Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao chiết từ hạt cần tây

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây cần tây có tên khoa học là Apium graveolens L., thuộc họ Cần (Apiaceae), có nguồn gốc từ châu Âu và được di thực vào Việt Nam. Ngoài công dụng làm rau ăn, cần tây cũng được biết như một thảo dược được sử dụng ở nhiều quốc gia để chữa bệnh. Đặc biệt, hạt cần tây được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh gút và các bệnh về khớp cho hiệu quả tốt 22, 28. Gần đây, hạt cần tây được quan tâm với một số tác dụng sinh học đã được chứng minh bằng thực nghiệm như hạ huyết áp 67, chống ung thư 63, ức chế sự ngưng tập tiểu cầu 21, 65, ức chế quá trình đông máu 21, bảo vệ gan 58 và đáng chú ý là các tác dụng liên quan tới bệnh gút như hạ acid uric huyết thanh 51, tác dụng ức chế hoạt t nh enzym xanthin oxidase là enzym chìa khóa trong bệnh gút 10, chống viêm 59 và giảm đau 61. Do đó, hạt cần tây là một dược liệu tiềm năng có thể sử dụng để phòng và điều trị nhiều loại bệnh đặc biệt là bệnh gút và các bệnh về khớp. Để nâng cao giá trị sử dụng và quản lý chất lượng hạt cần tây có hiệu quả, việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu là cần thiết. Vì vậy, đề tài “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn dược liệu hạt cần tây” được thực hiện với mục tiêu khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm hạt cần tây để đánh giá và quản lý chất lượng dược liệu này.

HOÀNG PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới TS

NGUYỄN THU HẰNG (Bộ môn Dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội),

người thầy đã luôn giành thời gian, tâm huyết để tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên và khích lệ tôi trong suốt quãng thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS Phạm Thùy Linh và DS Nguyễn Thanh

Tùng, những người đã luôn ở bên hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi để tôi có thể

hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của

bộ môn Dược liệu trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Lê Xuân Kỳ cùng các thầy cô của bộ môn Vật lý -

Hóa lý đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành tới những người thân yêu trong gia đình tôi, các anh chị, các bạn và các em sinh viên làm đề tài tại bộ môn Dược liệu đã luôn ủng hộ, cổ vũ và khích lệ tôi trong trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Hoàng Phương Thảo

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật loài Apium graveolens L 2

1.2 Phân bố 2

1.3 Thành phần hóa học 2

1.4 Tác dụng sinh học 12

1.5 Công dụng 14

1.6 Độc tính 14

1.7 Tổng quan về các tiêu chuẩn trong chuyên luận dược liệu 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Cảm quan 17

2.3.2 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi 17

2.3.3 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hoá học 18

2.3.4 Độ ẩm 18

2.3.5 Tro toàn phần 18

2.3.6 Chất chiết được trong dược liệu 18

2.3.7 Tạp chất 18

2.3.8 Tỷ lệ vụn nát 19

2.3.9 Định lượng 19

2.3.10 Xử lý kết quả thực nghiệm 19

Chương 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20

3.1 Khảo sát và xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây 20

3.1.1 Mô tả 20

3.1.2 Bột 20

3.1.3 Vi phẫu 21

3.1.4 Định tính 22

3.1.5 Độ ẩm 26

3.1.6 Tro toàn phần 26

3.1.7 Chất chiết được trong dược liệu 27

3.1.8 Tạp chất 29

3.1.9 Tỷ lệ vụn nát của dược liệu 30

3.1.10 Định lượng flavonoid toàn phần 30

3.2 Dự thảo tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây 36

BÀN LUẬN 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADP Adenin diphosphat

