Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao giảo cổ lam 7 lá ( gynostemma longipes)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, xu hƣớng trở về với thiên nhiên ngày càng trở nên phổ biến trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam. Nhiều dƣợc liệu cổ truyền đã đƣợc nghiên cứu sản xuất thành các dạng bào chế hiện đại, tiện lợi để phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho nhân dân. Giảo cổ lam từ lâu đã là một vị thuốc quý đƣợc ngƣời dân ở nhiều nƣớc châu Á trên thế giới sử dụng để nâng cao sức khỏe và tuổi thọ. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu khoa học chỉ ra những tác dụng sinh học của giảo cổ lam nhƣ tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, tác dụng hạ đƣờng huyết, tác dụng hạ cholesterol, tác dụng bảo vệ tim mạch, chống stress… 23, 28, 29, 38, 39. Ở Việt Nam, các chế phẩm giảo cổ lam ngày càng đƣợc ngƣời dân sử dụng rộng rãi để chăm sóc sức khỏe. Những tác dụng sinh học của giảo cổ lam đƣợc cho là tác dụng của các Gypenosid (các saponin trong giảo cổ lam) 23, 27. Nhằm mục tiêu ổn định chất lƣợng trong nghiên cứu cũng nhƣ sử dụng làm thuốc chúng tôi nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá; từ đó đánh giá tác dụng chống oxy bảo vệ gan của saponin trong giảo cổ lam 7 lá theo đề tài: “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao Giảo cổ lam 7 lá Gynostemma longipes” với 3 mục tiêu chính: Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá. iểm nghiệm và đƣa ra dự thảo tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa ảo vệ gan của cao gypenosid GCL 7 lá.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

- -

LÊ MAI PHƯƠNG

XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN

VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO GIẢO CỔ LAM 7 LÁ

(GYNOSTEMMA LONGIPES)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ MAI PHƯƠNG

XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN

VÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CAO GIẢO CỔ LAM 7 LÁ

Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2014

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Phạm Tuấn Anh – Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội Thầy là người luôn

tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi phương pháp nghiên cứu khoa học, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lê Thanh Bình, người luôn sẵn sàng giúp đỡ

tôi trong quá trình tôi hoàn thành khóa luận tại bộ môn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khích lệ, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn nhất để tôi có thể đạt được kết quả ngày hôm nay

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI GYNOSTEMMA 2

1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma 2

1.1.3 Đặc điểm một số loài trong chi Gynostemma 3

1.2 THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG CHI GYNOSTEMMA 5

1.2.1 Saponin nhân Dammaran 5

1.2.2 Saponin trong chi Gynostemma 6

1.2.3 Tác dụng sinh học 8

1.3 T NG QU N VỀ C O THU C 12

1.3.1 Khái niệm 12

1.3.2 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc 13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 13

2.1.1 Nguyên liệu 13

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 14

2.1.3 Động vật thí nghiệm 15

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá 15

2.3.2 Kiểm tra các chỉ tiêu của cao Gypenosid GCL 7 lá 17

2.3.3 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan 18

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu [4] 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT GYPENOSID 21

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết xuất 21

3.1.2 Tinh chế 23

3.2 KIỂM TRA MỘT S CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM GYPENOSID 26

3.2.1 Mô tả 26

3.2.2 Độ ẩm 26

3.2.3 Độ đồng nhất 27

3.2.4 Định tính 27

3.2.5 Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 28

3.2.6 Định lượng saponin toàn phần 29

3.3 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN VÀ CH NG OXY HÓA 31

3.3.1 Ảnh hưởng của Gypenosid lên trọng lượng gan chuột nhắt trắng bị gây độc bằng paracetamol 31

3.3.2 Ảnh hưởng của Gypenosid lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh chuột bị gây độc bằng paracetamol 32

3.3.3 Ảnh hưởng của Gypenosid lên sự thay đổi hàm lượng MDA dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng bị gây độc bằng paracetamol 33

