trên chuột với một chất ức chế kép trên DPP8/9 (2.1) (Hình 2.20)

IC50 tương ứng là 38 và 55 nM với các tác dụng phụ là : rụng lông, giảm lượng tiểu cầu, thiếu máu, giãn lá lách và có thể gây tử vong Độc tố tương tự khi quan sát với các chất ức chế trên không chọn lọc DPP-IV và vì thế nó ức chế cả DPP8/9, nhưng điều này không được quan sát

thấy với các chất có tính chọn lọc trên DPP-IV như MK-0431 (2.3) (Hình 2.20) (DPP-IV IC50=

27 nM, DPP8 IC50= 69 µM và DPP9 IC50 > 100 µM Một vài chất ức chế đầu tiên được công bố

là ức chế DPP-IV kém chọn lọc trên DPP-8/9 Do đó, nó cũng cần hết sức thận trọng khi tiếp tục phát triển nhóm ức chế DPP-IV trong nghiên cứu điều trị T2DM Mặc dù cơ chế chưa được hiểu

rõ nhưng FDA (U.S Food và Drug Administration) đã yêu cầu tất cả các chất ức chế DPP-IV

phải được thử trên khỉ [98]

Hình 2.20: Tính chọn lọc trên DPP-IV của một số chất ức chế.

PHẦN 3: CÁC CHẤT ỨC CHẾ DPP-IV

3.1 Chất dẫn đường

* Theo phương pháp sang lọc tự nhiên, có 2 chất là:

 TMC-2 (3.1), phân lập từ Aspergillus orzae A374 ( IC50 = 7,7 µM) [147] Một chất

được tổng hợp hóa học với kích thước nhỏ hơn (3.1) và đã xác định được cấu trúc là TSL-225 (3.2) vẫn duy trì được hiệu lực tương đương (IC50 = 5,7 µM)

 Sulphostin (3.3) được phân lập từ Streptomyces sp MK251-43F3 [12].

* Theo phương pháp sàng lọc ngân hàng hóa chất (HTS), có các chất là:

Các chất dẫn đường (Hình 3.21) gồm : cyanopyrrolidin, noncyano-pyrrolidin và –

thiazolin, xanthin và β-phenethylamin [4, 20, 72, 77, 95, 117, 126, 130, 131, 138, 141]

Hình 3.21: Các chất dẫn đường trong tổng hợp của DPP-IV.

*Theo phương pháp thiết kế có chủ đích, có (3.6), (3.7), (3.8) :

Hình 3.22: Giản đồ cơ chất của DPP-IV.

Những chất ức chế đầu tiên xuất hiện vào cuối những năm 1980 và đầu năm 1990 Nó là

cơ sở quan trọng cho việc nghiên cứu SAR (nghiên cứu liên quan giữa cấu trúc và tác dụng) cho những khảo sát sau đó Các chất ức chế DPP-IV được chia làm 2 nhóm chính : nhóm cộng hóa trị và nhóm không cộng hóa trị

Tripeptide diprotin A (Ile-Pro-Ile (3.4)) và diprotin B (Val-Pro-Leu (3.5)) là những cơ chất

ức chế DPP-IV tương ứng với IC50 là 8 và 920 µM Hai chất này đều chứa proline ở vị trí điểm

nút Lys[Z-4-NO2]-pyrrolidin (3.6) với một vòng thơm khác được gắn vào P1, nơi mà DPP-IV thường tấn công vào prolin và alanin với IC50=2 µM Hai hợp chất khác với vòng thơm khác giả proline tại vị trí P1 là Val-pyrrolind (3.7) và Ile-thiazolidid ((3.8), P32/98) với IC50 tương ứng là 6.0 và 2.8 µM Những hợp chất này đã trở thành cơ sở cho việc phát triển các chất ức chế DPP-IV.

Hình 3.23: Các chất ức chế nhóm peptid và không cộng hóa trị

Các chất ức chế DPP-IV có liên kết cộng hóa trị với DPP-IV cũng được nghiên cứu sớm

N-peptidyl-O-aroyl hydrolamin (3.9) là chất ức chế yếu, ức chế không thuận nghịch và dễ bị

thủy phân [44] Các phosphonat dipaptid cũng là các chất ức chế không thuận nghịch

Hình 3.24: Các chất ức chế cộng hóa trị.