SD Độ lệch chuẩn SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự

TLTK Tài liệu tham khảo

TT Thuốc thử

UV Ultra violet

XO Xanthin oxidase

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Các hợp chất flavonoid có trong hạt cần tây 3 1.2 Các hợp chất phthalid có trong tinh dầu hạt cần tây 5 1.3 Các hợp chất monoterpenoid có trong tinh dầu hạt cần tây 6 1.4 Các hợp chất sesquiterpenoid có trong tinh dầu hạt cần tây 7 1.5 Các hợp chất khác có trong tinh dầu hạt cần tây 8 1.6 Các hợp chất furanocoumarin có trong hạt cần tây 9 1.7 Các hợp chất furanocoumarin glycosid có trong hạt cần tây 10 1.8 Các hợp chất coumarin đơn giản có trong hạt cần tây 11 1.9 Các hợp chất glycosid khác có trong hạt cần tây 11 3.1 Kết quả xác định độ ẩm của dược liệu hạt cần tây 26 3.2 Tỷ lệ phần trăm tro toàn phần của hạt cần tây 27 3.3 Phần trăm chất chiết được bằng ethanol trong hạt cần tây 28 3.4 Phần trăm tạp chất lẫn trong hạt cần tây 29 3.5 Tỷ lệ vụn nát của hạt cần tây 30 3.6 Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ apigenin chuẩn 32 3.7 Kết quả định lượng flavonoid toàn phần trong hạt cần tây 34 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1 Khung cấu trúc của các hợp chất flavonoid có trong hạt cần tây 3

1.2 Khung cấu trúc các hợp chất furanocoumarin có trong hạt cần

tây

9

1.3 Cấu trúc hóa học của seselin (60) 11

3.1 Ảnh chụp hạt cần tây quan sát bằng mắt thường và dưới kính

3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ

apigenin

32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây cần tây có tên khoa học là Apium graveolens L., thuộc họ Cần (Apiaceae),

có nguồn gốc từ châu Âu và được di thực vào Việt Nam Ngoài công dụng làm rau

ăn, cần tây cũng được biết như một thảo dược được sử dụng ở nhiều quốc gia để chữa bệnh Đặc biệt, hạt cần tây được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa bệnh gút và các bệnh về khớp cho hiệu quả tốt [22], [28] Gần đây, hạt cần tây được quan tâm với một số tác dụng sinh học đã được chứng minh bằng thực nghiệm như

hạ huyết áp [67], chống ung thư [63], ức chế sự ngưng tập tiểu cầu [21], [65], ức chế quá trình đông máu [21], bảo vệ gan [58] và đáng chú ý là các tác dụng liên quan tới bệnh gút như hạ acid uric huyết thanh [51], tác dụng ức chế hoạt t nh enzym xanthin oxidase là enzym chìa khóa trong bệnh gút [10], chống viêm [59] và giảm đau [61] Do đó, hạt cần tây là một dược liệu tiềm năng có thể sử dụng để phòng và điều trị nhiều loại bệnh đặc biệt là bệnh gút và các bệnh về khớp Để nâng cao giá trị sử dụng và quản lý chất lượng hạt cần tây có hiệu quả, việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu là cần thiết

Vì vậy, đề tài “Xây dựng dự thảo tiêu chuẩn dược liệu hạt cần tây” được thực hiện với mục tiêu khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm hạt cần tây để đánh giá và quản lý chất lượng dược liệu này

Cây cần tây có tên khoa học là Apium graveolens L., thuộc họ Cần (Apiaceae) [12] Theo hệ thống phân loại Takhtajan (1987) [16], chi Apium L thuộc họ Apiaceae, bộ Apiales, phân lớp Rosidae, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta,

giới Plantae

1.1 Đặc điểm thực vật loài Apium graveolens L

Cây thảo, cao 15-150 cm, toàn thân có mùi thơm, sống 1-2 năm Thân mọc thẳng đứng, nhẵn, có nhiều rãnh dọc, phân nhánh nhiều [14], [22], [48] Lá hình thuôn hoặc hình trứng ngược, dài 7,0-18,0 cm, rộng 3,5-8,0 cm, chia làm 3 thùy