3.3.4 Ảnh hưởng của saponin giảo cổ lam lên sự thay đổi mô bệnh học gan 34

3.4 BÀN LUẬN 34

KẾT LUẬN 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ALAT Alanin amino transferase ASAT Aspartat amino transferase AST Ánh sáng thường

ảng TÊN BẢNG Trang

1.1 Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của các saponin trong G

3.1 Hàm lượng saponin toàn phần thu được khi sử dụng các

3.4 ết quả xác định độ ẩm của cao gypenosid GCL 7 lá 27

3.5 ết quả định t nh các nhóm hợp chất trong cao giảo cổ lam 28

3.6 Định lượng saponin toàn phần trong cao gypenosid GCL 7 lá 30

3.7 Ảnh hưởng của cao gypenosid GCL 7 lá lên trọng lượng gan

3.8 Ảnh hưởng của saponin giảo cổ lam lên hoạt độ ST trong

huyết thanh chuột gây độc ằng paracetamol 32

3.9 Ảnh hưởng của saponin giảo cổ lam lên hoạt độ LT trong

huyết thanh chuột gây độc ằng paracetamol 33

3.10 Ảnh hưởng của saponin giảo cổ lam lên hàm lượng MDA gan

3.11 Ảnh hưởng của saponin giảo cổ lam lên sự thay đổi mô ệnh

2.1 Quy trình nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá trên mô hình

3.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, xu hướng trở về với thiên nhiên ngày càng trở nên phổ biến trên thế giới cũng như ở Việt Nam Nhiều dược liệu cổ truyền đã được nghiên cứu sản xuất thành các dạng bào chế hiện đại, tiện lợi để phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe cho nhân dân Giảo cổ lam từ lâu đã là một vị thuốc quý được người dân ở nhiều nước châu Á trên thế giới sử dụng để nâng cao sức khỏe và tuổi thọ

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu khoa học chỉ ra những tác dụng sinh học của giảo cổ lam như tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan, tác dụng hạ đường huyết, tác dụng hạ cholesterol, tác dụng bảo vệ tim mạch, chống stress… [23], [28], [29], [38], [39] Ở Việt Nam, các chế phẩm giảo cổ lam ngày càng được người dân

sử dụng rộng rãi để chăm sóc sức khỏe Những tác dụng sinh học của giảo cổ lam được cho là tác dụng của các Gypenosid (các saponin trong giảo cổ lam) [23], [27] Nhằm mục tiêu ổn định chất lượng trong nghiên cứu cũng như sử dụng làm thuốc chúng tôi nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá; từ đó đánh giá tác dụng chống oxy bảo vệ gan của saponin

trong giảo cổ lam 7 lá theo đề tài: “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn và nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao Giảo cổ lam 7 lá Gynostemma longipes” với 3 mục

tiêu chính:

- Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá

- iểm nghiệm và đưa ra dự thảo tiêu chuẩn cao gypenosid GCL 7 lá

- Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa ảo vệ gan của cao gypenosid GCL 7 lá

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI GYNOSTEMMA

1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma

Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật [4], Cây cỏ Việt Nam [13], chi Gynostemma được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ bầu bí) Vị trí của chi

Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dược

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma

Chi Gynostemma được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc điểm hình thái của loài G simplicifolium [45] Một số đặc điểm chung của các loài thuộc chi Gynostemma [13],[45]:

Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm Lá kép, t khi là lá đơn, lá kh a răng cưa Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con; cuống hoa có đốt Đài hoa hình ánh xe, chia 5 thùy, ngắn Tràng hình ánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3 đầu nhọn Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không

mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc Hạt sần sùi

Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea Loài G

pentaphyllum là loài phổ biến nhất, nó phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh,

Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [45]

1.1.3 Đặc điểm một số loài trong chi Gynostemma

Ở Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ [8],[13], chi Gynostemma

có 2 loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino và Gynostemma laxum

Wall Cogn Năm 2009 Ths Hoàng Văn Lâm đã công ố thêm 1 loài mới thuộc

chi Gynostemma, bổ sung vào hệ thực vật Việt Nam là Gynostemma longipes C.Y

Wu in C.Y WU & S.K[29] T nh đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã

được công bố ở Việt Nam

a) Gynostemma pentathyllum (Thunb) Makino

Tên khác: Giảo cổ lam, Thất diệp đởm, Cổ yếm

Đặc điểm thực vật: Cây thảo mọc leo yếu, thân cành mảnh, có góc cạnh không lông hoặc có lông thưa thớt ở mấu Lá kép chân vịt, cuống chung dài 3-4 cm, phiến

do 5-7 lá chét với mép có răng dài 3-9 cm, rộng 1,5-3 cm Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh Cụm hoa đực dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh, phân nhánh nhiều, cỡ 10-15cm Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, tràng màu xanh nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác cỡ 2,5-3 × 1mm, đỉnh nhọn có 1 gân, nhị 5 Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực Hoa cái có đài và tràng giống như hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, núm nhụy có 2 thùy, nhị lép 5 ngắn Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5-6 mm, khi ch n màu đen, 2 hạt Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường

k nh 4mm, màu nâu, đỉnh tù gốc hình tim dẹt [8], [9], [10]

Tại Việt Nam cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000 m ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên Huế, on Tum, Đồng Nai [8], [9]

Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong cây có chứa saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử [7], [12], [11], [18] Bằng phương pháp

đo phổ phát xạ tia X, đã xác định được trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: l, Si, Mg,

P, , Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, P , g Trong đó, nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0,0001%) [10]

b) Gynostemma laxum (Wall.) Cogn

Tên khác: Cổ yếm lá óng, thư tràng thưa

Đặc điểm thực vật: Dây leo mảnh, gióng dài 10 – 20 cm, mỏng, mép có răng cưa nhọn, gân phụ 5 – 7 cặp, có lông mịn hoặc không lông Cây có hoa khác gốc, chùy hoa ngắn hay dài đến 30 cm; cánh hoa rời nhau, cao 3 mm; nhị 5 đ nh liền ở chỉ nhị và bao phấn Quả tròn, to 6 – 8 mm, hình trái xoan, hơi dẹt, dài và rộng cỡ 4

mm Ra hoa tháng 5 Cây mọc leo ở các rừng thưa, savan cỏ, trên đất sét hoặc trong các rừng cây bụi trên núi đá vôi [8]

Ở nước ta cây mọc leo ở rừng thưa các tỉnh Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình và Quảng Trị [3], [13]

c) Gynostemma longipes C.Y.Wu ex C.Y.Wu et S.K.Chen

Đặc điểm thực vật: Cây dây leo Thân cành mảnh, có 5 góc hình ngũ giác; mỗi gióng dài 10-20 cm, đường kính 0,2 -0,3 cm, lông dày ở mấu Lá kép chân vịt Cuống lá dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm; gốc hình nêm; mép lá răng cưa to có gai nhỏ ở đỉnh răng; ngọn lá nhọn thuôn dài; mặt trên có lông cứng rải rác, mặt dưới nhẵn, gân bên 9 cặp hình lông chim, có lông tơ thưa Lá ên nhỏ dần Tua cuốn mảnh, rẽ đôi muộn Hoa đơn t nh khác gốc Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh, dài khoảng 5-15 cm Hoa đựa rất nhỏ, tỏa tia màu trắng Cuống 2,3-2,5 mm Đài 5 rời, hình tam giác, dài 0,5-0,7 mm Tràng 5, hình tam giác, rời, dài 1,2-1,4 mm, rộng 0,8-1mm, ngọn thường quăn Nhị 5, chỉ nhị dính thành 1 cột ở trung tâm, phần trên tách 5, hình sao; bao phấn 2 ô, hướng ngoài Cụm hoa cái kép 3 lần chùm, dài 10-18cm Hoa cái, cuống dài 1,8-2,0 mm, đài và tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thường bởi 3 lá noãn hàn liền, 2-3 vòi nhụy mập, rời, núm nhụy chia 2-3;bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt Quả mọng, khi ch n màu vàng xanh, đường kính 6-7

mm, cuống quả dài 8-15 mm Hạt hình tim, rộng 3-4 mm, dài 3-4 mm, màu xám nhạt, cạnh hạt lõm vào phía trong, viền hạt có răng cưa, 2 mặt có hoa văn dạng cục