Cyanopyrrolidin :

Trong các chất dẫn đường trên thì các dẫn chất của cyanopyrrolidin chiếm số lượng nhiều nhất và có nhiều thuốc đã đi vào sử dụng hiện nay Việc tìm ra chất dẫn đường cyanopyrrolidin đầu tiên (cyanopyrrolidid, pyrrolidin-2-nitril, prolinenitril) năm 1995 được dựa trên 2 cơ sở: Thứ 1 :

Trong vài thập kỷ nay chúng ta đã biết, các nitril peptid có khả năng ức chế nhóm cystein protease và chúng cũng có khả năng ức chế yếu nhóm sterine protease vì nó có khả năng tạo imidat với gốc xúc tác serin [85, 89, 134, 143]

Thứ 2 :

Khoảng cuối năm 1980 và đầu năm 1990 các dẫn chất của aminoacylprilon có nhóm ái điện tử tương tác với gốc xúc tác serin được công bố và được cho là có tác dụng ức chế DPP-IV với mốc thời gian và tác giả tương ứng là Demuth năm 1989 [43, 54], Flentke [38, 57] 1991và

Powers năm 1994 [22, 33, 82, 128] (Hình 3.25), đây được xem là các chất ức chế DPP-IV đầu

tiên [34] Tuy nhiên, các hợp chất trên đều có hiệu lực điều trị thấp và độ ổn định hóa học không cao

Hình 3.25: Các chất dẫn đường của cyanopyrrolidin.

Quan sát các dữ kiện trên, Sherwin Wilk và cộng sự đã tìm cách gắn nhóm nitrile vào các chất ức chế DPP-IV: aminoacylprolin Kết quả là hình thành các dẫn chất của cyanopyrrolidin

có hiệu lực điều trị tốt, độ ổn định hóa học cao và cũng có tính chọn lọc trên enzym này [18] Tiếp những năm sau đó, Ferring đã có 2 bài báo khi nghiên cứu các chất ức chế DPP-IV dựa trên cấu hình của cyanopyrrolidin, họ đã đạt được bằng sáng chế năm 1993 và được xuất bản năm

1995 [13, 87] :

Thứ 1 : gắn thêm cycloalkyl làm tăng cả hiệu lực và độ bền hóa học [13, 115]

Thứ 2 : Đưa ra các nghiên cứu SAR với vị trí P1 Với vòng no 5 và 6 cạnh chứa kết hợp nitrogen, sulfur và oxygen, mỗi nhóm đều có nitril tại vị trí 2 [13, 115] Hợp chất có hiệu lực tốt nhất là thiazolidid

Các hợp chất từ Ferring đã cho thấy khả năng ức chế vượt trội, và độ ổn định hóa học cao Việc nghiên cứu DPP-IV như là đích điều trị của T2DM đã làm cho nhóm cyanopyrrolidin trở thành để tài nghiên cứu vô cùng rộng lớn trong suốt những năm sau đó Chất điển hình đầu tiên

là NVP-DPP728 (năm 1998) [72, 96, 141] Chất này đã được chứng minh có hiệu lực tác dụng trên người [9] và sau đó là vildagliptin [140] cùng saxagliptin [15, 61] là những chất tiến bộ nhất hiện nay trong thế hệ cyanopyrrolidin Vildagliptin và saxagliptin đều đã được phát triển thành thuốc trên thị trường

Những cơ chất hoặc các dẫn xuất tương tự cơ chất ((3.18)-(3.21)) ức chế DPP-IV đầu tiên

là [32, 43, 55, 68, 80, 84, 139] :

Một trong những hợp chất đó (ví dụ (3.20) và (3.21) ) là những chất ức chế không thuận

nghịch của enzym và được thiết kế để tạo ra sản phẩm cộng hóa trị với serin có hoạt tính xúc

tác Chính vì thế đã tạo ra các hợp chất có hiệu lực cao, bao gồm các chất có cả hoạt tính trên in

vivo [22].