hoặc xẻ 3, thùy cuối có hình thoi, k ch thước 1,2-2,5 × 0,8-2,5 cm, có răng cưa

hoặc có khía tai bèo Lá phía trên có cuống ngắn, phiến lá hình tam giác rộng, xẻ sâu 3 thùy, thùy cuối có hình trứng [49] Lá ở gốc có cuống, bẹ to rộng, có nhiều sóng, hình tam giác - thuôn hoặc dạng 5 cạnh có gốc cụt, xẻ 3-5 thùy hình tam giác, đầu tù, mép kh a răng to, không lông Cụm hoa dạng tán, rộng 1,5-4,0 cm, mọc đối diện với lá, gồm nhiều tán dài, ngắn không đều, các tán ở đầu có cuống dài hơn các tán bên trong và có k ch thước 4,0-15,0 mm [22], [48], tán kép mang 8-12 tán đơn [12], [22], mỗi tán hoa có 7-25 hoa, k ch thước 6,0-9,0 mm theo chiều ngang Hoa phía ngoài có 3-8 (-16) cánh hoa mảnh, k ch thước 0,5-2,5 cm [48] Hoa nhỏ màu

trắng hoặc lục nhạt, tràng có cánh khum, bầu nhỏ [22] Quả đôi dạng trứng, hơi dẹt,

nhẵn, có cánh lồi chạy dọc thân [22], có 5 cạnh, k ch thước 1,3-1,5 x 1,0-2,0 mm Cuống quả dài 1,0-1,5 mm [48] Số nhiễm sắc thể 2n = 22 [14] Mùa ra hoa và ra quả từ tháng 4 đến tháng 7 hàng năm [48]

1.2 Phân bố

Loài Apium graveolens L có nguồn gốc ở bờ biển Đại Tây Dương và Địa Trung

Hải, được trồng lâu đời ở các nước phương Tây [3], thích hợp và phân bố nhiều ở vùng khí hậu ôn đới Cây mới di nhập vào Việt Nam và được trồng rộng rãi ở nhiều nơi để làm rau ăn

1.3 Thành phần hóa học

Căn cứ vào các tài liệu thu thập được, có 90 chất đã được phát hiện có trong hạt

cần tây (Apium graveolens L.) Các hợp chất được phân nhóm dựa theo cấu trúc hóa

học như sau:

- Flavonoid: 10 chất được ký hiệu từ (1) đến (10)

- Tinh dầu: 28 chất được ký hiệu từ (11) đến (38)

- Coumarin: 22 chất được ký hiệu từ (39) đến (60)

- Glycosid khác: 17 chất được ký hiệu từ (61) đến (77)

- Các nhóm hợp chất khác: 13 chất

1.3.1 Flavonoid

Các flavonoid có trong hạt cần tây gồm 10 chất có khung cấu trúc được trình

bày ở hình 1.1 và được tổng kết ở bảng 1.1

Hình 1.1 Khung cấu trúc của các hợp chất flavonoid có trong hạt cần tây

Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid có trong hạt cần tây

Ký

(1) Apigenin -H -H -H

[34], [42], [65],

(8)

methylether-7-apiosyl

Nhận xét: Các flavonoid có trong cây cần tây chủ yếu có khung flavon, là dẫn

xuất của apigenin hoặc luteolin Apigenin (1) và dẫn chất có tác dụng chống viêm [43], [47], chống ngưng tập tiểu cầu [43], chống ung thư [63] Luteolin (7) có tác dụng

sinh học như chống oxy hóa [27], chống viêm [35], chống dị ứng [40], chống ung thư [37], phòng bệnh thận do đái tháo đường [33]