Đặc điểm sinh thái: ra hoa vào tháng 8-10, quả tháng 11-12

Bộ phận dùng: toàn cây [29]

Phân bố: Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [29]

Năm 2010, trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Phan Thị Thảo nghiên cứu về G.longipes đã chứng minh loài này có chứa flavonoid, saponin, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, sterol, polysaccharid, trong đó saponin là thành phần chính

và đã phân lập được một saponin mới có tên là vinagynosteside A [18]

1.2 THÀNH PHẦN SAPONIN TRONG CHI GYNOSTEMMA

1.2.1 Saponin nhân Dammaran

Theo các nghiên cứu ,[28] [34],[42], saponin là một trong những nhóm chất

chính của các loài Gynostemma Cũng theo các nghiên cứu này, các saponin trong chi Gynostemma chủ yếu thuộc nhóm Dammaran Do đó, chúng tôi tổng quan sâu

hơn về nhóm cấu trúc hóa học này

Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây

thuộc chi Panax, họ raliaceae Đặc biệt các saponin trong nhân sâm (Panax

ginseng) cho thấy nhiều tác dụng qu đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới

nghiên cứu

1 2

3 4 5

8 9 10

11

12 13

14

15 16

17

18 19

1.2.2 Saponin trong chi Gynostemma

Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran Đã có trên 100 saponin trong thành phần Gynostemma pentaphyllum đƣợc phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống nhƣ loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng là Rb1 (Gypenosid III) [28], [42], Rc [36], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [36], Rg3 [38], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [28] Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [36] Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm đƣợc tìm thấy ngoài họ Araliaceae Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gymnema sylvestra [46] Các saponin còn lại chiếm phần lớn các gypenosid đƣợc phát hiện lần đầu ở loài G pentaphyllum Cấu trúc một số saponin trong G pentaphyllum đƣợc trình bày ở hình 1.2; hình 1.3 và bảng 1.1

OOH O

OCH3

CH2O

OH Glu O Rha

Bảng 1.1 Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của các saponin trong

R1 Đường glu, rham, xyl; có thể 1

hoặc 2, 3 đường kết hợp với nhau

R2

- H

- OH

Gypenosid I, Rb1 Gynos TN1, Gynos TN2

biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí 19 (R3) Nhóm –OH cũng có ở vị trí

C-2 α và C-1C-2 β

Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vi trí C-17 cũng được phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [34] Các saponin trong giảo cổ lam

đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [37]và gynosaponin TN1 [39]

1.2.3 Tác dụng sinh học

Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu khoa học về tác dụng sinh học của

Gynostemma pentaphyllum

a Tác dụng chống oxy hóa

Theo Lin J.M., Lin C.C và cộng sự, Gynostemma pentaphyllum là dược liệu

được sử dụng làm thuốc điều trị viêm gan, chứng cao huyết áp và chống ung thư ở Đài Loan Các tác giả đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm và bảo vệ tế

bào gan của dịch chiết phần trên mặt đất của cây Gynostemma pentaphyllum Kết

quả cho thấy dược liệu có tác dụng chống viêm mạnh hơn indomethacin Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của tetracloruacarbon (CCl4) và acetaminophen được thể hiện rõ qua chỉ số AST (aspartate aminotransferase) và ALT (alanine aminotransferase) giảm rõ rệt sau khi dùng thuốc [33], [32]