Các hợp chất được tìm thấy sớm khác gồm các dẫn xuất của acid proline-boronic, như là

((3.22) - (3.23) - (3.24)) Những hợp chất này đều đã thử hoạt tính ức chế trên DPP-IV, bởi vì

người ta cho rằng acid boric có liên quan đến việc ức chế enzym này [57] 2 trong số 3 chất trên

là ổn định về mặt hóa học [76] và chọn lọc [38, 71, 129]

Các acylthiazolidid và acylpyrrolidid là những “cơ chất giả” [17, 50] Chất (3.25), P32/98

đã được kiểm tra hoạt tính và nó cũng có khả năng cải thiện lượng đường huyết [16, 117] Cấu

trúc tinh thể của valin-pyrolidin (3.26) đã cho thấy vòng pyrrolidin nằm trong hốc sơ nước S1, trong khi vanile ở chuỗi bên lại không có bất kỳ tương tác nào với enzym [122] Điều này đã

khiến các nhà khoa học nghiên cứu ra (3.27) có hiệu lực cao hơn Hợp chất (3.27) chiếm không

gian hốc S2 tốt hơn và hiệu lực điều trị cao hơn Tuy nhiên (3.27) là phân cực và pK không cao

và đã được cải tiến thành (3.28) có pK cao hơn [110].

Như đã nói ở trên, việc ức chế chọn lọc trên DPP-IV là rất quan trọng khi điều trị trên

người vì lý do an toàn Một nghiên cứu với những chất chọn lọc cao bắt đầu với (3.29) và (3.30),

theo cấu hình threo- (3.29) cho thấy khả năng chọn lọc tốt hơn cấu hình erythro- (3.30) từ 5 đến

10 lần, (3.31) là 1 chất ức chế chọn lọc trên DPP-IV (IC50 = 3nM ) và không ức chế kênh hERG Trong các chất đó, các hợp chất có một proton trong P2, như là (3.31), có pK thấp nhưng không

ức chế kênh hERG, trong khi các hợp chất như là (3.32) thiếu proton có pK hợp lý nhưng ức chế hERG [146] Các chất trong dãy trên đều có liên kết mạnh với protein [49] Pyridon (3.33) có

tính chọn lọc và có kết quả tốt, nghiên cứu SAR liên quan tới các pyridin đã được tiến hành

[145] Việc tối ưu hóa (3.34) có tác dụng ức chế chọn lọc trên DPP-IV với IC50 = 34nM, DPP II (IC50 = 8µM), DPP8 và DPP9 (IC50 > 50 µM) Nó không ức chế hERG và có pK hợp lý Trên

chuột gầy (không mỡ), (3.34) cho thất tác dụng đường uống tốt (OGTT) với 1 mg/kg Từ đây

chúng ta có thể thấy:

Thứ 1: Quan sát thấy sự khác nhau giữa các dạng đồng phân (3.29) và (3.30) có sự khác

biệt trong việc ức chế DPP-IV và DPP8/9 là điều quan trọng để nghiên cứu tiếp

Thứ 2 : Trong số các chất này, dãy thứ nhất có thông số pK hợp lý nhưng không an toàn cho người có nguy cơ tim mạch, trong khi dãy chất thứ 2 thì ngược lại

Thứ 3 : Độ ổn định của các hợp chất : việc hướng đến có cả thông số pK hợp lý và an toàn với người có nguy cơ tim mạch đã hướng tới các hợp chất mới

Các cyanopyrrolidid (các hợp chất này ức chế các enzym trong nhóm prolyl

oligopeptidase), như là (3.35) và (3.36) có khả năng ức chế DPP-IV [86] Các chất này có liên

kết thuận nghịch nhưng hình thành liên kết cộng hóa trị với Ser-630 tại vị trí hoạt động của enzym, điều này được chỉ rõ trong các nghiên cứu cấu trúc bằng X-quang [51, 107] Novartis đã

tối ưu hóa nhóm này và đã có 2 sản phẩm được thử hoạt tính lâm sàng (3.37) và (3.38) [140,

141]

Hợp chất (3.39) (DPP-IV IC50=1.9 nM) và (3.40) (IC50= 11 nM) được tìm ra bởi hãng

Merk Tối ưu hóa (3.39) đưa đến (3.41) (IC50=119 nM), có sinh khả dụng đường uống thấp trên

chuột (3%), trong khi tối ưu hóa (3.40) tới (3.42), cũng có sinh khả dụng đường uống thấp hơn

[36, 144] Các nghiên cứu trên chuyển hóa đã cho thấy vòng piperazin có thể bị oxy hóa Việc

thay đổi vòng piperazin đã tạo ra (3.43) (MK-0431, sitagliptin, IC50=18nM), có tác dụng ức chọn lọc tốt trên DPP-IV, và sinh khả dụng đường uống trên chuột là 76% Hợp chất này đã trở

thành thuốc Cấu trúc tinh thể của (3.43) cho thấy carbonyl amid với vòng phenyl nằm trong hốc

S1 [77]