1.3.2.Tinh dầu

Hạt cần tây chứa 2-3 % tinh dầu [22] Bằng phương pháp sắc ký kh kết hợp

khối phổ (GC/MS) đã phát hiện ra được 28 thành phần trong tinh dầu hạt cần tây,

Nhận xét: Thành phần ch nh của tinh dầu hạt cần tây là limonen (19) và β

-selinen (30), sedanolid (12), sedanenolid (13), 3nB (11) Limonen (19) có tác dụng

chống oxy hóa [38], chống viêm [71], chống ung thư, làm tan sỏi mật [29], [64] và

an thần [44] 3nB (11) có tác dụng hạ huyết áp [67], chống viêm [39], bảo vệ gan, chống ung thư [72] và làm giảm độc t nh của acrylamid [58] Sedanolid (12) có tác

dụng giải độc ở gan [72], chống loét dạ dày [52], chống oxy hóa [36]

1.3.3 Coumarin

Các coumarin có trong hạt cần tây gồm 11 hợp chất furanocoumarin, 6 hợp chất furanocoumarin glycosid, ngoài ra còn có 4 hợp chất coumarin đơn giản và 1 hợp chất pyranocoumarin

1.3.3.1 Furanocoumarin

Furanocoumarin có khung cấu trúc được trình bày ở hình 1.2 và được tổng kết ở bảng 1.6 và bảng 1.7

Hình 1.2 Khung cấu trúc các hợp chất furanocoumarin có trong hạt cần tây

Bảng 1.6 Các hợp chất furanocoumarin có trong hạt cần tây

CH2 -H

[28], [30]

1.3.3.2 Coumarin đơn giản

Bảng 1.8 Các hợp chất coumarin đơn giản có trong hạt cần tây

Các hợp chất glycosid khác có trong hạt cần tây được tổng kết ở bảng 1.9

Bảng 1.9 Các hợp chất glycosid khác có trong hạt cần tây

1.4.1 Tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase (XO)

Xanthin oxidase là enzym xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin

và phản ứng oxy hóa xanthin thành acid uric Đây là hai phản ứng trong giai đoạn cuối cùng của quá trình chuyển hóa các base purin trong cơ thể Do đó, XO đóng vai trò enzym chìa khóa trong bệnh gút và các chất ức chế enzym XO làm giảm sinh tổng hợp acid uric từ các base purin là một trong những nhóm thuốc quan trọng được sử dụng để phòng và điều trị các bệnh liên quan tới tăng acid uric máu trong

đó có bệnh gút [54]

Phân đoạn chloroform và phân đoạn ethyl acetat từ hạt cần tây có tác dụng ức

chế XO in vitro rõ rệt ở 3 nồng độ 10 µg/ml, 50 µg/ml và 100 µg/ml (p < 0,01) [10]

1.4.2 Tác dụng hạ acid uric huyết thanh

Dịch chiết ether dầu hỏa và dịch chiết methanol từ hạt cần tây với liều 500 mg/kg có tác dụng hạ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat Dịch chiết ether dầu hỏa có tác dụng mạnh hơn dịch chiết methanol [51]

1.4.3 Tác dụng chống viêm

Dịch chiết ethanol hạt cần tây có tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm màng hoạt dịch khớp gối bằng natri urat, độ phù bàn chân chuột của lô thử giảm 18% so với lô chứng bệnh (p < 0,01) [66]

Dịch chiết nước và dịch chiết n-hexan từ hạt cần tây ở mức liều 100-500 mg/kg thể trọng, có tác dụng chống viêm đáng kể trên chuột nhắt được gây phù bằng formalin và xylen [59]

1.4.4 Tác dụng giảm đau

Dịch chiết ethanol hạt cần tây với các liều tương đương 30 mg dược liệu/kg, 50 mg/kg, 80 mg/kg chuột đều có tác dụng giảm đau tương đương với ibuprofen ở liều tương ứng 200 mg/kg, 100 mg/kg và 50 mg/kg chuột trên mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau Randall - Sellito [56]

1.4.5 Tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu in vitro

Dịch chiết hạt cần tây có tác dụng ức chế mạnh sự ngưng tập tiểu cầu in vitro

gây ra bởi ADP so với mẫu chứng ở nồng độ rất thấp (0,05 mg/ml) (p < 0,05) và thể hiện tác dụng mạnh hơn dung dịch aspirin 81 µg/ml ở các nồng độ 0,10 mg/ml; 1,00 mg/ml; 2,00 mg/ml và 3,00 mg/ml một cách rõ rệt (p < 0,01) [21]