Các Gypenoside (saponin của cây Gynostemma pentaphyllum) có tác dụng

như là một chất chống oxy hoá đã được nghiên cứu bằng nhiều mô hình khác nhau

để tác động oxy hoá lên các đại thực bào, các microsom gan và tế bào biểu mô nội mạch Các tác giả cũng thấy rằng các gypenoside bảo vệ các màng sinh học khỏi các tổn thương oxy hoá ằng cách làm đảo ngược sự giảm chất lỏng màng của các microsom gan và các ty lạp thể mitochondria , tăng hoạt tính men của ty lạp thể trong các tế bào biểu mô nội mạch và giảm sự thất thoát của men lactate dehydrogenase nội bào từ các tế bào này Hiệu quả chống oxy hoá rõ rệt của các

gypenoside có thể rất có giá trị trong điều trị và phòng ngừa nhiều bệnh như xơ vữa động mạch, bệnh gan và các triệu chứng viêm [31]

Các gypenoside chiết xuất từ Gynostemma pentaphyllum có tác dụng chống

oxy hoá bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của tetracloruacarbon (CCl4) [27]

Nghiên cứu khả năng chống oxy hoá của gypenosid cho thấy dịch chiết (1:1)

và flavonoid toàn phần có hoạt tính chống oxy hoá khá cao, đạt 50,11% ở nồng độ dịch chiết (1:25) và 63,80% ở nồng độ 0,3mg flavonoid toàn phần [12]

b Tác dụng hạ cholesterol

Tác dụng hạ cholesterol: các gypenosid trong G pentaphyllum gây giảm

cholesterol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) và rất thấp VLDL , làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao (HDL) và tỉ lệ HDL/LDL [43]

Đã nghiên cứu tác dụng hạ cholesterol máu của Giảo cổ lam theo phương pháp gây tăng cholesterol nội sinh, với liều 5 g/kg thể trọng thỏ/ngày dùng trong 4 ngày liền đã chứng tỏ cao lỏng (1:1) có tác dụng hạ cholesterol máu, kết quả có ý nghĩa thống kê với p<0,02 so với lô chứng không điều trị [3], [14]

c Tác dụng trên đường huyết

Trên đường huyết: các dịch chiết gypenosid với liều uống 100 và 200 mg/kg thể trọng chuột trong 2 tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose (2 g/kg) [43]

d Tác dụng trên tim mạch

Các gypenosid đã cho thấy tác dụng bảo vệ chứng loạn nhịp tim ở lợn, giảm phạm vi ảnh hưởng của chứng nhồi máu cơ tim ở thỏ và tăng cường sự lưu thông mạch vành trên chó đã gây tê [22]

Tác dụng trên tim mạch: gypenosid (nồng độ 50 µg/ml, 100 µg/ml và 200 µg/ml) có tác dụng bảo vệ cơ tim ằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và

oxygen đồng thời cũng ức chế việc giải phóng men creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase (LDH) [38]

e Tác dụng trên miễn dịch và ung thư

hi gây ung thư iểu mô tuyến thực quản của chuột cống trước hai tuần rồi cho

uống dịch chiết 2% của Gynostemma pentaphyllum và theo dõi thấy số lượng chuột

uống dịch chiết bị bệnh t hơn so với chuột không uống Vì vậy các tác giả cho rằng

Gynostemma pentaphyllum có tác dụng ngăn ngừa và chống lại ung thư đối với

chuột cống [23]

Gynostemma pentaphyllum có tác dụng kìm hãm ung thư iểu bì của chuột túi

vàng sau khi gây ung thư ằng dimethylbenzanthracene (DMBA) Các tác giả cũng

nghiên cứu ảnh hưởng của Gynostemma pentaphyllum tới gen đột biến tách từ khối

tế ào ung thư sau khi gây ung thư ằng DMBA Kết quả cho thấy Gynostemma

pentaphyllum có tác dụng chống lại khối u [24]

Tác dụng lên hệ miễn dịch: gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300 mg/kg thể trọng chuột trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh và giảm lượng kháng thể tiêu huyết Lượng IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim [38]

 Nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cũng đã có nhiều nghiên cứu khoa học về tác dụng sinh học của gypenosid trong giảo cổ lam