Apigenin - một flavonoid trong hạt cần tây có tác dụng ức chế sự ngưng tập tiểu

cầu in vitro trong máu thỏ gây ra bởi collagen, ADP, acid arachidonic và các yếu tố

hoạt động của tiểu cầu [65]

1.4.6 Tác dụng hạ huyết áp

Nghiên cứu in vitro cho thấy dịch chiết methanol hạt cần tây có tác dụng ức chế

men chuyển angiotensin (IC50 = 666,26 ± 1,32 µg/ml) so với thuốc đối chứng lisinopril (IC50 = 0,19 ± 0,02 ng/ml) [68] Tác dụng hạ huyết áp của hạt cần tây do 3-n-butylphthalid (3nB) - một hợp chất có trong tinh dầu hạt cần tây gây nên [67]

1.4.7 Tác dụng giải độc, bảo vệ gan

Dịch chiết cần tây có khả năng giải độc đáng kể, trong đó tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết hạt cần tây là cao nhất [58]

1.4.8 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết methanol từ hạt cần tây có tác dụng chống lại các tác nhân gây ung thư gan trên chuột Wistar [63] Dịch chiết (ether dầu hỏa, methanol, aceton) của cần tây có tác dụng bảo vệ gan, chống lại tác nhân gây ung thư CCl4 trên chuột Wistar albino ở liều 250 mg/kg Trong đó dịch chiết methanol với liều 250 mg/kg có tác dụng bảo vệ gan tốt nhất, tương đương với silymarin liều 10 mg/kg [24]

1.4.9 Tác dụng hạ đường huyết

Dịch chiết n-buthanol từ hạt cần tây với liều 60 mg/kg có tác dụng hạ đường huyết ở chuột bị đái tháo đường do streptozotocin [26]

Ngoài ra, hạt cần tây còn có tác dụng làm giảm lượng mỡ trong máu, cải thiện

sự lưu thông máu tới cơ và xương [8], kháng khuẩn, kháng nấm [6], [50], chống loét dạ dày [25], [74]

1.5 Công dụng

Hạt cần tây được dùng để chữa bệnh gút và các bệnh về khớp [22], [28], [55], cao huyết áp [8], kích thích tiêu hóa [22], chữa viêm bàng quang, giúp khử trùng bàng quang và ống dẫn nước tiểu [8], [22], [55] Ngoài ra, hạt cần tây còn làm giảm triệu chứng các bệnh phổi như bệnh suyễn, viêm phế quản [8]

1.7 Tổng quan về các tiêu chuẩn trong chuyên luận dƣợc liệu

iểm tra chất lượng dược liệu bao gồm việc mô tả, định t nh, các phép thử tinh khiết, xác định hàm lượng chất chiết được và định lượng hoạt chất trong dược liệu

Theo DĐVN IV việc kiểm tra dược liệu được tiến hành theo quy định sau:

1 Lấy mẫu kiểm nghiệm (Phụ lục 12.1)

2 Sử dụng các mô tả của chuyên luận, một mẫu đối chiếu th ch hợp đã đạt yêu cầu chất lượng theo chuyên luận riêng để xác nhận kết quả kiểm nghiệm

3 Nếu dược liệu được kiểm tra đã bị vụn nát thì dược liệu đó vẫn phải đáp ứng các yêu cầu chung, trừ yêu cầu về mô tả trong chuyên luận tương ứng

4 Nếu dược liệu đòi hỏi phải được làm thành bột trước khi định t nh, định lượng thì phải tán dược liệu đó thành bột, rây và trộn đều như được mô tả trong Phụ lục 3.5

và trong chuyên luận riêng

5 Chỉ tiêu “Mô tả” bao gồm những mô tả về hình thái, k ch thước, màu sắc, mùi vị, các đặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệu, đặc điểm thể chất của dược liệu

6 Định t nh là những phương pháp dùng để nhận biết dược liệu, bao gồm các kinh nghiệm truyền thống, phương pháp vi học và các phương pháp lý hóa

7 Thử tinh khiết là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu Tùy từng dược liệu

mà thử tinh khiết có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu dưới đây:

a Mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6 hay 12.13)

b Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrocloric (Phụ lục 9.7 và 9.8)

c Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối (Phụ lục 12.11)

d Tỉ lệ vụn nát của dược liệu (Phụ lục 12.12)

e Hàm lượng kim loại nặng (Phụ lục 9.4.11)

f Dư lượng các chất bảo vệ thực vật (Phụ lục 12.17)

g Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác) (Phụ lục 12.10)

8 Định lượng là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trong dược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học Định lượng bao gồm cả việc xác định hàm lượng chất béo (Phụ lục 12.9), tinh dầu (Phụ lục 12.7) và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học

Chuyên luận dược liệu hạt cần tây đã được đưa vào Dược điển Anh với các chỉ tiêu: Mô tả, vi phẫu, bột, định tính bằng SKLM, tạp chất, tro toàn phần, tro không tan trong acid hydrochloric, chất chiết được trong nước [69]

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Cây cần tây có hoa và hạt cần tây được thu hái tại xã Hải Nam - Hải Hậu - Nam Định vào tháng 11 năm 2012

Mẫu cây có hoa được ép tiêu bản, lưu trữ tại Phòng Tiêu bản - Bộ môn Thực vật

- Trường đại học Dược Hà Nội với số hiệu tiêu bản là HNIP/17860/13

Căn cứ vào đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu, sử dụng khóa phân loại chi

Apium L và đối chiếu với bản mô tả loài theo tài liệu [49], mẫu cần tây nghiên cứu

đã được xác định tên khoa học là Apium graveolens L., họ Cần (Apiaceae)

Hạt cần tây được đem phơi khô, bảo quản trong túi nilon k n, để nơi khô ráo, thoáng mát

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

 Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có:

- Các dung môi hữu cơ: Ethanol, ethyl acetat, toluen, acid formic, chloroform, methanol, ether dầu hỏa

- Hóa chất: NaOH, FeCl3, HCl, Mg, acid acetic 5%, Javen, xanh methylen, carmin, triethylamin

- Apigenin chuẩn (Tauto Biotech), độ tinh khiết 98,0312% (HPLC)

- Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn (Merck)

 Dụng cụ thí nghiệm:

- Pipet, bình định mức, ống nghiệm, bình cầu, cốc cỏ mỏ, ống đong, phễu

- Bộ dụng cụ chiết hồi lưu, bộ dụng cụ chiết soxhlet

2.1.3 Thiết bị và máy móc sử dụng

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S9 (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,01 mg

- Cân phân tích Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,1 mg

- Máy đo quang Hitachi U-1900 Spectrophotometer

- Máy đo độ ẩm Precisa XM60

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Kính hiển vi Leica (Đức)

- Kính lúp soi nổi Leica EZ4

- Máy cắt vi phẫu cầm tay

- Máy ảnh Canon

- Lò nung Naberthern

- Máy đun cách thủy Memmert (Đức)

- Máy siêu âm Sonic vibra cell

2.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm sau của dược liệu hạt cần tây:

2.3.2 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hiển vi

- Bột dược liệu: Sấy khô dược liệu hạt trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C sau đó dùng thuyền tán và chày cối sứ hoặc máy xay nghiền nhỏ Rây lấy bột mịn, dùng kim mũi mác lấy bột dược liệu cho lên phiến k nh đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, đặt lamen lên và quan sát dưới kính hiển vi để xác định các đặc điểm bột dược liệu