Đã tiến hành thử độc tính cấp với mức liều 50g/kg thể trọng chuột tương đương 1250 lần liều dùng cho người) không có biểu hiện ngộ độc cấp trên chuột và thử độc t nh án trường diễn với mức liều 3g/kg thỏ/ngày, dùng liên tục trong một tháng đối với thỏ không thấy biểu hiện độc [10]

Đã nghiên cứu khả năng chống oxy hoá cho thấy dịch chiết (1:1) và flavonoid toàn phần có hoạt tính chống oxy hoá khá cao, đạt 50,11% ở nồng độ dịch chiết (1:25) và 63,80% ở nồng độ 0,3mg flavonoid toàn phần [12]

Đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết, mẫu tách riêng từ phân đoạn chiết bằng ethylacetat với liều 4g/kg ttc sau 124h nồng độ đường huyết là 18,8 mmol/dl giảm không đáng kể so với lô chứng, nhưng mẫu từ dịch chiết cồn toàn phần với liều 5g/kg ttc sau 124h nồng độ đường huyết là 9,0 mmol/dl giảm rõ rệt so với lô chứng là 20,9 mmol/dl khi gây tăng đường huyết bằng streptozocin với mức ý nghĩa

p < 0,001 [1]

Đã nghiên cứu tác dụng làm tăng đáp ứng miễn dịch trên cả hai mô hình: ức chế miễn dịch bằng cyclophosphamid và ức chế bằng tia xạ [15]

Saponin trong G pentaphyllum có tác dụng ức chế khối u trong điều kiện thí

nghiệm [14] Một nghiên cứu mới công bố phát hiện ra 7 saponin mới gây độc với một số dòng tế ào ung thư phổi, ung thư ruột già, ung thư vú và ung thư uồng trứng [21]

1.2.4 Sử dụng trong điều trị

Theo YHCT, dược liệu có vị đắng, tính hàn, có tác dụng tiêu viêm, giải độc, ngừng ho và long đờm [8]

Gynostemma pentaphyllum là một trong 24 vị dược liệu của Trung Quốc có

tác dụng tới acid nucleic, protein và vòng tuần hoàn của bệnh nhân ung thư phổi Dược liệu có tác dụng tăng cường sức đề kháng của cơ thể, dùng làm thuốc tu bổ cường tráng [20]

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, giảo cổ lam được trồng trên diện rộng

ở các địa phương, được chế biến thành các sản phẩm chè đa dạng và lưu thông rộng rãi trên thị trường Giảo cổ lam được sử dụng để tăng cường chức năng giải độc gan, chống oxy hóa, giảm stress, làm hạ mỡ máu [14], [12], [16]

1.3 TỔNG QUAN VỀ CAO THUỐC

1.3.1 Khái niệm

Cao thuốc là chế phẩm điểu chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định

các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp

Các dược liệu trước khi chiết xuất, được xử lý sơ ộ (sấy khô và chia nhỏ đến

k ch thước thích hợp) Với một số dược liệu đặc biệt, có chứa men phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi sử dụng làm nguyên liệu chiết xuất bằng hơi ethanol sôi, hơi nước sôi, hoặc phương pháp th ch hợp khác để bảo vệ hoạt chất

trong dược liệu

Cao thuốc được chia thành 3 loại:

- Cao lỏng: thể chất lỏng hơi sánh, mùi vị đặc trưng của dược liệu dùng để

điều chế cao

- Cao đặc: khối đặc quánh, hàm lượng dung môi dùng để chiết xuất còn lại

trong cao không quá 20%

- Cao khô: một khối hoặc bột khô, đồng nhất, có độ ẩm không lớn hơn 5 [6]

Tiêu chuẩn là quy định về đặc tính kỹ thuật và yêu cầu quản lý, dùng làm

chuẩn để phân loại, đánh giá sản phẩm, hàng hóa, dịch vụ, quá trình, môi trường và các đối tượng khác trong hoạt động kinh tế, xã hội nhằm nâng cao chất lượng và hiệu quả của các đối tượng này Tiêu chuẩn do một tổ chức công bố dưới dạng văn bản để tự nguyện áp dụng