- Vi phẫu: Cắt vi phẫu bằng máy cắt cầm tay, tẩy bằng nước Javen, nhuộm vi phẫu

phẫu

- Chụp ảnh đặc điểm bột và vi phẫu bằng máy ảnh Canon Xử lý ảnh bằng phần mềm PHOTOSHOP CS8

2.3.3 Kiểm nghiệm bằng phương pháp hoá học

- Định tính flavonoid, coumarin trong hạt cần tây bằng phản ứng hóa học theo phương pháp ghi trong tài liệu [20]

 Định tính flavonoid: Phản ứng cyanidin, phản ứng với kiềm, phản ứng với FeCl3 5%

 Định tính coumarin: Phản ứng mở, đóng vòng lacton; quan sát hiện tượng huỳnh quang

- S LM: Định t nh dược liệu hạt cần tây bằng S LM theo phương pháp ghi trong

Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 5.4) [2]

2.3.4 Độ ẩm

- Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn, quá độ ẩm đó thì dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng Việc xây dựng chỉ tiêu độ ẩm cho dược liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản [1]

- Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô hay phương pháp

sấy theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 9.6) [2]

2.3.5 Tro toàn phần

- Tro toàn phần là lượng cắn vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn một dược liệu Cắn vô cơ có cấu tạo chủ yếu là các carbonat và oxyd kim loại [1]

- Tiến hành tro hóa hoàn toàn mẫu thử tại một điều kiện nung nhất định trong 1g

mẫu thử theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt Nam IV (Phụ lục 9.8) [2]

2.3.6 Chất chiết được trong dược liệu

Xác định chất chiết được trong dược liệu theo phương pháp ghi trong Dược điển

Việt Nam IV (Phụ lục 12.10) [2]

2.3.7 Tạp chất

Xác định tạp chất lẫn trong dược liệu theo phương pháp ghi trong Dược điển

Định lượng flavonoid toàn phần trong hạt cần tây bằng phương pháp đo quang:

- Tiến hành chiết xuất dịch chiết hạt cần tây và loại tạp

- Làm phản ứng tạo màu với dung dịch triethylamin 1% trong methanol

- Khảo sát cực đại hấp thụ

- Khảo sát khoảng tuyến tính

- Sử dụng kĩ thuật đường chuẩn để xác định được nồng độ chất cần phân t ch có trong mẫu định lượng, từ đó t nh ra hàm lượng flavonoid có trong mẫu dược liệu

- Thẩm định phương pháp: hảo sát độ đúng, độ lặp lại của phương pháp

2.3.10 Xử lý kết quả thực nghiệm

Kết quả thực nghiệm lưu trữ và tính toán bằng phần mềm MICROSOFT EXCEL sử dụng T-test với khoảng tin cậy 95% (α = 0,05)

3.1 Khảo sát và xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu hạt cần tây 3.1.1 Mô tả

Dược liệu là quả ch n phơi hay sấy khô của cây cần tây (Apium graveolens L.),

họ Cần (Apiaceae)

Mô tả: Hạt rất nhỏ, màu nâu, hình bầu dục, dài khoảng 1-1,5 mm, rộng khoảng 0,5-1 mm, có 5 cánh, mép ngoài mỗi cánh màu vàng nhạt Mùi thơm đặc trưng, vị đắng, hơi cay

Ảnh chụp hạt cần tây quan sát bằng mắt thường và dưới kính lúp soi nổi Leica EZ4 được trình bày ở hình 3.1

Quan sát bằng mắt thường Quan sát dưới kính lúp Leica EZ4

Hình 3.1 Ảnh chụp hạt cần tây quan sát bằng mắt thường và dưới

kính lúp Leica EZ4 3.1.2 Bột

Bột màu nâu, mùi thơm, vị đắng, hơi cay Soi dưới k nh hiển vi thấy các đặc điểm:

- Mảnh biểu bì (1) gồm những tế bào hình chữ nhật, xếp sát nhau

- Mảnh mô mềm (2) gồm những tế bào hình tròn, thành mỏng

- Mảnh nội nhũ (3) gồm những tế bào dài, thành mỏng