- Hệ thống tiêu chuẩn và ký hiệu tiêu chuẩn:

+ Tiêu chuẩn quốc gia, ký hiệu TCVN

+ Tiêu chuẩn cơ sở, ký hiệu TCCS

- Căn cứ xây dựng tiêu chuẩn Tiêu chuẩn được xây dựng dựa trên một hoặc những

căn cứ sau:

+ Tiêu chuẩn quốc tế, tiêu chuẩn khu vực, tiêu chuẩn nước ngoài

+ Kết quả nghiên cứu khoa học và công nghệ, tiến bộ kỹ thuật

- Kinh nghiệm thực tiễn

- Kết quả đánh giá, khảo nghiệm, thử nghiệm, kiểm tra, giám định [19]

1.3.2 Yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng cao thuốc

Đạt yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng và các yêu cầu chung sau đây:

- Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã dùng để điều chế cao

- Độ trong, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã được

mô tả trong chuyên luận riêng, phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn

- Tỷ trọng: Tùy theo từng cao thuốc cụ thể mà có yêu cầu về tỷ trọng của cao

- Mất khối lượng do làm khô (nếu không có chỉ dẫn cao đặc không quá 20%, cao khô không quá 5%

- Các chỉ tiêu khác: giới hạn nhiễm khuẩn, dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật, giới

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT Ị, HÓA CHẤT

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu là phần trên mặt đất của loài Gynostemma longipes C.Y.Wu ex

C.Y et S.K.Chen thu hái tại Tam Đảo Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 50-600C trong tủ sấy Shellab có quạt thông gió Dược liệu sau sấy khô được bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Hóa chất và dụng cụ:

Hóa chất và thuốc thử trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích

- Hóa chất: Paracetamol (Efferalgan viên 500 mg của hãng Bristol-Myers), silymarin: viên nén silimax 70mg…Các hóa chất natri clorid, formalin 10 … và các hóa chất khác đủ tiêu chuẩn phòng thí nghiệm

- Dung môi hữu cơ: dicloromethan, chloroform, n-butanol, methanol,

- Thuốc thử: các thuốc thử trong phản ứng định tính và sắc ký

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của Merck

- Dụng cụ: dụng cụ thủy tinh và bộ dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm

Thiết bị dùng trong nghiên cứu:

- Kính hiển vi Leica

- Cân kĩ thuật Sartorious

- Cân phân tích Precisa

- Tủ sấy Memmert

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R-200

- Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U – 1900

- Máy xét nghiệm sinh hóa Screen - Master của hãng Hospitex Diagnostic, Italy it định lƣợng AST, ALT của hãng Hospitex Diagnostics Italy , máy định lƣợng ELISA Lx 800 (Mỹ), kính hiển vi điện tử đọc vi thể gan

- Hệ thống máy chấm sắc ký: thiết bị ơm mẫu tự động (CAMAG – LIMONAT 5)

2.1.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai giống khỏe mạnh, trọng lượng 18 -22g

do viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

Súc vật được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy đủ thức ăn chuẩn

và nước uống sạch

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu

- Khảo sát và xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cao chiết từ giảo cổ lam:

- Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của Gypenosid từ Giảo cổ lam 7 lá

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế cao gypenosid GCL 7 lá

Ở Việt Nam, Phạm Thanh Kỳ và cộng sự 2010 đã nghiên cứu về

Gynostemma longipes và xác định trong lá, thân G longipes chứa flavonoid,

saponin, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, sterol, polysaccharid, trong đó saponin

là thành phần chính [18]

Saponin gọi là gypenosid (hoặc gyposaponin) có cấu trúc tri-terpen dammaran tồn tại chủ yếu ở dạng glycosid Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao gypenosid GCL 7 lá là khảo sát các điều kiện để chiết xuất, tinh chế thu được saponin toàn phần từ giảo cổ lam

a) Khảo sát chiết xuất

Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất gypenosid dựa vào việc khảo sát các tiêu chí:

- Dung môi phù hợp với nguyên tắc an toàn, dễ kiếm, hiệu quả kinh tế: ethanol được lựa chọn để nghiên cứu

- Lựa chọn phương pháp chiết xuất: đun hồi lưu, ngâm lạnh, chiết siêu âm…

b) Tinh chế và loại tạp

Căn cứ vào tài liệu tham khảo và quy trình thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp tinh chế bằng chiết lỏng-rắn sử dụng nhựa hấp phụ do có những ưu điểm nổi bật:

- Khả năng tinh chế tốt, loại được hầu hết các tạp chất trong dịch chiết và không làm mất saponin trong quá trình tinh chế

- Khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chiết lỏng-lỏng là quy trình phức tạp, tốn thời gian, cần dùng nhiều dung môi đắt tiền, dễ cháy nổ, độc hại với người phân tích và với môi trường

Việc tinh chế gypenosid được thực hiện bằng cách loại bỏ các tạp chất bằng cách sử dụng nhựa hấp phụ D101

c) Đánh giá quy trình

Tiêu ch đánh giá quy trình: dựa trên hiệu suất chiết suất, hàm lượng gypenosid trong cao, tính ứng dụng của quy trình dùng dung môi t độc, rẻ tiền, quy trình đơn giản dễ áp dụng cho quy mô lớn)

Định lượng saponin toàn phần bằng phương pháp đo quang [1]

Quá trình định lượng được thực hiện các ước sau:

Bước 1 Xác định hàm ẩm bột dược liệu: Lấy khoảng 1 g bột thô GCL đem đo, làm 3 lần, tính kết quả trung bình

Bước 2 Cân chính xác khoảng 10g bột GCL, cho vào cốc có mỏ sạch dung tích 250 ml, thấm ẩm bằng dung môi EtOH 70% rồi thêm dung môi đến ngập hết dược liệu Chiết siêu âm 3 lần trong 10 phút ở công suất 40% Gạn dịch chiết, lọc

qua giấy lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, sấy cắn ở 60oC đến cắn

Bước 3 Hòa tan cắn bằng 10 ml nước cất hấp phụ vào cột chứa Diaion HP20 theo tỉ lệ 1:4 (thể tích/thể t ch Để yên 1 giờ, rửa lần lượt bằng 100 ml nước cất,

100 ml MeOH 20 và MeOH 80 đến kiệt saponin (khoảng 200 ml) Thu dịch MeOH 80%, bốc hơi đến cắn Hòa tan cắn thu được bằng MeOH trong ình định mức 100 ml

Bước 4 Lấy 6 ống nghiệm có nắp dung tích 5ml Hút chính xác 1ml dịch vào ống nghiệm 1 Thêm vào các ống 2-6 dung dịch chuẩn Rb1 nồng độ 0,1 mg/ml lần lượt là 0 ml; 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml và đun cách thủy đến cắn Thêm 0,3 ml vanillin/acid acetic ăng; 0,8 ml acid perchloric, lắc đều và đặt lên bể điều nhiệt ở 80o C trong 10 phút Làm lạnh nhanh bằng nước đá và thêm dung dịch acid acetic ăng đến vừa đủ 5 ml Làm song song một mẫu trắng và tiến hành đo quang ở ước sóng 550nm, cu vet thạch anh l=1 cm

Tính kết quả:

Dựa vào đường chuẩn tính được nồng độ saponin toàn phần tính theo Rb1 của mẫu phân tích Csaponin (µg/ml), từ đó t nh được khối lượng saponin và hàm lượng trong mẫu phân tích:

X% =

* 100% =

*100%

Trong đó X%: hàm lượng saponin trong mẫu phân tích

C: nồng độ saponin toàn phần tính theo Rb1 M: khối lượng dược liệu đem cân gam a: độ ẩm dược liệu

2.3.2 Kiểm tra các chỉ tiêu của cao Gypenosid GCL 7 lá

a) Cảm quan

Quan sát ở ánh sáng thường Mô tả màu sắc, thể chất và mùi vị